JP5322638B2 - チトクロムｃを測定することによる肺傷害検査方法および検査キット - Google Patents
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Description
本発明は、肺疾患における肺傷害の検査方法および検査キットに関する。さらに詳しくは、間質性肺疾患または急性呼吸窮迫症候群等の肺疾患における肺傷害の検査方法および検査キットに関する。また、肺傷害を伴う肺疾患の検査方法及び検査キットに関する。
肺疾患には、肺癌、縦隔腫瘍、呼吸器感染症（肺炎，肺抗酸菌症，肺真菌症）、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患（間質性肺炎）、急性呼吸窮迫（促迫）症候群（ＡＲＤＳ）、気管支喘息・アレルギー性肺疾患、自然気胸、サルコイドーシス、気管支拡張症、肺血栓塞栓症、睡眠時無呼吸症候群（外来簡易検査）等があり、さまざまな診断方法がある。特に、間質性肺疾患は、肺胞の壁（間質）に炎症がおきる疾患を総称するもので、その中でも繊維化を起こしやすい疾患を特に間質性肺炎と呼んでいる。間質性肺炎は、肺胞の形も不規則になって、肺全体が少し固くなっていく。その結果、肺のふくらみが悪くなり肺活量がおちると同時に、酸素の吸収効率も悪くなってゆき、息苦しくなったり、咳が出たりして、さらに進行すると、 肺は線維性成分の固まりとなり、この部分での肺としての機能が失われる。この間質性肺炎には、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、急性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連性間質性肺疾患、リンパ球性間質性肺炎等の疾患があるが、肺胞細胞の傷害の程度により、治療方法を変えることが疾患の早期治癒に重要である。
急性呼吸窮迫症候群は、ショック肺とも呼ばれ、さまざまな原因によって引き起こされる急性の呼吸困難、重症の低酸素血症、肺損傷の総称をいう。肺の間質や肺胞腔に水分と細胞浸潤がみられ、酸素化（血液中に酸素を取り込むこと）が損なわれる症状が見られる。その本体は、血管内皮細胞が損なわれて血管の透過性が進み、その結果もたらされる急性肺水腫と考えられている。
ところが、現在、肺傷害（肺胞細胞の傷害）の程度を容易に検査する方法がなく、特に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候群において、肺傷害を表すマーカーが望まれている。
一方、チトクロムｃは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知られているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリアにあったチトクロムｃが急速にサイトゾルへと放出されることが報告されている（非特許文献１）。そしてサイトゾルのチトクロムｃは、アポトーシスのキーファクターであるカスパーゼ(caspase)-3の活性化に関与し、チトクロムｃの増加が、アポトーシス進行と関係することが報告されている（非特許文献２）。
チトクロムｃを測定することにより種々の診断を行うことが知られている（特許文献１−２）。
国際公開０１／３５０９３号パンフレット
特開２００３−０２８８６０号
Dinsdale D. et al., American J. Pathol. 155:607-18, 1999
Medina V. et al., Cancer Research 57:3697-707, 1999
本発明の課題は、肺傷害（肺胞細胞の傷害）の検査方法および検査キットを提供することである。
また、他の課題は、肺傷害を伴う肺疾患、特に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候群の検査方法および検査キットを提供することである。
本発明者らは、肺胞細胞の傷害にアポトーシスが関与していると予測し、研究を行った結果、気管支肺洗浄液中の、アポトーシス関連タンパクであるチトクロムｃを測定することにより肺胞細胞の傷害を検査できることを見出し、発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］ 肺疾患における肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする方法。
［２］ 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項１記載の方法。
［３］ 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項１記載の方法。
［４］ 定量が免疫化学的方法による項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 以下の工程を含む項４記載の方法。
（１）採取した体液中のチトクロムｃを免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害と判定する工程
［６］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項４又は５に記載の方法。
［７］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項６記載の方法。
［８］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項７記載の方法。
［９］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［１］ 肺疾患における肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする方法。
［２］ 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項１記載の方法。
［３］ 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項１記載の方法。
［４］ 定量が免疫化学的方法による項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 以下の工程を含む項４記載の方法。
（１）採取した体液中のチトクロムｃを免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害と判定する工程
［６］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項４又は５に記載の方法。
［７］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項６記載の方法。
［８］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項７記載の方法。
［９］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［１０］ 肺傷害検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムcを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット。
［１１］ 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項１０記載のキット。
［１２］ 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項１０記載のキット。
［１３］ 定量が免疫化学的方法による項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
［１４］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項１３に記載のキット。
［１５］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を含む、項１４記載のキット。
［１６］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項１５記載のキット。
［１７］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１０〜１６のいずれか１項に記載のキット。
［１１］ 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、項１０記載のキット。
［１２］ 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、項１０記載のキット。
［１３］ 定量が免疫化学的方法による項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
［１４］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項１３に記載のキット。
［１５］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を含む、項１４記載のキット。
［１６］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項１５記載のキット。
［１７］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１０〜１６のいずれか１項に記載のキット。
［１８］ 肺傷害を伴う肺疾患を検査する方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を伴う肺疾患を検査することを特徴とする方法。
［１９］ 肺疾患が間質性肺疾患である、項１８記載の方法。
［２０］ 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項１８記載の方法。
［２１］ 定量が免疫化学的方法による項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［２２］ 以下の工程を含む項２１に記載の方法。
（１）採取した体液中のチトクロムｃを免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害を伴う肺疾患と判定する工程
［２３］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項２１又は２２記載の方法。
［２４］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項２３記載の方法。
［２５］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項２４記載の方法。
［２６］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［１９］ 肺疾患が間質性肺疾患である、項１８記載の方法。
［２０］ 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項１８記載の方法。
［２１］ 定量が免疫化学的方法による項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［２２］ 以下の工程を含む項２１に記載の方法。
（１）採取した体液中のチトクロムｃを免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害を伴う肺疾患と判定する工程
［２３］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項２１又は２２記載の方法。
［２４］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行う、項２３記載の方法。
［２５］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項２４記載の方法。
［２６］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［２７］ 肺傷害を伴う肺疾患の検査用キットであって、採取した気管支肺胞洗浄液中のチトクロムcを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット。
［２８］ 肺疾患が間質性肺疾患である、項２７記載のキット。
［２９］ 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項２７記載のキット。
［３０］ 定量が免疫化学的方法による項２７〜２９のいずれか１項に記載のキット。
［３１］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項３０記載のキット。
［３２］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を含む、項３１記載のキット。
［３３］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項３２記載のキット。
［３４］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項２７〜３３のいずれか１項に記載のキット。
［２８］ 肺疾患が間質性肺疾患である、項２７記載のキット。
［２９］ 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、項２７記載のキット。
［３０］ 定量が免疫化学的方法による項２７〜２９のいずれか１項に記載のキット。
［３１］ 免疫化学的方法が抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応による方法である、項３０記載のキット。
［３２］ 抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための緩衝液を含む、項３１記載のキット。
［３３］ 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、項３２記載のキット。
［３４］ 体液を含む溶液が気管支肺胞洗浄液である項２７〜３３のいずれか１項に記載のキット。
以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の検査方法は、肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする。
本発明の検査方法は、肺傷害の検査方法であって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする。
本発明において、肺傷害とは、肺胞細胞の傷害を意味する。肺疾患は、その種類により、肺傷害が現れる段階が異なるが、肺傷害を伴う場合が多い。従って、本発明は、肺傷害を伴う疾患、すなわち、肺傷害が現れる段階にある肺疾患の検査方法も提供する。進行段階により肺傷害の程度が異なる肺疾患であれば、本発明により肺疾患における段階が検査できる。
ここで、肺疾患とは、肺癌，縦隔腫瘍，呼吸器感染症（肺炎，肺抗酸菌症，肺真菌症），慢性閉塞性肺疾患，間質性肺疾患（間質性肺炎），気管支喘息・アレルギー性肺疾患，自然気胸，サルコイドーシス，気管支拡張症，肺血栓塞栓症，睡眠時無呼吸症候群（外来簡易検査）等をいう。好ましくは、間質性肺疾患および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）であり、特に好ましくは、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。
本発明の検査方法は、肺傷害が早い段階から現れる肺疾患や、肺傷害の有無による段階の判定が重要な肺疾患に適用することが好ましい。
採取した体液を含む溶液中のチトクロムｃを測定する方法としては、免疫化学的方法、電気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロムｃをバンドとして検出する方法、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許される。
体液を含む溶液としては、気管支肺胞洗浄液が挙げられるが、その他の体液（血液、血清、血漿若しくは脳脊髄液等）を含む溶液であってもよい。ここで、体液を含む溶液は、体液そのものであってもよい。
気管支肺胞洗浄液は、通常の方法により採取されたものを用いることができる。
気管支肺胞洗浄液は、通常の方法により採取されたものを用いることができる。
チトクロムｃを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロムｃに対する抗体を用いて、チトクロムｃを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムｃを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムｃに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。
本発明に使用される抗チトクロムｃ抗体は、チトクロムｃ（断片を含む）を検出できる抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル（抗血清）でもモノクローナル抗体でもよい。
本発明で言うポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができ、モノクローナル抗体は、抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。
またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。
さらに、本発明における抗体には、抗体のフラグメントも含まれるものであり、この「抗体のフラグメント」とは、前述のようなモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2 、Fab'、Fab 、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）などを意味する（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。
本発明の方法では、好ましくは酸性領域で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃとを反応させる。本願明細書でいう酸性領域とは、抗体とチトクロムｃの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響が減弱するｐＨ領域である。ｐＨを低下させることにより妨害物質の影響を減弱させることができるが、同時に抗体とチトクロムｃの結合も弱くなるため、本発明の免疫化学的な測定におけるｐＨは、通常には、以下の条件を満たすｐＨに決められる。
１．緩衝液中で１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬのチトクロムｃが定量可能な測定感度が得られる。
２．体液存在下での添加回収試験における回収率が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上得られる。
２．体液存在下での添加回収試験における回収率が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上得られる。
妨害物質の影響および抗体とチトクロムｃの結合に及ぼすｐＨの効果は用いる抗体により異なるため、当該免疫化学的方法に用いるｐＨは、抗体毎に最適なｐＨを決めることができる。好ましくは、ｐＨ７以下、さらに好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０、特に好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５、その中でもさらに好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ４．５である。
以下に、免疫化学的な測定におけるｐＨを決める方法を具体的に示すが、ｐＨを決める方法は、これに限定されるものではない。
１．測定感度へのｐＨの影響
ＢＳＡ等の適当な蛋白質、ＮａＣｌ等の適当な塩類、必要により適当な界面活性剤を含むｐＨ３〜ｐＨ７．５の緩衝液に、チトクロムｃを１〜１０００ｎｇ／ｍＬに希釈する。当該免疫化学的な測定法が２ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロムｃを固相化した抗チトクロムｃ抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロムｃ抗体を加えて標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。
ＢＳＡ等の適当な蛋白質、ＮａＣｌ等の適当な塩類、必要により適当な界面活性剤を含むｐＨ３〜ｐＨ７．５の緩衝液に、チトクロムｃを１〜１０００ｎｇ／ｍＬに希釈する。当該免疫化学的な測定法が２ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロムｃを固相化した抗チトクロムｃ抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロムｃ抗体を加えて標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。
また、当該免疫化学的な測定法が１ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロムｃと固相化した抗チトクロムｃ抗体、標識した抗チトクロムｃ抗体を加えて反応させ、標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。
10ｎｇ／ｍＬ、好ましくは1ｎｇ／ｍＬのチトクロムｃを含む検体から得られるシグナルが、チトクロムｃを含まない緩衝液のみの検体のシグナルと比較して充分に強ければ、当該pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液のpHの候補として挙げられる。
２．添加回収へのpHの影響
免疫化学的測定法に用いる検体（例えば、気管支肺胞洗浄液）に、既知量のチトクロムｃを添加する。チトクロムｃを添加した検体、及び添加しなかった検体中のチトクロムｃ量を、当該免疫化学的な方法により測定し、理論値に対する測定値の比率を回収率とする。
免疫化学的測定法に用いる検体（例えば、気管支肺胞洗浄液）に、既知量のチトクロムｃを添加する。チトクロムｃを添加した検体、及び添加しなかった検体中のチトクロムｃ量を、当該免疫化学的な方法により測定し、理論値に対する測定値の比率を回収率とする。
回収率は、添加したチトクロムｃ量をＡ、チトクロムｃ未添加検体中のチトクロムｃ測定値をＢ、チトクロムｃ添加検体中のチトクロムｃ測定値をＣとして、
(1)測定値（Ｃ）／理論値（ＡとＢの加重平均）、
(2)チトクロムｃ添加による測定値の上昇値（Ｃ−Ｂ）／添加量（Ａ）、
の何れでも計算できる。
(1)測定値（Ｃ）／理論値（ＡとＢの加重平均）、
(2)チトクロムｃ添加による測定値の上昇値（Ｃ−Ｂ）／添加量（Ａ）、
の何れでも計算できる。
回収率が70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の場合、当該pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液のpHの候補として挙げられる。
当該免疫化学的な方法に用いる緩衝液のpHは１．測定感度へのpHの影響、２．添加回収へのpHの影響を勘案して決定する。緩衝液の種類は、酸性条件に調整し得る緩衝液であれば特に制限されないが、例えばクエン酸リン酸緩衝液などが挙げられる。
また、免疫化学的なチトクロムｃの測定に当たり、酸性領域の緩衝液を用いる方法は、固相化した抗体と検体中のチトクロムｃとを反応させる第１反応のみならず、第１反応で妨害物質が除去しきれなかった時に、第２反応（チトクロムｃと標識抗体を反応させる工程）に用いても有効である。
本態様の方法は、第１反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものではない。
本態様の方法は、第１反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものではない。
本態様の方法では、通常には、酸性条件で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃとを反応させた後に、チトクロムｃの検出を行う。検出は、好ましくは洗浄を行った後、例えば、標識された2次抗体を反応させ、標識に応じた検出法により、検出する方法が挙げられる。例えば、ビオチン標識された2次抗体を用いる場合は、さらに、アビジン標識されたペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を反応させた後、該酵素の基質を用いて発光又は発色により検出することができる。また、酵素標識された2次抗体、蛍光標識された2次抗体、ルテニウム標識された2次抗体などを用いてもよい。
チトクロムｃを測定する免疫化学的方法の例としては、例えば下記の参考例に記載した方法で調製したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体を用いる方法が挙げられる。
さらに本発明は、肺傷害検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムcを定量するための試薬を含むことを特徴とするキット、及び、肺傷害を伴う肺疾患検査用キットであって、採取した体液を含む溶液中のチトクロムcを定量するための試薬を含むことを特徴とするキットに関する。本発明のキットは、好ましくは、体液を含む溶液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定するための試薬、通常には、チトクロムｃ抗体を含む。本発明のキットは、さらに好ましくは、抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とするキットである。例えば、キット付属の使用説明書に、酸性条件でチトクロムｃと抗チトクロムｃ抗体の反応を行う旨が記載されたキットが挙げられる。また、酸性に調整した反応用緩衝液を含むキットでもよい。本発明のキットは抗チトクロムｃ抗体の他に、2次抗体、チトクロムｃ標準液、希釈液、洗浄液、検出用の基質などを含むものでもよい。
本発明の検査キットは、通常には、体液を含む溶液中のチトクロムｃをチトクロムｃに対する抗体を用いて定量するための試薬を含む。この態様の試薬は、例えば、抗体として抗チトクロムｃ抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬と同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロムｃを測定する検査試薬は、例えば1)抗チトクロムｃ抗体コートカップ、抗チトクロムｃ抗体コートビーズなどの抗チトクロムｃ抗体コート固相、2)標識抗チトクロムｃ抗体、3)既知濃度のチトクロムｃ標準溶液、4)希釈液、5)洗浄液、を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、6)発色基質、7)反応停止液が含まれてもよい。
チトクロムｃの定量結果を指標として用いることにより、肺傷害の程度が検査される。例えばチトクロムｃの定量値が正常値と比較して高値であるときに、肺傷害と判定することができる。また、正常値上限（カットオフ値）を設定し（例えば、コントロール群の濃度の平均値+標準偏差の2倍）、それとの比較で肺傷害の有無を判定してもよい。肺傷害を伴う肺疾患の検査も肺傷害の程度の検査と同様に行うことができる。
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記しない限り質量％である。
［参考例１］抗チトクロムｃモノクローナル抗体の作製
ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）110μg/100μLと65 mMリン酸緩衝液pH 7.5に溶解した2 mg/mLオブアルブミン55μLを混合して、そこへ65 mMリン酸緩衝液pH 7.5で希釈した1 mMグルタルアルデヒド42μLを加え、室温で２時間撹拌した。次に、0.15 M NaClで４℃において４８時間透析し、等量のFCAとの混合物を作製し、BALB/Cマウス腹腔に0.1 mL免疫した。２週間おきに合計３回同様に免疫した。３回目の免疫の２週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロムｃ50μg/100μLを尾静脈より静注した。３日後マウスから脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞P3X63 Ag8U.1と細胞融合した。ヒトチトクロムｃを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロムｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（clone：27G9）を樹立した。
ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）110μg/100μLと65 mMリン酸緩衝液pH 7.5に溶解した2 mg/mLオブアルブミン55μLを混合して、そこへ65 mMリン酸緩衝液pH 7.5で希釈した1 mMグルタルアルデヒド42μLを加え、室温で２時間撹拌した。次に、0.15 M NaClで４℃において４８時間透析し、等量のFCAとの混合物を作製し、BALB/Cマウス腹腔に0.1 mL免疫した。２週間おきに合計３回同様に免疫した。３回目の免疫の２週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロムｃ50μg/100μLを尾静脈より静注した。３日後マウスから脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞P3X63 Ag8U.1と細胞融合した。ヒトチトクロムｃを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロムｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（clone：27G9）を樹立した。
樹立したハイブリドーマをエスクロンSF-B培地（三光純薬社）で培養して増殖させ、BALB/Cマウス腹腔に接種した。１週間後、腹水を採取した。採取した腹水からプロテインＡを用いてIgGを精製し、抗チトクロムｃ抗体（27G9抗体）を得た。
［参考例２］抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズの作製
抗チトクロムｃモノクローナル抗体（clone：2B5F8（R&D Systems社））を、0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で透析し、OD 280 nmが0.56になるよう0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で希釈した。希釈した抗体1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）3 mLで3回洗浄したビーズ（Dynabeads(登録商標) M-450 Epoxy, Dynal社）3.36 mL分と混合し、室温で１７時間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファー（50 mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN3, pH7.5）3 mLで懸濁し、室温で７時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを150mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.3% トレハロース, 0.03容量% Tween 20, 0.3% NaN3, EDTA, pH7.5、3 mLで３回洗浄し、150mM Tris・HCl,3% BSA, 0.3% トレハロース, 0.03容量% Tween 20, 75μg/mLマウスIgG, 0.3% NaN3, pH7.5、12.5mLに懸濁した。これを使用時に濃度を調整して測定に用いた。
抗チトクロムｃモノクローナル抗体（clone：2B5F8（R&D Systems社））を、0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で透析し、OD 280 nmが0.56になるよう0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で希釈した。希釈した抗体1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）3 mLで3回洗浄したビーズ（Dynabeads(登録商標) M-450 Epoxy, Dynal社）3.36 mL分と混合し、室温で１７時間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファー（50 mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN3, pH7.5）3 mLで懸濁し、室温で７時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを150mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.3% トレハロース, 0.03容量% Tween 20, 0.3% NaN3, EDTA, pH7.5、3 mLで３回洗浄し、150mM Tris・HCl,3% BSA, 0.3% トレハロース, 0.03容量% Tween 20, 75μg/mLマウスIgG, 0.3% NaN3, pH7.5、12.5mLに懸濁した。これを使用時に濃度を調整して測定に用いた。
［参考例３］ルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体の作製
参考例１で作製した抗チトクロムｃモノクローナル抗体（27G9抗体）をPBSで透析し、抗体濃度を0.5 mg/mLから2 mg/mLの範囲に調製した。抗体1 mLにジメチルスルホキシドに10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体（ruthenium(II) tris(bipyridyl)-N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA）を12.2μL加え室温で３０分撹拌した。次に2 M グリシンを50μL加え、室温で１０分撹拌した。それを、PBS-3（10 mMリン酸カリウム, 0.15M NaCl, 0.05% NaN3, pH 6）であらかじめ平衡化したSephadex G-25（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（1.5 cmφ x 30 cm）にアプライしてPBS-3で溶出し、1 mLでフラクション分取した。各フラクションのOD 280 nmを測定し、第１ピークのフラクションを集め、ルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体とした。抗体濃度をMicro BCA protein Assay kit（PIERCE社）を用いて測定した。
参考例１で作製した抗チトクロムｃモノクローナル抗体（27G9抗体）をPBSで透析し、抗体濃度を0.5 mg/mLから2 mg/mLの範囲に調製した。抗体1 mLにジメチルスルホキシドに10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体（ruthenium(II) tris(bipyridyl)-N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA）を12.2μL加え室温で３０分撹拌した。次に2 M グリシンを50μL加え、室温で１０分撹拌した。それを、PBS-3（10 mMリン酸カリウム, 0.15M NaCl, 0.05% NaN3, pH 6）であらかじめ平衡化したSephadex G-25（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（1.5 cmφ x 30 cm）にアプライしてPBS-3で溶出し、1 mLでフラクション分取した。各フラクションのOD 280 nmを測定し、第１ピークのフラクションを集め、ルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体とした。抗体濃度をMicro BCA protein Assay kit（PIERCE社）を用いて測定した。
［参考例４］ヒトチトクロムｃ標準抗原の調製
チトクロムｃ標準抗原は、ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）を5% BSA、0.15 M NaCl, 0.1% NaN3を含む0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4で3000 ng/mL, 1000 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mLに希釈して作製した。
チトクロムｃ標準抗原は、ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）を5% BSA、0.15 M NaCl, 0.1% NaN3を含む0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4で3000 ng/mL, 1000 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mLに希釈して作製した。
［実施例１］
急性呼吸窮迫（促迫）症候群、特発性肺線維症、非特異的間質性肺炎、持続性器質化肺炎、膠原病由来の間質性肺炎、過敏性肺炎、および、サルコイドーシスの患者、ならびに、健常者から気管支肺胞洗浄液を採取した。気管支肺胞洗浄液の採取方法は、1990年に厚生省特定疾患研究班により作成されたガイドラインに沿った。すなわち、滅菌生理食塩水150mLで気管支肺胞を洗浄し、回収した洗浄液をガーゼで漉して粘液を除去し、気管支肺胞洗浄液とした。
急性呼吸窮迫（促迫）症候群、特発性肺線維症、非特異的間質性肺炎、持続性器質化肺炎、膠原病由来の間質性肺炎、過敏性肺炎、および、サルコイドーシスの患者、ならびに、健常者から気管支肺胞洗浄液を採取した。気管支肺胞洗浄液の採取方法は、1990年に厚生省特定疾患研究班により作成されたガイドラインに沿った。すなわち、滅菌生理食塩水150mLで気管支肺胞を洗浄し、回収した洗浄液をガーゼで漉して粘液を除去し、気管支肺胞洗浄液とした。
検体希釈液（0.15M NaCl, 15mM EDTA, 2% Lipidure（登録商標)-BL802 (日本油脂社), 2% Lipidure(登録商標)-BL405 (日本油脂社), 0.1% NaN3を含む0.1M こはく酸緩衝液, pH4.0）をピコルミTM８２２０用反応管（三光純薬社）に200μL入れ、次に検体を20μL注入した。
以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミTM８２２０（三光純薬社）を用いて行った。
反応管に、1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN3を含む0.15 M PBS, pH 7.5でビーズ濃度1mg/mLに調整した抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズ25μLを加えて９分反応させ、ピコルミBF洗浄液（三光純薬社）350μLで2回洗浄後、1% BSA, 0.3%スクロース, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN3を含む0.15 M PBS, pH 7.5で0.5−１μg/mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体200μLを加えて９分反応させた。ピコルミBF洗浄液350μLで2回洗浄後、ピコルミ発光電解液（三光純薬社）を300μL加えて発光カウント値を計測した。
横軸にヒトチトクロムｃ標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロムｃ標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、気管支肺洗浄液の発光カウント値からそれぞれに含まれるチトクロムｃ量を算出し、マンホイットニー順位和検定(Mann-Whitney U-test)により疾患群間における有意差を検討した。
その結果を図１に示す。図１によれば、非特異的間質性肺炎(NSIP)やコントロール(CONTROL)にはチトクロムｃ量の上昇が全く見られず、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、特発性肺線維症(IPF)、持続性器質化肺炎(COP)、膠原病由来の間質性肺炎(CVD-IP)、過敏性肺炎(HP)、サルコイドーシス(SA)ではチトクロムｃ量の上昇が見られた。特に急性呼吸窮迫症候群はチトクロムｃ量の上昇が顕著に見られた。チトクロムｃ量の上昇が見られない疾患は肺傷害を伴わない疾患であるか、又は、本実施例において気管支肺胞洗浄液を採取した患者では肺傷害が生じる段階に達していないと考えられる。
次に、症例の疾患分類を詳細に検討した結果、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)1例を過敏性肺炎(HP)に、特発性肺線維症(IPF)1例を急性呼吸窮迫症候群(ARDS)に変更した。更に、有意差検定の方法を分散分析（one way ＡＮＯＶＡ）および多重比較（post hoc analysis）に変更して検討した。
その結果を図２および図３に示す。図２および図３によれば、非特異的間質性肺炎(NSIP)、持続性器質化肺炎(COP)およびコントロール(CONTROL)にはチトクロムｃ量の上昇が全く見られず、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、特発性肺線維症(IPF)、膠原病由来の間質性肺炎(CVD-IP)、過敏性肺炎(HP)、サルコイドーシス(SA)ではチトクロムｃ量の上昇が見られた（p<0.05）。特に急性呼吸窮迫症候群(ARDS)はチトクロムｃ量の上昇が顕著に見られた（p<0.0001）。チトクロムｃ量の上昇が見られない疾患は肺傷害を伴わない疾患であるか、又は、本実施例において気管支肺胞洗浄液を採取した患者では肺傷害が生じる段階に達していないと考えられる。
［実施例２］
肺傷害の程度とチトクロムc量との関係をマウス実験動物モデルにおいて説明する。
ブレオマイシン(BLM)誘発肺傷害動物モデルは、ヒト急性肺傷害・特発性間質性肺炎のモデルとして広く使われている（Adamson IY. et al., American J. Pathol. 77:185-197, 1974）。７〜８週齢のC57BL/6雄性マウスにフェノバルビタールナトリウム（シェリング・プラウ社）を腹腔内に投与して麻酔し、体重1kgあたり、滅菌生理食塩水に溶解した3.0Uのブレオマイシン（日本化薬社）を気管内投与して、肺傷害動物モデルを作製した。ブレオマイシン非投与群、投与後７日群、投与後１４日群について、滅菌生理食塩水1mLで２回気管支肺胞内を洗浄して気管支肺胞洗浄液を採取した。気管支肺胞洗浄液中のチトクロムc量を測定した結果を図４に示す。
肺傷害の程度とチトクロムc量との関係をマウス実験動物モデルにおいて説明する。
ブレオマイシン(BLM)誘発肺傷害動物モデルは、ヒト急性肺傷害・特発性間質性肺炎のモデルとして広く使われている（Adamson IY. et al., American J. Pathol. 77:185-197, 1974）。７〜８週齢のC57BL/6雄性マウスにフェノバルビタールナトリウム（シェリング・プラウ社）を腹腔内に投与して麻酔し、体重1kgあたり、滅菌生理食塩水に溶解した3.0Uのブレオマイシン（日本化薬社）を気管内投与して、肺傷害動物モデルを作製した。ブレオマイシン非投与群、投与後７日群、投与後１４日群について、滅菌生理食塩水1mLで２回気管支肺胞内を洗浄して気管支肺胞洗浄液を採取した。気管支肺胞洗浄液中のチトクロムc量を測定した結果を図４に示す。
以上のことより、チトクロムｃを測定することにより、肺傷害の程度が評価でき、また、肺傷害を伴う肺疾患、特に急性呼吸窮迫症候群を検査できることが示された。
［実施例３］
特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の血清中チトクロムc量を測定した。
検体希釈液（0.15M 塩化ナトリウム, 15mM EDTA, 2% Lipidure（登録商標)-BL802 (日本油脂社), 2% Lipidure(登録商標)-BL405 (日本油脂社), 0.1% NaN3を含む0.1M こはく酸緩衝液, pH4.0）をピコルミTM８２２０用反応管（三光純薬社）に200μL入れ、次に血清を20μL注入した。
特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の血清中チトクロムc量を測定した。
検体希釈液（0.15M 塩化ナトリウム, 15mM EDTA, 2% Lipidure（登録商標)-BL802 (日本油脂社), 2% Lipidure(登録商標)-BL405 (日本油脂社), 0.1% NaN3を含む0.1M こはく酸緩衝液, pH4.0）をピコルミTM８２２０用反応管（三光純薬社）に200μL入れ、次に血清を20μL注入した。
以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミTM８２２０（三光純薬社）を用いて行った。
反応管に、1% BSA, 0.3% トレハロース, 10mM EDTA, 0.15M 塩化ナトリウム, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN3を含む50mM Tris・HCl, pH 7.5でビーズ濃度1mg/mLに調整した抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズ25μLを加えて９分反応させ、ピコルミBF洗浄液（三光純薬社）350μLで2回洗浄後、1% BSA, 0.3%トレハロース, 0.15M 塩化ナトリウム, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN3を含む50 mM Tris・HCl, pH 7.5で0.5−1μg/mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体200μLを加えて９分反応させた。ピコルミBF洗浄液350μLで2回洗浄後、ピコルミ発光電解液（三光純薬社）を300μL加えて発光カウント値を計測した。
横軸にヒトチトクロムｃ標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロムｃ標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、気管支肺洗浄液の発光カウント値からそれぞれに含まれるチトクロムｃ量を算出した。
その結果を表１及び図５に示した。表１に血清を採取した日、最初の採取日からの日数、及びそれぞれのチトクロムｃ量を示した。疾患は臨床所見、検査所見により進行していることを確認し、チトクロムｃ量もそれに応じて上昇し、特に重篤な肺障害を伴った死亡例では、著明な高値を呈することが解った。
以上のことより、チトクロムｃを測定することにより、肺傷害の程度が評価でき、また、肺傷害を伴う肺疾患を検査できることが示された。
本発明によれば、肺傷害（肺胞細胞の傷害）の程度を容易に検査することができる。また、肺傷害を伴う肺疾患、特に間質性肺疾患や急性呼吸窮迫症候群の検査を行うことができる。
Claims (10)
- 肺疾患における肺傷害の検査方法であって、酸性領域の緩衝液中で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を行う免疫化学的方法により、採取した気管支肺胞洗浄液中のチトクロムｃを定量することにより肺傷害を検査することを特徴とする方法。
- 肺傷害が間質性肺疾患における肺傷害である、請求項１記載の方法。
- 肺傷害が急性呼吸窮迫症候群における肺傷害である、請求項１記載の方法。
- 以下の工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（１）採取した気管支肺胞洗浄液中のチトクロムｃを、酸性領域の緩衝液中で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を行う免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害と判定する工程 - 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、請求項４記載の方法。
- 肺傷害を伴う肺疾患を検査する方法であって、採取した気管支肺胞洗浄液中のチトクロムｃを、酸性領域の緩衝液中で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を行う免疫化学的方法により定量することにより肺傷害を伴う肺疾患を検査することを特徴とする方法。
- 肺疾患が間質性肺疾患である、請求項６記載の方法。
- 肺疾患が急性呼吸窮迫症候群である、請求項６記載の方法。
- 以下の工程を含む請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
（１）採取した気管支肺胞洗浄液中のチトクロムｃを、酸性領域の緩衝液中で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を行う免疫化学的方法により定量する工程
（２）定量した結果、正常値と比較して高値のときに肺傷害を伴う肺疾患と判定する工程 - 酸性領域がｐＨ３．０からｐＨ６．０である、請求項９記載の方法。
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