JP5568466B2 - インピーダンスバイオセンサー及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、センサー表面に直接的に結合された受容体分子が関与する生化学反応を直接
的にモニターするのに適したインピーダンスバイオセンサーの分野に関する。特に、本発
明は、２つの高導電性電極を分離する絶縁バリアの表面形態に関する。

免疫反応が介在する場合には、インピーダンスの測定値が、化学的修飾電極表面で発生
する生化学反応の記録に利用でき（バタイラード・Ｐ他「分析化学」１９８８年、６０：
２３７４−２３７９；Ｃ・ベルグレン、Ｂ・ブジャナンソン、Ｇ・ヨハンソン「電気分析
」２００１年、１３：１７３）、ＤＮＡのハイブリッド形成の直接的測定に利用できるこ
と（特許ＷＯ２００４０６５６２４；リィ・ＸＨ、リー・ＪＳ、クラーツ・ＨＢ“電極マ
イクロアレイを利用した一塩基不適合の電気化学検出”「分析化学」２００６年９月１日
、７８（１７）：６０９６−６１０１）は知られている。

測定感度を増強し、センサー要素を小型化する目的で、櫛状構造である２個の平坦電極
で形成されたインピーダンストランスジューサ（櫛状電極アレイ）が存在する（Ｐ・バン
ガーウェン他「センサーアクチュエータ・Ｂ」１９９８年、４９、７３；Ｗ・ローレイン
他「センサーアクチュエータ・Ｂ」２０００年、６８、３６０）（櫛状電極アレイ、ＩＤ
ＥＡ）。

図１では、トランスジューサの直交突起が図示されている。これは、絶縁基板（１）と
、２つの集電バー体（２）と（３）を含む。集電バー体は、櫛状電極を溶接接点（４）と
（５）に結合する。

インピーダンス測定の中心的な考えは、いくつもの特許において対処されてきた（ＷＯ
２００４０４４５７０、ＥＰ０５４３５５０、ＥＰ０２４１７７１、ＧＢ２１３７３６１
）。特に、図２で示すようなインピーダンスセンサーでは、一部の分子が電極表面で各対
の櫛状電極間に固定されるか、１対の櫛歯間の表面上に固定される。

これら分子は、サンプル溶液に曝露されると特定の分析対象物を“認識”する。この認
識プロセスは、一般的に、媒質の導電率及び/又は誘電率の変化をもたらす。これら変動
は、広周波数域でのインピーダンススペクトルの変化として記録される。最後に、２体の
電極間のインピーダンスを測定することで、等価電極回路のパラメータを調節する手段に
よって認識プロセスの規模が確立できる。これは、スペクトルの形状から除去される（図
３で概略的に図示）。

等価回路を形成する要素の物理的特徴は、以下の通りである。

Ｒ_Ｃ：結合スレッド、接点および集電バーの接触抵抗；
Ｃ_Ｇ：２電極と接触媒質（一般的に水溶液）の間で確立される幾何容量；
Ｒ_Ｓ：２電極間の水溶液の電気抵抗；
Ｃ_ＤＬ：相間電極/溶液の二重層容量；
Ｒ_ＣＴ：電極表面のファラデー処理による電荷移動抵抗；
Ｚ _Ｗ ：濃縮の追加分極化（ワールブルグインピーダンス）、電極表面の粗度及び/又
は電極表面の追加層存在。

電極上に固定センサーを備えたセンサーが提起する問題は、前述したごとく、良好な精
度と感度を備えた測定結果を得るには、導電性電極（図２Ｂの６）上の固定層が完璧に均質で無欠でなければならないが、これは、現実には達成が困難である。

前述のインピーダンスセンサーのパラメータは、櫛状電極の形態により変動する。すな
わち、各櫛歯の幅および櫛歯間隔（図２Ａのパラメータａとｂ）による。信号の大部分は
、ベルトル線（７）が概略的に示されている図２Ａに関して解説されているように、媒質
内へのその浸透が２体の隣接する櫛状電極の中央部間の距離と等しい電極の領域によるも
のである。生体分子の一般的な長さは、１０ｎｍから１００ｎｍの範囲である。このこと
は、分子が各対の櫛状電極間の空間に固定されている場合を暗示する。櫛歯の太さと櫛歯
電極間の距離は、非常に小さい必要がある。このことは、従来の超小型電子技術では達成
が困難である。

上記の困難性によって、これらセンサーを直接的な測定に利用しようとする場合には、
これらセンサーは、他の従来技術よりも低い感度を有する。

特許ＷＯ２００５０２６１７８およびＵＳ２００５１７６０６７で教示されているよう
に、櫛状電極アレイの感度を向上させるために、酸化還元種のプロダクションまたはレジ
ストレーションに基づいて、免疫（シー・ＭＨ、ペン・ＹＹ、ゾウ・Ｊ他“ヒト血清にお
ける肝臓線維症マーカの大量スクリーニングのためにシリコンチップ上に配置された超小
型電極に基づく免疫アッセイ”「バイオセンサー＆バイオエレクトロニクス」２００６年
６月１５日、２１（１２）：２２１０−２２１６）、ＤＮＡ（Ｖ・ダルマン他“電気化学
酸化還元プローブを利用した櫛状超小型電極に対するオリゴヌクレオチドハイブリッド形
成のラベルを使用しないインピーダンス検出”「バイオセンサー＆バイオエレクトロニク
ス」２００５年、２１：６４５から６５４）またはＲＮＡ（エルショルツ・Ｂ、ワール・
Ｒ、ブローム・Ｌ他“超小型電気アレイを利用したバクテリアＲＮＡの自動検出および定
量化”「分析化学」２００６年７月１５日、７８（１４）：４８９４から４８０２）のた
めに間接分析が利用された。

これらセンサーの電気化学感度を向上させるため、三次元櫛状電極の利用が提案された
。これは、３０μｍ厚の金属電極を含んでいる（ホンダ・Ｎ、イナバ・Ｍ、カタギリ・Ｔ
他“３Ｄ櫛状電極を利用した高効率電気化学免疫センサー”「バイオセンサー＆バイオエ
レクトロニクス」２００５年５月１５日、２０（１１）：２３０５から２３０９）。

インピーダンス感度を向上させる別の方法は、特許ＵＳ２００２２１５０８８６および
ＷＯ２００５００１４７９で開示されているように検出対象である分子に結合した金属粒
子またはポリマー粒子を利用する（ワング・ＪＢ、プロフィット・ＪＡ、プギア・ＭＪ他
“バイオセンサーにおけるインピーダンスとキャパシタンス信号増幅のための金ナノ粒子
共役”「分析化学」２００６年３月１５日、７８（６）：１７６９から１７７３）。マー
キングされた分子とセンサーに固定された受容体の間の相互作用は、増強された電界との
干渉をもたらし、その結果、感度の向上が得られる。

特許ＵＳ６４４０６６２においては、金属シートで部分的に被覆された通路により形成
され、金属表面層と共にセンサー電極を形成する三次元ＩＤＥＡセンサーが教示されてい
る。この形態は、分析された電界の再分布およびセンサー感度の向上を提供する。

本発明の１目的は、サンプル内の分析対象物の存在を直接的に判定するために有用なインピーダンスバイオセンサーの利用であり、以下の要素を含む（図４参照）：
ｉ）絶縁基板（８）または絶縁層による被膜；
ｉｉ）基板上に高導電性材料で形成され、各対の櫛歯が分離されている少なくとも１
対の化学的に不活性である櫛状電極（９と１０）；
ｉｉｉ）絶縁材料製のバリア（１１）であって、溶接点（１３と１４）が内部方向に開
いている１対の隣接櫛状電極の中央部間の距離と高さが類似；
ｉｖ）絶縁材料表面上または電極表面上に化学的に固定された受容体分子（１２）。

本発明の１特殊目的は、要素（ｉ）の絶縁基板がポリマー、ガラスまたは無機酸化物で
製造されている本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明は、それらに限定されない。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉ）の基板が絶縁材料ではなく、二酸化ケイ素若しくはポリマーの絶縁層または誘電層を含んでいる本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定はされない。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉ）の高導電性で不活性である電極が、好適にはＰ
ｔ、ＰｄおよびＡｕのごとき金属、酸化物、Ｓｉ、多結晶シリコン、ケイ化タンタルある
いはポリマー導電体に属する材料である本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定はされない。

本発明の別な特殊目的は、電極が０．５μｍから１０．０μｍの幅と間隔の櫛歯を有し
ている本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉｉ）の絶縁バリアが、無機酸化物、ポリマーおよ
びＵＶ光に敏感な材料である本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明は、それらに限定されない。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉｉ）の絶縁バリアが、絶縁層の厚みを特徴として
いる本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。この厚みは、２体の隣接櫛歯を分離するバリアの高さである。すなわち、１対の連続櫛状電極の中央部を分離する距離の５０％から１５０％であり、好適に１００％である。

本発明の別な特殊目的は、ＡＣ電圧が印加される（ｉｉ）の電極の電気特性を検出し、
バリアの表面に近接する電界の変動を検出する装置と、その電圧を印加する装置とをさら
に含んでいる本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。

本発明の別な特殊目的は、生体サンプルで発見される分析対象物または分子の利用を特
徴とする本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。

本発明の１目的は、新規な電気化学インピーダンスバイオセンサー並びに分析対象サンプル内における分子構造物また分析対象物の存在あるいは不在を判定することができる方法の提供である。

本発明は、その作用原理が、２つの電極間で発生する電界と、センサー表面の受容体分
子または固定センサーとの溶液内のサンプルからの分析対象物の反応により形成される分
子構造との間で発生する干渉に基づいて新規で非常に高感度である電気化学センサーを構
築することができるという実験結果に基づいており、そこでは非常に高導電性である電極
は絶縁材料のバリアで分離されている（例１から３参照）。

分子相互反応で起きる生化学反応は、イオン電荷分布に影響を及ぼす。よって、バリア
表面に近接した層の電気特性に影響を及ぼす。ＡＣ電圧が検出装置を介して電極に印加さ
れ、発生するインピーダンス変化が検出される。

絶縁バリアの存在のために、電極間を流れる電流のほとんどはバリアの表面に非常に近
い薄層内を通過する。よって、生化学プロセスで誘導されるインピーダンス変化に対する
感度が向上する。

特に、それが電圧差であろうと電流差であろうと、本発明のセンサーの溶接点（１３）
と（１４）に電気信号が適用されると（図４Ａ）、一連のベクトル線（７）を発生させる
電界が出現する（図４Ｂ）。もし、検出対象の分子または分析対象物がサンプル溶液内で
発見されれば、それらは、受容体分子またはセンサー（１２）に結合し、バリア表面に近
接する電界に大きな変動をもたらす。

図２Ｃの構成における変動はずっと小さい。この変動は、特定の周波数及び/又は適し
たＤＣ極性でのインピーダンス測定によって定量化できる（例２と３参照）。

従って、本発明の１目的は、サンプル内における分析対象物の存在を直接的に確認させ
る有用なインピーダンスバイオセンサーによって達成される。本発明のインピーダンスバイオセンサーは、以下の要素を含む（図４参照）：
ｉ）絶縁基板（８）または絶縁層による被膜で覆われた非絶縁性基板；
ｉｉ）前記絶縁基板（８）または前記絶縁層による被膜で覆われた非絶縁性基板上に高導電性材料で形成され、各対の櫛歯が分離されている少なくとも１対の化学的に不活性である櫛状電極（９と１０）であって、該１対の櫛状電極（９と１０）の櫛歯は、互いに対向した位置関係で、かつ、各対の櫛歯が交互に噛み合っている櫛状電極（９と１０）；
ｉｉｉ）前記１対の櫛状電極（９と１０）の櫛歯が交互に噛み合った位置関係でそれぞれの櫛歯間に位置する絶縁材料製のバリア（１１）であって、各バリア（１１）の高さは、隣接する櫛状電極の中央部間距離と類似し、その溶接点（１３と１４）は、前記絶縁材料製のバリア（１１）の形成材料である絶縁体（１５）が、該絶縁体（１５）の表面から内部方向に向かって除去されることにより凹部が形成されているバリア（１１）；
ｉｖ）絶縁材料表面上に化学的に固定された受容体分子（１２）；
（ｖ）前記１対の櫛状電極（９と１０）の隣接する櫛歯間は、前記バリア（１１）によって絶縁状態に分離されているが、各櫛歯の上部は、前記バリア（１１）によって覆われていないこと。

本発明の受容体分子は、サンプルの他の分子または分析対象物と反応して錯体（複合物
）を形成及び/又は二次反応を誘起することができる機能的に特定される分子であると理
解される。１例として、受容体分子は、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ断片、ＲＮ
Ａ断片、またはオリゴヌクレオチドである。

溶液またはサンプル内で確認される分析対象物または分子は受容体分子と結合または反
応可能な、サンプル内に存在するどのような分子であってもよい。それら分析対象物は、
例えば、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、
または真核生物や原核生物のごとき異なるタイプの完全細胞等であるが、これらに限定さ
れない。

受容体分子と分析対象物との間の結合は、例えば、サンプル内での分析対象物特定作業
において（好適には臨床生物学または獣医生物学、栄養学または環境起源、等々）単ＤＮ
Ａ及び/又はＲＮＡ鎖、抗原/抗体および酵素/基板反応のハイブリッド形成において発生
する。

ベース層と呼ばれる要素（ｉ）の絶縁基板は、異なる種類の材料でもよい。例えば、結晶ウェハー（水晶、シリコン、サファイア）、アモルファス材料（ガラス）、ポリマー（ＰＭＭＡ、ＰＣＣ、ＰＥＥＫ、ＰＶＥ、ＰＥＩ）またはＡｌ_２Ｏ_３のごときセラミック厚層でよい。

基板が絶縁性ではない場合、絶縁誘電層がその表面に形成されなければならない。この
絶縁層は、ポリイミドまたはＢＣＢのごときポリマー材料、あるいはＬＰＣＶＤやＰＥＣ
ＶＤ技術で堆積されるＳｉ_３Ｎ_４のごとき無機材料、またはシリコンウェハー上に堆積されるか熱的に成長するＳｉＯ_２層でよい。

本発明の１特殊目的は、要素（ｉ）の絶縁基板がポリマー、ガラスまたは無機酸化物で
製造されている本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定されない。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉ）の基板が絶縁材料ではなく、二酸化ケイ素若しくはポリマーの絶縁層または誘電層を含んでいる本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定はされない。

要素（ｉｉ）の櫛状電極は、良好な導電性である材料層が、好適には蒸着処理によって誘電層状に堆積されて形成される。電極の形態は、リトグラフ技術および引き続く直接エッチングまたはリフトオフ技術により定義される。

各対の櫛状電極間の幅と分離距離（図１Ａではパラメータａとｂ）は、好適にはミクロ
ン単位であるが、サブミクロン単位でも構わない。良好な導電体であり、溶液と反応しな
いならばどのような材料であっても電極の形成に使用できる。本発明の範囲は、限定しな
いが、電極特性を変更するような反応が発生しない限り、Ｐｔ、Ｐｄ、ＡｕまたはＳｉの
ごとき材料、シリコン多結晶体、ケイ化タンタルあるいはポリマー導電体が利用できる。
導電層の厚みは、非常に大きいものでもよいが、生化学センサーとして利用するには約１
５０ｎｍの厚みが好適である。

層の堆積は、熱蒸着、陰極スパッタリング、電子銃または導電材料の層を製造できるど
のような他の知られた技術を利用してもよい。これらは専門家の技術範囲である。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉ）の高導電性で不活性である櫛状電極が、好適にはＰｔ、ＰｄおよびＡｕのごとき金属、酸化物、Ｓｉ、多結晶シリコン、ケイ化タンタルあるいはポリマー導電体に属する材料である本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定はされない。

本発明の別な特殊目的は、櫛状電極が０．５μｍから１０．０μｍの幅と間隔の櫛歯を有している本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。

インピーダンスセンサーと外部測定回路（例：インピーダンス材料）との間の確実な接
続を得るためには、溶接点（１３）と（１４）を準備し、以下で解説するように製造工程
を実行することが必要である。

その構造パターンが決定されたセンサー表面に金属層が積層される。この積層には、コ
ントラストマスキングとフォトリトグラフ処理および従来のエッチング処理が利用される
。溶接点の金属は、導電性電極を形成するように良好なスレッド溶接と、その下側の材料
との低接触抵抗を保証する限りいかなる金属であっても良い。例えばこの金属はアルミニ
ウムである。

それぞれの対の櫛状構造である隣接電極間の誘電バリア（１１）は、絶縁材料（１５）の層を堆積する手段によって作成される。この絶縁材料層は、フォトリトグラフＵＶ処理とエッチング（主として深い反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ））の手段によって金属電極（櫛歯）および溶接点の上で除去される。絶縁層の厚みはバリアの高さであり、このバリア（１１）は２つの隣接櫛歯を分離し、その対の隣接櫛歯電極の中央間距離の１００％に等しい。

同様に、２連続櫛歯の中心間距離の５０％から１５０％の高さのバリアも可能であると
同時にこの範囲以下または以上であっても可能である。分析対象溶液との接触防止が必須
である集電器バリア（図１の２）を除いて、本発明においてはセンサーの表面の他部分に
絶縁層を維持することは必須ではない。

バリア（１１）を形成する誘電材料はいかなる絶縁材料であっても構わない。しかし、技術的理由により、ＬＰＣＶＤで得られる二酸化ケイ素が好適である。なぜなら、この材料は容易に除去できるからである。

エッチング処理後に製造されるバリア形状もさほど重要ではない。なぜなら、バリアは
方形でも構わず、傾斜壁または垂直壁を備えることができ、それらの上部は平坦であって
も丸形であってもよいからである。

異なる電極を分離するバリアを製造するため、上記以外に従来技術に従って、本発明の
範囲内で他の方法も利用できる。従って、ＵＶ光に敏感な材料がバリアの形成に利用でき
る。毛細管ミクロ成型、レプリカ成型、溶剤利用ミクロ成型、等々であるミクロ成型（超
小型成型）技術も活用できる。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉｉ）の絶縁バリアが、無機酸化物、ポリマーおよ
びＵＶ光に敏感な材料である本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用であるが、本発明はそれらに限定されない。

本発明の別な特殊目的は、要素（ｉｉｉ）の絶縁バリアが、絶縁層の厚みを特徴として
いる本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。この厚みは、２体の隣接櫛歯を分離するバリアの高さである。すなわち、１対の連続櫛状電極の中央部を分離する距離の５０％から１５０％であり、好適には１００％である。

要素（ｉｖ）の受容体分子（図４Ｃの符号１２）は、従来の分子固定方法によって絶縁バリア（１１）の表面に固定できる。本発明を限定するものではないが、例えば、エポキシドやカルボジイミドによる結合、還元精製による結合、シアノゲンブロミド、スクシンイミド、カルボジイミダゾール、塩化トレシルおよび塩化トシル、塩化ジビニル、マレイミド、ヒドラジド、イソ（チオ）シアネートによる結合、および好適にはアミノシラン、エポキシドシラン、チオシアネートおよびイソチオシアネートシラン、無水琥珀酸シラン、スルフィドリルシランおよびカプロラクタムシランによるシアン化による結合である。

受容体分子（１２）とは、分析対象生体サンプル内に存在する対応分析対象物と結合することができる生体分子である。本発明の別なセンサー形態は、要素（ｉｖ）の受容体分子が電極表面で固定されたものである。

解説した技術方法は、従来の超小型電子技術を利用と相俟ってセンサーの超小型化を可
能にし、単体である基板上に造り付けセンサーアレイの構築を可能にする。

解説した方法による造り付けセンサーアレイは、マイクロ診断用の装置の製造を可能に
する。これら造り付け装置は複数のパラメータを同時的に検出させるため、マルチパラメ
ータ分析と呼称される。このことは、サンプルが小さい場合にスクリーニングアッセイを
望むように状況において特に重要である。

本発明の別特殊目的は、電極が櫛状アレイで構成されている本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。

受容体分子と分析対象物との結合が発生したときのインピーダンスバイオセンサー電界の変動は、適した周波数及び/又はＤＣ分極化におけるインピーダンス測定により定量化が可能である。インピーダンス分析は好適な電気測定である。なぜなら、ＤＣ分極化を含んでも含まなくても、あるいは両方の技術を組み合わせてもこのインピーダンス分析は周波数の所定範囲で、抵抗、容量、誘電及び/又はリアクタンスの損失の測定を可能にするからである。

本発明の別特殊目的は、要素（ｉｉｉ）の電極に接続された電気特性を検出する装置を
さらに備えた本発明のインピーダンスバイオセンサーの利用である。その装置にはＡＣ電圧が印加され、バリア表面に近接した電界の変動を検出する。このインピーダンスバイオセンサーはその電圧を印加させる装置をさらに含む。

本発明の１特殊実施形態は、検出装置がセンサーの電極間のインピーダンスを測定する
インピーダンスメータである本発明のインピーダンスバイオセンサーである。

本発明の別特殊実施形態は、複数の生体分子センサーを含む本発明のインピーダンスバイオセンサーである。それらは、例えば、核酸（例：プローブまたはオリゴヌクレオチド）、抗原、抗体、酵素、タンパク質、またはペプチド等である異なる種類の生体分子であろうと、あるいは同一種類の分子であろうと、それらは１以上の異なる標的分子に向かう。

本発明の別特殊目的は、生体サンプル内に発見される分析対象物または分子のバイオセ
ンサーの利用である。

前述したように、分析対象物とは、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ
断片、オリゴヌクレオチド、あるいは、真核生物または原核生物のごとき異なる種類の完
全細胞であるがこれらには限定されない。それらの特定は、例えば、ヒトまたは動物の病
気の診断、環境分析、法医学分析、等々の分野において重要である。

櫛状電極アレイ（ＩＤＥＡ）と称される２つの共面櫛状電極を備えた従来のインピーダンストランスジューサ図である。 このトランスジューサは、絶縁基板（１）、櫛状電極（２’と３’）に接続する２体の集電バー（２）と（３）、および溶接点（４）と（５）を備える。 図１で図示されているトランスジューサの断面図である。 （Ａ）幅が“ｂ”であり、電極間距離が“ａ”であり、電界（７）のベクトルを有する櫛状電極（２’と３’）が図示されている。電界のさらに高い強度は、装置表面に配置された２体の隣接電極（ａとｂ）の中央間距離に等しい距離範囲で囲まれている。 （Ｂ）櫛状電極上で固定された受容体分子（６）の例である。 （Ｃ）櫛状電極間で固定された受容体分子（６）の例である。 櫛状電極アレイに等価である電気回路図である。 この等価回路を形成する要素の物理的特徴は、次の通りである： Ｒ_Ｃ：結合スレッド、接点および集電バーの接触抵抗； Ｃ_Ｇ：２電極と接触媒質（一般的に水溶液）の間で確立される幾何容量； Ｒ_Ｓ：２電極間の水溶液の電気抵抗； Ｃ_ＤＬ：相間電極/溶液の二重層容量； Ｒ_ＣＴ：電極表面のファラデー処理による電荷移動抵抗； Ｚ _Ｗ ：濃縮の追加分極化（ワールブルグインピーダンス）、電極表面の粗度及び/又は電極表面の追加層存在。 このうち図４Ａは、本発明のインピーダンスバイオセンサーの斜視図である。インピーダンスバイオセンサーは、非常に良好な導電材料で成り、絶縁バリア（１１）で分離された１対の櫛状電極（９）と（１０）が両側に提供されている絶縁層が被膜されている基板（８）（高さが２体の電極櫛歯の中央部間距離に等しい）を備えている。これら櫛歯間に絶縁バリアを形成する材料は、良好な絶縁体（１５）であり、溶接点（１３と１４）はその方向に開いている。 図４Ｂは、図４Ａの装置の断面図である。基板（８）、電極（９と１０）、それら電極を隔てるバリア（１１）と電界（７）のベクトルが図示されている。 図４Ｃは、図４Ａで図示する装置の断面図である。バリア表面で固定された受容体分子（１２）の層を含む。 スルファピリジン溶液に対するＥＬＩＳＡ免疫アッセイ（破線）および本発明の免疫センサー（赤線）のキャリブレーション曲線図である。 実験の別々の時間で測定されたインピーダンススペクトルを調整する手段により、図３で示す等価回路で発生するパラメータＲ_ＳとＲ_ＣＴである。

発明インピーダンスセンサーの製造
本発明の実施例の開始材料は、シリコンウェハーであった。それを基板としてのみ使用
する場合には、その物質のタイプや使用量は重要ではなく、導電率や結晶方位性も重要で
はない。そのシリコンウェハーは、９５０℃での湿潤酸化法により熱的に酸化され、良好
な誘電特性を備えた２５００ｎｍの二酸化ケイ素層が形成された。

次のステップは、マグネトロンによる陰極スパッタリングの手段で厚みが２３０ｎｍで
あるケイ化タンタル層を堆積することであった。

最初のフォトリトグラフ処理段階で、集電バーと２体の電極櫛歯が提供された。形状化
は、反応性イオンエッチング技術によってなされた。その結果、２１６本の櫛歯を有する
アレイが製造された。その櫛歯は、それぞれ３．０μｍの厚さであり、他は隣接櫛歯間距
離が３．０μｍであった。電極間の開口は、１．４ｍｍであり、各電極の全長は、３０１
．０ｍｍであった。

溶接点は、１．０μｍのアルミ層を堆積することで形成された。集電バーの両端でのそ
の堆積は、従来のフォトリトグラフとエッチング技術を利用した手段により実行された。

最終ステップは、絶縁バリアの作成であった。このためウェハー表面は、ＬＰＣＶＤで
堆積された４．０μｍの酸化ケイ素層で被覆された。

フォトリトグラフおよびエッチングが再び利用され、溶接点を除いて、櫛歯間に材料を
残すパターンを作成し、集電バーを被覆した。この層除去は、深い反応性イオンエッチン
グ（ＤＲＩＥ）技術で実施された。これは、ほぼ垂直な壁を有したバリアを提供した。こ
の特殊形態の場合、このバリアの高さは、２体の隣接櫛歯間距離の約６７％であった。

ウェハーが切断されると、個々の装置は、ＰＣＢ基板に接着され、インピーダンスメー
タとの電気的接続のためにスレッドが溶接された。

免疫センサーとしての発明センサーの利用
機能付与に進む前に電極は、７０％の無水エタノールと３０％のミリＱ水の溶液で洗浄
された。その後、電極は、２．５％のＮａＯＨとミリＱ水の溶液に１０分間浸され、Ｎａ
ＯＨの作用を中和させるために１００ｍＬのミリＱ水で濯がれた。最後に、それら電極は
、エタノールで洗浄され、窒素流で乾燥された。

電極は、２．５％の無水エタノールのＧＰＴＳ（３−グルシドキシプロピル）トリメト
キシシラン溶液内に３時間、常温にて浸され、軌道撹拌された。その後、電極は、エタノ
ールで洗浄され、窒素流で乾燥された。

電極櫛歯上の抗原の共有結合固定は、炭酸バッファ溶液（ｐＨ＝９．６）内の２ｄ−Ｂ
ＳＡ（０．８μｇ/ｍｌ、３００μＬ）抗原溶液を使用して実行された。反応は２４時間
、２５℃にて維持され、軌道撹拌された。余剰液は、電極をＰＢＳＴバッファで洗浄する
ことで（４回、１０００μＬ/電極）で除去され、乾燥窒素流で乾燥された。

生体分子受容体（抗体）は、ファミド類から抗生物質の分析用に設計され、製造された
。生物受容体の準備は、分子モデル化法を利用して免疫不完全抗原（ハプテン）を設計す
る手段によって取り組まれた。

これら研究の結果、２個のハプテンまたは抗原の合成が提案された。

一方（ハプテン１）は、スルファミド構造の大部分を占め、他方（スルプテン２）は、
ほんの一断片であり、この種類の抗生物質化合物の大部分に共通する部位を保存した。こ
れら２つのハプテンは、従来方法に従ってＨＣＨ（カブトガニヘモシアニン）タンパク質
およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）タンパク質に組み合わされた。

これらハプテンまたは抗原の共有結合と、タンパク質に結合された抗原の残物の数の定
量化は、質量分析器により実施された。その後、ニュージーランド種のウサギが６ヶ月間
の免疫プロトコールによりこの抗原で免疫化された。その間、免疫反応の進行は、少量の
血液サンプルを得ることでモニターされた。

スルフォンアミドタイプの抗体によって製造される抗血清剤の親和性を評価するには、
競合タイプの免疫化学アッセイを確立することが必要であった。このため、８つの競合ハ
プテン（ＳＡ−３−１０）の準備が提案された。これらは、抗体の製造に使用されるハプ
テンまたは抗原と化学的に類似した構造であったが、幾分かの構造修飾または分子の異な
る部位に位置するスペーサアームが必要であった。

当初は、これらのハプテンは、酵素ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）を備えた酵素ト
レーサを準備するのに使用された。直接ＥＬＩＳＡフォーマットでのこれら酵素トレーサ
を使用した予備研究では、スルファピラジン等の抗体によっては９μｇＬ−１に近いＩＣ
５０で認知できた。

ＰＢＳＴ（ＰＥＳＴ内の０．６４ｎＭから５００００ｎＭ）で準備されたスルファピリ
ジン様式の溶液が電極（１５０μＬ/電極）に加えられ、その後に得られた特殊スルファ
ミド抗血清剤（＃１５５）（ＰＢＳＴ内の１/２０００、１５０μＬ/電極）の溶液が加え
られた。

常温で３０分間培養した後に、電極は、ＰＢＳＴ（３回、１０００μＬ/電極）と、ミ
ルＱ水（１回、１０００μＬ/電極）で洗浄された。この反応は、低導電溶液内で測定さ
れた。

キャリブレーション曲線は、４つのパラメータで次の式に調整された。

（式） Ｙ＝｛（Ａ−Ｂ）/［１＋（ｘ/Ｃ）^Ｄ］｝＋Ｂ
（Ａは最大吸収率、Ｂは最少吸収率、Ｃは最大値の５０％である吸収率を提供する濃度、
ＤはＳ状曲線の湾曲点の傾斜度）。

これらの値は、キャリブレーション曲線の調整に使用された４つのパラメータにより
式から得られた値である。

表１で示されるデータは、免疫酵素アッセイＥＬＩＳＡと、インピーダンス免疫センサ
ーのパラメータ特性を表す。ＩＣ５０は、感度を表した。このとき、アッセイの最も高感
度である値は、最少である。

免疫センサーのＩＣ５０とＥＬＩＳＡの値を比較すると、それらが同じ大きさの特性に
よるものであり、本発明の免疫センサーが感度に関しては、ＥＬＩＳＡアッセイと同様に
振舞うことが確認された。

別な重要なパラメータは、最大信号と最小信号との関係であった。本発明の装置では、
値が大きいほど、反応は良好である。

本発明の免疫アッセイと、ＥＬＩＳＡアッセイとを比較すると、ＥＬＩＳＡよりも優れ
た反応が免疫アッセイからあったことが判明した。最後に、重要な情報としてＲ^２が提供
された。これは、前述のＳ状曲線に対する実験データの調整程度を示したが、結局は同一
であった。

ＤＮＡバイオセンサーとしての発明センサーの利用
機能付与に進む前に、電極は、７０％の無水エタノールと３０％のミルＱ水の溶液で洗
浄された。その後、電極は、２．５％のＮａＯＨとミリＱ水の溶液に１０分間浸され、Ｎ
ａＯＨの作用を中和させるために１００ｍＬのミリＱ水で濯がれた。最後に、電極は、エ
タノールで洗浄され、窒素流で乾燥された。

電極は、２．５％の無水エタノールのＧＰＴＳ（３−グルシドキシプロピル）トリメト
キシシラン溶液に３時間、常温で浸され、軌道撹拌された。その後、電極は、エタノール
で洗浄され、窒素流で乾燥された。

２０対の塩基の単一オリゴヌクレオチド鎖が電極表面に配位５’でアミノ基によって固
定された。これら電極は、炭酸バッファ８ｐｈ−９．６９内で２０対の塩基のオリゴヌク
レオチドを含む溶液（１０μｇ/ｍｌ、３００μＬ）に浸された。

２４時間の反応後に、電極は、ＰＢＳＴバッファで洗浄され（４回、１０００μＬ/電
極）、窒素流で乾燥された。

オリゴは、２０以下：５’−アミノヘキシル−ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣ
Ａ ＴＣＧ ＡＧ−３’であり、２０以上：５’−フルオレセイナヘキシル−ＣＴＣ Ｇ
ＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＡＣＴ ＣＧ−３’であった。

オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成が配位５’でフルオレセインにマーキングされ
た相補２０塩基対のオリゴヌクレオチドによりバッファ溶液内にて実行された。

電極は、相補オリゴヌクレーチドを含む溶液（１０μｇ/ｍｌ、３００μＬ）に浸され
、５分間常温で培養された。その後、電極は、ＰＢＳＴバッファ（１０００μＬ/電極）
で洗浄され、乾燥窒素流で乾燥された。ハイブリッド形成プロセスは低導電性溶液内にて
測定された。

表示値（ＲｓとＲｃｔ）から理解されようが、表面の当初固定オリゴヌクレオチド鎖に
よる本発明のセンサー装置と、相補的であるハイブリッド化オリゴヌクレオチド鎖による
同一装置との間には大きな変化が存在する。

この観察される相違は、本発明のセンサーがオリゴヌクレオチド鎖のハイブリッド形成
を区別するのに使用が可能であることを示した。

Claims (14)

1. サンプル内における分析対象物の存在如何を直接的に判定するインピーダンスバイオセンサーであって、以下の要素である、
   （ｉ）絶縁基板（８）または絶縁層による被膜で覆われた非絶縁性基板と、
   （ｉｉ）前記絶縁基板（８）または前記絶縁層による被膜で覆われた非絶縁性基板上に高導電性材料で形成されている少なくとも１対の化学的に不活性である櫛状電極（９と１０）であって、該１対の櫛状電極（９と１０）の櫛歯は、互いに対向した位置関係で、かつ、各対の櫛歯が交互に噛み合っている櫛状電極（９と１０）と、
   （ｉｉｉ）前記１対の櫛状電極（９と１０）の櫛歯が交互に噛み合った位置関係でそれぞれの櫛歯間に位置する絶縁材料製のバリア（１１）であって、各バリア（１１）の高さは、隣接する櫛状電極の中央部間距離と類似し、その溶接点（１３と１４）は、前記絶縁材料製のバリア（１１）の形成材料である絶縁体（１５）が、該絶縁体（１５）の表面から内部方向に向かって除去されることにより凹部が形成されているバリア（１１）と、
   （ｉｖ）前記絶縁材料製のバリア（１１）表面上に化学的に固定された受容体分子（１２）と、
   を含み、
   （ｖ）前記１対の櫛状電極（９と１０）の隣接する櫛歯間は、前記バリア（１１）によって絶縁状態に分離されているが、各櫛歯の上部は、前記バリア（１１）によって覆われていないことを特徴とするインピーダンスバイオセンサー。
2. 受容体分子は、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片およびオリゴヌ
   クレオチドで成る群に属していることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
3. 要素（ｉ）の絶縁基板（８）は、ポリマー、ガラスおよび無機酸化物で成る群に属していることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
4. 要素（ｉ）の絶縁基板（８）は、絶縁材料ではなく、二酸化ケイ素若しくはポリマーに属する絶縁層または誘電層による皮膜で覆われていることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
5. 要素（ｉｉ）の高導電性で不活性である櫛状電極（９と１０）は、金属、酸化物、Ｓｉ、多結晶ケイ素、ケイ化タンタルおよびポリマー導電体で成る群に属する材料であることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
6. 電極は、０．５μｍから１０．０μｍの幅と櫛歯間距離を有した櫛歯を有していること
   を特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
7. 要素（ｉｉｉ）の絶縁材料製のバリア（１１）は、無機酸化物、ポリマーおよびＵＶ光に高感度である材料で成る群に属する材料であることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
8. 要素（ｉｉｉ）の絶縁材料製のバリア（１１）は、絶縁層の厚みを特徴とし、該厚みは、２体の櫛歯を分離するバリア高さを与えるものであり、該バリア高さは、連続的櫛状電極の中央部を分離する距離の５０％から１５０％の範囲内であることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
9. 要素（ｉｖ）の受容体分子（１２）は、電極の表面に固定されることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
10. 櫛状電極（９と１０）は、櫛状アレイ状に構成されていることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
11. 要素（ｉｉ）の櫛状電極（９と１０）に接続されている電気特性を検出する装置をさらに含んでおり、
    該装置には、ＡＣ電圧が印加され、バリアの表面に近接する電界の変動を検出するもの
    であり、また、該電圧を印加する装置をさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載
    のインピーダンスバイオセンサー。
12. 検出装置は、センサーの電極間のインピーダンスを測定するインピーダンスメータであることを特徴とする請求項１１記載のインピーダンスバイオセンサー。
13. 複数の生体分子センサーを含んでいることを特徴とする請求項１記載のインピーダンスバイオセンサー。
14. 生体サンプル内にて発見される分析対象物または分子の特定のための請求項１から１３
    のいずれかに記載のインピーダンスバイオセンサーを用いた装置。
    

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