JP5459710B2

JP5459710B2 - Pharmaceutical composition for suppressing type I allergy containing maslinic acid as an active ingredient

Info

Publication number: JP5459710B2
Application number: JP2010108480A
Authority: JP
Inventors: 聡福光; 和彦間
Original assignee: Nippon Flour Mills Co Ltd
Current assignee: NIPPN Corp
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2030-05-10
Also published as: JP2011236150A

Description

本発明は、マスリン酸を有効成分とする抗アレルギー剤に関する。 The present invention relates to an anti-allergic agent containing maslinic acid as an active ingredient.

マスリン酸は、オリーブ果肉や葉に豊富に含まれているトリテルペン類の一種であることが報告されており、基礎研究では、ガン細胞を用いた発ガン抑制作用が報告されている（例えば非特許文献１参照）。
また、難消化性デキストリンと、コロソリン酸、マスリン酸、トルメンティック酸及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つとを有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤としての使用が知られている（例えば特許文献１参照）。
また、マスリン酸を含有する皮膚の美白用飲食物又は経口美白剤としての使用が知られている（例えば特許文献２参照）。 Maslinic acid has been reported to be a type of triterpene that is abundantly found in olive pulp and leaves, and in basic research, its carcinogenesis-inhibiting effect has been reported using cancer cells (see, for example, Non-Patent Document 1).
In addition, the use of resistant dextrin as an agent for suppressing blood glucose level increase, which contains as active ingredients at least one selected from the group consisting of corosolic acid, maslinic acid, tormentic acid, and pharma- ceutical acceptable salts thereof, is known (see, for example, Patent Document 1).
In addition, the use of maslinic acid in food and drink for skin whitening or as an oral whitening agent is known (see, for example, Patent Document 2).

特開２００６−３４７９６７号公報JP 2006-347967 A 国際公開２００２／０４３７３６号パンフレットInternational Publication No. 2002/043736

「ザジャーナルオブニュートリション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、（米国）、「アメリカンソサイエティーオブニュートリショナルサイエンス（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００６年、１３６号、ｐ. ２５５３−２５５７"The Journal of Nutrition", (USA), "American Society of Nutritional Sciences", 2006, Vol. 136, pp. 2553-2557

近年、国内のアレルギー患者数は年々増加している。
現在、問題視されているアレルギー性鼻炎やアトピー性皮膚炎（通年性・花粉症）などは、体内に入り込んだ異物を除去するために働く免疫システムが異常反応を起こすもので、I型アレルギーと呼ばれ、アレルゲンが体内へ侵入後、ただちに反応を示す即時型である。
アレルギーの全貌はいまだ十分に解明されておらず、軽度の患者は一般用医薬品やサプリメントで対応するケースも多いため、アレルギー改善訴求食品素材への注目度は高まってきている。
従って、本発明の目的は日常的に安心して摂取できる抗アレルギー剤を提供することである。 In recent years, the number of allergy sufferers in Japan has been increasing year by year.
Allergic rhinitis and atopic dermatitis (perennial hay fever), which are currently considered problematic, are caused by an abnormal reaction of the immune system, which works to remove foreign substances that have entered the body. These are known as type I allergies, and are of the immediate type, which reacts immediately after an allergen enters the body.
The full extent of allergies has yet to be fully elucidated, and patients with mild symptoms often respond with over-the-counter medicines and supplements, so there has been growing attention on food ingredients that claim to improve allergies.
Accordingly, an object of the present invention is to provide an antiallergic agent which can be taken safely on a daily basis.

本発明者らは、オリーブを処理して得られるマスリン酸化合物に着目し、鋭意研究を重ねた結果、マスリン酸が優れた抗アレルギー作用をもつことを見出し、本発明を完成させるに至った。
特にオリーブの果肉、オリーブの葉、オリーブオイル絞りかす、エキストラバージンオリーブオイルを処理して得られるマスリン酸は、植物由来であることから安全性が高い。
従って、本発明はマスリン酸を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤である。 The present inventors focused on the maslinic acid compound obtained by processing olives, and as a result of extensive research, discovered that maslinic acid has excellent anti-allergic effects, which led to the completion of the present invention.
In particular, maslinic acid, which is obtained by processing olive pulp, olive leaves, olive pomace, and extra virgin olive oil, is highly safe because it is derived from plants.
Therefore, the present invention is an antiallergic agent characterized by containing maslinic acid as an active ingredient.

本発明のマスリン酸を有効成分とする抗アレルギー剤により、花粉やハウスダストなどのアレルゲンによって引き起こされるアレルギーを軽減することができる。 The anti-allergy agent of the present invention, which contains maslinic acid as an active ingredient, can reduce allergies caused by allergens such as pollen and house dust.

本発明者らは、オリーブを処理して得られるマスリン酸化合物に着目し、鋭意研究を重ねた結果、マスリン酸が優れた抗Ｉ型アレルギー作用をもつことを見出し、本発明を完成させるに至った。
特にオリーブの果肉、オリーブの葉、オリーブオイル絞りかす、エキストラバージンオリーブオイルを処理して得られるマスリン酸は、植物由来であることから安全性が高い。
従って、本発明はマスリン酸を有効成分として含有することを特徴とするＩ型アレルギーを抑制するための医薬組成物である。 The present inventors focused on the maslinic acid compound obtained by processing olives, and as a result of extensive research, discovered that maslinic acid has an excellent anti- type I allergy effect, which led to the completion of the present invention.
In particular, maslinic acid, which is obtained by processing olive pulp, olive leaves, olive pomace, and extra virgin olive oil, is highly safe because it is derived from plants.
Therefore, the present invention is a pharmaceutical composition for suppressing type I allergy, which is characterized by containing maslinic acid as an active ingredient.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用するマスリン酸は、化学式（１）で示されるトリペルテン類の１種である。 The present invention will be described in detail below.
The maslinic acid used in the present invention is a type of triperthene represented by the chemical formula (1).

マスリン酸は、化学合成によって得ることができるほか、オリーブから公知の方法で抽出、精製して得ることができる。
例えば、乾燥したオリーブや搾油工程で発生するオリーブオイル絞りかすなどを原料として使用できる。
さらに、オリーブ乾燥物をｎ−ヘキサン等の脂溶性有機溶媒で油分を除去した脱脂物でも使用できる。
使用するオリーブの品種には特に限定はなく、国内産、外国産などの産地、栽培用、搾油用を問わず使用できる。
本発明で使用するマスリン酸は、これらの原料からマスリン酸が抽出可能な低級アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなど）又はその含水アルコールでマスリン酸を抽出し、必要であれば、ケン化処理、中和を行い、吸着剤としてオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）、シリカゲル、合成吸着剤などを使用して、分画、精製することで得ることができる。
マスリン酸精製画分を濃縮乾固したものは、茶褐色の粉末状であり、純度が高いほど白色粉末となり、含水アルコールなどに溶解する。 Maslinic acid can be obtained by chemical synthesis, or by extraction and purification from olives using known methods.
For example, dried olives and olive oil pomace generated during the oil extraction process can be used as raw materials.
Furthermore, defatted dried olives obtained by removing oil with a fat-soluble organic solvent such as n-hexane can also be used.
There are no particular limitations on the variety of olives used, and they can be any variety, whether domestic or foreign, used for cultivation or for oil extraction.
The maslinic acid used in the present invention can be obtained by extracting maslinic acid from these raw materials with a lower alcohol capable of extracting maslinic acid (e.g., ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, etc.) or a hydrous alcohol thereof, and then, if necessary, carrying out saponification and neutralization, and fractionating and purifying the extract using an adsorbent such as octadecyl silica (ODS), silica gel, or a synthetic adsorbent.
The purified maslinic acid fraction is concentrated and dried in the form of a brown powder, and the higher the purity, the whiter the powder becomes, and it dissolves in aqueous alcohol.

Ｉ型アレルギー反応は、抗原特異的なＩｇＥとＩｇＥ特異的な高親和性Ｆｃレセプターをもつ肥満細胞や好塩基球が関わっている。
肥満細胞や好塩基球の表面に結合しているＩｇＥが抗原によって架橋されると、肥満細胞や好塩基球は活性化され、ヒスタミンやβ−ヘキソサミニダーゼなどの細胞内顆粒内容物が放出される。この現象を脱顆粒とよび、この脱顆粒を防ぐことがアレルギー発症を抑えるために必要である。
本発明のマスリン酸を有効成分とする抗アレルギー剤は、脱顆粒の際にヒスタミンなどの化学物質と共に放出されるβ−ヘキソサミニダーゼの活性を抑制し、Ｉ型アレルギーを抑制することができる。 Type I allergic reactions involve antigen-specific IgE and mast cells and basophils that have IgE-specific high-affinity Fc receptors.
When IgE bound to the surface of mast cells or basophils is cross-linked by an antigen, the mast cells or basophils are activated and release intracellular granule contents such as histamine and β-hexosaminidase. This phenomenon is called degranulation, and preventing degranulation is necessary to suppress the onset of allergies.
The anti-allergic agent of the present invention, which contains maslinic acid as an active ingredient, can suppress the activity of β-hexosaminidase, which is released together with chemical substances such as histamine during degranulation, and thus suppress type I allergy.

投与量は、投与方法と患者の年齢、病状や一般状態などによって変化し得るが、大人では通常、1日当たり有効成分として０．１〜５００ｍｇ／ｋｇが適当である。 The dosage may vary depending on the method of administration, the patient's age, medical condition, and general condition, but for adults, a dosage of 0.1 to 500 mg/kg of active ingredient per day is usually appropriate.

本発明のマスリン酸を有効成分とする抗アレルギー剤は、一般食品や健康食品に配合することができ、また、食品添加物の成分とすることもできる。
本発明のマスリン酸を有効成分とする抗アレルギー剤を配合する食品は特に限定されず、例えば食パン、菓子パン、パイ、デニッシュ、ドーナツ、ケーキ等のベーカリー食品、うどん、そば、中華麺、焼きそば、パスタ等の麺類、天ぷら、コロッケ等のフライ類、カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類、ふりかけ類、かまぼこ等の練り製品、ジュース等の飲料、スナック菓子、米菓、飴、ガム等の菓子類を挙げることができる。 The antiallergic agent of the present invention, which contains maslinic acid as an active ingredient, can be incorporated into general foods and health foods, and can also be used as a food additive.
Foods that can be formulated with the antiallergic agent of the present invention containing maslinic acid as an active ingredient are not particularly limited, and examples include bakery foods such as bread, sweet bread, pies, Danish pastries, donuts, and cakes; noodles such as udon, soba, Chinese noodles, yakisoba, and pasta; fried foods such as tempura and croquettes; sauces such as curry, stew, and dressings; furikake seasonings, paste products such as kamaboko, beverages such as juice, and confectioneries such as snacks, rice crackers, candies, and gum.

以下本発明を実施例により具体的に説明する。
［抽出精製］
オリーブオイル絞りかす２５０ｇを乾燥（６０℃、３時間）し、ｎ−ヘキサンにより脱脂した後、含水９０％（ｖ／ｖ）メタノールにより還流抽出（７０℃、３時間）した。
抽出液をろ過し、ろ液を濃縮後、水に分散させ吸着剤として合成吸着剤アンバーライトＸＡＤ４（オルガノ株式会社）２００ｇを使用してマスリン酸画分を精製した。
抽出物（マスリン酸の純度は、３２．６％）１．６ｇが得られた。 The present invention will now be described in more detail with reference to examples.
[Extraction and purification]
250 g of olive oil pomace was dried (60° C., 3 hours), defatted with n-hexane, and then reflux-extracted (70° C., 3 hours) with 90% (v/v) water-containing methanol.
The extract was filtered, and the filtrate was concentrated and dispersed in water, and the maslinic acid fraction was purified using 200 g of a synthetic adsorbent, Amberlite XAD4 (Organo Corporation).
1.6 g of extract (maslinic acid purity: 32.6%) was obtained.

マスリン酸含有量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、分子量は、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ-ＭＳ）で確認した。
ＨＰＬＣによるマスリン酸、マスリン酸含有オリーブ抽出物の保持時間は４．９６分で確認した。
図１は、マスリン酸標準品（純度９８％）、図２はマスリン酸含有オリーブ抽出物のＨＰＬＣの測定結果である。
ＬＣ-ＭＳによるマスリン酸標準品、マスリン酸含有オリーブ抽出物の正負同時スキャン測定の結果、検出された分子量関連イオンは、マスリン酸標準品、抽出物ともに［Ｍ＋Ｎａ＋ＣＨ_３ＣＮ］^＋ｍ／ｚ５３６、［Ｍ−Ｈ］⁻ ｍ／ｚ４７１であった。
図３は、ＬＣ-ＭＳによって観察されたマスリン酸の分子イオン種（正イオン）［Ｍ＋Ｎａ＋ＣＨ_３ＣＮ］^＋ｍ／ｚ５３６、図４は、ＬＣ-ＭＳによって観察されたマスリン酸の分子イオン種（負イオン）［Ｍ−Ｈ］⁻ ｍ／ｚ４７１のチャートである。 The maslinic acid content was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC), and the molecular weight was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
The retention time of maslinic acid and maslinic acid-containing olive extract by HPLC was confirmed to be 4.96 minutes.
FIG. 1 shows the HPLC results of a maslinic acid standard (purity 98%), and FIG. 2 shows the HPLC results of an olive extract containing maslinic acid.
As a result of simultaneous positive and negative scan measurements of the maslinic acid standard and the maslinic acid-containing olive extract by LC-MS, the molecular weight-related ions detected were [M+Na+ _CH3CN ] ⁺ m/z 536 and [M-H] ^- m/z 471 for both the maslinic acid standard and the extract.
FIG. 3 is a chart of the molecular ion species (positive ion) of maslinic acid, [M+Na+ _CH3CN ] ^+, m/z 536, observed by LC-MS, and FIG. 4 is a chart of the molecular ion species (negative ion) of maslinic acid, [M-H] ^-, m/z 471, observed by LC-MS.

［実施例１］β‐ヘキソサミニダーゼアッセイ測定試験
前記マスリン酸含有オリーブ抽出物及び前記マスリン酸標準品について、β-ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を、ラット由来好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３;好塩基球細胞、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター）から遊離されるβ-ヘキソサミニダーゼを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価した。 Example 1 β-hexosaminidase assay measurement test The β-hexosaminidase release inhibitory effect of the maslinic acid-containing olive extract and the maslinic acid standard was evaluated using an anti-allergic effect test method using β-hexosaminidase released from rat-derived basophil cells (RBL-2H3; basophil cells, RIKEN BioResource Center) as an indicator.

ＲＢＬ−２Ｈ３を２４穴プレートに２．５×１０^５細胞／穴となるように細胞を播種し、２４時間培養（二酸化炭素５％、３７℃）後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ（−）（ＰＢＳ（−））で１回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）を５００μｌ／穴となるように添加し、
抗体のＡｎｔｉＤＮＰ−ＩｇＥ溶液（２５μｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、２時間培養することによって、細胞を感作させた。
これをコントロール、陽性対照及び検体用とし、Ｂｌａｎｋ用として抗体のＡｎｔｉＤＮＰ−ＩｇＥ溶液の代わりにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地を２０μｌ入れた。 RBL-2H3 cells were seeded in a 24-well plate at 2.5 x ¹⁰ cells/well, and after 24 hours of culture (5% carbon dioxide, 37°C), the cells were washed once with phosphate buffer saline (-) (PBS (-)), and then DMEM medium (10% FBS) was added at 500 μl/well.
20 μl of an antibody Anti-DNP-IgE solution (25 μg/ml) was added, and the cells were cultured for 2 hours to sensitize them.
This was used as a control, a positive control, and a specimen, and 20 μl of DMEM (10% FBS) medium was added as a blank instead of the Anti-DNP-IgE antibody solution.

前記ＡｎｔｉＤＮＰ−ＩｇＥ溶液及び前記ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地を除去し、１．５ｍｌ／穴ＭＴＢｕｆｆｅｒで２回洗浄した。
検体にはマスリン酸又はマスリン酸含有抽出物を含むＭＴＢｕｆｆｅｒ溶液を５００μｌ／穴入れた。
Ｂｌａｎｋ、Ｃｏｎｔｒｏｌには、ＭＴＢｕｆｆｅｒのみを５００μｌ／穴入れた。
陽性対照には、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ溶液（５μＭ）を５００μｌ／穴入れた。 The Anti-DNP-IgE solution and the DMEM (10% FBS) medium were removed, and the plate was washed twice with 1.5 ml/well of MT Buffer.
As a sample, 500 μl/well of an MT Buffer solution containing maslinic acid or an extract containing maslinic acid was placed.
For blank and control, 500 μl/well of MT Buffer alone was added.
As a positive control, 500 μl/well of Wortmannin solution (5 μM) was added.

これらを、３７℃、二酸化炭素５％インキュベータで１０分間培養した。
Ｂｌａｎｋ以外には２０μｌ／穴となるように抗原のＤＮＰ−ＨＡＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）を加え、良く混合し、３７℃、二酸化炭素５％インキュベータで３０分間培養した。
培養上清を採り、Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔとした。
残った細胞に５２０μl／穴０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を入れ、氷上で５分間静置し、溶解したものをＣｅｌｌｌｙｓａｔｅとした。
Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ, Ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅをそれぞれ８０μｌ、９６穴マイクロプレートにとり、３７℃、５分間プレインキュベーションした。 These were then cultured in a 37° C., 5% carbon dioxide incubator for 10 minutes.
Except for the blank, 20 μl/well of the antigen DNP-HAS solution (5 μg/ml) was added, mixed thoroughly, and incubated at 37° C. in a 5% carbon dioxide incubator for 30 minutes.
The culture supernatant was collected and used as a Supernatant.
To the remaining cells, 520 μl/well of 0.1% Triton X-100 solution was added and allowed to stand on ice for 5 minutes to lyse the cells, which was used as a cell lysate.
80 μl of each of the Supernatant and Cell lysates was placed in a 96-well microplate and pre-incubated at 37° C. for 5 minutes.

これらに、１００μｌ／穴Ｐ−ニトロフェニル‐２‐アセトアミド‐２‐デオキシ‐β‐Ｄ‐グルコプラノシド（３．３ｍＭ）を加え、良く混合した後、３７℃、２５分インキュベーションした。
１００μｌ／穴グリシンバッファーを加えよく混合したのち、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。
試料抽出物が４０５ｎｍに吸収を持つ可能性があるため、別でＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔ及びＣｅｌｌｌｙｓａｔｅを採取しておき、反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際の吸光度を同時に測定し、以下の計算式でβ‐ヘキソサミニダーゼ放出率（％）を算出し、コントロールを放出率１００％としたときのサンプル添加時の放出率（％）を算出した。 To these was added 100 μl/well of P-nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopranosid (3.3 mM), which was then thoroughly mixed and incubated at 37° C. for 25 minutes.
Glycine buffer was added at 100 μl/well and mixed thoroughly, after which the absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader.
Since the sample extract may have absorption at 405 nm, a supernatant and cell lysate were separately collected, and the absorbance was measured simultaneously when the reaction stop solution was added followed by the substrate solution. The β-hexosaminidase release rate (%) was calculated using the following formula, and the release rate (%) at the time of sample addition was calculated when the control was taken as 100% release rate.

β‐ヘキソサミニダーゼ放出率（％）＝１００×〔（Ｓ−Ｓｃ）／｛（Ｓ−Ｓｃ）＋（ＣＬ−ＣＬｃ）｝〕
ＣＬ:Ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅの吸光度
ＣＬｃ:反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際のＣｅｌｌ
ｌｙｓａｔｅの吸光度
Ｓ:Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔの吸光度
Ｓｃ:反応停止溶液→基質溶液の順で加えた際のＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔの吸光度 β-hexosaminidase release rate (%)=100×[(S−Sc)/(S−Sc)+(CL−CLc)]]
CL: absorbance of cell lysate CLc: absorbance of cell lysate when reaction stop solution was added followed by substrate solution
Absorbance of lysate S: Absorbance of Supernatant Sc: Absorbance of Supernatant when reaction stop solution → substrate solution were added in that order

結果を図５に示す。
平均値は、Ｂｌａｎｋ４７．４％、Ｃｏｎｔｒｏｌ１００．０％、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ５１．８％、オリーブ抽出物（１００μg/ml）４０．４％、マスリン酸標準品（１００μＭ）８０．７％、マスリン酸標準品（２００μＭ）７３．２％、マスリン酸標準品（５００μＭ）３５．８％であった。
マスリン酸を含むオリーブ抽出物及びマスリン酸標準品はいずれも抗アレルギー効果を有することが確認できた。 The results are shown in Figure 5.
The average values were as follows: Blank 47.4%, Control 100.0%, Wortmannin 51.8%, Olive extract (100 μg/ml) 40.4%, Maslinic acid standard (100 μM) 80.7%, Maslinic acid standard (200 μM) 73.2%, Maslinic acid standard (500 μM) 35.8%.
It was confirmed that both the olive extract containing maslinic acid and the standard maslinic acid preparation had anti-allergic effects.

［実施例２］錠菓及び錠剤の製造
卵殻カルシウム１０８g、ピロリン酸第二鉄２ｇ、アスコルビン酸４０ｇ、微結晶セルロース４０ｇ、還元麦芽糖２８０ｇ、マスリン酸５ｇをミキサーによって常法により混合した後、打錠して錠菓及び錠剤を製造した。
[Example 2] Production of tablet confectionery and tablets 108 g of eggshell calcium, 2 g of ferric pyrophosphate, 40 g of ascorbic acid, 40 g of microcrystalline cellulose, 280 g of reduced maltose, and 5 g of maslinic acid were mixed in a mixer using conventional methods and then compressed into tablets to produce tablet confectionery and tablets.

Claims

A pharmaceutical composition for suppressing type I allergy, comprising maslinic acid as an active ingredient.