JP5604782B2 - Receptor reconstructed product and disease test method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、ＬＯＸ−１変異体−界面活性剤複合体およびＲＡＧＥ変異体−界面活性剤複合体、ならびにこれらを用いて生活習慣病危険因子などを検出する方法に関する。 The present invention relates to a LOX-1 mutant-surfactant complex and a RAGE mutant-surfactant complex, and a method for detecting lifestyle-related disease risk factors using these.
レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：本明細書中以降、ＬＯＸ−１ともいう）は、アテローム発生の原因となる酸化ＬＤＬ（本明細書中以降、ＯｘＬＤＬともいう）のような変性ＬＤＬに対する特有のスカベンジャー受容体であり、１９９７年に、培養ウシ大動脈内皮細胞において初めて同定された。ＬＯＸ−１は、他のスカベンジャー受容体と機能的には類似しているにもかかわらず、構造的には異なる独特の構造を有している。 Lectin-like oxidized low density lipoprotein (LDL) receptor 1 (Lectin-like Oxidized LDL receptor: hereinafter referred to as LOX-1) is an oxidized LDL (hereinafter referred to as LOX-1) that causes atherogenesis. A unique scavenger receptor for denatured LDL (also referred to as OxLDL) and was first identified in 1997 in cultured bovine aortic endothelial cells. Although LOX-1 is functionally similar to other scavenger receptors, it has a unique structure that is structurally different.
ウシＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａ（１３９位および１８３位の糖鎖付加により、分子量約４０ｋＤａ）のＩＩ型膜タンパク質である。この受容体は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメイン（本明細書中以降、ＣＴＬＤという）からなる。このＣＴＬＤは、種間で、特に、６個のシステイン残基の位置で高度に保存されており、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインである。このＣＴＬＤ中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の分子内ジスルフィド結合に関与している。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、Ｘｉｅら（非特許文献１：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３２：６８−７４（２００３））によれば、ＣＴＬＤが変性ＬＤＬを結合するのに十分な最小ドメインであり、たとえＣＴＬＤがグリコシル化されていなくても、変性ＬＤＬを認識および結合できることが明らかにされた。 Bovine LOX-1 (bLOX-1) is a glycoprotein consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family and having a molecular weight of about 50 kDa, the N-terminus is in the cytoplasm, and the C-terminus is outside the cell membrane. A single-penetration type II membrane protein. Human LOX-1 (hLOX-1) is also a type II membrane protein of about 30 kDa consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family (molecular weight of about 40 kDa due to addition of sugar chains at positions 139 and 183). This receptor is structurally composed of the following four domains: an N-terminal cytoplasmic domain, a hydrophobic transmembrane domain, a neck domain, and a C-type lectin-like domain (hereinafter referred to as CTLD). . This CTLD is highly conserved among species, particularly at the position of 6 cysteine residues, and is a functional domain for recognizing LOX-1 ligands. Six cysteine residues in this CTLD are involved in the intramolecular disulfide bond of hLOX-1. In addition to this conserved CTLD, neck domains in hLOX-1 and other known species have high sequence identity. According to Xie et al. (Non-patent Document 1: Protein Expression and Purification 32: 68-74 (2003)), CTLD is a minimal domain sufficient to bind denatured LDL, even if CTLD is glycosylated. It has been shown that denatured LDL can be recognized and bound without it.
これまでの研究により、ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージおよび活性化血管平滑筋細胞において発現されており、構造的に関連性のない種々の高分子（変性ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、および血小板があげられる）を認識し、生体防御機構や炎症性機転などの種々の生命現象において重要な役割を果たしていること、そしてその発現は種々の条件下で、高脂血症、糖尿病、高血糖、高血圧症、高血圧性腎硬化症、動脈硬化、虚血再灌流傷害、血管バルーン傷害後のような病態；ならびに酸化ＬＤＬ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン、ＴＮＦ−α、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）、ＴＧＦ−β、８−イソ−プロスタグランジンＦ２α、ズリ応力のような刺激によって、調節されていることが分かっている（非特許文献２：Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ． １２７，１０３−１０７（２００６））。 According to previous studies, LOX-1 is expressed not only in vascular endothelial cells but also in macrophages and activated vascular smooth muscle cells, and various structurally unrelated macromolecules (modified LDL, bacteria, aging) Erythrocytes, cells undergoing apoptosis, and platelets), and plays an important role in various biological phenomena such as biological defense mechanisms and inflammatory mechanisms, and its expression is under various conditions, Conditions such as hyperlipidemia, diabetes, hyperglycemia, hypertension, hypertensive nephrosclerosis, arteriosclerosis, ischemia-reperfusion injury, vascular balloon injury; and oxidized LDL, angiotensin II, endothelin, TNF-α, advanced glycation products (AGE), TGF-β, 8- iso - prostaglandin F 2.alpha, by stimuli such as shear stress, are adjusted Bets are known (Non-Patent Document 2:. Folia Pharmacol.Jpn 127,103-107 (2006)).
変性ＬＤＬ測定に関しては、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。これまで、ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定には、モノクローナル抗体が用いられてきたが、特に変性ＬＤＬは分子の修飾構造は一定ではなく、意味のある分子種が明確でないなどの理由で、モノクローナル抗体による検出にも問題が多い。 Regarding the measurement of denatured LDL, it is expected to be used in various fields such as early diagnosis of diseases, evaluation of preventive effects of functional foods, evaluation of treatment effects by improving lifestyle and medication. So far, monoclonal antibodies have been used to measure denatured LDL, which is a risk factor for arteriosclerosis in human plasma. In particular, denatured LDL has a definite molecular modification structure, and the meaningful molecular species is not clear. For this reason, there are many problems in detection using monoclonal antibodies.
後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：本明細書中以降、ＡＧＥという）は、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症（あわせて三大合併症）とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。 Late Glycation End Products (hereinafter referred to as AGE in the present specification) are involved in the development and development of diabetic vascular disorders known as vascular complications that are the primary cause of impaired quality of life for diabetic patients. ing. Eye, nerve, and kidney disorders due to vascular complications are called diabetic retinopathy, neuropathy, and nephropathy (a total of three major complications), which are characteristic pathologies for diabetic patients.
ＡＧＥを認識する受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＡＧＥ：本明細書中以降、ＲＡＧＥという）は、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎｅ）、アンホテリンおよびアミロイド−βペプチド（およびβ−シート原線維のクラス））と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞内ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須であることが示された（非特許文献３：Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９）。 A receptor for recognizing AGE (Receptor for AGE: hereinafter referred to as RAGE) was identified from bovine lung in 1992 and belongs to the immunoglobulin superfamily that binds to AGE, and is a type I membrane with a molecular weight of about 35 kDa. It is a protein (complete RAGE subjected to sugar chain modification has a molecular weight of 55 kDa). The extracellular domain of RAGE has a structure in which a domain having three immunoglobulin fold structures of one V-type immunoglobulin domain and then two C-type immunoglobulin domains (C1 region and C2 region) are combined. . RAGE also contains a single-pass membrane domain and a 43 amino acid intracellular domain. RAGE interacts with various classes of ligands (AGE, S100 / calgranulin, amphoterin and amyloid-β peptides (and β-sheet fibril class)). The V domain is an essential site for ligand binding, and the intracellular domain has been shown to be essential for RAGE-mediated intracellular signal transduction (Non-patent Document 3: Circ Res. 2003; 93: 1159-1169). ).
ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。例えば、糖尿病患者の血管では、ＲＡＧＥの代表的リガンドとしては、以下のＡＧＥ構造体が挙げられる：（カルボキシメチル）リジン−タンパク質付加物（インビボで存在する主なＡＧＥ）、カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）タンパク質付加物、ペントシジン−付加物（コラーゲンおよび基底膜の不安定化に関連した糖尿病組織において見いだされる主要なＡＧＥ架橋物質）、ピラリン、イミダゾロン、メチルグリオキサール（他の範囲のＡＧＥの形成の前駆体）、クロスリン、フルオロリンク、プロピリジン、アルグピリミジン、ベスパーリジン、グリオキサール誘導リジンダイマー、デオキシグルコサミン誘導リジンダイマーなど。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる（非特許文献４：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１））。 RAGE is expressed only at low levels in normal tissues and the vascular system. However, this receptor is upregulated where the ligand accumulates. For example, in diabetic blood vessels, typical ligands for RAGE include the following AGE structures: (carboxymethyl) lysine-protein adduct (major AGE present in vivo), carboxyethyl-lysine (CEL) ) Protein adducts, pentosidine-adducts (major AGE crosslinkers found in diabetic tissues associated with collagen and basement membrane destabilization), pyralin, imidazolone, methylglyoxal (precursors for the formation of other ranges of AGEs) ), Croslin, fluorolink, propyridine, argpyrimidine, vesperlysine, glyoxal-derived lysine dimer, deoxyglucosamine-derived lysine dimer, and the like. RAGE expression is increased in endothelial cells, smooth muscle cells, and infiltrating mononuclear phagocytes in the diabetic vasculature. AGE-RAGE interactions change cellular properties important in vascular homeostasis. For example, after RAGE binds to AGE, endothelial cells increase the expression of VCAM-1, tissue factor, and IL-6, and their permeability to macromolecules. In mononuclear phagocytes, RAGE activates the expression of cytokines and growth factors and induces cell migration in response to soluble AGE, whereas chemotaxis occurs with a fixed ligand (Non-Patent Document 4: J Clin. Invest. 108: 949-955 (2001)).
これまでに、変性ＬＤＬを検出するために、抗酸化ホスファチジルコリンモノクローナル抗体および抗ヒトアポリポプロテインＢ抗体などが、そしてＡＧＥを検出するために抗ＡＧＥモノクローナル抗体および抗ペントシジンモノクローナル抗体、ＡＧＥ構造体を加水分解後のＨＰＬＣなどが用いられてきた。 So far, hydrolyzed antioxidant phosphatidylcholine monoclonal antibody and anti-human apolipoprotein B antibody, etc. to detect denatured LDL, and anti-AGE monoclonal antibody and anti-pentocidin monoclonal antibody, AGE structure to detect AGE Later HPLC and the like have been used.
また、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの細胞外領域には、血液中などに存在する特異性の高いプロテアーゼの認識部位は存在せず、切断をうけることはないと予想されてきた。しかし、実際、ＬＯＸ−１の細胞外領域は、過剰量のトロンビンなどによって分解が起こり、ＲＡＧＥの細胞外領域（ｓＲＡＧＥ１という）は、過剰量のトロンビン、第Ｘａ因子などによって切断が起こることを発明者らは初めて明らかにした。これらのプロテアーゼによる分解は、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥを変性ＬＤＬ／ＡＧＥ検出アッセイなどにおいて活用する際に大きな問題となる。 In addition, in the extracellular region of LOX-1 and RAGE, there is no recognition site for a highly specific protease present in blood or the like, and it has been predicted that it will not be cleaved. However, in fact, the extracellular region of LOX-1 is degraded by an excessive amount of thrombin and the extracellular region of RAGE (referred to as sRAGE1) is cleaved by an excessive amount of thrombin and factor Xa. They revealed for the first time. Degradation by these proteases poses a serious problem when LOX-1 and RAGE are utilized in denatured LDL / AGE detection assays and the like.
また、変性ＬＤＬおよびＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないために、モノクローナル抗体、ＨＰＬＣなどによる定量的検出にも問題が多い。ＬＯＸ−１は、それぞれ、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そしてＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。
本発明の課題は、抗体に代わる、汎用性の高い検出方法において使用しやすい、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを特異的に認識するペプチドを得ることである。 An object of the present invention is to obtain a peptide that specifically recognizes modified LDL and AGE of a wide variety of molecular species that can be easily used in a versatile detection method instead of an antibody.
そこで本発明者らは、鋭意工夫した結果、認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性を増したＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体−界面活性剤複合体を開発することに成功した。 Thus, as a result of diligent efforts, the present inventors have succeeded in developing a mutant-surfactant complex of LOX-1 and RAGE with increased protease resistance without affecting the recognition ability.
従って、本発明はまた、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体−界面活性剤複合体を使用して変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出する方法を提供する。 Accordingly, the present invention also provides a method for detecting denatured LDL and AGE using LOX-1 and RAGE mutant-surfactant complexes.
一局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドは、
（Ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（Ａ３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｂ３）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸配列は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｃ１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（Ｃ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｃ３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸配列は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。
In one aspect, the present invention provides a C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, wherein the C-type lectin-like domain polypeptide comprises:
(A1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(A2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it contains one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 90 and 107, and exhibits the activity of natural LOX-1. An amino acid sequence; and (A3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid sequence is The amino acid sequence at positions 90 and 107 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 2 and exhibits the activity of native LOX-1;
(B1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(B2) An amino acid sequence showing the activity of natural LOX-1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 104 and 121 And (B3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence that is complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and position 104 in the encoded amino acid sequence; The amino acid sequence at positions 121 and 121 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 6 and exhibits the activity of native LOX-1;
(C1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(C2) An amino acid sequence showing the activity of natural LOX-1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 172 and 189 And (C3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and position 172 in the encoded amino acid sequence The amino acid sequence at positions 189 and 189 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 8 and exhibits the activity of native LOX-1;
A sequence selected from the group consisting of:
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記置換は、好ましくは、保存的置換であり得る。 In one embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the substitution may preferably be a conservative substitution.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドのなお別の実施形態において、上記（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列、配列番号４の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持され得る。 In still another embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide of the present invention, the amino acid sequence shown in (A1) to (C3) above, positions 144, 155, 172, 243, 256 of SEQ ID NO: 4 A cysteine corresponding to position 264 may be retained.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記欠失は、配列番号２、６および８において、配列番号４の２６８位〜２７１位までのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のうちのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失；配列番号４の２００位〜２０５位までのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸の欠失；配列番号４の１４３位に対応するアミノ酸の欠失；または
これらの任意の組み合わせであり得る。
In one embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the deletion is the amino acid sequence from position 268 to position 271 of SEQ ID NO: 4, in SEQ ID NO: 2, 6, and 8. Deletion of any one to 6 amino acids of the amino acid sequence corresponding to 1; Deletion of any of the amino acid sequences corresponding to the amino acid sequence of positions 200 to 205 of SEQ ID NO: 4; Deletion of the amino acid corresponding to position 143 of number 4; or any combination thereof.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい一実施形態において、上記（Ａ１）〜（Ａ３）において、上記付加は、配列番号４の６１位〜１４２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の付加であり得る。 In a preferred embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, in the above (A1) to (A3), the addition is selected from positions 61 to 142 of SEQ ID NO: 4. Any contiguous 1-82 amino acid sequence addition.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体のさらに好ましい実施形態において、上記付加は、フレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加であり得る。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体のなお好ましい実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る、
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記天然型ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＤＬの認識能であり得る。
In a further preferred embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the invention, said addition is a flexible linker sequence or a repeat thereof, or an EGF repeat of an LDL receptor related protein (LRP). It may be an addition of a sequence comprising (epidermal growth factor receptor-like cysteine rich domain). In a still preferred embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the linker sequence may be the amino acid sequence shown in Gly-Gly-Ser, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16. ,
In one embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the natural LOX-1 activity may be the ability to recognize denatured LDL.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい実施形態において、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、好ましくは、タグ配列をさらに有し得る。さらに好ましくは、上記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９であり得る。 In a preferred embodiment of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex may preferably further comprise a tag sequence. More preferably, the tag sequence can be SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 19.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、一実施形態において、標識をさらに含み得る。 The C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may further comprise a label in one embodiment.
本発明は、一局面において、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体がジスルフィド結合によって結合されている、二量体を提供する。 In one aspect, the present invention provides a dimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex; a multimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex; Dimers are provided in which the lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex is linked by a disulfide bond.
なお別の局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出剤を提供し得る。 In yet another aspect, the present invention can provide a denatured LDL detection agent comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex.
本発明の変性ＬＤＬ検出剤の一実施形態において、上記検出剤におけるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。 In one embodiment of the modified LDL detection agent of the present invention, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex in the detection agent may be in a dry form.
さらなる局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体および基材を含む、変性ＬＤＬ検出用デバイスを提供する。 In a further aspect, the present invention provides a denatured LDL detection device comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex and a substrate.
上記変性ＬＤＬ検出用デバイスの一実施形態において、上記検出用デバイスにおけるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。 In one embodiment of the modified LDL detection device, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex in the detection device may be in a dry form.
上記変性ＬＤＬ検出用デバイスの一実施形態において、上記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスであり得る。さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含み得る。 In one embodiment of the modified LDL detection device, the substrate is composed of beads, gold particles, plates, test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, metal thin films, filters, tubes, balls, diamond-like materials. It can be carbon coated stainless steel. In a more preferred embodiment, the beads are polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, natural resin, plastic, gelatin, silica gel, metal, dextran, polyvinyl alcohol, polystyrene, agarose, polyamino acid, cellulose, hydroxyapatite, It may include beads made from polyethylene, polysulfone, polypropylene, cellulose acetate, polymethyl methacrylate, cellulose diacetate, methylene vinyl alcohol.
本発明は、一局面において、被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；
（３）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；または
（５）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
In one aspect, the present invention provides a method for detecting denatured LDL in a sample of a subject, the method comprising:
(A) providing a sample isolated from a subject;
(B) The above sample and the following:
(1) C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(2) a dimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(3) a multimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(4) the modified LDL detection agent of the present invention; or (5) the modified LDL detection device of the present invention,
And a step of forming a complex between the C-type lectin-like domain polypeptide and the modified LDL; and (C) detecting the complex;
Can be included.
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｂ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。上記方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体からなる群より選択され得る。 In one embodiment of the method of detecting denatured LDL in a sample of a subject of the invention, the method may further comprise the step of contacting with a (B ′) antibody to form a ternary complex. In a preferred embodiment of the above method, the antibody is an anti-ApoB antibody, an anti-OxLDL antibody, an anti-MDA-LDL antibody, an anti-acrolein (ACR) antibody, an anti-crotonaldehyde (CRA) antibody, an antimalondialdehyde (MDA) antibody, It can be selected from the group consisting of anti-4-hydroxynonenal (HNE) antibody, anti-hexanoyllysine (HEL) antibody.
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得、好ましくは、上記ＬＤＬを含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液であり得る。 In one embodiment of the method for detecting denatured LDL in a sample of a subject of the present invention, the sample may be a body fluid containing LDL, and preferably the body fluid containing LDL is blood, serum, plasma, marrow Fluid, serous cavity fluid, alveolar lavage fluid.
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル化ＬＤＬ，サクシニル化ＬＤＬ、または糖化ＬＤＬから選択され得る。 In one embodiment of the method for detecting denatured LDL in a sample of a subject of the present invention, the denatured LDL is oxidized LDL, malondialdehyded LDL, acetylated LDL, acrolein modified LDL, nonenal modified LDL, hexanoylated LDL. , Succinylated LDL, or saccharified LDL.
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。 In one embodiment of the method for detecting denatured LDL in a sample of a subject of the present invention, the step of detecting the complex includes an optical detection step, a physical detection step, or a chemical detection step. Can be included.
一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出用キットを提供し得る。 In one aspect, the present invention can provide a denatured LDL detection kit comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex.
別の一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む変性ＬＤＬ検出剤と、上記変性ＬＤＬ検出剤と変性ＬＤＬとの複合体を検出するための手段とを備える、変性ＬＤＬ検出システムを提供し得る。 In another aspect, the present invention provides a modified LDL detection agent comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, and a complex of the modified LDL detection agent and the modified LDL. A denatured LDL detection system.
本発明のシステムの好ましい実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。なお好ましい実施形態において、上記光学的検出手段は、分光光度計、蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含し得る。別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含し得る。さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的検出手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含し得る。 In a preferred embodiment of the system of the present invention, the detection means may include optical detection means, physical detection means or chemical detection means. In a preferred embodiment, the optical detection means includes a spectrophotometer, a fluorescent color cell sorter (FACS), a colorimeter, a fluorometer, a chemiluminescence detector, an electrochemiluminescence detector, an image analyzer, or a microscope. Can do. In another preferred embodiment, the physical detection means may include electrical detection, surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, or thermal measurement. In yet another preferred embodiment, the chemical detection means may include mass spectrometry or high performance liquid chromatography.
さらなる一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む動脈硬化診断剤を提供し得る。 In a further aspect, the present invention can provide an arteriosclerosis diagnostic agent comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex.
なお別の一局面において、本発明は、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）上記疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；
（３）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；
（５）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス；または
（６）本発明の動脈硬化診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中の変性ＬＤＬの上記コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
In yet another aspect, the present invention provides a method for supporting diagnosis of a disease caused by denatured LDL, the method comprising:
(A) providing a sample isolated from a subject suspected of having the disease;
(B) providing a sample isolated from a control subject not suffering from the disease;
(C) The above sample and the following:
(1) C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(2) a dimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(3) a multimer of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(4) Modified LDL detection agent of the present invention;
(5) Denatured LDL detection device of the present invention; or (6) Arteriosclerosis diagnostic agent of the present invention,
And a step of forming a complex of the C-type lectin-like domain polypeptide and the modified LDL; and (D) detecting the complex;
(E) comparing the amount of complex in the sample isolated from the subject with the amount of complex in the sample isolated from the control subject to determine the amount of denatured LDL in the subject. Calculating a relative value for the control subject,
Can be included.
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｃ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。 In one embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by the modified LDL of the present invention, the method may further comprise a step of contacting with a (C ′) antibody to form a ternary complex.
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体からなる群より選択され得る。 In a preferred embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by the modified LDL of the present invention, the antibody comprises an anti-ApoB antibody, an anti-OxLDL antibody, an anti-MDA-LDL antibody, an anti-acrolein (ACR) antibody, an anti-crotonaldehyde ( CRA) antibody, anti-malondialdehyde (MDA) antibody, anti-4-hydroxynonenal (HNE) antibody, anti-hexanoyllysine (HEL) antibody.
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患は、動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症、および全身性エリテマトーデス（SLE）のような自己免疫疾患からなる群より選択され得る。好ましい実施形態において、上記虚血性心疾患は、心筋梗塞、または狭心症を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記脳血管障害は、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、または一過性脳虚血発作を含み得る。 In one embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by the modified LDL of the present invention, the disease caused by the modified LDL is arteriosclerosis, ischemic heart disease, cerebrovascular disorder, aortic aneurysm, renal infarction, high It may be selected from the group consisting of lipemia and autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE). In a preferred embodiment, the ischemic heart disease can include myocardial infarction or angina. In another preferred embodiment, the cerebrovascular disorder can include cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, or transient cerebral ischemic attack.
一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の、変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患の診断のための医薬の製造のための使用を提供する。 In one aspect, the present invention provides use of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex for the manufacture of a medicament for diagnosis of a disease caused by denatured LDL.
さらなる一局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法を提供し、上記方法は、
Ａ）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）上記封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含し得る。
In a further aspect, the present invention provides a method for producing a C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, the method comprising:
A) producing the C-type lectin-like domain polypeptide of the present invention as an inclusion body in a bacterial host cell; and B) refolding the inclusion body with a surfactant and cycloamylose to produce the C-type lectin-like domain polypeptide. Obtaining a peptide-surfactant binding complex;
Can be included.
一局面において、本発明は、後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｔ１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列；
（Ｔ２）配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｔ３）配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。
In one aspect, the present invention provides a late glycation reaction product receptor (RAGE) -like polypeptide-surfactant binding complex, wherein the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex comprises:
(P1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
(P2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (P3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 12, an amino acid sequence;
(Q1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(Q2) Natural RAGE activity comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95, 206 and 250 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (Q3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 under stringent conditions, the encoded amino acid An amino acid sequence in which the amino acids at positions 92, 95, 206 and 250 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 14;
(R1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37;
(R2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 (R3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, wherein: An amino acid sequence wherein the amino acids at positions 95, 206 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 37;
(S1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39;
(S2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 And (S3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38, wherein 92 An amino acid sequence in which the amino acids at positions 95, 206 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 39;
(T1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41;
(T2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41, the activity of natural RAGE comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 14, 17, 128 and 172 And (T3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 under stringent conditions, the encoded amino acid An amino acid sequence in which the amino acid sequence at positions 14, 17, 128 and 172 in the sequence retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 41;
(U1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43;
(U2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (U3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 42, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 43; an amino acid sequence;
(V1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45;
(V2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (V3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 45;
(W1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47;
(W2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (W3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 47;
(X1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49;
(X2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (X3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 49;
A sequence selected from the group consisting of:
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。 In one embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the substitution may be a conservative substitution.
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の別の一実施形態において、上記（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基は保持されている。 In another embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, positions 38 and 99 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the amino acid sequences shown in (P1) to (X3) above, Cysteine residues corresponding to positions 144, 208, 259 and 301 are retained.
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい一実施形態において、上記欠失は、配列番号１２、１４、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９において、配列番号１０の１位〜３７位に対応するアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸の欠失であり得る。 In a preferred embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the deletion is as shown in SEQ ID NO: 10 in SEQ ID NO: 12, 14, 37, 39, 41, 43, 45, 47 and 49. Deletion of any amino acid in the amino acid sequence corresponding to position 1 to position 37.
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のさらに別の一実施形態において、上記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の連続する１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１〜２８４個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加であり得る。好ましい実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る。 In yet another embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the invention, the addition is any contiguous 1-22 amino acids selected from positions 1-22 of SEQ ID NO: 10 Addition to the N-terminal side of the sequence, addition of any continuous 1 to 284 amino acids selected from positions 121 to 404 of SEQ ID NO: 10, or flexible linker sequence or a repeated sequence thereof, or LDL receptor-related EGF repeats of protein (LRP) (addition of sequences containing epidermal growth factor receptor-like cysteine-rich domain. In a preferred embodiment, the linker sequence is Gly-Gly-Ser, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 The amino acid sequence shown in FIG.
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能であり得る。 In one embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the activity of the natural RAGE may be AGE recognition ability.
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のなお別の一実施形態において、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに有し得る。好ましくは、上記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９であり得る。 In yet another embodiment of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex may further comprise a tag sequence. Preferably, the tag sequence can be SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 19.
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤を提供し得る。 In one aspect, the present invention can provide a late glycation reaction product (AGE) detection agent comprising the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex.
後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤の好ましい実施形態において、上記検出剤におけるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。 In a preferred embodiment of the late saccharification reaction product (AGE) detection agent, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex in the detection agent may be in a dry form.
本発明は、一局面において、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体および基材を含む、ＡＧＥ検出用デバイスを提供し得る。 In one aspect, the present invention can provide a device for detecting AGE comprising the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex and a substrate.
上記ＡＧＥ検出用デバイスの一実施形態において、上記検出デバイスにおけるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。 In one embodiment of the AGE detection device, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex in the detection device may be in a dry form.
上記ＡＧＥ検出用デバイスの一実施形態において、上記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスを含み得る。さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含み得る。 In one embodiment of the AGE detection device, the substrate is composed of beads, gold particles, plates, test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, metal thin films, filters, tubes, balls, diamond-like carbon. Coated stainless steel may be included. In a more preferred embodiment, the beads are polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, natural resin, plastic, gelatin, silica gel, metal, dextran, polyvinyl alcohol, polystyrene, agarose, polyamino acid, cellulose, hydroxyapatite, It may include beads made from polyethylene, polysulfone, polypropylene, cellulose acetate, polymethyl methacrylate, cellulose diacetate, methylene vinyl alcohol.
本発明は、一局面において、被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；または
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
In one aspect, the present invention provides a method for detecting AGE in a sample of a subject, the method comprising:
(A) providing a sample isolated from a subject;
(B) The above sample and the following:
(1) the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(2) the AGE detection agent of the present invention; or (3) the AGE detection device of the present invention,
And a step of forming a complex between the polypeptide and the AGE; and (C) a step of detecting the complex.
Can be included.
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｂ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。上記好ましい方法の実施形態において、上記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択され得る。 In one embodiment of the method of detecting AGE in a sample of a subject of the invention, the method may further comprise the step of contacting with a (B ′) antibody to form a ternary complex. In an embodiment of the preferred method, the antibody can be selected from the group consisting of an anti-HbA1c antibody, an anti-AGE antibody and an anti-carboxymethyllysine antibody.
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得、好ましくは、上記タンパク質を含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液または尿を含む体液であり得る。 In one embodiment of the method for detecting AGE in a sample of a subject of the present invention, the sample may be a body fluid containing a protein, and preferably the body fluid containing a protein is blood, serum, plasma, spinal fluid. , Body fluids including serous fluid, joint fluid, alveolar lavage fluid, tears or urine.
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記ＡＧＥは糖化タンパク質であり得る。 In one embodiment of the method for detecting AGE in a sample of a subject of the present invention, the AGE may be a glycated protein.
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。 In one embodiment of the method for detecting AGE in a sample of a subject of the present invention, the step of detecting the complex includes a step of optical detection, a step of physical detection, or a step of chemical detection. Can be included.
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、ＡＧＥ検出用キットを提供する。 In one aspect, the present invention provides a kit for AGE detection comprising the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex.
別の一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含むＡＧＥ検出剤と上記ＡＧＥ検出剤とＡＧＥとの複合体を検出するための手段とを備える、ＡＧＥ検出システムを提供し得る。 In another aspect, the present invention comprises an AGE detection agent comprising the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex, and means for detecting the complex of the AGE detection agent and AGE. A system can be provided.
本発明のシステムの好ましい実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。なお好ましい実施形態において、上記光学的検出手段は、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含し得る。別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含し得る。さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的検出手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含し得る。 In a preferred embodiment of the system of the present invention, the detection means may include optical detection means, physical detection means or chemical detection means. In still preferred embodiments, the optical detection means may include a spectrophotometer, FACS, colorimeter, fluorometer, chemiluminescence detector, electrochemiluminescence detector, image analyzer, or microscope. In another preferred embodiment, the physical detection means may include electrical detection, surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, or thermal measurement. In yet another preferred embodiment, the chemical detection means may include mass spectrometry or high performance liquid chromatography.
さらなる局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、糖尿病性血管障害診断剤を提供し得る。 In a further aspect, the present invention can provide a diagnostic agent for diabetic vascular disorder comprising the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex.
なお別の一局面において、本発明は、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）上記疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス；または
（４）本発明の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中のＡＧＥの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
In yet another aspect, the present invention provides a method for supporting diagnosis of a disease caused by AGE,
(A) providing a sample isolated from a subject suspected of having the disease;
(B) providing a sample isolated from a control subject not suffering from the disease;
(C) The above sample and the following:
(1) the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention;
(2) AGE detection agent of the present invention;
(3) AGE detection device of the present invention; or (4) Diabetic vascular disorder diagnostic agent of the present invention,
Contacting with any of the above to form a complex of the RAGE-like polypeptide and the AGE; and (D) detecting the complex.
(E) comparing the amount of complex in the sample isolated from the subject with the amount of complex in the sample isolated from the control subject to determine the amount of AGE in the subject. Calculating a relative value for the control subject;
Can be included.
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において
上記方法は、（Ｃ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。
In one embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by AGE of the present invention, the method may further comprise a step of contacting with (C ′) antibody to form a ternary complex.
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択され得る。 In a preferred embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by AGE of the present invention, the antibody may be selected from the group consisting of an anti-HbA1c antibody, an anti-AGE antibody and an anti-carboxymethyllysine antibody.
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記ＡＧＥにより引き起こされる疾患は、糖尿病、糖尿病性血管障害、細小血管症、および大血管障害からなる群より選択され得る。好ましい実施形態において、上記細小血管症は、腎症、網膜症、または神経症を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記大血管障害は、虚血性心疾患、脳血管疾患、または閉塞性動脈硬化症を含み得る。 In one embodiment of the method for supporting diagnosis of a disease caused by AGE of the present invention, the disease caused by AGE may be selected from the group consisting of diabetes, diabetic vascular disorder, microangiopathy, and macrovascular disorder. . In preferred embodiments, the microangiopathy can include nephropathy, retinopathy, or neurosis. In another preferred embodiment, the macrovascular disorder can include ischemic heart disease, cerebrovascular disease, or obstructive arteriosclerosis.
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体質の、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断剤の製造のための使用を提供する。 In one aspect, the present invention provides use of the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex for the manufacture of a diagnostic agent for a disease caused by AGE.
さらなる局面において、本発明は、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法を提供し、上記方法は、
Ａ）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）上記封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含し得る。
In a further aspect, the present invention provides a method for producing a RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex, the method comprising:
A) producing the RAGE-like polypeptide of the present invention as an inclusion body in a bacterial host cell; and B) refolding the inclusion body with a surfactant and cycloamylose to produce a RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex. Obtaining a body,
Can be included.
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。 Still further embodiments and advantages of the present invention will be appreciated to those of ordinary skill in the art upon reading and understanding the following detailed description.
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Thus, it should be understood that singular articles or adjectives (eg, “a”, “an”, “the”, etc., in the English language) also include the plural concept unless otherwise stated. is there. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.
本明細書において使用される場合、用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。 As used herein, the term “receptor” is a biological structure comprising one or more binding domains that reversibly and specifically complex with one or more ligands. Here, this complexation has a biological structure. Receptors can be completely outside the cell (extracellular receptors), inside the cell membrane (but directing the receptor portion to the extracellular environment and cytosol), or completely inside the cell (intracellular Of the receptor). They can also function independently of cells. Receptors in the cell membrane allow cells to communicate (eg, signal transduction) with space outside their boundaries and to function in the transport of molecules and ions to the inside and outside of the cell. As used herein, a receptor may be a full length receptor or a fragment of a receptor.
本明細書において使用される場合、用語「レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、ＬＯＸ−１ともいわれ、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（５）配列番号３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号３に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。また、ＬＯＸ−１としては、ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１ともいう）、ウシＬＯＸ−１（ｂ−ＬＯＸ１ともいう）、ブタＬＯＸ−１、マウスＬＯＸ−１、ウサギＬＯＸ−１のような哺乳動物のＬＯＸ−１が挙げられるが、これらに限定されない。ｂＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ｈＬＯＸ−１はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメインからなる。 As used herein, the term “lectin-like oxidized low density lipoprotein (LDL) receptor 1 (Lectin-like Oxidized LDL receptor)” is also referred to as LOX-1, and is shown in (1) SEQ ID NO: 4. (2) an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a natural LOX-1 (3) a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibiting the activity of natural LOX-1; (4) An amino acid sequence having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 And a polypeptide exhibiting the activity of natural LOX-1; (5) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 3; (6) against the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a complementary nucleic acid sequence under stringent conditions and exhibiting the activity of natural LOX-1; (7) the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having one or several nucleotide substitutions, additions and / or deletions in the sequence and exhibiting the activity of native LOX-1; (8) SEQ ID NO: 3 above Comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity to the nucleic acid sequence shown in A polypeptide exhibiting the activity of native LOX-1; and (9) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 above, and native LOX It is one of the polypeptides that show the activity of -1. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art. Further, as LOX-1, feeding such as human LOX-1 (also referred to as hLOX-1), bovine LOX-1 (also referred to as b-LOX1), porcine LOX-1, mouse LOX-1, and rabbit LOX-1 Examples include, but are not limited to, animal LOX-1. bLOX-1 is a glycoprotein having a molecular weight of about 50 kDa consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family. It is a type membrane protein. hLOX-1 is also an approximately 30 kDa type II membrane protein consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family. LOX-1 is structurally composed of the following four domains: an N-terminal cytoplasmic domain, a hydrophobic transmembrane domain, a neck domain, and a C-type lectin-like domain.
本明細書において使用される場合、用語「Ｃ型レクチン様ドメイン」とは、ＣＴＬＤともいい、Ｃ型レクチンファミリーに属するメンバーの糖鎖認識部位と相同性を有する。ＣＴＬＤは、このメンバー間で、種間で非常によく保存されており、６個のシステイン残基の位置は、完全に保存されている。また、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインであり、この中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の３カ所の分子内ジスルフィド結合に関与している。従って、本発明の変異ＬＯＸ−１−界面活性剤複合体は、配列番号４のアミノ酸配列において、１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインが保持されていることが好ましい。同様に、本発明のＣＴＬＤ−界面活性剤複合体においても、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸が保持されていることが好ましい。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、ｈＬＯＸ−１における１４０位のシステインは、分子間ジスルフィド結合に関与し、ｈＬＯＸ−１の二量体を形成する。しかし、この１４０位のシステインは、変性ＬＤＬの認識に必須ではないので、発現された場合に、必ずしもこの１４０位のシステインが保持されている必要はなく、変異されていてもよい。さらに、ｈＬＯＸ−１では、１８３位のＮと１３９位のＮにおいて糖鎖が付加されている。糖鎖が付加されたｈＬＯＸ−１の分子量は、４０ｋＤａである。通常ｈＬＯＸ−１はグリコシル化されているが、たとえグリコシル化されていなくても、グリコシル化された通常のｈＬＯＸ−１と同様に、変性ＬＤＬを認識および結合できる。上記ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合するのに必要十分な最小ドメインである。このＬＯＸ−１のＣ末端の４残基（ＬＲＡＱ）は、リガンドの認識と取り込みに必須であり、Ｃ末端の７残基（ＫＡＮＬＲＡＱ）がｈＬＯＸ−１のフォールディングと輸送に必須である。ｈＬＯＸ−１のＷ１５０、Ｒ２０８、Ｒ２２９、Ｒ２３１、Ｒ２４８等がリガンド認識と取り込みに必須のアミノ酸である。ＬＯＸ−１はまた、細胞膜から切断され、可溶性形態として放出され、健常者の血中にも存在することが報告されている。 As used herein, the term “C-type lectin-like domain” is also referred to as CTLD, and has homology with a sugar chain recognition site of a member belonging to the C-type lectin family. CTLD is very well conserved among these members, among species, and the position of the 6 cysteine residues is completely conserved. CTLD is a functional domain for recognizing the ligand of LOX-1, and six cysteine residues among them are involved in three intramolecular disulfide bonds of hLOX-1. Therefore, in the mutant LOX-1-surfactant complex of the present invention, cysteines at positions 144, 155, 172, 243, 256, 264 are retained in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Is preferred. Similarly, in the CTLD-surfactant complex of the present invention, amino acids corresponding to cysteines at positions 144, 155, 172, 243, 256, and 264 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are retained. Preferably it is. In addition to this conserved CTLD, neck domains in hLOX-1 and other known species have high sequence identity. In addition, cysteine at position 140 in hLOX-1 is involved in an intermolecular disulfide bond and forms a dimer of hLOX-1. However, since the cysteine at position 140 is not essential for recognition of denatured LDL, it is not always necessary to retain the cysteine at position 140 when expressed, and it may be mutated. Furthermore, in hLOX-1, sugar chains are added at N at position 183 and N at position 139. The molecular weight of hLOX-1 added with a sugar chain is 40 kDa. Although hLOX-1 is usually glycosylated, it can recognize and bind to denatured LDL, even though it is not glycosylated, in the same way as normal glycosylated hLOX-1. The CTLD is a minimal domain necessary and sufficient to bind denatured LDL. The 4 C-terminal residues (LRaq) of LOX-1 are essential for ligand recognition and uptake, and the 7 C-terminal residues (KANLRAQ) are essential for hLOX-1 folding and transport. hLOX-1 W150, R208, R229, R231, R248 and the like are essential amino acids for ligand recognition and uptake. LOX-1 has also been reported to be cleaved from the cell membrane, released as a soluble form, and also present in the blood of healthy individuals.
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ様ポリペプチド」とは、「ＣＴＬＤ」、「ＰＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（プロテアーゼ耐性））−ＣＴＬＤ」、「ＣＴＬＤ１４」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインのＣ末端側の１４アミノ酸を有するポリペプチド）、「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」、「ＣＴＬＤ＋ネック」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインを有するポリペプチド）、または「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」に包含される全てのポリペプチドまたはその変異体を包含する。 As used herein, the term "CTLD-like polypeptide", "CTLD", "PR (P rotease- R esistant (protease resistance)) - CTLD ', C-terminal, the" CTLD14 "(CTLD + neck domain Polypeptide having 14 amino acids on the side), “PR-CTLD14”, “CTLD + neck” (polypeptide having CTLD + neck domain), or “PR-CTLD + neck” all polypeptides or variants thereof Include.
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ」とは、代表的には、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD” and “PR-CTLD” typically include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (2) SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence represented by (3); (3) other than positions 90 and 107 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at the amino acid position and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% sequence identity; (5) at least 80% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 1; and (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and under stringent conditions An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with the amino acid at positions 90 and 107 in the encoded amino acid sequence, retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 2 and (9) a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions and having the activity of native LOX-1; (10) shown in SEQ ID NO: 1 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence; (11) by a nucleic acid sequence having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 above Indicated by one of the polypeptides comprising the encoded amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ１４」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」とは、（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号５に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号５に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD14” and “PR-CTLD14” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; (2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising a substitution, addition and / or deletion of one or several amino acids in (3); or 1 or 2 at amino acid positions other than positions 104 and 121 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 5; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and under stringent conditions Wherein the amino acids at positions 104 and 121 in the encoded amino acid sequence retain the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 6 and A polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting activity; (9) the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions in and exhibiting the activity of native LOX-1; (10) shown in SEQ ID NO: 5 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence; (11) by a nucleic acid sequence having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 above Indicated by one of the polypeptides comprising the encoded amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ＋ネック」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」とは、（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号７に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号７に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD + Neck” and “PR-CTLD + Neck” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; (2) shown in SEQ ID NO: 8 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising a substitution, addition and / or deletion of one or several amino acids in the amino acid sequence; (3) in amino acid positions other than positions 172 and 189 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 above; A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least 90% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence identity; (5) at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 A polypeptide comprising an amino acid sequence having 0% sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 7; (7) a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule which hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and stringent An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under various conditions, wherein the amino acids at positions 172 and 189 in the encoded amino acid sequence retain the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 6 and are naturally occurring A polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting LOX-1 activity; (9) shown in SEQ ID NO: 7 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions in said nucleic acid sequence and exhibiting the activity of native LOX-1; (10) SEQ ID NO: 7 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (11); (11) having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 above Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
なお、上記ＣＴＬＤ様ポリペプチドは、天然型ＬＯＸ−１の活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。 The CTLD-like polypeptide may contain an unnatural amino acid, an amino acid analog, an amino acid derivative, or the like as long as the activity of natural LOX-1 is retained.
上記に示されるＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤複合体においても、システイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与しているので、本発明のＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいて、配列番号４のアミノ酸配列の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されていることが好ましい。 Also in the CTLD-like polypeptide-surfactant complex shown above, cysteine residues are involved in intramolecular disulfide bonds. Therefore, in the CTLD-like polypeptide of the present invention, 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is used. It is preferred that cysteines corresponding to positions 155, 172, 243, 256, 264 are retained.
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。 As used herein, the term “ligand” is a binding partner for a specific receptor or family of receptors. The ligand can be an endogenous ligand for the receptor, or alternatively, a synthetic ligand for the receptor, such as a drug, drug candidate, or pharmacological means.
本明細書において使用される場合、「変性ＬＤＬ」とは、ＬＤＬが体内で活性酸素、酸化的酵素、Ｆｅ３＋などと接触すること、あるいは、血管内皮細胞やマクロファージなどによる細胞依存性化学変化によって発生する種々の分子修飾を有する任意のＬＤＬ改変体である。生体内に存在する変性ＬＤＬとしては、代表的には、酸化ＬＤＬ（完全酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｆ−ＯｘＬＤＬともいう）および部分酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｍ−ＯｘＬＤＬともいう）が挙げられる）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ（直径２５５ｎｍ以下のＬＤＬ）、糖化ＬＤＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化ＬＤＬが異常値を示す場合、動脈硬化症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などのような疾患が予想されるがこれらに限定されない（「今日の臨床検査 ２００７−２００８」発行所 株式会社 南江堂、参照）。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用されている。 As used herein, “denatured LDL” refers to contact of LDL with active oxygen, oxidative enzymes, Fe 3+, etc. in the body, or cell-dependent chemical changes caused by vascular endothelial cells, macrophages, etc. Any LDL variant with various molecular modifications that occur. Typical modified LDLs present in vivo include oxidized LDL (fully oxidized LDL (also referred to herein as F-OxLDL)) and partially oxidized LDL (also referred to as M-OxLDL herein). ), Malondialdehyded LDL (MDA-LDL), acrolein modified LDL, nonenal modified LDL, crotonaldehyde (CRA) modified LDL, 4-hydroxynonenal (HNE) modified LDL, hexanoyl (HEL) modified LDL, small particle LDL ( Examples include, but are not limited to, LDL having a diameter of 255 nm or less, and saccharified LDL. When oxidized LDL shows abnormal values, arteriosclerosis, ischemic heart disease (myocardial infarction, angina, etc.), cerebrovascular disorder (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, transient ischemic attack, etc.), Diseases such as aortic aneurysm, renal infarction, and hyperlipidemia are expected, but are not limited to these (see “Today's clinical test 2007-2008” publisher, Nankodo, Inc.). In a commonly used test method, MDA-LDL (normal range: 10 to 80 U / L) and oxidized phosphatidylcholine (normal range: 8.4 U / mL to 17.6 U / mL) are used as reference substances. .
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」とは、ＡＧＥともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。ＡＧＥはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するＡＧＥ構造としては、カルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。さらに、インビトロ実験系では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に糖化処理を施したもの、例えば、Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）なども汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。このようなＡＧＥ生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するＡＧＥとしては、：蛍光性で架橋構造を有するもの（ペントシジン、クロスリンなど）および蛍光も架橋もないもの（カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール（ＭＧ）−イミダゾロンなど）の２つに大別できる。ＡＧＥが異常値を示す場合、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））などが使用される（「今日の臨床検査 ２００７−２００８」発行所 株式会社 南江堂、参照）。 As used herein, the term “advanced glycation end products” is also referred to as AGE and is a diabetic blood vessel known as a vascular complication that impairs the quality of life of diabetic patients. Involved in the onset and progression of disabilities. Reducing sugars represented by glucose react non-enzymatically with amino groups of proteins and amino acids to form glycation products such as Schiff bases or Amadori rearrangement compounds. The reaction so far is reversible and is called the first reaction. Thereafter, a late saccharification reaction product is formed through complicated and irreversible reactions such as condensation, cleavage, and cross-linking. Such a series of reactions is called glycation. AGE is also a general term for structures generated through such a process. Examples of the AGE structure present in the living body include, but are not limited to, carboxymethyllysine (CML), carboxyethyllysine (CEL), pentosidine, pyralin, imidazoline, methylglyoxal, and croslin. A product obtained by glycation of albumin, immunoglobulin, ovalbumin or the like present in plasma is also AGE, and is widely used in experimental systems as AGE. Furthermore, in the in vitro experimental system, BSA (bovine serum albumin) subjected to saccharification treatment, for example, R-AGE (BSA saccharified with ribose), F-AGE (BSA treated with fructose); G- AGE (BSA saccharified with glucose) and the like are also widely used. Hemoglobin A1c used as an index for blood glucose control is an Amadori transfer compound, but is included in AGE. Arbitrary proteins can also be converted to AGE. For example, CML albumin and CEL albumin included in AGE are both AGEs in which albumin is glycated. Such an AGE production reaction can occur in the living body either in the circulating blood, in the extracellular matrix, or in the cell. For example, AGEs present in the blood vessels of diabetic patients include: those that are fluorescent and have a cross-linked structure (such as pentosidine and croslin) and those that do not fluoresce or cross-link (such as carboxymethyllysine, pyralin, methylglyoxal (MG) -imidazolone) ). When AGE shows an abnormal value, diseases such as microangiopathy (nephropathy, retinopathy, neurosis, etc.) and macrovascular disorder (ischemic heart disease, cerebrovascular disease, obstructive arteriosclerosis) are expected. In the test method generally used, as reference substances, pyralin (normal range: less than 23 pmol / mL in plasma), pentosidine (normal range: 0.00915 to 0.0431 μg / mL in plasma (when measured by ELISA)) (See “Today's clinical test 2007-2008” publisher, Nanedo Co., Ltd.).
本明細書において使用される場合、用語「ＡＧＥ受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＡＧＥ）」とは、ＲＡＧＥともいわれ、（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（５）配列番号９に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号９に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥはまた、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の、３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド）と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。ＲＡＧＥはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異ＲＡＧＥ−界面活性剤複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基を保持していることが好ましい。ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、ＡＧＥが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、ＲＡＧＥの発現が増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、血管内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。 As used herein, the term “AGE receptor (Receptor for AGE)” is also referred to as RAGE, and (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; (2) SEQ ID NO: 10 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence represented by the above, and exhibiting the activity of natural RAGE; (3) the amino acid represented by SEQ ID NO: 10 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the sequence and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) an amino acid having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 above A polypeptide comprising a sequence and exhibiting the activity of native RAGE; (5) shown in SEQ ID NO: 9 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule; (6) an amino acid encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 above. A polypeptide comprising a sequence and exhibiting the activity of native RAGE; (7) encoded by a nucleic acid molecule having one or several nucleotide substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 above (8) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9; And a polypeptide exhibiting the activity of natural RAGE; and (9) shown in SEQ ID NO: 9 above Comprises an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with acid sequence, and polypeptides displaying the activity of natural RAGE, it is one of. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art. RAGE is also a type I membrane protein with a molecular weight of about 35 kDa, which was identified from bovine lung in 1992 and belongs to the immunoglobulin superfamily that binds to AGE (complete RAGE with sugar chain modification has a molecular weight of 55 kDa). . The extracellular domain of RAGE has a structure in which one V-type immunoglobulin domain and then two C-type immunoglobulin domains (C1 region and C2 region) are combined with a domain having three immunoglobulin fold structures. Yes. RAGE also contains a single-pass membrane domain and a 43 amino acid cytoplasmic domain. RAGE interacts with various classes of ligands (AGE, S100 / calgranulin, amphoterin and amyloid-β peptide). The V domain is an essential site for ligand binding, and the cytoplasmic domain is essential for RAGE-mediated intracellular signaling. Since RAGE also has a disulfide bond within each domain, the mutant RAGE-surfactant complex of the present invention has positions 38, 99, 144, 208, 259 and 301 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. It is preferred to retain a cysteine residue corresponding to the position. RAGE is expressed only at low levels in normal tissues and the vascular system. However, this receptor is upregulated where the ligand accumulates. RAGE expression is increased in endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, renal mesangial cells and infiltrating mononuclear phagocytes in the diabetic vasculature. RAGE expression is also increasing in pathological sites such as arteriosclerotic lesions where AGE is accumulated. AGE-RAGE interactions change cellular properties important in vascular homeostasis. For example, after RAGE binds to AGE, vascular endothelial cells increase the expression of VCAM-1, tissue factor, and IL-6, and their permeability to macromolecules. In mononuclear phagocytes, RAGE activates the expression of cytokines and growth factors and induces cell migration in response to soluble AGEs, whereas chemotaxis occurs with fixed ligands.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」とは、「ＲＡＧＥ８」、「ｍＲＡＧＥ８」、「ＲＡＧＥ１」、「ｍＲＡＧＥ１」、「ＲＡＧＥ２」、「ｍＲＡＧＥ２」、「ＲＡＧＥ３」、「ｍＲＡＧＥ３」、「ＲＡＧＥ４」、「ｍＲＡＧＥ４」、「ＲＡＧＥ７」、「ｍＲＡＧＥ７」、「ＲＡＧＥ１４３」、「ｍＲＡＧＥ１４３」、「ＲＡＧＥ２２３」、「ｍＲＡＧＥ２２３」、「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」と称されるポリペプチドまたはこれらの変異体を包含する。 As used herein, the term “RAGE-like polypeptide” refers to “RAGE8”, “mRAGE8”, “RAGE1”, “mRAGE1”, “RAGE2”, “mRAGE2”, “RAGE3”, “mRAGE3”. , “RAGE4”, “mRAGE4”, “RAGE7”, “mRAGE7”, “RAGE143”, “mRAGE143”, “RAGE223”, “mRAGE223”, “RAGE226” and “mRAGE226” or their variants Includes the body.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ８」および「ｍＲＡＧＥ８」とは、（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE8” and “mRAGE8” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) 1 or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above A polypeptide comprising a variant; (5) at least 80% sequence homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 above. (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 11; (7) a nucleic acid complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with the sequence under stringent conditions; (8) one or several substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above; (9) a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above. A peptide comprising amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence; A polypeptide which retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 12 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above And (11) one of the polypeptides comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above. Indicated by one. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１」および「ｍＲＡＧＥ１」とは、（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE1” and “mRAGE1” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence containing several substitutions, additions and / or deletions; (3) amino acid positions other than positions 92, 95, 206 and 250 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions, and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) at least 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 above A polypeptide comprising a variant having the sequence identity of: (5) less than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 above A polypeptide comprising a variant having a sequence homology of 80%; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 13; (7) the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having addition and / or deletion; (9) hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 above Amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule, wherein the amino acid sequence is at position 92 A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 14 and exhibits the activity of native RAGE; (10) at least a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having 90% sequence identity; and (11) encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 above. Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２」および「ｍＲＡＧＥ２」とは、（１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE2” and “mRAGE2” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, 1 or 2 at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 36; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 above. A polypeptide having a position of 92 and 95 in the encoded amino acid sequence. And the amino acid sequence at positions 206 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 37 and exhibits the activity of natural RAGE; (10) at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having sex; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 above. Indicated by one of the peptides. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ３」および「ｍＲＡＧＥ３」とは、（１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３７４）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE3” and “mRAGE3” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence containing several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, 1 or 2 at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (374) at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 above (5) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 and at least 8 A polypeptide comprising a variant having% sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 38; (7) against the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions or additions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 above And / or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) a nucleic acid molecule that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 under stringent conditions A polypeptide encoded by the amino acid sequence at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence And the amino acid sequence at positions 206 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 39 and exhibits the activity of native RAGE; (10) at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having sex; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 above. Indicated by one of the peptides. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ４」および「ｍＲＡＧＥ４」とは、（１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４０に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４０に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４０に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE4” and “mRAGE4” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41, amino acid positions other than positions 14, 17, 128 and 172 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions, and exhibiting the activity of native RAGE; (4) at least 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 above A polypeptide comprising a variant having the sequence identity of: (5) less than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 above A polypeptide comprising a variant having a sequence homology of 80%; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 40; (7) the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to said nucleotide sequence; (8) one or several substitutions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having additions and / or deletions; (9) hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 above A polypeptide encoded by a nucleic acid molecule, wherein the polypeptide is at position 14 in the encoded amino acid sequence. A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 41 and exhibits the activity of native RAGE; (10) at least a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having 90% sequence identity; and (11) encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 above. Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ７」および「ｍＲＡＧＥ７」とは、
（１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４２に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４２に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４２に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
As used herein, the terms “RAGE7” and “mRAGE7”
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43; (2) a polypeptide comprising an amino acid sequence containing one or several substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43 (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43, including an amino acid sequence containing substitution, addition and / or deletion of one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95, and natural type A polypeptide having RAGE activity; (4) a polypeptide comprising a variant having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43; (5) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43; A polypeptide comprising a variant having at least 80% sequence homology; (6) by a nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 42 A polypeptide comprising an encoded amino acid sequence; (7) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 above. (8) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having one or several substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 42; A polypeptide encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in No. 42, wherein the amino acid sequences at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence are: , Retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 43 and the activity of natural RAGE (10) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 42; and (11) in SEQ ID NO: 42 Indicated by one of the polypeptides comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the indicated nucleic acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１４３」および「ｍＲＡＧＥ１４３」とは、（１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４４に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４４に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４４に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE143” and “mRAGE143” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) 1 or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 44; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 above. A polypeptide wherein the positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 45 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44 above Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２３」および「ｍＲＡＧＥ２２３」とは、（１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE223” and “mRAGE223” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47, one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47 above A polypeptide comprising a variant; (5) at least 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47 above A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 46; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 above. Of the encoded amino acid sequence at positions 92 and 95 A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 47 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 above. Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」とは、（１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE226” and “mRAGE226” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) 1 or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 above A polypeptide comprising a variant; (5) at least 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49 above A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 48; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 above. A polypeptide wherein the positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 49 and exhibits natural RAGE activity; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48 above. Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)), a sequence analysis tool, using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
なお、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、天然型ＲＡＧＥの活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。 The RAGE-like polypeptide may contain an unnatural amino acid, an amino acid analog, an amino acid derivative, or the like as long as the activity of the natural RAGE is retained.
上記のＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは重要であるので、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。 Also in the above RAGE-like polypeptide, since it is important to form an intramolecular disulfide bond, it corresponds to positions 38, 99, 144, 208, 259 and 301 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. Cysteine is preferably retained.
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。 As used herein, “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is done.
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。 In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural as long as it satisfies the object of the present invention.
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。 As used herein, “amino acid derivative” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such amino acid derivatives and amino acid analogs are well known in the art. As used herein, it is understood that amino acid derivatives and amino acid analogs can be used alternatively as long as they can provide the same biological function as an amino acid.
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。 As used herein, “natural amino acid” means an L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, γ-carboxyglutamic acid, arginine, ornithine , And lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。 As used herein, “unnatural amino acid” means an amino acid that is not normally found naturally in proteins. Examples of non-natural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homo-arginine D-form or L-form and D-phenylalanine.
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。 As used herein, “amino acid analog” refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and / or function of an amino acid. Examples of amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like. Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。 Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。 In this specification, the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters using BLAST, which is a sequence analysis tool. The identity search can be performed using, for example, NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12). In the present specification, the identity value usually refers to a value when the BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value.
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。例えば、ＬＯＸ−１においては、２３２位および２４９位におけるアミノ酸であり、ＲＡＧＥにおいては、１１４位、１１７位、２２８位、２７２位におけるアミノ酸である。 As used herein, a “corresponding” amino acid has, or is predicted to have, in a certain protein molecule or polypeptide molecule, the same action as a predetermined amino acid in a protein or polypeptide as a reference for comparison. An amino acid. For example, in LOX-1, the amino acids are at positions 232 and 249, and in RAGE, the amino acids are at positions 114, 117, 228, and 272.
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。 In the present specification, the “corresponding” gene refers to a gene having, or expected to have, the same action as that of a predetermined gene in a species as a reference for comparison in a certain species. When there are a plurality of genes having the same, those having the same origin evolutionarily. Thus, a gene corresponding to a gene (eg, LOX-1) can be an ortholog of that gene. Therefore, genes corresponding to human genes can be found in other animals (mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.). Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Thus, for example, the corresponding gene in an animal is the sequence of that animal (eg, mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.) using the sequence of the gene serving as the reference for the corresponding gene as a query sequence. It can be found by searching the database.
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＬＯＸ−１の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。 As used herein, “heterologous” refers to nucleotide or amino acid sequences that are different or non-corresponding sequences, or sequences from different species. For example, the human nucleotide or amino acid sequence is heterologous to the mouse nucleotide or amino acid sequence, and the human LOX-1 nucleic acid or amino acid sequence is heterologous to the human albumin nucleotide or amino acid sequence. It is.
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。 As used herein, “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, the lengths of polypeptides and polynucleotides can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the above numbers are not absolute, and the upper limit is not limited as long as they have the same function. Alternatively, the above-mentioned number as the lower limit is intended to include the upper and lower numbers (or, for example, up and down 10%) of the number. In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the value. The length of a fragment useful herein can be determined by whether or not at least one of the functions of a full-length protein that serves as a reference for the fragment is retained.
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＬＯＸ−１が変性ＬＤＬを認識する機能、ＲＡＧＥがＡＧＥを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。 As used herein, “biological function” refers to a specific function that a gene, nucleic acid molecule or polypeptide may have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples of the antibody include, but are not limited to, generation of specific antibodies, enzyme activity, and imparting resistance. Examples of the present invention include, but are not limited to, a function that LOX-1 recognizes denatured LDL and a function that RAGE recognizes AGE. As used herein, a biological function can be exerted by “biological activity”. As used herein, “biological activity” refers to activity that a certain factor (eg, polynucleotide, protein, etc.) may have in vivo, and exhibits various functions (eg, transcription promoting activity). For example, an activity in which another molecule is activated or inactivated by interaction with one molecule. When two factors interact, their biological activity depends on the binding between the two molecules and the resulting biological change, eg, when one molecule is precipitated with an antibody, the other When molecules also coprecipitate, the two molecules are considered bound. Therefore, seeing such coprecipitation is one method of judgment. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art.
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。 Thus, “activity” indicates or reveals binding (either direct or indirect); affects the response (ie, has a measurable effect in response to some exposure or stimulus); Refers to various measurable indicators, such as the affinity of a compound that directly binds to a polypeptide or polynucleotide of the invention, or the amount of protein upstream or downstream after some stimulation or event or other Similar measures of function are mentioned.
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。 In this specification, the term “interaction” refers to two substances. Force (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state.
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 The term “binding” as used herein means a physical or chemical interaction between two proteins or compounds or related proteins or compounds, or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like. A physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates.
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 As used herein, a first substance or factor “specifically interacts” with a second substance or factor means that the first substance or factor has a second Interacting with a higher affinity than a substance or factor other than a substance or factor (especially another substance or factor present in a sample containing a second substance or factor). Specific interactions for a substance or factor include, for example, when both nucleic acid and protein are involved, such as hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, ligand-receptor reactions, enzyme-substrate reactions, etc. Examples include, but are not limited to, protein-lipid interactions, nucleic acid-lipid interactions, and the like, such as reactions with transcription factor binding sites. Thus, when both a substance or factor is a nucleic acid, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor. Further, for example, when both substances or factors are proteins, the fact that the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor includes, for example, interaction by antigen-antibody reaction, receptor- Examples include, but are not limited to, interaction by a ligand reaction and enzyme-substrate interaction. When two substances or factors include proteins and nucleic acids, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the transcription factor and the transcription factor Interaction between the binding region of the nucleic acid molecule to be included. Therefore, in the present specification, a “factor that specifically interacts” with a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide means an affinity for the biological agent such as the polynucleotide or the polypeptide, The affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides is typically equivalent or higher, preferably significantly (eg, statistically significant) ) Includes the expensive. Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。 As used herein, “contacting” means bringing a compound into physical proximity, either directly or indirectly, to a polypeptide or polynucleotide of the present invention. . The polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
本明細書において「複合体」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合体としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ＬＯＸ−１に関する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合体も使用することができる。 As used herein, “complex” refers to a molecule formed by linking a plurality of molecules such as polypeptides, polynucleotides, lipids, sugars, and small molecules. Examples of such a complex include, but are not limited to, glycolipids and glycopeptides. As used herein, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant or fragment thereof, and a nucleic acid molecule that encodes each variant or fragment as long as it has biological activity with respect to LOX-1. Can be used. Complexes containing such nucleic acid molecules can also be used.
本明細書において使用される場合、用語「３成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質もしくは因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子と、これら第一の物質もしくは因子または第二の物質もしくは因子のいずれかに対して特異的に相互作用する第三の物質もしくは因子との複合体をいう。このような３成分複合体としては、受容体と、そのリガンドと、そのリガンドもしくはリガンド中の成分に特異的に相互作用する因子との複合体が挙げられるが、これに限定されない。最も狭義には、３成分複合体とは、本発明のＣＴＬＤ様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体と、ＬＯＸ−１もしくはＲＡＧＥのリガンドと、これらリガンドに対して特異的に結合する抗体との複合体をいう。３成分複合体を形成するために使用される抗体としては、代表的には、本発明の本発明のＣＴＬＤ様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体のリガンド（例えば、ＭＤＡ化ＬＤＬ、すなわちＭＤＡ−ＬＤＬ）またはリガンドに含まれる成分（例えば、リガンドがＭＤＡ−ＬＤＬの場合には、ＭＤＡ）に特異的に結合する抗体（例えば、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体または抗ＭＤＡ抗体）が挙げられるが、これらに限定されず、上記リガンドを認識する限りにおいて、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体が挙げられる）が使用されてもよい。 As used herein, the term “ternary complex” broadly refers to a first substance or factor and a second substance or factor that specifically interacts with the substance or factor; A complex with a third substance or factor that specifically interacts with either the first substance or factor or the second substance or factor. Examples of such a three-component complex include, but are not limited to, a complex of a receptor, a ligand thereof, and a factor that specifically interacts with the ligand or a component in the ligand. In the narrowest sense, a ternary complex is a CTLD-like domain polypeptide-surfactant binding complex or RAGE-like polypeptide-surfactant complex of the present invention, a LOX-1 or RAGE ligand, and A complex with an antibody that specifically binds to a ligand. The antibodies used to form the ternary complex typically include the CTLD-like domain polypeptide-surfactant binding complex or RAGE-like polypeptide-surfactant complex of the present invention of the present invention. That specifically bind to a ligand (eg, MDA-modified LDL, ie, MDA-LDL) or a component contained in the ligand (eg, MDA if the ligand is MDA-LDL) (eg, an anti-MDA-LDL antibody) Or anti-MDA antibodies), but not limited thereto, as long as the ligand is recognized, antibody fragments (eg, Fab, Fab ′ and F (ab ′) 2, Fd, single chain Fv (scFv), Single chain antibodies) may be used.
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ
Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
As used herein, “stringent conditions” for hybridization means that the complementary strand of a nucleotide strand having similarity or homology to the target sequence preferentially hybridizes to the target sequence, and the similarity Alternatively, it means a condition in which a complementary strand of a nucleotide strand having no homology does not substantially hybridize. The “complementary strand” of a certain nucleic acid sequence refers to a nucleic acid sequence (for example, T for A and C for G) that pair based on hydrogen bonding between the bases of the nucleic acid. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. T m is the temperature at which 50% of the nucleotides complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in equilibrium under a defined ionic strength, pH, and nucleic acid concentration. “Stringent conditions” are sequence-dependent and depend on various environmental parameters. General guidelines for nucleic acid hybridization can be found in Tijsssen (Tijssen (1993), Laboratory Technologies In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part.
I, Chapter 2, “Overview of privacy of the stabilization of the nucleic acid probe”, Elsevier, New York.
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。 Typically, stringent conditions will be those in which the salt concentration is less than about 1.0 M Na +, typically, Na + concentration of approximately 0.01~1.0M in PH7.0～8.3 ( Or other salts) and the temperature is at least about 30 ° C. for short nucleotides (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for long nucleotides (eg, longer than 50 nucleotides). Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide. Stringent conditions herein include hybridization in a buffer solution of 50% formamide, 1M NaCl, 1% SDS (37 ° C.), and washing at 60 ° C. with 0.1 × SSC. It is done.
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。 In the present specification, “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then 0.1 to 2 times the concentration. Means a polynucleotide that can be identified by washing the filter under conditions of 65 ° C. using a SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). To do. Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford Universe. Here, the sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. The “hybridizable polynucleotide” refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions. Specifically, the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% homology with the base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% Examples thereof include a polynucleotide having the above homology, a polynucleotide having a homology of 90% or more, and more preferably a polynucleotide having a homology of 95% or more.
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
As used herein, “highly stringent conditions” are designed to allow hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences and to exclude hybridization of DNA having significant mismatches. Say conditions. Hybridization stringency is primarily determined by temperature, ionic strength, and the conditions of denaturing agents such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridization and washing are 0.0015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 65-68 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M citric acid. Sodium, and 50% formamide, 42 ° C. For such highly stringent conditions, see Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold
Spring Harbor, N, Y .; 1989); and Anderson et al. Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, IV, IRL Press Limited (Oxford, England). See Limited, Oxford, England. If necessary, more stringent conditions (eg, higher temperature, lower ionic strength, higher formamide, or other denaturing agents) may be used. Other agents can be included in the hybridization and wash buffers for the purpose of reducing non-specific hybridization and / or background hybridization. Examples of such other agents include 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinyl pyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO 4 or SDS), Ficoll, Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (or another non-complementary DNA) and dextran sulfate, but other suitable agents can also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8-7.4; however, at typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost pH independent. Anderson et
al. , Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
Factors that affect the stability of the DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by one of ordinary skill in the art to apply these variables and to allow different sequence related DNAs to form hybrids. The melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation: T m (° C.) = 81.5 + 16.6 (log [Na + ]) + 0.41 (% G + C) −600 / N−0.72 (% formamide)
Where N is the length of the duplex formed, [Na + ] is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or wash solution, and% G + C is the (guanine + Cytosine) base percentage. For imperfectly matched hybrids, the melting temperature decreases by about 1 ° C. for each 1% mismatch.
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。 As used herein, “moderately stringent conditions” refers to conditions under which a DNA duplex having a higher degree of base pair mismatch than can be generated under “highly stringent conditions”. . Examples of representative “moderately stringent conditions” are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 50-65 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, and 20 % Formamide, 37-50 ° C. By way of example, “moderately stringent” conditions at 50 ° C. in 0.015 M sodium ion tolerate a mismatch of about 21%.
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。 It will be appreciated by those skilled in the art that there may not be a complete distinction between “highly” stringent conditions and “moderate” stringent conditions herein. For example, at 0.015M sodium ion (no formamide), the melting temperature of perfectly matched long DNA is about 71 ° C. In washing at 65 ° C. (same ionic strength), this allows about 6% mismatch. In order to capture more distant related sequences, one of ordinary skill in the art can simply decrease the temperature or increase the ionic strength.
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
For oligonucleotide probes up to about 20 nucleotides, a reasonable estimate of the melting temperature in 1M NaCl is
Tm = (2 ° C. for one AT base) + (4 ° C. for one GC base pair)
Provided by. The sodium ion concentration in 6 × sodium citrate (SSC) is 1M (Suggs et al., Developmental Biology).
Using Purified Genes, p. 683, Brown and Fox (ed.) (1981)).
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。 A nucleic acid encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a variant or fragment thereof is essentially 1% bovine serum albumin (BSA); 500 mM sodium phosphate (NaPO 4 ); 1 mM EDTA; Low stringency conditions defined by hybridization buffer containing 7% SDS at temperature, and wash buffer containing essentially 2 × SSC (600 mM NaCl; 60 mM sodium citrate); 0.1% SDS at 50 ° C. And more preferably a hybridization buffer comprising 1% bovine serum albumin (BSA) at a temperature of essentially 50 ° C .; 500 mM sodium phosphate (NaPO 4 ); 15% formamide; 1 mM EDTA; 7% SDS, and Essentially 50 ° C. 1 × SSC (3 0 mM NaCl; 30 mM sodium citrate); 1% bovine serum albumin (BSA) at low stringency conditions defined by a wash buffer containing 1% SDS, most preferably essentially at a temperature of 50 ° C .; 200 mM phosphorus Sodium acetate (NaPO 4 ); 15% formamide; 1 mM EDTA; hybridization buffer containing 7% SDS, and essentially 0.5 × SSC at 65 ° C. (150 mM NaCl; 15 mM sodium citrate); 0.1% It can hybridize with one or a portion of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 under low stringency conditions defined by a wash buffer containing SDS.
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。 As used herein, “homology” indicates that, in a comparison of two or more sequences, those sequences evolutionarily share ancestry. Whether two genes have homology can be determined by performing a determination based on similarity by direct comparison of sequences or by a hybridization method under stringent conditions. When judging based on similarity by direct comparison of sequences, the simplest interpretation in the alignment of the similarity measurement process is juxtaposed with the same (or equivalent) character string (base, amino acid residue, etc.) Strings indicate that these regions were ancestral sequences that did not change, and non-identical (or not equivalent) strings were mutations in one sequence It is possible to consider. Gaps (indels) in the alignment are considered to be those in which insertions or deletions have occurred on one side of the sequence. That is, it is understood that the high identity or similarity of these sequences strongly suggests homology in those sequences. Homology is referenced in the design of expression inhibitors.
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。 As used herein, the terms “complementary” or “complement” are used herein to refer to a sequence of a polynucleotide that allows the entire complementary region to directly form a Watson & Crick base pair with another specific polynucleotide. Show. For purposes of the present invention, a first polynucleotide is considered complementary to a second polynucleotide when each base of the first polynucleotide is paired with its complementary base. Complementary bases are generally A and T (or A and U) or C and G. In the present specification, the term “complement” is used as a synonym for “complementary polynucleotide”, “complementary nucleic acid” and “complementary nucleotide sequence”. These terms apply to a pair of polynucleotides based solely on their sequence, and do not apply to the particular set in which the two polynucleotides are effectively in a combined state.
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。 In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene. “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. “Ortholog” is also called an orthologous gene, which is a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, the human and mouse alpha hemoglobin genes are orthologs, but the human alpha and beta hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, orthologs may also be useful in the present invention.
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。 As used herein, “conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. An array. Such base sequence modification methods include restriction enzyme digestion, DNA polymerase, Klenow fragment, DNA ligase treatment and other ligation treatments, site-specific base substitution methods using synthetic oligonucleotides (specification) Site-directed mutagenesis; Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)), but other modifications may also be made by methods usually used in the field of molecular biology. it can. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent modifications (mutations)” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the art, each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan), produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of the polypeptide.
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。 Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure, such as, for example, the binding site of a ligand molecule, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in proteins that still retain their original properties after substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or in the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。 In designing such modifications, the hydrophobicity index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ. Mol. Biol. 157 ( 1): 105-132, 1982). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 .8); Glycine (−0.4); Threonine (−0.7); Serine (−0.8); Tryptophan (−0.9); Tyrosine (−1.3); Proline (−1.6) ); Histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) And arginine (-4.5)).
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタ
ミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン
（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
It is known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in ligand binding capacity). It is well known. In such amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline ( Alanine (−0.5); histidine (−0.5); cysteine (−1.0); methionine (−1.3); valine (−1.5); leucine (−0.5 ± 1); -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。 In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid are similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and isoleucine; However, it is not limited to these.
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。 As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain. Deletion of amino acids means deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。 Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。 As used herein, “substitution, addition and / or deletion” of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, relative to the original polypeptide or polynucleotide. , Replacing, adding, or removing. Such substitution, addition and / or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. These changes in the reference nucleic acid molecule or polypeptide can occur at the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleic acid molecule as long as the desired function (eg, AGE recognition ability, etc.) is retained, or It can occur at the amino-terminal or carboxy-terminal site of the amino acid sequence representing this polypeptide, or can occur anywhere between those terminal sites and is interspersed individually between residues in the reference sequence. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such number is a function (for example, AGE recognition ability, etc.) intended in a variant having the substitution, addition or deletion. As long as it is). For example, such a number can be one or several, and preferably within 20%, within 15%, within 10%, within 5%, or less than 150, less than 100, less than 100, It can be 50 or less, 25 or less, and the like.
本明細書において使用される場合、用語「フレキシブルなリンカー配列」とは、特定の立体構造をとらず、連結される分子の機能に影響を与えない分子をいう。このようなリンカー配列は、当業者に周知である。リンカー配列がある分子に連結した場合に、その分子がとるべき立体構造を妨害せず、その電荷に実質的に影響を及ぼさない限り、どのようなリンカー配列を使用してもよい。 As used herein, the term “flexible linker sequence” refers to a molecule that does not have a specific conformation and does not affect the function of the molecule to be linked. Such linker sequences are well known to those skilled in the art. Any linker sequence may be used as long as it does not interfere with the conformation that the molecule should take when linked to a molecule, and does not substantially affect its charge.
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグ配列は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “tag sequence” refers to a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, to bind a specific substance. A substance (for example, having a relationship such as biotin-avidin or biotin-streptavidin) that serves as a binding partner. Thus, for example, a specific substance to which a tag sequence is bound can be selected by contacting the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound. Such tag sequences are well known in the art. Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like.
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、変性ＬＤＬ、ＡＧＥなど）を検出できるあらゆる因子をいう。 As used herein, the term “detection agent” broadly refers to any agent capable of detecting a target substance (eg, denatured LDL, AGE, etc.).
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “solid phase” refers to a material used interchangeably herein with “substrate” and “substrate” from which the device of the present invention is constructed. A planar support to which molecules such as antibodies can be immobilized. In the present invention, when detecting using the principle of surface plasmon resonance, the solid phase is preferably a glass substrate base material having a metal thin film containing gold, silver or aluminum on one side. In the present invention, when detecting using the principle of the crystal oscillator microbalance, a frequency conversion element (for example, a crystal oscillator or a surface acoustic wave element) is used as a solid phase, and the receptor is directly coupled. One side of the quartz plate is coated with silicone, and the other side is provided with a gold electrode as a solid phase. In the present invention, when a mechanism such as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is used, a microtiter plate is generally used as the solid phase (substrate). The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials. Suitable substrates include beads, gold particles, plates (eg, microtiter plates), test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, metal films, filters, tubes, balls, diamond-like carbon coated stainless steel. However, it is not limited to these.
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。 As such a material for use as a solid phase and a substrate, any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicone, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (also alloys) Natural) and synthetic polymers (including, but not limited to) polystyrene, cellulose, amylose, chitosan, dextran, and nylon. The substrate may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin Organic materials such as polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. In the present invention, a membrane used for blotting such as a nylon membrane, a nitrocellulose membrane, and a PVDF membrane can also be used. When analyzing a high-density material, it is preferable to use a material having hardness such as glass. A preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above.
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。 In this specification, “chip” refers to a micro integrated circuit that has various functions and is a part of a system. In the present specification, a solid phase on which a biotinylated receptor is immobilized is referred to as a receptor chip and / or a receptor microchip.
本明細書において使用される場合、用語「乾燥形態」とは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む検出剤、デバイス、診断剤などにおいて、実質的に水分含量が低下している状態であることをいう。一般的には、「乾燥状態」は、風乾、減圧乾燥などの当該分野で周知の技術を用いて容易に達成することができる。 As used herein, the term “dry form” refers to a detection agent comprising a C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex or RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention. In devices, diagnostic agents, etc., it means that the water content is substantially reduced. In general, the “dry state” can be easily achieved by using techniques well known in the art such as air drying and drying under reduced pressure.
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
(General technology)
Molecular biological techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Sambrook J. et al. et
al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F .; M.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F .; M.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M .; A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1992). Short Protocols in
Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F .; M.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M .; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky. J. et al. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, “Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis”, Yodosha, 1997, etc., which are related in this specification (may be all) Is incorporated by reference.
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。 For DNA synthesis technology and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, M. et al. J. et al. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRLPpress; Gait, M .; J. et al. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F .; (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac, IRL Press; Adams, R .; L. etal. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G .; M.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G .; T. T. et al. (I996). Bioconjugate Technologies, Academic Press, etc., which are incorporated herein by reference in the relevant part.
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。 The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and fragments and variants thereof used in the present invention can be produced using genetic engineering techniques.
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。 In the present specification, when referring to a gene, “vector” or “recombinant vector” refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell. Such vectors can be autonomously replicated in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, individual animals and individual plants, or can be integrated into chromosomes. Examples include those containing a promoter at a position suitable for nucleotide transcription. Among vectors, a vector suitable for cloning is called “cloning vector”. Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites that contain multiple restriction enzyme sites. Such restriction enzyme sites and multiple cloning sites are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and use them according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra). Preferred vectors include, but are not limited to, plasmids, phages, cosmids, episomes, viral particles or viruses and integratable DNA fragments (ie, fragments that can be integrated into the host genome by homologous recombination).
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。 One type of vector is a “plasmid”, which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, wherein additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) can replicate autonomously in the host cell into which they are introduced. Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) are integrated into the host cell's genome upon introduction into the host cell, and are thereby replicated along with the host genome. Furthermore, certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”.
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。 Therefore, in the present specification, an “expression vector” or “expression plasmid” refers to a nucleic acid in which various regulatory elements are linked in a state capable of operating in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. An array. Regulatory elements can preferably include terminators, selectable markers such as drug resistance genes, and enhancers. It is well known to those skilled in the art that the type of organism (eg, mammalian) expression vector and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。 “Recombinant vectors” for prokaryotic cells that can be used in the present invention include pcDNA3 (+), pBluescript-SK (+/−), pGEM-T, pEF-BOS, pEGFP, pHAT, pUC18, pFT-DEST ™ 42GATEWAY And pENTR ™ / D-TOPO (Invitrogen). Prokaryotic cells can be used for gene amplification and modification.
本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。 “Recombinant vectors” for eukaryotic cells that can be used herein include pECFP (Clontech), pAcGFP (Clontech), pEYFP (Clontech), pDsRED (Clontech), pTRE (Clontech), pCMV (Clontech), pcDNA (Invitrogen), pTarget (Promega), and the like, but are not limited thereto.
本明細書において「哺乳動物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。哺乳動物発現ベクターは、好適には、哺乳動物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。 As used herein, “mammalian expression vector” refers to a nucleic acid sequence to which various regulatory elements such as a promoter that regulates the expression of the gene of the present invention are operably linked in a host cell. As used herein, the term “regulatory sequence” refers to a DNA sequence having a functional promoter and any associated transcription elements (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.). As used herein, the term “operably linked” refers to the operation of a polynucleotide associated therewith and various regulatory elements such as promoters, enhancers and the like that regulate its expression in a host cell so that the gene can be expressed. It is said that it is connected in the obtained state. The mammalian expression vector can suitably include a mammalian gene, a promoter, a terminator, a drug resistance gene and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector and the type of regulatory elements used can vary depending on the host cell.
上記のような哺乳動物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。哺乳動物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＥＣＦＰ系のベクター、ｐｃＤＮＡ系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。 Mammalian expression vectors as described above can be prepared using gene recombination techniques well known to those skilled in the art. For the construction of a mammalian expression vector, for example, a pECFP-based vector, a pcDNA-based vector, and the like are preferably used, but are not limited thereto.
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。 As used herein, “terminator” is a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a gene and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA, and addition of a poly A sequence. Terminators are known to contribute to mRNA stability and affect gene expression levels.
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。 As used herein, the term “promoter” refers to a region on DNA that determines the transcription start site of a gene and directly regulates its frequency, and is a base sequence that initiates transcription upon binding of RNA polymerase. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene.
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。 The promoter may be inducible, constitutive, site specific, or time specific, but is preferably a constitutive promoter or an inducible promoter. Any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as mammalian cells, E. coli, and yeast.
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。 In the present specification, the expression of a promoter is “constitutive” refers to the property that it is expressed in an almost constant amount in all tissues of an organism, regardless of whether the organism is growing or proliferating. Specifically, when Northern blot analysis is performed, for example, at any time point (for example, 2 points or more (for example, 5th day and 15th day)), the same or corresponding sites have almost the same level. When the expression level is observed, the expression is constitutive by definition of the present invention. Constitutive promoters are thought to play a role in maintaining homeostasis of organisms in normal growth environments. The expression “responsiveness” of the promoter of the present invention refers to the property that the expression level changes when at least one factor is given to an organism. In particular, the property of increasing the expression level is called “inducibility” with respect to the factor, and the property of decreasing the expression level is called “decreasing” with respect to the factor. The expression of “decreasing” is a concept that overlaps with “constitutive” expression because it is assumed that expression is observed in the normal state. These properties can be determined by extracting RNA from any part of the organism and analyzing the expression level by Northern blot analysis or quantifying the expressed protein by Western blot. Mammalian cells or mammals (including specific tissues etc.) transformed with a vector incorporating a promoter inducible to the factor together with a nucleic acid encoding the site-specific recombination inducing factor of the present invention, the promoter By using a stimulating factor having an inducing activity, site-specific recombination of site-specific recombination sequences can be performed under certain conditions.
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリアなど）に含まれるＤＮＡを含む。 The polynucleotide of the present invention can be used as it is or modified, linked to an appropriate expression vector using a method well known to those skilled in the art, and introduced into a host cell by a known gene recombination technique. The introduced gene is incorporated into DNA in the host cell. The DNA in the host cell includes not only the chromosome but also DNA contained in various organelles (for example, mitochondria) contained in the host cell.
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。 When using Escherichia coli as a host cell, promoters derived from Escherichia coli and phage, such as trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, etc., SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. Can be mentioned. An artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp x2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。 As used herein, “replication origin” refers to a specific region on a chromosome where DNA replication begins. The origin of replication can either be provided by constructing the vector to include an endogenous origin, or it can be provided by the host cell's chromosomal replication machinery. The latter may be sufficient if the vector is integrated into the host cell chromosome. Alternatively, rather than using a vector containing a viral origin of replication, one of skill in the art can transform mammalian cells by a method that co-transforms a selectable marker and the DNA of the present invention. Examples of suitable selectable markers are dihydrofolate reductase (DHFR) or thymidine kinase (see US Pat. No. 4,399,216).
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。 As used herein, “operably linked” refers to a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that has the expression (operation) of a desired sequence. That means. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
In this specification, any technique may be used for introducing a nucleic acid molecule into a cell, and examples thereof include transformation, transduction, and transfection. Such a technique for introducing a nucleic acid molecule is well known in the art and commonly used. For example, Ausubel F. et al. A. Et al. (1988), Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, a separate volume of experimental medicine “Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha, 1997, and the like. Gene transfer can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known conventional techniques.
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。 Moreover, as a method for introducing a vector, any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used. For example, transfection, transduction, transformation, etc. (for example, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, electroporation method, method using particle gun (gene gun), etc.).
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。 As used herein, “transformant” refers to all or part of a living organism such as a cell produced by transformation. Examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like. A transformant is also referred to as a transformed cell, transformed tissue, transformed host, etc., depending on the subject. The cell used in the present invention may be a transformant.
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。 When prokaryotic cells are used in genetic manipulation or the like in the present invention, prokaryotic cells include, for example, prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc. Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1 are exemplified.
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。 As used herein, any method for introducing a DNA can be used as a method for introducing a recombinant vector. For example, a calcium chloride method, an electroporation method [Methods. Enzymol. , 194, 182 (1990)], lipofection method, spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], lithium acetate method and the like.
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。 As used herein, “detection” or “quantification” of gene expression (eg, mRNA expression, polypeptide expression) can be accomplished using appropriate methods, including, for example, mRNA measurement and immunoassay methods. Examples of molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR. Examples of the immunological measurement method include an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and an immunohistochemical staining method. Examples of the quantitative method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array). The DNA array is widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and latest PCR method"). For protein arrays, see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32. Examples of gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like. Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Lab Manual, Editing / Yusuke Nakamura Yodosha (2002), etc., all of which are incorporated herein by reference. Is done.
本明細書において使用される場合、用語「標識」とは、特定の物質を検出するために、この物質に結合することが既知の物質に付加される分子をいう。標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “label” refers to a molecule that is attached to a substance that is known to bind to that substance in order to detect that substance. Examples of labels include, but are not limited to, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and the like.
本明細書において使用される場合、用語「リフォールディング」とは、異常な折り畳みを有するためにその本来有する機能を失っているポリペプチドの異常な構造を解きほぐし、界面活性剤により再凝集を防ぎつつ、サイクロアミロースの包接能を活用してそのポリペプチドの本来の正しい構造に再折りたたみすることをいう。 As used herein, the term “refolding” is used to unravel the abnormal structure of a polypeptide that has lost its original function due to abnormal folding, while preventing reaggregation with a surfactant. This refers to refolding to the original correct structure of the polypeptide by utilizing the inclusion ability of cycloamylose.
本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、液体に溶解すると、溶液の表面張力を著しく減少させる物質をいう。界面活性剤は、溶液の中で臨海ミセル濃度を超えると、ミセルコロイドを形成する。界面活性剤は、親水性基と親油性基とを有するために、両親媒性化合物であり、二相界面で方向配位をして安定な層をなす。界面活性剤は、長鎖脂肪酸塩やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような陰イオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤、さらに両性界面活性剤、ＴｒｉｔｏｎシリーズおよびＴｗｅｅｎシリーズのような非イオン性界面活性剤に分けられる。適切な界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “surfactant” refers to a substance that, when dissolved in a liquid, significantly reduces the surface tension of the solution. A surfactant forms a micelle colloid when it exceeds the sea micelle concentration in the solution. Since the surfactant has a hydrophilic group and a lipophilic group, it is an amphiphilic compound, and forms a stable layer by directional coordination at the two-phase interface. Surfactants include long chain fatty acid salts and anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), cationic surfactants such as cetyltrimethylammonium bromide, amphoteric surfactants, Triton series and Tween. It is divided into nonionic surfactants such as series. Suitable surfactants include, but are not limited to, polyoxyethylene surfactants and ionic surfactants.
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
(Description of Preferred Embodiment)
The description of the preferred embodiment is described below, but it should be understood that this embodiment is an illustration of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to such a preferred embodiment. It should be understood that those skilled in the art can easily make modifications, changes and the like within the scope of the present invention with reference to the following preferred embodiments.
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（Ａ３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｂ３）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｃ１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（Ｃ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｃ３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含み得る。好ましくは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、変性ＬＤＬの認識能を有し得る。好ましいのは、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号４における２３２位および２４９位のアミノ酸に対応するアミノ酸がＡ（アラニン）であるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体である。このポリペプチド部分は、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している。
The C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention comprises:
(A1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(A2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it contains one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 90 and 107, and exhibits the activity of natural LOX-1. An amino acid sequence; and (A3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid sequence is Amino acids at positions 90 and 107 retain the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 2 and exhibit the activity of native LOX-1;
(B1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(B2) An amino acid sequence showing the activity of natural LOX-1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 104 and 121 And (B3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence that is complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and position 104 in the encoded amino acid sequence; And amino acids at positions 121 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 6 and exhibit the activity of native LOX-1;
(C1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(C2) An amino acid sequence showing the activity of natural LOX-1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 172 and 189 And (C3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and position 172 in the encoded amino acid sequence And the amino acid at position 189 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 8 and exhibits the activity of native LOX-1;
A C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex comprising a sequence selected from the group consisting of: Preferably, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention can have a recognition ability for denatured LDL. Preferred is a C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant in which the amino acid corresponding to the amino acids at positions 232 and 249 in SEQ ID NO: 4 is A (alanine) in the amino acid sequence of the C-type lectin-like domain polypeptide. It is a binding complex. This polypeptide portion is not degraded even when exposed to a large excess of protease, and retains the activity of natural LOX-1 by mutating the site.
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて保存的置換を含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体はまた、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している限りにおいて、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて欠失を含んでいてもよい。好ましい欠失としては、（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列において、そのＣ末端から１〜６個目までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、配列番号４におけるアミノ酸配列の２００位〜２０５位までに対応するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは配列番号２のアミノ酸配列の１位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。 In one embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may comprise conservative substitutions in the C-type lectin-like domain polypeptide. In another embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention is also in its C-type lectin-like domain polypeptide as long as it retains the activity of native LOX-1. It may contain a deletion. Preferred deletions include deletion of any one to six amino acids from the C-terminal to the first to sixth amino acids in the amino acid sequences shown in (A1) to (C3), the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Deletion of any amino acid among amino acid sequences corresponding to positions 200 to 205, deletion of amino acid corresponding to amino acid at position 1 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or any combination thereof Can be.
特に好ましいＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体としては、（Ｐ１）〜（Ｘ３）の各アミノ酸配列において、配列番号４における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されているものが挙げられる。 Particularly preferred C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complexes include (P1) to (X3) in the amino acid sequences 144, 155, 172, 243, 256 in SEQ ID NO: 4. Examples include those in which cysteine corresponding to position 264 is retained.
なお別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて別の分子の付加を含んでいてもよい。好ましくは、このような付加は、（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号４の６１位〜１４２位に対応するアミノ酸から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列、リンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列）の付加が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、または他の当該分野で公知のフレキシブルなリンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。 In yet another embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may comprise the addition of another molecule in the C-type lectin-like domain polypeptide. Preferably, such addition is performed by any continuous 1 to 82 amino acids selected from amino acids corresponding to positions 61 to 142 of SEQ ID NO: 4 in the amino acid sequence represented by (A1) to (C3). Examples include, but are not limited to, addition of sequences, linker sequences or repeats thereof, or EGF repeats of LDL receptor-related protein (LRP) (sequences containing epidermal growth factor receptor-like cysteine-rich domains). Preferred linker sequences include, but are not limited to, Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, or other flexible linker sequences known in the art.
特に好ましい実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。 In a particularly preferred embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8. May be included.
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may further comprise a tag sequence. Representative examples of the tag sequence include, but are not limited to, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19.
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。 In preferred embodiments, the polypeptides of the invention may further comprise a label. Representative labels include, but are not limited to, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and the like. Preferred fluorescent labels include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, 1,1′-dioctadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine (DiD) perchlorate, 1, Examples include, but are not limited to, 1′-dioctadecyl-3,3,37,37-tetramethyl-endo-carbocyanine (DiI), Alexa, fluorescent protein, and the like. Preferred chemiluminescent labels include, but are not limited to, luminol, lucigenin and the like. Preferred bioluminescent labels include, but are not limited to, luciferase, aequorin and the like.
好ましい一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、二量体であり得る。さらに好ましくは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、多量体であり得る。別の好ましい一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、ジスルフィド結合によって結合された二量体であり得る。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、単量体で変性ＬＤＬを認識できるので、必ずしも二量体である必要はないが、より高い認識能を発揮するためには、二量体または多量体を形成することが好ましい。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、１４０位（ここでこの番号付けは、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列（配列番号４）に従う）のシステインによって分子間でジスルフィド結合されるのが好ましい。このような分子間ジスルフィド結合によって、生体内で通常発現されているような状態を再現することができ、より高感度な変性ＬＤＬの認識が可能になる。 In a preferred embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may be a dimer. More preferably, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may be multimeric. In another preferred embodiment, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may be a dimer linked by disulfide bonds. The C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention is not necessarily a dimer because it can recognize denatured LDL with a monomer, but to exhibit higher recognition ability. Preferably form dimers or multimers. The C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention is a disulfide bond between molecules by a cysteine at position 140 (where the numbering is according to the amino acid sequence of LOX-1 (SEQ ID NO: 4)). Preferably it is done. Such an intermolecular disulfide bond can reproduce a state normally expressed in a living body, and enables recognition of modified LDL with higher sensitivity.
本発明はまた、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出剤；変性ＬＤＬ検出用キット；動脈硬化などの変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患を診断するための診断剤を包含し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法；変性ＬＤＬ検出システム；ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を包含し得る。上記変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患としては、代表的には、動脈硬化症、冠動脈疾患、動脈炎、動脈硬化症に基づく冠攣縮性狭心症、拡張型心筋症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などなどが挙げられるが、これらに限定されない。 The present invention also provides a denatured LDL detection agent comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex; a denatured LDL detection kit; a diagnosis for diagnosing a disease caused by denatured LDL such as arteriosclerosis. Agents can be included. Furthermore, the present invention may include a method of using these to detect denatured LDL in a sample of a subject; a denatured LDL detection system; a method of assisting in the diagnosis of a disease caused by LDL. The diseases caused by the above-mentioned degenerative LDL are typically arteriosclerosis, coronary artery disease, arteritis, coronary vasospastic angina based on arteriosclerosis, dilated cardiomyopathy, ischemic heart disease (myocardial infarction, Angina, etc.), cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, transient ischemic attack, etc.), aortic aneurysm, renal infarction, hyperlipidemia, etc. .
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のポリペプチドのリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための乾燥粉体、乾燥フィルム、固相化物として提供されてもよい。 The detection agent and diagnostic agent of the present invention may contain excipients well known in the art. It will be understood that any such excipient may be used as long as it does not interfere with the ligand recognition ability of the polypeptide of the present invention. In addition, the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex contained in such a detection agent and kit may be provided as a liquid, or a dry powder or a dry powder to be appropriately prepared at the time of use. It may be provided as a film or a solid phase.
本発明はさらに、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と基材とを含む変性ＬＤＬ検出用デバイス、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む変性ＬＤＬ検出剤などを使用して変性ＬＤＬを検出する方法を包含し得る。 The present invention further includes a modified LDL detection device comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex and a substrate, and a denaturation comprising the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex. A method of detecting denatured LDL using an LDL detection agent or the like can be included.
本発明の方法は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれる変性ＬＤＬと複合体を形成させる工程を包含し得る。一実施形態において、上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液などが挙げられ得るが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。 The method of the present invention comprises the step of bringing the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, device, detection agent, etc. into contact with a sample to form a complex with denatured LDL contained in the sample. Can be included. In one embodiment, the sample can be a body fluid containing LDL. Typically, these body fluids can include, but are not limited to, blood, serum, plasma, spinal fluid, serous cavity fluid, alveolar lavage fluid, and the like. The sample may or may not be pre-labeled.
一実施形態において、本発明の方法は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、上記サンプルと接触させた後に、変性ＬＤＬもしくは変性ＬＤＬに含まれる成分に結合する抗体と接触させて、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と変性ＬＤＬと抗体との３成分複合体を形成させる工程を包含し得る。このように３成分複合体を形成させると、変性ＬＤＬをさらに特異的に検出できる可能性があり、よって、検出される変性ＬＤＬの種類、変性ＬＤＬにおける各種分子の組成などが明らかにできる。使用される好ましい抗体としては、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the method of the present invention includes the above-mentioned C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, device, detection agent and the like contained in denatured LDL or denatured LDL after contacting the sample. Contacting with an antibody that binds to the component may include the step of forming a ternary complex of the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex, the modified LDL, and the antibody. When a ternary complex is formed in this way, there is a possibility that denatured LDL can be detected more specifically. Therefore, the type of denatured LDL to be detected, the composition of various molecules in the denatured LDL, etc. can be clarified. Preferred antibodies used include anti-ApoB antibody, anti-OxLDL antibody, anti-MDA-LDL antibody, anti-acrolein (ACR) antibody, anti-crotonaldehyde (CRA) antibody, antimalondialdehyde (MDA) antibody, anti-4-hydroxy Nonane (HNE) antibody and anti-hexanoyl lysine (HEL) antibody are included, but are not limited thereto.
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。 In one embodiment, the device may take various forms depending on the detection method / detection means employed. Preferred substrates used in the above devices include beads, gold particles, plates (eg, microtiter plates), test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, metal thin films, filters, tubes, balls, Examples include, but are not limited to, diamond-like carbon-coated stainless steel. In a preferred embodiment, the beads are polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, natural resin, plastic, gelatin, silica gel, metal, dextran, polyvinyl alcohol, polystyrene, agarose, polyamino acid, cellulose, hydroxyapatite, polyethylene. , Polysulfone, polypropylene, cellulose acetate, polymethyl methacrylate, cellulose diacetate, beads made from methylene vinyl alcohol, and the like.
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体に付加されている標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, the method of the present invention may include a step of detecting the complex. Means / detection methods for detecting the complex may also vary depending on the label attached to the C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the invention. Representative detection means include optical detection means, physical detection means, and chemical detection means. In a preferred embodiment, the optical detection means generally includes a spectrophotometer, FACS, colorimeter, fluorometer, chemiluminescence detector, electrochemiluminescence detector, image analyzer, microscope, etc. It is not limited to these. In a preferred embodiment, the physical detection means generally includes, but is not limited to, electrical detection, surface plasmon resonance, crystal oscillation microbalance, thermal measurement, and the like. Examples of the chemical detection means generally include, but are not limited to, mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
最も簡便に使用される変性ＬＤＬの検出方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を採用するものである。ＥＬＩＳＡは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。 The most convenient method for detecting denatured LDL is to employ an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA is a binding assay that uses an enzyme and its substrate as a labeling system and is well known in the art.
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方で変性ＬＤＬが検出され、これらのサンプル間で本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と変性ＬＤＬとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中の変性ＬＤＬのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用される。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断され得る。変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患は、代表的には、動脈硬化症、冠動脈疾患、動脈炎、動脈硬化症に基づく冠攣縮性狭心症、拡張型心筋症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。 In the method for supporting diagnosis of a disease caused by denatured LDL of the present invention, a subject (for example, a healthy subject) not suffering from the disease and a subject suspected of suffering from the disease ( Patient) denatured LDL was detected in both samples and the amount of complex of C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex of the present invention and denatured LDL was compared between these samples The relative value of denatured LDL in a subject suspected of being relative to a control subject is calculated. As reference substances, MDA-LDL (normal range: 10 to 80 U / L) and oxidized phosphatidylcholine (normal range: 8.4 U / mL to 17.6 U / mL) are used. These normal ranges can also be referred to. When this relative value is an abnormal value, it can be diagnosed that the patient suffers from the disease. The diseases caused by degenerated LDL are typically arteriosclerosis, coronary artery disease, arteritis, coronary spasm angina based on arteriosclerosis, dilated cardiomyopathy, ischemic heart disease (myocardial infarction, angina) ), Cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, transient ischemic attack, etc.), aortic aneurysm, renal infarction, hyperlipidemia, and systemic lupus erythematosus (SLE) Examples include, but are not limited to, diseases.
本発明の後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し得、ここで該ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｔ１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列；
（Ｔ２）配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｔ３）配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。好ましくは、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、ＡＧＥの認識能を有し得る。好ましいのは、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドのアミノ酸配列各々において、配列番号１０における１１４位、１１７位、２２８位および２７２位に対応するアミノ酸が、それぞれＱ（グルタミン）、Ａ（アラニン）、Ｎ（アスパラギン）、およびＩ（イソロイシン）であるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体である。このポリペプチド部分は、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している。
A late glycation reaction product receptor (RAGE) -like polypeptide-surfactant binding complex of the invention can be provided, wherein the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex comprises
(P1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
(P2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (P3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 12, an amino acid sequence;
(Q1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(Q2) Natural RAGE activity comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95, 206 and 250 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (Q3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 under stringent conditions, the encoded amino acid An amino acid sequence in which the amino acids at positions 92, 95, 206 and 250 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 14;
(R1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37;
(R2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 (R3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, wherein: An amino acid sequence wherein the amino acids at positions 95, 206 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 37;
(S1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39;
(S2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 And (S3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 38, wherein 92 An amino acid sequence in which the amino acids at positions 95, 206 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 39;
(T1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41;
(T2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41, the activity of natural RAGE comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 14, 17, 128 and 172 And (T3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 under stringent conditions, the encoded amino acid An amino acid sequence in which the amino acid sequence at positions 14, 17, 128 and 172 in the sequence retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 41;
(U1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43;
(U2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (U3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 42, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 43; an amino acid sequence;
(V1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45;
(V2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (V3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 45;
(W1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47;
(W2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (W3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 47;
(X1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49;
(X2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (X3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 under stringent conditions, and positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence The amino acid at position holds the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 49;
A sequence selected from the group consisting of: Preferably, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may have AGE recognition ability. Preferably, in each of the amino acid sequences of the RAGE-like polypeptide, the amino acids corresponding to positions 114, 117, 228, and 272 in SEQ ID NO: 10 are Q (glutamine), A (alanine), and N (asparagine, respectively). ) And I (isoleucine), a RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex. By mutating the site, this polypeptide portion is not degraded even when exposed to a large excess of protease, and retains the activity of natural RAGE.
一実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて保存的置換を含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体はまた、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している限りにおいて、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて欠失を含んでいてもよい。好ましい欠失としては、（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０のアミノ酸配列における３７位（リジン）に対応するアミノ酸の位置までの欠失が挙げられる。 In one embodiment, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may comprise conservative substitutions in the RAGE-like polypeptide. In another embodiment, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may also contain a deletion in the RAGE-like polypeptide as long as it retains the activity of native RAGE. . Preferred deletions include deletions up to the amino acid position corresponding to position 37 (lysine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the amino acid sequences shown in (P1) to (X3).
特に好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体としては、配列番号１０における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位におけるシステインに対応するアミノ酸がさらに保持されているものが挙げられる。 Particularly preferred RAGE-like polypeptide-surfactant complexes are those in which amino acids corresponding to cysteines at positions 38, 99, 144, 208, 259 and 301 in SEQ ID NO: 10 are further retained. Can be mentioned.
別の実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて別の分子の付加を含んでいてもよい。好ましくは、このような付加は、（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位に対応するアミノ酸列から選択される任意の連続する１〜２８４個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、または他の当該分野で公知のフレキシブルなリンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。 In another embodiment, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the invention may comprise the addition of another molecule in the RAGE-like polypeptide. Preferably, such addition is to the N-terminal side of any one to 22 amino acid sequences selected from positions 1 to 22 of SEQ ID NO: 10 in the amino acid sequences represented by (P1) to (X3). , Addition of any continuous 1-284 amino acids selected from the amino acid sequence corresponding to positions 121 to 404 of SEQ ID NO: 10, or a flexible linker sequence or a repeated sequence thereof, or an LDL receptor-related protein (LRP) EGF repeats (including but not limited to the addition of sequences containing epidermal growth factor receptor-like cysteine-rich domains. Preferred linker sequences include Gly-Gly-Ser, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 or other flexible linker sequences known in the art including, but not limited to, the amino acid sequence shown in FIG. No.
特に好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、配列番号１２、１４、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。 In a particularly preferred embodiment, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the invention is an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 14, 37, 39, 41, 43, 45, 47 and 49. Can be included.
本発明の一実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。 In one embodiment of the invention, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the invention may further comprise a tag sequence. Representative examples of the tag sequence include, but are not limited to, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19.
好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。 In preferred embodiments, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention may further comprise a label. Representative labels include, but are not limited to, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and the like. Preferred fluorescent labels include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, 1,1′-dioctadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine (DiD) perchlorate, 1, Examples include, but are not limited to, 1′-dioctadecyl-3,3,37,37-tetramethyl-endo-carbocyanine (DiI), Alexa, fluorescent protein, and the like. Preferred chemiluminescent labels include, but are not limited to, luminol, lucigenin and the like. Preferred bioluminescent labels include, but are not limited to, luciferase, aequorin and the like.
本発明はまた、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、ＡＧＥ検出剤；ＡＧＥ検出用キット；糖尿病性血管障害などのようなＡＧＥによって引き起こされる疾患を診断するための診断剤を包含し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法；ＡＧＥ検出システム；ＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を包含し得る。上記ＡＧＥによって引き起こされる疾患としては、糖尿病、非糖尿病性の腎機能障害、糸球体腎炎、糖尿病性血管障害、腎不全、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。 The present invention also provides a diagnostic agent for diagnosing a disease caused by AGE such as an AGE detection agent; an AGE detection kit; a diabetic vascular disorder, and the like, comprising the above RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex. Can be included. Furthermore, the present invention may include a method of using these to detect AGE in a sample of a subject; an AGE detection system; and a method of supporting diagnosis of a disease caused by AGE. The diseases caused by AGE include diabetes, non-diabetic renal dysfunction, glomerulonephritis, diabetic vascular disorder, renal failure, microangiopathy (nephropathy, retinopathy, neurosis, etc.), macrovascular disorder ( Examples include, but are not limited to, ischemic heart disease, cerebrovascular disease, and obstructive arteriosclerosis.
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための乾燥粉体、乾燥フィルム、固相化物として提供されてもよい。 The detection agent and diagnostic agent of the present invention may contain excipients well known in the art. It will be appreciated that such excipients may be any as long as they do not interfere with the ligand recognition ability of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention. In addition, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex contained in such a detection agent and kit may be provided as a liquid, or a dry powder, a dry film, or a solid to be appropriately prepared at the time of use. It may be provided as a compatibilizer.
本発明はさらに、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体と基材とを含むＡＧＥ検出用デバイス、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含むＡＧＥ検出剤などを使用してＡＧＥを検出する方法を包含し得る。 The present invention further provides a device for AGE detection comprising the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex, the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex and a substrate, and the RAGE-like polypeptide-surfactant. A method of detecting AGE using an AGE detection agent containing a binding complex or the like may be included.
本発明の方法は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれるＡＧＥと複合体を形成させる工程を包含し得る。一実施形態において、上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液、尿などが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。 The method of the present invention can include the step of bringing the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex, device, detection agent, and the like into contact with a sample to form a complex with AGE contained in the sample. In one embodiment, the sample may be a body fluid containing protein. Typically, these body fluids include, but are not limited to, blood, serum, plasma, spinal fluid, serous cavity fluid, joint fluid, alveolar lavage fluid, tear fluid, urine and the like. The sample may or may not be pre-labeled.
一実施形態において、本発明の方法は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、上記サンプルと接触させた後に、ＡＧＥもしくはＡＧＥに含まれる成分に結合する抗体と接触させて、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体とＡＧＥと抗体との３成分複合体を形成させる工程を包含し得る。このように３成分複合体を形成させると、ＡＧＥをさらに特異的に検出できる可能性があり、よって、検出されるＡＧＥの種類、ＡＧＥにおける各種分子の組成などが明らかにできる。使用される好ましい抗体としては、抗ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the method of the present invention comprises an antibody that binds to AGE or a component contained in AGE after contacting the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex, device, detection agent, etc. with the sample. Contacting with RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex to form a ternary complex of AGE and antibody. When a ternary complex is formed in this way, there is a possibility that AGE can be detected more specifically. Therefore, the type of AGE to be detected, the composition of various molecules in AGE, etc. can be clarified. Preferred antibodies used include, but are not limited to, anti-hemoglobin A1c (HbA1c) antibody, anti-AGE antibody and anti-carboxymethyllysine antibody.
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレートが挙げられる）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、または金属薄膜などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。 In one embodiment, the device may take various forms depending on the detection method / detection means employed. Preferred substrates used in the above devices include beads, gold particles, plates (for example, microtiter plates), test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, or metal thin films. However, it is not limited to these. In a preferred embodiment, the beads are polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, natural resin, plastic, gelatin, silica gel, metal, dextran, polyvinyl alcohol, polystyrene, agarose, polyamino acid, cellulose, hydroxyapatite, polyethylene. , Polysulfone, polypropylene, cellulose acetate, polymethyl methacrylate, cellulose diacetate, beads made from methylene vinyl alcohol, and the like.
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体に付加されている標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, the method of the present invention may include a step of detecting the complex. The means / detection method for detecting the complex may also vary depending on the label attached to the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the invention. Representative detection means include optical detection means, physical detection means, and chemical detection means. In a preferred embodiment, the optical detection means generally includes a spectrophotometer, FACS, colorimeter, fluorometer, chemiluminescence detector, electrochemiluminescence detector, image analyzer, microscope, etc. It is not limited to these. In a preferred embodiment, the physical detection means generally includes, but is not limited to, electrical detection, surface plasmon resonance, crystal oscillation microbalance, thermal measurement, and the like. Examples of the chemical detection means generally include, but are not limited to, mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
最も簡便に使用されるＡＧＥの検出方法は、分解反応後のＨＰＬＣ分析、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を採用するものである。ＥＬＩＳＡでは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。 The most easily used AGE detection method employs HPLC analysis after decomposition reaction and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA is a binding assay using an enzyme and its substrate as a labeling system and is well known in the art.
本発明のＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方でＡＧＥが検出され、これらのサンプル間で本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体とＡＧＥとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中のＡＧＥのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））が使用される（「今日の臨床検査 ２００７−２００８」発行所 株式会社 南江堂、参照）。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断される。ＡＧＥによって引き起こされる疾患は、代表的には、糖尿病、非糖尿病性の腎機能障害、糸球体腎炎、糖尿病性血管障害、腎不全、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。 In the method for supporting diagnosis of a disease caused by AGE of the present invention, a subject (for example, healthy person) sample not suffering from the disease and a subject (patient) suspected of suffering from the disease ) A test in which the disease is suspected by detecting AGE in both samples and comparing the amount of the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex of the present invention and the complex of AGE between these samples. The relative value of AGE in the body relative to the control subject is calculated. As reference substances, pyralin (normal range: less than 23 pmol / mL in plasma) and pentosidine (normal range: 0.00915-0.0431 μg / mL in plasma (when measured by ELISA)) are used (“Today's (Clinical laboratory 2007-2008 ”publisher, Nanedo Co., Ltd.). These normal ranges can also be referred to. When this relative value is an abnormal value, it is diagnosed that the patient suffers from the disease. The diseases caused by AGE are typically diabetic, non-diabetic renal dysfunction, glomerulonephritis, diabetic vasculopathy, renal failure, microangiopathy (nephropathy, retinopathy, neurosis, etc.), large Vascular disorders (including but not limited to ischemic heart disease, cerebrovascular disease, obstructive arteriosclerosis).
（ＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の生成）
１つの局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供する。この方法は、Ｃ型レクチン様ドメインペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチドを大腸菌で封入体として大量生産する工程を包含し得る。大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、（１）封入体を形成しない（または少量のみの封入体を形成する）宿主細菌細胞の使用、（２）封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、（３）形成された封入体のリフォールディング、または、（４）これら（１）〜（３）の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、本発明の方法は、さらに該封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングする工程を包含し得る。
(Generation of CTLD-like polypeptide-surfactant binding complex and RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex)
In one aspect, the present invention provides a method for producing a C-type lectin-like domain polypeptide-surfactant binding complex and a RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex. This method can include the step of mass producing a C-type lectin-like domain peptide or RAGE-like polypeptide as inclusion bodies in E. coli. When a large amount of foreign protein is expressed using bacterial host cells such as E. coli, inclusion bodies are often formed. Inclusion bodies have abnormal polypeptide folding, and therefore often lose the functions inherent to the polypeptide. Therefore, (1) use of host bacterial cells that do not form inclusion bodies (or form only a small amount of inclusion bodies), (2) culture of host bacterial cells under conditions that do not form inclusion bodies, (3) formed It is necessary to use refolding of inclusion bodies or (4) a combination of these (1) to (3). For each of these, without limitation, for example, the method of the present invention may further comprise the step of refolding the inclusion bodies with a surfactant and cycloamylose.
本明細書において、封入体として発現された本発明のポリペプチドのリフォールディングは、変性剤により間違った高次構造を解きほぐした後、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中、または環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中で行われる。本明細書において使用される環状糖質サイクロアミロース（ＣＡと略す）の重合度の下限は１７以上、好ましくは３０以上、より好ましくは５０以上であり、重合度の上限は５００以下、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下である。 In the present specification, the refolding of the polypeptide of the present invention expressed as an inclusion body contains cyclic carbohydrate cycloamylose and a polyoxyethylene-based surfactant after unraveling the wrong higher-order structure with a denaturing agent. It is carried out in a solution or in a solution containing cyclic carbohydrate cycloamylose and an ionic surfactant. The lower limit of the degree of polymerization of cyclic saccharide cycloamylose (abbreviated as CA) used herein is 17 or more, preferably 30 or more, more preferably 50 or more, and the upper limit of the degree of polymerization is 500 or less, preferably 200. Below, more preferably 100 or less.
上記リフォールディング法に使用されるポリオキシエチレン系界面活性剤としては、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨと表され、通常ＣｎＥｘと略記されるポリオキシエチレン系界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。 The polyoxyethylene surfactant used in the refolding method is represented by the general formula C n H 2n + 1 (OCH 2 CH 2 ) x OH, and is usually abbreviated as C n E x Activators, preferably polyoxyethylene sorbitan ester, polyoxyethylene dodecyl ether, polyoxyethylene heptamethylhexyl ether, polyoxyethylene isooctyl phenyl ether, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester or sucrose fatty acid ester For example, but not limited to.
上記リフォールディング法に使用されるイオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−[(３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸、ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムブロマイド（以下、ＣＴＡＢと略記することもある。）、ミリスチルサルフォベタイン（以下、ＳＢ３−１４と略記することもある。）などが挙げられ、特に、ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４などのカチオン系、ないしは両性界面活性剤が望ましいが、これらに限定されない。
Examples of ionic surfactants used in the refolding method include cetyltrimethylammonium bromide, sodium dodecyl sulfate, sodium deoxycholate, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid , Hexadecyltrimethylammonium bromide (hereinafter sometimes abbreviated as CTAB), myristyl sulfobetaine (hereinafter sometimes abbreviated as SB3-14), and the like, and in particular, CTAB, SB3-14 and the like. Cationic or amphoteric surfactants are preferred, but not limited thereto.
正しい高次構造にリフォールディングする際に使用する特に好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロマイド（ＣＴＡＢ）、デオキシコール酸ナトリウム、ミリスチルサルフォベタイン（ＳＢ３−１４）等が挙げられる。 Particularly preferred surfactants for use in refolding to the correct higher order structure include polyoxyethylene sorbitan ester, polyoxyethylene dodecyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester or sucrose fatty acid ester, hexadecyltrimethylammonium promide (CTAB) , Sodium deoxycholate, myristyl sulfobetaine (SB3-14), and the like.
界面活性剤を過剰量に添加することにより、ポリペプチドなどを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド−界面活性剤複合体を形成させて、ポリペプチド同士の凝集を防ぐことができる。また、環状糖質としては、前記したように、重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンなどを挙げることができる。 By adding an excessive amount of surfactant, it is possible to dilute a substance in which a polypeptide or the like is in a denatured state and to form a polypeptide-surfactant complex to prevent aggregation between the polypeptides. . Examples of the cyclic saccharide include cyclic α-1,4-glucan having a polymerization degree of 17 or more as described above.
また、リフォールディングしたポリペプチドをアビジンもしくはストレプトアビジンを介して方向性を保った状態で固相上に固定し、例えばマイクロタイタープレート、ビーズなどに結合させたり、表面プラズモン共鳴や水晶発振子マイクロバランスなどの原理を利用した検出機器のセンサー部位として利用したりすることによって、変性ＬＤＬまたはＡＧＥなどを簡便に検出することが可能である。 In addition, the refolded polypeptide is immobilized on a solid phase while maintaining its orientation via avidin or streptavidin, and is bound to, for example, a microtiter plate or a bead, or surface plasmon resonance or quartz crystal microbalance. It is possible to detect denatured LDL or AGE easily by using it as a sensor part of a detection device using the principle such as.
上記リフォールディング法に従って、間違った構造を取っているポリペプチドの構造を変性剤により解きほぐした後、過剰量の界面活性剤を添加することにより、本発明のポリペプチドを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド−界面活性剤複合体を形成させ、ポリペプチド同士の凝集を防ぎ、次いで重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記ポリペプチド−界面活性剤複合体から界面活性剤を除き、ポリペプチドを、リガンド認識能を有する正しい高次構造に戻し、センサーとして利用することも可能である。 In accordance with the above refolding method, the structure of a polypeptide having an incorrect structure is unraveled with a denaturing agent, and then an excessive amount of a surfactant is added to thereby denature the substance of the polypeptide of the present invention. While diluting, a polypeptide-surfactant complex is formed, aggregation between the polypeptides is prevented, then cyclic α-1,4-glucan having a polymerization degree of 17 or more is added, and its inclusion ability is utilized. It is also possible to remove the surfactant from the polypeptide-surfactant complex, return the polypeptide to the correct higher-order structure having ligand recognition ability, and use it as a sensor.
大腸菌内に蓄積した本発明のポリペプチドのリガンド認識に関係する領域の再構成は、第１段階として、不溶性画分に回収された受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩中で１時間処理し、間違った構造を解きほぐすことにより行う。続いて、第２段階として、７０倍容量の０．０１〜０．１５％の範囲の界面活性剤溶液、好ましくは、０．０５〜０．１％界面活性剤溶液（最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ）を添加し、室温で１時間反応させる。 Reconstitution of the region related to ligand recognition of the polypeptide of the present invention accumulated in E. coli, as a first step, the extracellular region of the receptor or the ligand recognition region recovered in the insoluble fraction was converted to a final concentration of 40 mM. 1 hour treatment in 6M guanidine hydrochloride containing the DTT and unraveling the wrong structure. Subsequently, as a second step, 70 times the volume of the surfactant solution in the range of 0.01 to 0.15%, preferably 0.05 to 0.1% surfactant solution (2 mM DL at the final concentration). -TBS containing cysteine) is added and allowed to react at room temperature for 1 hour.
この過程で、変性剤が希釈されると同時に、変性剤の希釈に伴う受容体同士の凝集は、添加した界面活性剤が受容体・界面活性剤複合体を形成することにより防止される。さらに、最終段階として、最終濃度で０．６％になるように３％のＣＡ保存溶液を添加し、室温で１時間反応させる。ＣＡは、受容体・界面活性剤複合体から界面活性剤を剥離する。この過程で受容体は正しい立体構造にリフォールディングされ、再構成受容体を得ることができる。 In this process, the denaturant is diluted, and at the same time, aggregation of the receptors due to the dilution of the denaturant is prevented by the added surfactant forming a receptor / surfactant complex. Furthermore, as a final step, a 3% CA stock solution is added to a final concentration of 0.6% and allowed to react at room temperature for 1 hour. CA strips the surfactant from the receptor / surfactant complex. In this process, the receptor is refolded into the correct conformation, and a reconstituted receptor can be obtained.
上記リフォールディング法に用いる変性剤としては、グアニジン塩酸塩、尿素などがあるが、間違った構造を完全に解きほぐす目的で、最終濃度で６Ｍのグアニジン塩酸塩を一般に用いる。また、間違って形成されているＳ−Ｓ結合を切断する目的で、変性剤溶液中には最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを添加する。処理するタンパク質濃度は、１０〜２５ｍｇ／ｍ１程度である。封入体をＴＢＳに懸濁した後、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む最終濃度６Ｍのグアニジン塩酸塩を加え、室温で１時間反応させる。 Examples of the denaturing agent used in the refolding method include guanidine hydrochloride and urea, but 6M guanidine hydrochloride is generally used at a final concentration for the purpose of completely unraveling the wrong structure. In addition, 40 mM DTT is added to the denaturant solution at the final concentration for the purpose of cleaving the S—S bond formed by mistake. The protein concentration to be processed is about 10 to 25 mg / m1. After suspending the inclusion bodies in TBS, a final concentration of 6 M guanidine hydrochloride containing 40 mM DTT is added and allowed to react at room temperature for 1 hour.
発現させたポリペプチド（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチド）を封入体として大腸菌内に蓄積させた後、上記したように、グアニジン塩酸塩などの変性剤を用いて間違った高次構造を解きほぐす。続いて、変性状態にあるビオチン化ポリペプチドに過剰量の界面活性剤を添加することにより、ポリペプチドを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド同士の凝集を防ぐ。 After the expressed polypeptide (for example, CTLD-like polypeptide or RAGE-like polypeptide) is accumulated in E. coli as inclusion bodies, as described above, a wrong higher-order structure is used using a denaturing agent such as guanidine hydrochloride. Unravel. Subsequently, an excessive amount of a surfactant is added to the biotinylated polypeptide in a denatured state, thereby diluting a substance that has denatured the polypeptide and preventing aggregation of the polypeptides.
次いで、環状糖質、例えば重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記界面活性剤を除き、正しい高次構造にリフォールディングし、リガンド認識能を有した状態に変換する。発現させたポリペプチドを利用して変性ＬＤＬまたはＡＧＥなどを検出する。アビジンもしくはストレプトアビジン等を介して方向性を保った状態でチップ、キュベット等の固相上に固定し、これをセンサー（すなわち、受容体チップ）として使用する。 Subsequently, a cyclic carbohydrate, for example, a cyclic α-1,4-glucan having a degree of polymerization of 17 or more is added, the surfactant is removed using its inclusion ability, refolding into a correct higher-order structure, and a ligand Convert to a state with recognition ability. Denatured LDL or AGE is detected using the expressed polypeptide. It is fixed on a solid phase such as a chip or a cuvette while maintaining the direction through avidin or streptavidin, and this is used as a sensor (that is, a receptor chip).
上記リフォールディングを用いることによって、封入体として発現されたＣＴＬＤ様ポリペプチド、ＲＡＧＥ様ポリペプチドをリフォールディングして、正常な変性ＬＤＬ結合活性またはＡＧＥ結合活性を有するポリペプチドとすることが可能である。 By using the above refolding, it is possible to refold the CTLD-like polypeptide and RAGE-like polypeptide expressed as inclusion bodies to obtain a polypeptide having normal denatured LDL-binding activity or AGE-binding activity. .
上記工程によって得られたポリペプチドは、混在している他のタンパク分子から分離されているという意味でそれ自体純度が非常に高いため、本発明において実際に使用する際にはこのポリペプチドをさらに精製してもよいし、精製せずそのまま使用してもよい。上記工程によって得られたポリペプチドには、本来の天然型のポリペプチドには結合していない、リフォールディング工程で使用した界面活性剤が結合している。これまで、このような再生されたタンパク質は、溶液中の遊離の界面活性剤だけでなく、ポリペプチドに結合している界面活性剤も、リフォールディング工程の後に除去する必要があると考えられていた。なぜなら、例えば、アッセイ系などで使用する場合において、界面活性剤が残っていると測定時に何らかの悪影響があると考えられていたからである。しかしながら、これに反して、本発明者らは、余分な界面活性剤分子も、再生（リフォールディング）されたポリペプチドに結合した界面活性剤分子も、除去する必要がないことを見いだした。むしろ、再生されたポリペプチドを界面活性剤と結合したままにすることで、界面活性剤分子を全く含んでいない天然型のポリペプチドと比較して、結合能などが天然型のポリペプチドと何ら遜色ないばかりか、アッセイ系で使用した場合にバックグランド値の低下がもたらされ、測定のＳ／Ｎ比が上昇した。その理由としては、再生されたタンパク質（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチド）における物性が、可溶性ポリペプチドとして発現したタンパク質とは異なることが挙げられる。結果的に、リフォールドされたポリペプチドの精製工程および界面活性剤の除去工程は省略可能であり、生成しようとするポリペプチド（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチド）の製造工程が簡略化されて、製造コストの低下がもたらされる。 Since the polypeptide obtained by the above process is very pure in the sense that it is separated from other protein molecules present in the mixture, this polypeptide is further used in actual use in the present invention. You may refine | purify and may use it as it is, without refine | purifying. The surfactant obtained in the refolding step, which is not bound to the original natural polypeptide, is bound to the polypeptide obtained by the above step. To date, it has been thought that such regenerated proteins need to remove not only the free surfactant in solution, but also the surfactant bound to the polypeptide after the refolding step. It was. This is because, for example, when used in an assay system or the like, if a surfactant remains, it was considered that there was some adverse effect at the time of measurement. On the other hand, however, the inventors have found that it is not necessary to remove excess surfactant molecules or surfactant molecules bound to the refolded polypeptide. Rather, by leaving the regenerated polypeptide bound to the surfactant, the binding ability and the like of the native polypeptide are not compared to those of the natural polypeptide that does not contain any surfactant molecules. Not only inferior, but when used in the assay system, it resulted in a decrease in the background value and an increase in the S / N ratio of the measurement. The reason is that the physical properties of the regenerated protein (for example, CTLD-like polypeptide) are different from the protein expressed as a soluble polypeptide. As a result, the purification process of the refolded polypeptide and the surfactant removal process can be omitted, and the production process of the polypeptide to be produced (eg, CTLD-like polypeptide) can be simplified and produced. Cost reduction is brought about.
上記のリフォールディング方法によって生成されたタンパク質もまた、本発明の範囲に包含され得ることが理解される。 It will be understood that proteins produced by the above refolding methods may also be encompassed within the scope of the present invention.
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明のリフォールディングされたポリペプチドの、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患（例えば、動脈硬化症など）、またはＡＧＥによって引きおこされる疾患（例えば、糖尿病性血管障害）を診断するための薬剤を製造するための使用を提供する。ここで使用されるポリペプチドは、本明細書において上記される任意のものであり得ることが理解される。
(use)
In another aspect, the invention relates to a disease caused by denatured LDL (eg, arteriosclerosis, etc.) or a disease caused by AGE (eg, diabetic vasculopathy) of the refolded polypeptide of the invention. The use for the manufacture of a medicament for diagnosing is provided. It will be appreciated that the polypeptide used herein may be any of those described herein above.
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。 References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described with reference to the preferred embodiments for easy understanding. In the following, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided only for the purpose of illustration, not for the purpose of limiting the present invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described in the present specification, but is limited only by the scope of the claims.
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
(Materials and methods)
In the examples described below, unless otherwise specified, experiments were generally conducted using the materials and methods described below.
（実施例１：ＬＯＸ−１は、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出することにおいてより安定な変性ＬＤＬ認識分子を得るために、ＬＯＸ−１のリガンド認識に必須のＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；ＬＯＸ−１のアミノ酸配列の１４３位〜２７３位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
(Example 1: LOX-1 is degraded by a large excess of protease)
In order to obtain a denatured LDL recognition molecule that is more stable in detecting denatured LDL and AGE, the present inventors have obtained a C-type lectin-like domain (CTLD; LOX-1 amino acid sequence) essential for ligand recognition of LOX-1. (Positions 143 to 273) were tested for stability against proteases.
ｃＤＮＡライブラリーを、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）から単離したｍＲＮＡ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）により、コピーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｗａｍｕｒａら（Ｎａｔｕｒｅ ３８６（６６２０），７３−７７（１９９７））に示される配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５４３もまた参照のこと）に基づいて、ＣＴＬＤに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡ−３’（順方向プライマー；配列番号２０）；および
５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２１）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
A cDNA library was constructed from mRNA isolated from human aortic endothelial cells (HAEC) (Whittaker, Walkersville, MD, USA) using a copy kit (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Based on the sequence shown in Sawamura et al. (Nature 386 (6620), 73-77 (1997)) (see also GenBank accession number NM_002543), two specific primers compatible with CTLD:
5′-GTGCCAGGATCCCCATATCCCTTGTCCCCAAGACTGGA-3 ′ (forward primer; SEQ ID NO: 20); and 5′-CAGCTCGAGGTCACTGTGCTCTAGTAGTTTGCC-3 ′ (reverse primer; SEQ ID NO: 21)
Was amplified using. Amplified transcripts were confirmed by DNA sequence analysis using an ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, Forster City, CA, USA).
増幅転写物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
Amplified transcripts were obtained from ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE
(Applied Biosystems, Forster City, CA, USA).
Ｎ末端ビオチン化タンパク質を生産するために、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩ切断部位の上流に、ＡｖｉＴａｇをコードする配列を挿入し、ｐＥＴ Ｎ−Ａｖｉベクターを構築した。ＣＴＬＤをコードするＤＮＡ（配列番号１）をＮｄｅＩ切断部位、ＸｈｏＩ切断部位でｐＥＴ Ｎ−Ａｖｉにクローニングした。ＣＴＬＤ内の分子間Ｓ−Ｓ結合を正しく構成するため、発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。上記で得られたベクターを、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＣＴＬＤの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導し、２０℃で２０時間培養した後、菌体を収菌後、ＴＢＳにて洗浄し超音波破砕した。９５％程度のＣＴＬＤは封入体を形成し、可溶性ポリペプチドとして得られるのは、５％程度であったが、可溶性ポリペプチド画分をＮｉ−アガロースに吸着させた後、イミダゾールによる濃度勾配で溶出し、ＣＴＬＤを部分精製した。得られたＣＴＬＤは、Ｎｉ−アガロース上に固定した状態で、ＤｉＤ−ＡｃＬＤＬを認識し結合することを確認した。 In order to produce an N-terminal biotinylated protein, a sequence encoding AviTag was inserted upstream of the NdeI cleavage site of pET22b (Novagen, Madison, WI) to construct a pET N-Avi vector. A DNA encoding CTLD (SEQ ID NO: 1) was cloned into pET N-Avi at the NdeI cleavage site and the XhoI cleavage site. Origami B (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host in order to correctly construct intermolecular S—S bonds in CTLD. The vector obtained above was transformed into Origami B (DE3). Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. In the case of adding AviTag, a vector containing a nucleic acid sequence encoding AviTag and a target protein and an expression vector containing a BirA gene were transformed at the same time. The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 25 ° C. in LB medium. The expression of CTLD was induced by adding IPTG and cultured at 20 ° C. for 20 hours. After harvesting the cells, the cells were washed with TBS and sonicated. About 95% of CTLD forms inclusion bodies, and about 5% was obtained as a soluble polypeptide. After the soluble polypeptide fraction was adsorbed to Ni-agarose, it was eluted with a concentration gradient with imidazole. CTLD was partially purified. The obtained CTLD was confirmed to recognize and bind to DiD-AcLDL while immobilized on Ni-agarose.
このようにして得られたＣＴＬＤ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのＣＴＬＤ含む）の系で行い（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ユニット（１ｕ）は、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度である）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加してプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色に供したところ、低分子領域にＣＴＬＤの断片が認められた（図３を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のＲ２３１とＧ２３２の間、およびＲ２４８とＧ２４９との間に対応する位置で切断され、この切断部位はＬＯＸ−１のリガンド認識に必須なアミノ酸残基を含むことが明らかになった（図５を参照のこと）。 The CTLD (0.25 mg / mL) thus obtained was treated with protease. The reaction was performed in a 0.1 ml system (containing 0.02 mg of CTLD at a final concentration) (20 mM Tris, pH 8.4, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 ), 2 units of thrombin (1 unit (1 u) was 10 u enterokinase (1 u is the concentration capable of degrading 0.05 mg of the protein of interest), or 10 u of factor Xa (1 u is 0.05 mg of the subject of interest) The protein was allowed to react at 25 ° C. for 18 hours. After 18 hours, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) was added and immediately after stopping the reaction, the reaction product was processed for SDS-PAGE according to a standard method. In the target section that was not treated with protease, PMSF was added at the same time as protease addition to inactivate the protease, and the sample was immediately subjected to sample processing for SDS-PAGE and stored at -20 ° C. When the protease-treated group and the untreated group were electrophoresed by SDS-PAGE and subjected to Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining, a CTLD fragment was observed in the low-molecular region (see FIG. 3). Furthermore, when peptide mapping was performed, CTLD was cleaved at the corresponding positions between R231 and G232 of LOX-1 and between R248 and G249, and this cleavage site is essential for ligand recognition of LOX-1. It was revealed to contain amino acid residues (see FIG. 5).
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成を試みた。 Therefore, the present inventors tried to produce a CTLD-like polypeptide imparted with protease resistance without affecting the ligand recognition ability.
（実施例２：ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例１において得られた知見に基づいて、上記の切断部位２箇所に変異を導入したＣＴＬＤ様ポリペプチド（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ；本実施例中、ＰＲ−ＣＴＬＤともいう）をコードする核酸を、定法に従って生成した。定法に従って、この核酸を、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したＰＲ−ＣＴＬＤコード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％ ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバーガラス上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞が確認できた。また、リガンドである変性ＬＤＬを蛍光色素である過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により標識し、この変性ＬＤＬをＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた（図４）。
Example 2: Production of CTLD-like polypeptide
Based on the knowledge obtained in Example 1, a nucleic acid encoding a CTLD-like polypeptide (G232A / G249A; also referred to as PR-CTLD in this example) in which mutations were introduced at the two cleavage sites described above was determined in a conventional manner. Produced according to By introducing this nucleic acid into a mammalian expression vector pECFP (Clontech, USA) fused with cyan fluorescent protein (CFP) according to a standard method, a plasmid containing PR-CTLD-encoding nucleic acid fused with CFP at the N-terminus is obtained. It was constructed. CHO cells were cultured in F12 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . 400 μl of CHO cells suspended at a density of 1 × 10 4 cells / ml were seeded on a cover glass 24 hours before transfection. Cells were transfected with LipofectAMINE reagent according to the manufacturer's protocol, incubated for 48 hours and transiently expressed in CHO cells. Thereafter, the cells were observed with a fluorescence microscope, and CTLD-like polypeptide-expressing cells were confirmed by CFP fluorescence. Further, the modified LDL as a ligand is labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine (DiD; Molecular Probes, Eugene, OR) as a fluorescent dye. When this modified LDL was added to CTLD-like polypeptide-expressing cells, the ligand recognition ability and uptake ability could be confirmed (FIG. 4).
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性を付与するために行ったアミノ酸置換は、変性ＬＤＬ認識能には何ら影響を与えていないことが示された。 From these results, PR-CTLD expressing cells showed a clear ligand uptake ability, and it was shown that the amino acid substitution performed for conferring protease resistance had no effect on the ability to recognize denatured LDL. .
さらに、このＰＲ−ＣＴＬＤのプロテアーゼ感受性を検討したところ、２ｕ（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）のトロンビンで、０．０２ｍｇのＰＲ−ＣＴＬＤを１８時間処理しても分解が起こらないことが確認され、プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）を生成することに成功した（図３）。 Furthermore, when the protease sensitivity of this PR-CTLD was examined, degradation occurred even when 0.02 mg of PR-CTLD was treated for 18 hours with 2u (1u is a concentration capable of degrading 1 mg of the target protein) thrombin. It was confirmed that there was no protease, and a protease-resistant CTLD-like polypeptide (PR-CTLD) was successfully produced (FIG. 3).
（実施例３：タグ配列付加ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例２において生成したＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）に加えて、さらに、ＣＴＬＤ様ポリペプチドと同様のプロテアーゼ耐性変異を導入した長さの異なるタンパク質ＰＲ−ＣＴＬＤ１４（ネック領域の１４アミノ酸を含む、ＬＯＸ−１のアミノ酸１２９位〜２７３位；図５）を作成した。ＰＲ−ＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列には分子間Ｓ−Ｓ結合に関与するＣｙｓが含まれる。分子間Ｓ−Ｓ結合を形成しなくても認識能はあるが、細胞上で機能を発現する際には、一定以上の分子密度をとる必要がある（Ｘｉｅら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３（２）：１１１−１１７（２００４）およびＭａｔｓｕｎａｇａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１３：１２０３−１２１４（２００７））。そこで、高密度集積に寄与し得る構造として分子間Ｓ−Ｓ結合形成が可能なＰＲ−ＣＴＬＤ１４もまた、実施例２と同様に生成して、変性ＬＤＬを検出するアッセイ系を構築するのに使用した。
(Example 3: Production of tag sequence-added CTLD-like polypeptide)
In addition to the CTLD-like polypeptide generated in Example 2 (PR-CTLD), the protein PR-CTLD14 (including 14 amino acids in the neck region) having a different length in which a protease resistance mutation similar to that of the CTLD-like polypeptide is introduced. , Amino acids 129 to 273 of LOX-1; FIG. 5). The amino acid sequence of PR-CTLD14 includes Cys involved in intermolecular S—S bond. Although there is recognition ability without forming an intermolecular S—S bond, it is necessary to take a molecular density of a certain level or higher when expressing a function on a cell (Xie et al., DNA and Cell Biology 23 (2 ): 111-117 (2004) and Matsunaga et al., Experimental Cell Research 313: 1203-1214 (2007)). Therefore, PR-CTLD14 capable of forming an intermolecular SS bond as a structure that can contribute to high-density integration is also produced in the same manner as in Example 2 and used to construct an assay system for detecting denatured LDL. did.
発現させたプロテアーゼ耐性のＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８））またはＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの５’側に、タグ配列をコードする核酸配列を導入して発現用プラスミドとした（ｐＥＴ Ｎ−Ａｖｉ、ｐＥＴ Ｎ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターそれぞれにＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入し、発現用プラスミドを作製した（ＢｉｒＡ／ｐＡＣ）。 When utilizing the expressed protease-resistant CTLD-like polypeptides (PR-CTLD and PR-CTLD14) in a detection / evaluation system, it is desirable that effective modifications are applied. Therefore, two types of tags (one sequence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 17)) undergoing biotinylation in E. coli and the other are Streptag (AWRHPQFGGG), which is a sequence directly recognized by streptavidin. (SEQ ID NO: 18)) or Streptag II (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 19)) was added, and the binding of biotin and streptavidin was the strongest by non-covalent bond (KD = 10 −15 M), immobilization via streptavidin, etc. However, in order to biotinylate, it takes time and effort to add biotin to the medium and to co-express biotin ligase. (KD = 10 −7 M), tag added on gene sequence and colon A StreptagII (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 19))-added protein capable of binding to streptavidin when expressed in bacteria was also generated, and in each case, a nucleic acid sequence encoding a tag sequence was introduced into the 5 ′ side of the pET system vector. The plasmids for expression (pET N-Avi, pET N-St II) PR-CTLD and PR-CTLD14 were introduced into each of these expression vectors according to a standard method to generate an expression construct. For conversion, a BirA gene encoding biotin ligase was introduced into a pAC vector that can be maintained in the same microbial cell as the pET vector to prepare an expression plasmid (BirA / pAC).
ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、分子内Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチドにＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。 In both PR-CTLD and PR-CTLD14, formation of an intramolecular S—S bond is essential for structural stabilization and function. Therefore, Origami B (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host. Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. When AviTag was added to a protease resistant CTLD-like polypeptide, it was simultaneously transformed with a vector containing a nucleic acid sequence encoding AviTag and the target protein and an expression vector containing a BirA gene. The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 37 ° C. in LB medium. When transformed with an expression vector containing StreptagII-encoding nucleic acid, it was cultured at 37 ° C. in LB medium supplemented with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), and tetracycline (12.5 μg / ml). Expression of PR-CTLD and PR-CTLD14 was induced by adding IPTG.
予備実験として、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）２時間、（Ｂ）４時間、（Ｃ）８時間、（Ｄ）１８時間、（Ｅ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、予想される分子量のタンパク質の誘導が確認されたが、１００％が不溶性画分に回収された。この結果に鑑みて、誘導時間を変動させずに、誘導時の温度を２５℃に下げたところ、わずかながら可溶性ポリペプチドとしての発現が確認された。さらに誘導時の温度を２０℃にまで下げて、誘導時間の検討を行ったところ、可溶性ポリペプチドとして回収するためには、温度条件（３）および誘導時間（Ｄ）１８時間〜（Ｅ）２４時間、特に２０〜２４時間の誘導が適切であると結論付けられた（図６を参照のこと）。 As a preliminary experiment, temperature conditions and induction time for expressing PR-CTLD and PR-CTLD14 as soluble polypeptides were examined. The temperature conditions were set to (1) 37 ° C, (2) 25 ° C and (3) 20 ° C. The induction time was set to (A) 2 hours, (B) 4 hours, (C) 8 hours, (D) 18 hours, and (E) 24 hours. First, these host cells were induced at 37 ° C., and the molecular weight of the induced protein was measured. As a result, induction of the protein having the expected molecular weight was confirmed, but 100% was recovered in the insoluble fraction. In view of this result, when the induction temperature was lowered to 25 ° C. without changing the induction time, expression as a soluble polypeptide was confirmed slightly. Further, the induction time was lowered to 20 ° C. and the induction time was examined. In order to recover the soluble polypeptide, the temperature condition (3) and the induction time (D) 18 hours to (E) 24 It was concluded that induction of time, especially 20-24 hours, was appropriate (see FIG. 6).
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、培養温度を２０℃に下げると同時に、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後２０〜２４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。 The above transformed cells were pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours. In the main culture, this pre-cultured solution was added to each of the LB media so as to be diluted 20-fold, and swirled at 25 ° C. Based on the conditions obtained above, when the optical density (A600) of the culture solution reached about 0.5, the culture temperature was lowered to 20 ° C. and at the same time, 1 mM (final concentration) IPTG was added. Protein expression was induced. When the AviTag-added protein was produced, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and the target protein to be expressed was simultaneously biotinylated. Twenty to 24 hours after the start of induction, the cells were pelleted by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, the supernatant was discarded, and washed with an appropriate amount of TBS.
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。発現された目的タンパク質の９０％以上が不溶性画分に残った。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図７）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｕｔｅｉｎ ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４とも、１Ｌ当たりの収量は、以下の表１に示すように、０．５ｍｇ未満であった。 The bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the supernatant recovered by centrifugation at 15,000 rpm × 30 minutes was used as the soluble fraction. More than 90% of the expressed target protein remained in the insoluble fraction. Since the His protein for purification was added to the C-terminal side, the target protein was purified by eluting with imidazole after binding to Ni-agarose (FIG. 7). AviTag added for detection can also be used for purification. In this case, it was adsorbed on streptavidin Mutein matrix (Roche) and then eluted with biotin. In the case of StrepTag II, it was adsorbed on Strep-Tactin Sepharose (IBA, US) and then eluted with dessiobiotin. For both PR-CTLD and PR-CTLD14, the yield per liter was less than 0.5 mg as shown in Table 1 below.
（実施例４：ＲＡＧＥは、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、ＡＧＥを検出することにおいてより安定なＡＧＥ認識分子を得るために、図８に模式的に示されるＲＡＧＥの細胞外ドメイン（ｓＲＡＧＥ１；ＲＡＧＥのアミノ酸配列の２３位〜３３２位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
(Example 4: RAGE is degraded by a large excess of protease)
In order to obtain a AGE recognition molecule that is more stable in detecting AGE, the present inventors have shown the extracellular domain of RAGE schematically shown in FIG. 8 (sRAGE1; positions 23 to 332 of the amino acid sequence of RAGE). Were tested for stability to proteases.
ヒト肺ｐｏｌｙＡ ＲＮＡを鋳型に逆転写反応後、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、ＲＡＧＥに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’（順方向プライマー；配列番号２２）；および
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２３）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
After reverse transcription using human lung polyA RNA as a template, two specific primers compatible with RAGE based on the sequence shown in GenBank accession number AB036432.
5'-GAATTCAGGATGGCAGCCGGAACAGCAG-3 '(forward primer; SEQ ID NO: 22); and 5'-CTCGAGTCAAGGCCCTCCAGTACTAC-3' (reverse primer; SEQ ID NO: 23)
Was amplified using. Amplified transcripts were confirmed by DNA sequence analysis using an ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, Forster City, CA, USA).
ｐＥＴ系ベクターの３’側にＡｖｉタグ配列をコードする核酸配列を導入して、Ｃ末端ビオチン化タンパク質の生産を可能とするベクターを構築し発現用プラスミドとした（ｐＰＥＴ Ｃ−Ａｖｉ）。定法に従って、発現ベクターにＲＡＧＥ１を導入して、発現構築物を生成した。 A nucleic acid sequence encoding an Avi tag sequence was introduced into the 3 'side of the pET vector to construct a vector capable of producing a C-terminal biotinylated protein and used as an expression plasmid (pPET C-Avi). According to a standard method, RAGE1 was introduced into an expression vector to generate an expression construct.
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ビオチン化ペプチドとして生産させるために、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入）とで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。誘導は２５℃で１８時間行った。２５℃で誘導することにより、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現された。誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。 In RAGE, as with CTLD, the formation of an SS bond is essential for structural stabilization and function. Therefore, OrigamiB (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host. Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. In order to produce a biotinylated peptide, it was simultaneously transformed with an expression vector containing the BirA gene (introducing the BirA gene encoding biotin ligase into a pAC vector that can be maintained in the same bacterial body as the pET vector). . The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 25 ° C. in LB medium. RAGE-like polypeptide expression was induced by adding IPTG. Induction was carried out at 25 ° C. for 18 hours. By induction at 25 ° C, over 90% was expressed as soluble polypeptides. Simultaneously with the start of induction, 50 μM (final concentration) of biotin was added, and the expressed target protein was biotinylated at the same time. 18 hours after the start of induction, the cells were pelleted by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, the supernatant was discarded, and washed with an appropriate amount of TBS.
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｕｔｅｉｎ ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。精製したタンパク質は、認識されている結合特異性およびＲ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）、Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）に対する親和性を示した。このことは、この精製タンパク質がビオチン化されていることを利用し、ＢＩＡＣＯＲＥのストレプトアビジンセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化し、このセンサーチップをＢＩＡＣＯＲＥ本体に挿入後、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により確認した。 The bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the supernatant recovered by centrifugation at 15,000 rpm × 30 minutes was used as the soluble fraction. Since the His protein for purification was added to the C-terminal side, the target protein was purified by eluting with imidazole after binding to Ni-agarose. AviTag added for detection can also be used for purification. In this case, it was adsorbed on streptavidin Mutein matrix (Roche) and then eluted with biotin. The purified proteins are recognized binding specificity and R-AGE (BSA glycated with ribose), F-AGE (BSA glycated with fructose), G-AGE (BSA glycated with glucose) Showed affinity for. This utilizes the fact that this purified protein is biotinylated, and is immobilized on the BIACORE streptavidin sensor chip so that the part involved in ligand recognition faces outward, and this sensor chip is inserted into the BIACORE body. This was confirmed by surface plasmon resonance (Biacore 2000, Amersham-Pharmacia).
このようにして得られたｓＲＡＧＥ１（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのｓＲＡＧＥ１含む）の系で行い（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にＰＭＳＦを添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加しプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＣＢＢ染色に供したところ、低分子領域にｓＲＡＧＥの断片が認められた（図９を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ｓＲＡＧＥ１は、大過剰のトロンビンではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、およびＲ２２８とＶ２２９との間に該当する位置で、大過剰の第Ｘａ因子ではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、Ｖ１１７とＹ１１８との間、およびＭ２７２とＫ２７３との間に該当する位置で切断されることが明らかになった（図８を参照のこと）。 The sRAGE1 (0.25 mg / mL) thus obtained was treated with protease. The reaction was performed in a 0.1 ml system (containing 0.02 mg of sRAGE1 at a final concentration) (20 mM Tris, pH 8.4, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 ), 2 units of thrombin (1 u is 1 mg of subject). 10 u enterokinase (1 u is a concentration capable of degrading 0.05 mg of the target protein), or 10 u factor Xa (1 u is a concentration capable of degrading 0.05 mg of the target protein) ) At 25 ° C. for 18 hours. After 18 hours PMSF was added and immediately after stopping the reaction, the reaction product was processed for SDS-PAGE according to a standard method. In the target section that was not treated with protease, PMSF was added simultaneously with the addition of protease to inactivate the protease, and the sample was immediately subjected to sample processing for SDS-PAGE and stored at -20 ° C. When the protease-treated group and the untreated group were electrophoresed by SDS-PAGE according to a standard method and subjected to CBB staining, a fragment of sRAGE was observed in the low-molecular region (see FIG. 9). Further, when peptide mapping was performed, sRAGE1 was found to be between RAGE R114 and V115 in a large excess of thrombin and between R228 and V229, and in a large excess of factor Xa, RAGE R114 and V115. , V117 and Y118, and M272 and K273 were found to be cut at corresponding positions (see FIG. 8).
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成を試みた。 Therefore, the present inventors tried to produce a RAGE-like polypeptide imparted with protease resistance without affecting the ligand recognition ability.
（実施例５：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成））
実施例４において得られた知見に基づいて、上記の切断部位４箇所に変異を導入したｓＲＡＧＥ１様ポリペプチド（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／Ｍ２７２Ｉ；本実施例中、ｍＲＡＧＥ１ともいう）を定法に従って生成した。この核酸を、定法に従って、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）またはｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したｍＲＡＧＥ１コード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％ ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバースリップ上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりｍＲＡＧＥ１発現細胞が確認できた。また、リガンドであるリボースにより糖化処理したＢＳＡ（Ｒ−ＢＳＡ）を蛍光色素であるＡｌｅｘａ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）により標識し、この標識糖化ＢＳＡをｍＲＡＧＥ１発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
(Example 5: Production of RAGE-like polypeptide)
Based on the findings obtained in Example 4, a sRAGE1-like polypeptide (R114Q / V117A / R228N / M272I; also referred to as mRAGE1 in this example) in which mutations were introduced at the four cleavage sites was generated according to a standard method. . By introducing this nucleic acid into a mammalian expression vector pECFP (Clontech, USA) fused with cyan fluorescent protein (CFP) or pTarget (Promega) according to a standard method, an mRAGE1-encoding nucleic acid fused with CFP at the N-terminus is obtained. The containing plasmid was constructed. CHO cells were cultured in F12 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . 400 μl of CHO cells suspended at a density of 1 × 10 4 cells / ml were seeded on coverslips 24 hours before transfection. Cells were transfected with LipofectAMINE reagent according to the manufacturer's protocol, incubated for 48 hours and transiently expressed in CHO cells. Then, when this cell was observed with the fluorescence microscope, the mRAGE1 expression cell was confirmed by the fluorescence of CFP. In addition, BSA (R-BSA) saccharified with ribose as a ligand was labeled with Alexa633 (Molecular Probe) as a fluorescent dye, and when this labeled glycated BSA was added to mRAGE1-expressing cells, the ability to recognize and take up the ligand. Was confirmed.
ｍＲＡＧＥ１発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し（図１０）、プロテアーゼ耐性の増大を狙ったアミノ酸置換は、リガンド認識能には影響を与えていないことが示された。 mRAGE1-expressing cells showed a clear ligand uptake ability (FIG. 10), indicating that amino acid substitution aimed at increasing protease resistance did not affect the ligand recognition ability.
さらに、そのプロテアーゼ感受性を検討したところ、天然型に比べ耐性が上昇していることが示され、プロテアーゼ耐性の上がったＲＡＧＥ分子の作出に成功した（図１１）。 Furthermore, when the protease sensitivity was examined, it was shown that the resistance was higher than that of the natural type, and a RAGE molecule with increased protease resistance was successfully produced (FIG. 11).
（実施例６：ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定）
これまで、ＲＡＧＥの細胞外領域がリガンド認識に必須であることは知られていたが、細胞外領域のどの部分がリガンド認識に必要十分であるかは明らかにされていない。よってリガンド認識に必須の最小領域を決定する目的で、領域欠損などによる削りこみを行って、ｍｉｎｉＲＡＧＥを作製した。
(Example 6: Determination of minimum region essential for ligand recognition ability of RAGE)
So far, it has been known that the extracellular region of RAGE is essential for ligand recognition, but it has not been clarified which part of the extracellular region is necessary and sufficient for ligand recognition. Therefore, for the purpose of determining the minimum region essential for ligand recognition, grinding with a region defect or the like was performed to produce miniRAGE.
ｍｉｎｉＲＡＧＥとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、以下のプライマー：
順方向プライマー（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６に共通）
５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２４）
逆方向プライマー
・ＲＡＧＥ１については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）
・ＲＡＧＥ２については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２６）
・ＲＡＧＥ３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２７）
・ＲＡＧＥ７については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２８）
・ＲＡＧＥ８については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧ−３’（配列番号２９）
・ＲＡＧＥ９については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３０）
・ＲＡＧＥ１４３については
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（配列番号３３）、
・ＲＡＧＥ２２３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧ−３’（配列番号３４）
・ＲＡＧＥ２２６については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号３５）
を設計し、ＲＡＧＥ４については、順方向プライマー
５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３１）
逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３２）
を設計し、ＲＡＧＥ２（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２５０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２３０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ４（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列１０１〜３３２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ７（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１３７位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ９（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１１２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ１４３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１４３位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ２２３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２３位）をコードするＤＮＡ、およびＲＡＧＥ２２６（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２６位）をコードするＤＮＡを得た。
Based on the sequence shown in GenBank accession number AB036432 as miniRAGE, the following primers:
Forward primer (common to RAGE1, RAGE2, RAGE3, RAGE7, RAGE8, RAGE9, RAGE143, RAGE223 and RAGE226)
5′-CTACATATGGCTCAAAAACATCACAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
For reverse primer RAGE1
5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 25)
・ About RAGE2
5′-TTACTTCGAGACCAGACACGGGGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 26)
・ About RAGE3
5′-TTACTTCGAGAAGCTACTGCTCACCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 27)
・ About RAGE7
5′-TTACTTCGAGAAACACCAGCCGTGAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 28)
・ About RAGE8
5′-TTACTCGAGAAATCTGGTAGACACGG-3 ′ (SEQ ID NO: 29)
・ About RAGE9
5'-TTACTCGAGACTTGGTCTCCTTTC-3 '(SEQ ID NO: 30)
-For RAGE143, 5'-TTACTCGAGTCCCCCACTTTATTGGGG-3 '
・ About RAGE223
5′-TTACTCGAGCTGTTGCGCAAGGCCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 34)
・ About RAGE226
5′-TTACTCGAGACTGGATGGGGGCTGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 35)
And for RAGE4, forward primer 5′-TCGCATATGCAATGAACAGGAATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 31)
Reverse primer 5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 32)
DNA encoding RAGE2 (amino acid sequence 23 to 250 of natural RAGE), DNA encoding RAGE3 (amino acid sequence 23 to 230 of natural RAGE), RAGE4 (amino acid sequence 101 to natural RAGE) 332), a DNA encoding RAGE7 (amino acid sequence 23 to 137 of natural RAGE), a DNA encoding RAGE8 (amino acid sequence 23 to 120 of natural RAGE), and RAGE9 (natural RAGE). DNA encoding amino acid sequence 23 to 112), DNA encoding RAGE143 (amino acid sequence 23 to 143 of natural RAGE), DNA encoding RAGE223 (amino acid sequence 23 to 223 of natural RAGE), and RAGE226 (Natural RAGE To obtain a DNA encoding the amino acid sequence 23 to 226 position).
これらｍｉｎｉＲＡＧＥをコードするＤＮＡを、制限酵素の認識配列を付加した特異的プライマーによりＰＣＲにより増幅した後、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローニング用ベクターとしてＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認した。 These miniRAGE-encoding DNAs were amplified by PCR using specific primers to which a restriction enzyme recognition sequence was added, and then TA cloning was performed using pCR2.1 (Invitrogen) as a cloning vector to confirm the nucleotide sequence.
（２）タグ配列付加ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成
実施例６において生成したＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８）またはＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの３’側にタグ配列をコードする核酸配列を導入して、発現用プラスミドとした（ｐＥＴ Ｃ−Ａｖｉ、ｐＥＴ Ｃ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターに、ｍＲＡＧＥおよびｍｉｎｉＲＡＧＥを導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入したＢｉｒＡ／ｐＡＣを作製した。
(2) Generation of tag sequence-added RAGE-like polypeptide RAGE-like polypeptides (sRAGE1, mRAGE1, RAGE2-RAGE8, RAGE143, RAGE223, and RAGE226) generated in Example 6 are effective when used in a detection / evaluation system. It is desirable that such modification is applied. Therefore, two types of tags (one sequence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 17)) which undergoes biotinylation in E. coli and the other are Streptag (AWRHPQFGGG) which is a sequence directly recognized by streptavidin. (SEQ ID NO: 18) or WSHPQFEK (SEQ ID NO: 19)) The binding of biotin and streptavidin was the strongest non-covalent bond (KD = 10 −15 M), and development to immobilization via streptavidin, etc. However, in order to biotinylate, it takes time and effort to add biotin to the medium and to co-express biotin ligase, etc. Therefore, the binding strength is inferior (KD = 10-7 M), adding a tag on the gene sequence and expressing it in E. coli A StreptagII (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 19)) addition protein capable of binding to toavidin was also generated, and in each case, a nucleic acid sequence encoding a tag sequence was introduced into the 3 ′ side of the pET vector to obtain an expression plasmid ( pET C-Avi, pET C-StII) According to a conventional method, mRAGE and miniRAGE were introduced into these expression vectors to generate an expression construct.For biotinylation of AviTag addition protein, the same bacteria as the pET system vector BirA / pAC was prepared by introducing a BirA gene encoding biotin ligase into a pAC vector that can be maintained in the body.
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をまとめて「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」と称する）にＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。 In RAGE, as with CTLD, the formation of an SS bond is essential for structural stabilization and function. Therefore, OrigamiB (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host. Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. When adding AviTag to RAGE-like polypeptide (sRAGE1, mRAGE1, RAGE2-RAGE8, RAGE143, RAGE223, and RAGE226 are collectively referred to as “RAGE-like polypeptide”), a vector comprising nucleic acid sequence encoding AviTag and this polypeptide And an expression vector containing the BirA gene. The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 37 ° C. in LB medium. When transformed with an expression vector containing StreptagII-encoding nucleic acid, it was cultured at 37 ° C. in LB medium supplemented with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), and tetracycline (12.5 μg / ml). RAGE-like polypeptide expression was induced by adding IPTG.
予備実験として、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）１８時間、（Ｂ）２０時間、および（Ｃ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、大部分が不溶性画分に回収された。培養温度を２５℃に下げるとｓＲＡＧＥの場合、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現されたが、ｍＲＡＧＥ１の場合は、２０％程度しか可溶性ポリペプチドとして発現されなかった。各ｍｉｎｉＲＡＧＥに関しては、欠損部分が長くなるほど可溶化率が下がる傾向が観察された。ＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しては培養温度を下げても殆どが不溶性となり、可溶性ポリペプチドとして発現させるのは困難であった。上記の結果に鑑みて、培養温度を２５℃に維持して、誘導時間の検討を行ったところ、誘導時間（Ａ）１８時間が適切であることが分かった（図１３を参照のこと）。 As a preliminary experiment, the temperature conditions and induction time for expressing a RAGE-like polypeptide as a soluble polypeptide were examined. The temperature conditions were set to (1) 37 ° C, (2) 25 ° C and (3) 20 ° C. The induction time was set to (A) 18 hours, (B) 20 hours, and (C) 24 hours. First, when these host cells were induced at 37 ° C. and the molecular weight of the induced protein was measured, most of them were recovered in the insoluble fraction. When the culture temperature was lowered to 25 ° C., 90% or more was expressed as a soluble polypeptide in the case of sRAGE, but only about 20% was expressed as a soluble polypeptide in the case of mRAGE1. For each miniRAGE, a tendency was observed that the solubilization rate decreased as the deficient portion became longer. RAGE8 and RAGE9 were almost insoluble even when the culture temperature was lowered, and it was difficult to express them as soluble polypeptides. In view of the above results, the induction time was examined while maintaining the culture temperature at 25 ° C., and it was found that the induction time (A) of 18 hours was appropriate (see FIG. 13).
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。 The above transformed cells were pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours. In the main culture, this pre-cultured solution was added to each of the LB media so as to be diluted 20-fold, and swirled at 25 ° C. Based on the conditions obtained above, when the optical density (A600) of the culture reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG was added to induce expression of the target protein. When the AviTag-added protein was produced, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and the target protein to be expressed was simultaneously biotinylated. 18 hours after the start of induction, the cells were pelleted by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, the supernatant was discarded, and washed with an appropriate amount of TBS.
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図１３）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｕｔｅｉｎ ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。 The bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the supernatant recovered by centrifugation at 15,000 rpm × 30 minutes was used as the soluble fraction. Since the His protein for purification was added to the C-terminal side, the target protein was purified by eluting with imidazole after binding to Ni-agarose (FIG. 13). AviTag added for detection can also be used for purification. In this case, it was adsorbed on streptavidin Mutein matrix (Roche) and then eluted with biotin. In the case of StrepTag II, it was adsorbed on Strep-Tactin Sepharose (IBA, US) and then eluted with dessiobiotin.
（３）ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定
上記のようにして溶出させた各ＭｉｎｉＲＡＧＥの発現効率、可溶性ポリペプチドとして発現する比率、収率などは以下の表２に示すとおりである。
(3) Determination of minimum region essential for ligand recognition ability of RAGE The expression efficiency of each MiniRAGE eluted as described above, the ratio expressed as a soluble polypeptide, the yield, etc. are as shown in Table 2 below. .
上記の結果から、ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域は、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）であることが分かった。 From the above results, it was found that the minimum region essential for the ligand recognition ability of RAGE is RAGE8 (amino acid sequence 23 to 120 of natural RAGE).
（実施例７：ＣＴＬＤ様ポリペプチドのリフォールディング）
（１）ＣＴＬＤ様ポリペプチドのリフォールディング
実施例３に示されるように、ＣＴＬＤ様ポリペプチドは、ほとんどが封入体として発現されるので、発現宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）とし、１００％近くを封入体として発現させた後、サイクロアミロースの包接能を活用しリフォールディングさせた。これにより、20mg/L程度の変異受容体を得ることが可能になった。
Example 7: Refolding of CTLD-like polypeptide
(1) Refolding of CTLD-like polypeptide As shown in Example 3, since CTLD-like polypeptide is mostly expressed as inclusion bodies, the expression host is BL21 (DE3), and nearly 100% of inclusion bodies are included. And then refolded using the inclusion ability of cycloamylose. As a result, a mutant receptor of about 20 mg / L can be obtained.
上記実施例３で得られた発現構築物とＢｉｒＡ遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）、若しくは発現構築物のみで形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）を、以下のように培養した。培養は、ＬＢ培地を基本とし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを付加したポリペプチドを発現させる場合、若しくは発現構築物のみで形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）の場合、ＬＢ培地にアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。 BL21 (DE3) transformed simultaneously with the expression construct obtained in Example 3 and a vector containing the BirA gene, or BL21 (DE3) transformed with only the expression construct was cultured as follows. The culture was based on LB medium, and ampicillin (50 μg / ml) and chloramphenicol (34 μg / ml) were added (both final concentrations). Ampicillin (50 μg / ml) was added to the LB medium when expressing a polypeptide to which Streptag II was added, or in the case of BL21 (DE3) transformed with the expression construct alone.
本培養は、実施例３に示される前培養液を２０倍希釈になるように添加し、３７℃で旋回培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加ポリペプチドを発現させる場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現タンパク質のビオチンも同時に行わせた。誘導開始後４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。 In the main culture, the pre-culture solution shown in Example 3 was added to a 20-fold dilution, and swirl culture was performed at 37 ° C. When the turbidity (A600) of the culture reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG was added to induce expression of the target protein. When expressing the AviTag-added polypeptide, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and biotin of the expressed protein was also simultaneously performed. Four hours after the start of induction, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, and washed with TBS.
次いで、ＴＢＳに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をＴＢＳで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の４種類の界面活性剤溶液（０．１％ ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、いずれも最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、最終濃度で０．６％になるように、それぞれに３％ＣＡ溶液を加え、さらに室温で１時間反応させた。その反応溶液を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を、リフォールディング溶液とした。ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４を用いた場合、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの９０％程度がリフォールディング溶液として回収されていることが確認されたが、Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０では効果が無かった（図１４）。精製はＨｉｓタグを活用したＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ精製、またはビオチン、ＳｔｒｅｐＴａｇを利用して、実施例３に示される可溶性ポリペプチドの精製と同様に精製できた。以下の表３に、ＣＴＡＢを用いた場合の結果を示す。 Subsequently, the bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the precipitate fraction of the cell lysate was washed with TBS to obtain inclusion bodies. Inclusion bodies were treated with 6M guanidine hydrochloride solution containing DTT at a final concentration of 40 mM for 1 hour at room temperature to completely unravel the wrong structure. Subsequently, four types of surfactant solutions (0.1% CTAB, SB3-14, Tween 40, Tween 60, each of which is a TBS solution containing 2 mM DL-cysteine at a final concentration) of 70 times volume are added, After reacting at room temperature for 1 hour, a 3% CA solution was added to each so that the final concentration would be 0.6%, and further reacted at room temperature for 1 hour. The reaction solution was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the resulting supernatant was used as a refolding solution. When CTAB and SB3-14 were used, it was confirmed that about 90% of the CTLD-like polypeptide was recovered as a refolding solution, but Tween 40 and Tween 60 had no effect (FIG. 14). Purification could be carried out in the same manner as in the purification of the soluble polypeptide shown in Example 3, using Ni-Agarose purification utilizing His tag, or biotin and StrepTag. Table 3 below shows the results when CTAB was used.
（２）可溶性ＰＲ−ＣＴＬＤとＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬ認識能の比較
各濃度のＦ−ＯｘＬＤＬ（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８、１０、１５、２０μｇ／ｍＬ）を９６穴プレートに分注し（５０μｌ／ウェル）、４℃で一晩放置後、１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ（３００μｌ／ウェル）でブロッキング（３７℃で４時間、若しくは４℃で一晩）し、ビオチン化ＣＴＬＤ（５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）と３７℃で２時間反応させた。定法に従ってＨＲＰ標識ストレプトアビジン（濃度１０ｍＵ／ｍＬ；１００μｌ／ウェル）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）を添加し、１５分間放置した。１Ｎ ＨＣｌにて反応停止後、Ａ４５０の吸光度を測定した。各反応工程の間は、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）にて５回洗浄した。結果を、図１６に示す。
(2) Comparison of denatured LDL recognition ability of soluble PR-CTLD and Re-CTLD F-OxLDL (0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 2, 4, 8) (10, 15, 20 μg / mL) were dispensed into a 96-well plate (50 μl / well), left at 4 ° C. overnight, and blocked with 1% BSA / 0.02% Tween20-containing TBS (300 μl / well) ( 4 hours at 37 ° C. or overnight at 4 ° C.) and reacted with biotinylated CTLD (5 μg / ml, 100 μl / well) at 37 ° C. for 2 hours. According to a conventional method, HRP-labeled streptavidin (concentration 10 mU / mL; 100 μl / well) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then TMB (HRP substrate) was added and left for 15 minutes. After stopping the reaction with 1N HCl, the absorbance of A450 was measured. Between each reaction step, it washed 5 times with TBS-Tween (0.02% Tween-20). The results are shown in FIG.
図１６から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤの認識能は、可溶性ＣＴＬＤに比較して遜色が無いことが実証された。 As is clear from FIG. 16, it was demonstrated that the recognition ability of Re-CTLD is not inferior to that of soluble CTLD.
（実施例８：ＲＡＧＥ様ポリペプチドのリフォールディング）
（１）ＲＡＧＥ様ポリペプチドのリフォールディング
実施例６に示されるように、ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、ほとんどが封入体として発現されるので、発現宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）とし、１００％近くを封入体として発現させた後、サイクロアミロースの包接能を活用しリフォールディングさせた。これにより、２０ｍｇ／Ｌ程度の変異受容体を得ることが可能になった。
(Example 8: Refolding of RAGE-like polypeptide)
(1) Refolding of RAGE-like polypeptide As shown in Example 6, since most of RAGE-like polypeptide is expressed as inclusion bodies, the expression host is BL21 (DE3), and nearly 100% of inclusion bodies are included. And then refolded using the inclusion ability of cycloamylose. As a result, a mutant receptor of about 20 mg / L can be obtained.
上記で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）を、以下のように培養した。培養は、ＬＢ培地を基本とし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを付加したポリペプチドを発現させる場合、ＬＢ培地にアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。前培養は、３７℃で１２時間培養することによって行った。 BL21 (DE3) obtained above was cultured as follows. The culture was based on LB medium, and ampicillin (50 μg / ml) and chloramphenicol (34 μg / ml) were added (both final concentrations). When expressing a polypeptide to which StreptagII was added, ampicillin (50 μg / ml) was added to the LB medium. The preculture was performed by culturing at 37 ° C. for 12 hours.
本培養は、上記に示される前培養液を２０倍希釈になるように添加し、３７℃で旋回培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加ポリペプチドを発現させる場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現タンパク質のビオチンも同時に行わせた。誘導開始後４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。 In the main culture, the pre-culture solution shown above was added to a 20-fold dilution, and swirl culture was performed at 37 ° C. When the turbidity (A600) of the culture reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG was added to induce expression of the target protein. When expressing the AviTag-added polypeptide, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and biotin of the expressed protein was also simultaneously performed. Four hours after the start of induction, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, and washed with TBS.
次いで、ＴＢＳに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をＴＢＳで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の４種類の界面活性剤溶液（０．１％ ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、いずれも最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、最終濃度で０．６％になるように、それぞれに３％ＣＡ溶液を加え、さらに室温で１時間反応させた。その反応溶液を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を、リフォールディング溶液とした。ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、４種類の界面活性剤（ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ４０、およびＴｗｅｅｎ６０）いずれによっても効率的にリフォールディングされた（図１５）。精製はＨｉｓタグを活用したＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ精製、またはビオチン、ＳｔｒｅｐＴａｇを利用して、実施例６に示される可溶性ポリペプチドの精製と同様に精製できた。以下の表４に、ＣＴＡＢを用いた場合の結果を示す。 Subsequently, the bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the precipitate fraction of the cell lysate was washed with TBS to obtain inclusion bodies. Inclusion bodies were treated with 6M guanidine hydrochloride solution containing DTT at a final concentration of 40 mM for 1 hour at room temperature to completely unravel the wrong structure. Subsequently, four types of surfactant solutions (0.1% CTAB, SB3-14, Tween 40, Tween 60, each of which is a TBS solution containing 2 mM DL-cysteine at a final concentration) of 70 times volume are added, After reacting at room temperature for 1 hour, a 3% CA solution was added to each so that the final concentration would be 0.6%, and further reacted at room temperature for 1 hour. The reaction solution was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the resulting supernatant was used as a refolding solution. The RAGE-like polypeptide was efficiently refolded by any of the four surfactants (CTAB, SB3-14, Tween 40, and Tween 60) (FIG. 15). Purification could be carried out in the same manner as the purification of the soluble polypeptide shown in Example 6 using Ni-Agarose purification utilizing His tag, or biotin and StrepTag. Table 4 below shows the results when CTAB was used.
（実施例９：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出と、市販の抗体による変性ＬＤＬの検出との比較）
ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定手法は、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。しかし、変性ＬＤＬは分子の修飾構造が一定ではなく、意味のある分子種が明確でないためにモノクローナル抗体による変性ＬＤＬの検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方で、ＬＯＸ−１は、幅広い分子種の変性ＬＤＬを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そこで、簡便かつ汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、抗体に代わる分子として受容体認識能を活用可能か検討した。
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ＬＤＬ（変性を受けていない正常なＬＤＬ（ネガティブコントロール。ヒト血漿より調製、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡより購入）；完全酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；部分酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ（酸化ストレスの指標）。ＭＤＡ修飾により調製）。
(Example 9: Comparison of detection of denatured LDL with a CTLD-like polypeptide and detection of denatured LDL with a commercially available antibody)
The method for measuring degenerative LDL, which is a risk factor for arteriosclerosis in human plasma, is expected to be used in various fields such as early diagnosis of diseases, evaluation of preventive effects of functional foods, evaluation of therapeutic effects of life improvement and medication. Yes. However, the modified LDL has a definite molecular modification structure, and the meaningful molecular species is not clear, so detection of the modified LDL with a monoclonal antibody is not always accurate. On the other hand, LOX-1 is highly amenable to reacting to denatured LDL, although there is ambiguity that can recognize denatured LDL of a wide range of molecular species. Therefore, it was examined whether the receptor recognition ability can be utilized as a molecule instead of an antibody in a simple and versatile ELISA system.
(1) Ligand preparation The following were used as ligands: LDL (normal LDL without denaturation (negative control; prepared from human plasma or purchased from Molecular Probe, USA); fully oxidized LDL (copper oxidation) Partially oxidized LDL (prepared by copper oxidation method); Malondialdehyde-ized LDL (MDA-LDL (index of oxidative stress); prepared by MDA modification).
酸化ＬＤＬを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。 Oxidized LDL was prepared as follows. In preparation, everything possible was sterilized and manipulated as aseptically as possible.
完全酸化ＬＤＬに関しては、ＬＤＬを、必要な場合、酸化する前に予め透析して、ＥＤＴＡを完全に取り除いた。このＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で１ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で２０時間インキュベートし、その後、５０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）に対して透析した。得られた完全酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％ ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。 For fully oxidized LDL, LDL was pre-dialyzed, if necessary, prior to oxidation to completely remove EDTA. This EDTA-free LDL was made into a 1 mg / mL solution with EDTA-free PBS (hereinafter referred to as (−) PBS), and CuSO 4 was added to the solution so that the final concentration was 5 μM. This solution was then incubated for 20 hours at 37 ° C., after which 50 μM butylated hydroxytoluene or 1 mM EDTA (final concentration) was added to stop oxidation. This solution was added to Tris-EDTA (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% EDTA) or PBS (−) (1 mM KH 2 PO 4 , 10 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCl, 2. Dialyzed against 7 mM KCl, pH 7.4). The resulting fully oxidized LDL-containing solution was sterilized by filtration, 0.02% NaN 3 (final concentration) was added to the filtrate, and stored at 4 ° C. until use.
部分酸化ＬＤＬに関しては、同様に、ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で２ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が２μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で４時間インキュベートし、その後、５０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）に対して透析した。得られた部分酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％ ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。 For partially oxidized LDL, similarly, EDTA-free LDL is made into a 2 mg / mL concentration solution in EDTA-free PBS (hereinafter referred to as (−) PBS), and CuSOSO is added to the solution so that the final concentration becomes 2 μM. 4 was added. The solution was then incubated for 4 hours at 37 ° C., after which 50 μM butylated hydroxytoluene or 1 mM EDTA (final concentration) was added to stop oxidation. This solution was dialyzed against Tris-EDTA (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% EDTA) or PBS (−). The obtained partially oxidized LDL-containing solution was sterilized by filtration, 0.02% NaN 3 (final concentration) was added to the filtrate, and stored at 4 ° C. until use.
ＭＤＡ−ＬＤＬを以下のように調製した。０．１６５ｍＬのマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）の急速酸加水分解（０．２ｍＬの１２Ｍ
ＨＣｌ）により、マロンジアルデヒドを室温で生成し、４．８ｍＬの０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）をこの溶液に添加し、１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨを６．４に調節した。ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１％ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）中の等量のタンパク質（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）中の新たに調製した０．２Ｍ マロンジアルデヒドとを混合し、この混合物を３７℃で３時間インキュベートすることによって修飾した。この混合物を緩衝液Ａに対して、４℃で１６時間透析することにより、反応を停止した。ＭＤＡ−ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％ ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
MDA-LDL was prepared as follows. Rapid acid hydrolysis of 0.165 mL of malonaldehyde bis (dimethylacetal) (Aldrich, USA) (0.2 mL of 12M
HCl) produced malondialdehyde at room temperature and 4.8 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.4) was added to this solution and the pH was adjusted to 6.4 with 10 M NaOH. EDTA-free LDL is mixed with an equal amount of protein (5-10 mg / mL) in 0.01 M sodium phosphate / 0.15 M NaCl / 0.01% EDTA, pH 7.4 (buffer A), 0.1 M The mixture was modified by mixing with freshly prepared 0.2 M malondialdehyde in sodium phosphate (pH 6.4) and incubating the mixture at 37 ° C. for 3 hours. The reaction was stopped by dialyzing this mixture against buffer A at 4 ° C. for 16 hours. The MDA-LDL-containing solution was sterilized by filtration, 0.02% NaN 3 (final concentration) was added to the filtrate, and stored at 4 ° C. until use.
（２）ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出と、市販の抗体による変性ＬＤＬの検出との比較
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＬＤＬおよび上記のように調製した各リガンドを、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳで希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを洗浄し、２％スキムミルク／ＴＢＳにて１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した各受容体（ネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗酸化ＬＤＬウサギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｈｏｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。
(2) Comparison of detection of denatured LDL with CTLD-like polypeptide and detection of denatured LDL with commercially available antibody In a 96-well plate (Nunc), LDL and each ligand prepared as described above were added at 0.1 μg / ml. After dilution with TBS to 1 μg / ml and 10 μg / ml, 100 μl / well was dispensed and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The plate was washed with TBS, blocked with 2% skim milk / TBS for 1 hour and washed with TBS, and then 100 μl of each receptor (native CTLD, native CTLD14, PR-CTLD and PR-CTLD14) solution diluted to 5 μg / ml Was added and left at room temperature for 2 hours. After thorough washing with TBS, a horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Roche, Germany) 100,000 × diluted solution was added at 100 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After thorough washing with TBS, 3,3 ′, 5,5 ′, which is a chromogenic substrate for HRP
Tetramethylbenzidine (TMB (Sigma-Aldrich, USA) was added at 50 μl / well, and after confirming color development, 1N HCl was added as a reaction stop solution at 50 μl / well, and the absorbance at A450 was measured. Antioxidant LDL rabbit polyclonal antibody (Novus Biologicals, USA), anti-MDA-LDL mouse monoclonal antibody (Antibody shop, Denmark) were used instead of CTLD-like polypeptide, instead of HRP-streptavidin. HRP labeled secondary antibody was used.
その結果、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、１μｇ／ｍｌの濃度（ウェル当たりでは、１００ｎｇ）の濃度の完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬを十分認識可能なことが示された。未変性のＬＤＬとも反応はするが、１０μｇ／ｍＬ（ｗｅｌｌ当たりでは１μｇ）と検出感度が低かった。また、目的タンパク質の変性ＬＤＬ認識能は、以下の表５に示されるように、プロテアーゼ耐性変異を導入していないネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４と比較しても、何ら遜色が無いことが示された。 As a result, it was shown that both PR-CTLD and PR-CTLD14 can sufficiently recognize fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, and MDA-LDL at a concentration of 1 μg / ml (100 ng per well). Although it reacted with native LDL, the detection sensitivity was low at 10 μg / mL (1 μg per well). In addition, as shown in Table 5 below, the ability of the target protein to recognize denatured LDL was shown to be comparable to native CTLD and native CTLD14 into which no protease resistant mutation was introduced.
さらに、市販の抗酸化ＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、以下の表６に示されるように、未変性ＬＤＬとも反応する上、酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬへの特異性が特別高くないことが明らかになった。 Furthermore, as shown in Table 6 below, commercially available antioxidant LDL antibodies and anti-MDA-LDL antibodies may also react with native LDL, and the specificity to oxidized LDL and MDA-LDL may not be particularly high. It was revealed.
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ、ＰＲ−ＣＴＬＤ１４は、ＥＬＩＳＡにおける抗体に代わる変性ＬＤＬ検出系として十分に機能し得ることが示された。 From these results, it was shown that PR-CTLD and PR-CTLD14 can sufficiently function as a denatured LDL detection system that replaces antibodies in ELISA.
総変性ＬＤＬを捕捉した後、総変性ＬＤＬに占める各種変性ＬＤＬ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＰＲ−ＣＴＬＤの有効性を検討した。 After capturing the total denatured LDL, the effectiveness of PR-CTLD in a sandwich ELISA system was examined in order to clarify the possibility of detecting various denatured LDL molecular species in the total denatured LDL.
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液を、１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、２％ スキムミルク溶液で１時間ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬの各リガンドを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、抗酸化ＬＤＬ抗体、または抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質として添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＬＤＬを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総変性ＬＤＬを分類可能なことが示された（表７）。 Receptor (PR-CTLD and PR-CTLD14) solution diluted with TBS to a concentration of 5 μg / ml was added to a 96-well plate at 100 μl / well. After standing at 4 ° C overnight, blocking with 2% skim milk solution for 1 hour and washing with TBS, LDL, fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, and MDA-LDL ligands were added and allowed to react at room temperature for 2 hours. It was. After thoroughly washing with TBS, it was reacted with antioxidant LDL antibody or anti-MDA-LDL antibody, washed thoroughly with TBS, then reacted with HRP-labeled secondary antibody and thoroughly washed with TBS. To this 96-well plate, TMB was added as a substrate, and the absorbance of A450 was measured as described above. As explained above, due to the low specificity of the antibodies used, complete typing was not possible, but after capturing various LDLs, using molecules such as antibodies with different specificities, It was shown that the total denatured LDL captured in the first stage can be classified (Table 7).
（３）Ｒｅ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを特異的に検出する
酸化ＬＤＬを検出するために、種々の抗体が使用されている。また、市販の酸化ＬＤＬ測定用キット（サンドイッチＥＬＩＳＡ機構による）において二次抗体として抗ＡｐｏＢ抗体が使用されていることから、Ｒｅ−ＣＴＬＤと抗ＡｐｏＢ抗体とを組み合わせて、より実用的な酸化ＬＤＬ検出系を作製することが考えられる。そこで、本実験においては、抗ＡｐｏＢ抗体を用いた新たな検出系が実現可能かどうかを調べるために、酸化されていないＬＤＬに対する特異性を検討した。
(3) Re-CTLD specifically detects denatured LDL Various antibodies are used to detect oxidized LDL. In addition, since an anti-ApoB antibody is used as a secondary antibody in a commercially available kit for measuring oxidized LDL (by sandwich ELISA mechanism), more practical oxidized LDL detection can be achieved by combining Re-CTLD and anti-ApoB antibody. It is conceivable to make a system. Therefore, in this experiment, in order to investigate whether a new detection system using an anti-ApoB antibody is feasible, the specificity for non-oxidized LDL was examined.
９６穴のプレートに１５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤ）溶液を、５０μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、１％ ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ溶液（３００μｌ／ウェル）で一晩ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬの各リガンド（濃度０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬ）を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間反応させた。ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）にて十分に洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ＡｐｏＢ抗体と３７℃で６０分反応させ、ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質として添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。結果を図１７に示す。この図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤは変性ＬＤＬを特異的に検出し、ＬＤＬに対する特異性は極めて低いことが実証された。 Receptor (PR-CTLD) solution diluted with TBS to a concentration of 15 μg / ml was added to a 96-well plate at 50 μl / well. After standing overnight at 4 ° C., blocking with 1% BSA / 0.02% Tween20-containing TBS solution (300 μl / well) overnight and washing with TBS, LDL, fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, MDA-LDL Of each ligand (concentrations 0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 2, 4, 8, and 10 μg / mL) was added at 100 μl / well. And reacted at 37 ° C. for 2 hours. After thoroughly washing with TBS-Tween (0.02% Tween 20), the mixture was reacted with an HRP-labeled anti-ApoB antibody at 37 ° C. for 60 minutes, and then thoroughly washed with TBS-Tween. To this 96-well plate, TMB was added as a substrate, and the absorbance of A450 was measured as described above. The results are shown in FIG. As is clear from this figure, Re-CTLD specifically detected denatured LDL, and it was demonstrated that the specificity for LDL was extremely low.
（実施例１０：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬ含有溶液からの変性ＬＤＬの除去）
（１）人工の変性ＬＤＬ含有溶液からの変性ＬＤＬの除去
溶液中に存在する変性ＬＤＬなどの除去にＰＲ−ＣＴＬＤなどが有効であるか明らかにする目的で、ＰＲ−ＣＴＬＤ等をビーズ上に固定化し、この固定化ビーズに変性ＬＤＬを結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ Ｍａｔｒｉｘ １０μｌ（５０％スラリー）とビオチン化ＣＴＬＤまたはビオチン化ＰＲ−ＣＴＬＤ（５μｇ／１００μｌ ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳで繰り返し洗浄した。続いて、ＤｉＤ標識変性ＬＤＬと５分間反応させた後、このＭａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとして、ＣＴＬＤを結合させていないＭｕｔｅｉｎ Ｍａｔｒｉｘ １０μｌ（５０％スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＣＴＬＤもしくはＰＲ−ＣＴＬＤを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤにより変性ＬＤＬが溶液中から完全に除去されたことが示された。
(Example 10: Removal of denatured LDL from a solution containing denatured LDL by a CTLD-like polypeptide)
(1) Removal of denatured LDL from artificial denatured LDL-containing solution For the purpose of clarifying whether PR-CTLD or the like is effective in removing denatured LDL present in the solution, PR-CTLD or the like is immobilized on beads. The modified LDL was bound to the immobilized beads. 10 μl of Mute Matrix (50% slurry) and biotinylated CTLD or biotinylated PR-CTLD (5 μg / 100 μl TBS) were reacted at 4 ° C. for 30 minutes. The Matrix was recovered by centrifugation with a swing rotor at 2,500 rpm × 5 minutes and then repeatedly washed with cold TBS. Subsequently, after reacting with DiD-labeled modified LDL for 5 minutes, the Matrix and the supernatant were recovered. As a control, an experimental group was prepared in which only 10 μl of Mute Matrix (50% slurry) not bound with CTLD was added. The recovered supernatant (100 μl) was dispensed into a fluorescence-free microtiter plate, and the fluorescence intensity was measured with a microphotometer (Molecular Device) compatible with the microtiter plate. As a result, almost no fluorescence was detected from the supernatant reacted with Matrix to which CTLD or PR-CTLD was bound, and it was shown that denatured LDL was completely removed from the solution by CTLD and PR-CTLD.
上記の結果から、表８に示すように、固相上に固定化されたＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合し、このことによって溶液中から除去可能なことが示された。 From the above results, as shown in Table 8, it was shown that CTLD and PR-CTLD immobilized on the solid phase bound to denatured LDL and thus could be removed from the solution.
（２）変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの変性ＬＤＬの除去
Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ ２０μｌ（５０％スラリー）とＲｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（５μｇ／１００μｌ ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのビーズを回収後、冷ＴＢＳで繰り返し洗浄した。
(2) Removal of modified LDL from modified LDL-containing plasma model Ni-agarose beads 20 μl (50% slurry) and Re-PR-CTLD (5 μg / 100 μl TBS) were reacted at 4 ° C. for 30 minutes. The beads were collected by centrifugation with a swing rotor at 2500 rpm × 5 minutes, and then washed repeatedly with cold TBS.
大過剰の酸化ＬＤＬを添加した血漿中（１２０μｌ）にＲｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤを固定化したＮｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ ２０μｌ（５０％スラリー）を添加し、３０分間４℃で反応させた後、遠心（２，８００ｒｐｍ×５分間）し、上清に回収される血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を、上記実施例９（３）で用いたＣＴＬＤ−抗ＡｐｏＢ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定し、含有酸化ＬＤＬ除去効率を求めた。結果を図１８に示す。 20 μl (50% slurry) of Ni-agarose beads immobilized with Re-PR-CTLD was added to plasma (120 μl) containing a large excess of oxidized LDL, reacted at 4 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged (2 , 800 rpm × 5 minutes), and the concentration of oxidized LDL in plasma collected in the supernatant was measured by sandwich ELISA using the CTLD-anti-ApoB antibody used in Example 9 (3) above, and the contained oxidized LDL removal efficiency Asked. The results are shown in FIG.
Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ固定化ビーズにより、１０μｇ／ｍｌ程度までの酸化ＬＤＬであれば、変性ＬＤＬ含有血漿モデルから酸化ＬＤＬを８６％回収可能なことが確認された。１００μｇ／ｍｌという異常な高濃度を含有するモデル血漿においても、含有変性ＬＤＬのうちの５０％以上は回収可能であった。 Re-PR-CTLD-immobilized beads confirmed that 86% of oxidized LDL could be recovered from a modified LDL-containing plasma model with oxidized LDL up to about 10 μg / ml. Even in model plasma containing an abnormally high concentration of 100 μg / ml, 50% or more of the contained modified LDL was recoverable.
（実施例１１：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出）
ヒト血液、尿中などのＡＧＥの測定手法は、糖尿病性血管障害の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待される。しかし、ＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないなど、モノクローナル抗体やＨＰＬＣなどによるＡＧＥの定量的検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方でＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。そこで、広く様々な分野で活用されており汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、受容体認識能を活用可能か検討した。
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ｃＢＳＡ（糖化処理をしていないＢＳＡ，ネガティブコントロールとして使用）；Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）。
(Example 11: Detection of AGE with RAGE-like polypeptide)
AGE measurement methods such as human blood and urine are expected to be used in various fields such as early diagnosis of diabetic vascular disorders, evaluation of preventive effects of functional foods, improvement of life and evaluation of therapeutic effects by medication. However, the molecular detection structure of AGE is not constant, and the molecular species that are meaningful as biomarkers are not clear. Therefore, the quantitative detection of AGE by a monoclonal antibody, HPLC, or the like is not always accurate. On the other hand, RAGE is a multi-ligand receptor capable of recognizing AGEs of a wide variety of molecular species, and is highly likely to detect AGEs in vivo. Therefore, it was examined whether receptor recognition ability can be used in an ELISA system that is widely used in various fields and has high versatility.
(1) Ligand preparation The following ligands were used: cBSA (BSA without glycation treatment, used as negative control); R-AGE (BSA glycation treatment with ribose), F-AGE (fructose) G-AGE (BSA saccharified with glucose).
糖化ＢＳＡを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。 Glycated BSA was prepared as follows. In preparation, everything possible was sterilized and manipulated as aseptically as possible.
エタノールで洗浄したスパチュラを使用して、各糖（グルコース ４．５１ｇ、フルクトース ４．５１ｇおよびリボース ３．７５ｇ）を秤量して、滅菌したキャップ付きプラスチックチューブ中に入れた。各プラスチックチューブに、２０ｍＬの滅菌１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を無菌的に添加し、穏やかに転倒混和することによってその溶液を混合した。最後に２１ｍＬのエンドトキシンフリーの蒸留水を添加した。各成文の最終濃度は、４００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、５０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、５００ｍＭ グルコース（Ｇｌｕ５００ ＢＳＡ）、５００ｍＭ フルクトース（Ｆｒｕ５００ ＢＳＡ）、５００ｍＭ リボース（Ｒｉｂ５００ ＢＳＡ）であった。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過滅菌した後、これらの糖−ＢＳＡ溶液を、最大１２週間、遮光して３７℃でインキュベートした。１週間に１回、無菌条件下で、チューブをアルコールに浸したペーパータオルで拭いてからキャップを開け、各糖−ＢＳＡ調製物を８０μｌ取り出し、３．５ｍｍマイクロプローブを備えたｐＨメーターでｐＨをモニターした。各糖−ＢＳＡ溶液のｐＨを、１０Ｎ 水酸化ナトリウム溶液（エンドトキシンフリー）で７．４に調節した。１週間に１回ｐＨを調節した後、５〜１０ｍＬずつ分注して、分析に供するまで−８０℃で保存した。未反応の糖を除去することによってこの反応を停止するために、分注したものをすべて解凍して透析チューブに入れ、オートクレーブ処理したビーカー中で滅菌ＰＢＳに対して完全に透析した。透析チューブから糖−ＢＳＡ溶液を取り出す前に、チューブの開口部を７０％エタノールで滅菌した。取り出した糖−ＢＳＡ溶液を、滅菌チューブに入れ、使用時まで４℃で保存した。
（２）ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出
ｓＲＡＧＥ、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１〜ＲＡＧＥ８については、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＢＳＡおよび上記のように調製した各リガンドを、ＴＢＳにて０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳにて希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（ｓＲＡＧＥ、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１〜ＲＡＧＥ８）溶液を１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。
Each sugar (4.51 g glucose, 4.51 g fructose and 3.75 g ribose) was weighed into a sterile capped plastic tube using a spatula washed with ethanol. To each plastic tube, 20 mL of sterile 1M sodium phosphate buffer (pH 7.4) was aseptically added and the solution was mixed by gentle inversion. Finally, 21 mL of endotoxin-free distilled water was added. The final concentration of each compound was 50 mg / mL BSA, 500 mM glucose (Glu500 BSA), 500 mM fructose (Fru500 BSA), 500 mM ribose (Rib500 BSA) in 400 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4). After filter sterilization using a Millipore Express 0.22 μm filter (Millipore), these sugar-BSA solutions were incubated at 37 ° C. protected from light for up to 12 weeks. Once a week, under sterile conditions, wipe the tube with a paper towel soaked in alcohol, then open the cap, remove 80 μl of each sugar-BSA preparation, and monitor the pH with a pH meter equipped with a 3.5 mm microprobe. did. The pH of each sugar-BSA solution was adjusted to 7.4 with 10N sodium hydroxide solution (endotoxin free). After adjusting the pH once a week, 5 to 10 mL was dispensed and stored at −80 ° C. until analysis. To stop this reaction by removing unreacted sugar, all aliquots were thawed and placed in dialysis tubes and dialyzed completely against sterile PBS in an autoclaved beaker. Prior to removing the sugar-BSA solution from the dialysis tube, the tube opening was sterilized with 70% ethanol. The removed sugar-BSA solution was placed in a sterile tube and stored at 4 ° C. until use.
(2) Detection of AGE by RAGE-like polypeptide For sRAGE, mRAGE, and RAGE1 to RAGE8, 0.1 μg / ml of BSA and each of the ligands prepared as described above were added to a 96-well plate (Nunc) with TBS at 0.1 μg / ml, After diluting to 1 μg / ml, 5 μg / ml, and 10 μg / ml with TBS, 100 μl / well was dispensed and left at 4 ° C. overnight. After blocking with Protein-Free blocking agent (Pierce, USA) for 1 hour and washing with TBS, 100 μl of a receptor solution (sRAGE, mRAGE, RAGE1 to RAGE8) diluted to 5 μg / ml was added and left at room temperature for 2 hours. did.
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６については、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＢＳＡおよび上記のように調製した各リガンドを、ＴＢＳにて０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した各ＲＡＧＥ様ポリペプチド溶液を１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。 For RAGE143, RAGE223, and RAGE226, the BSA and each of the ligands prepared as described above were placed in a 96-well plate (Nunc) using TBS at 0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0 After dilution to 4, 0.8, 1, 2, 4, 8, and 10 μg / mL, 100 μl / well was dispensed and left at 4 ° C. overnight. After blocking with Protein-Free blocking agent (Pierce, USA) for 1 hour and washing with TBS, 100 μl of each RAGE-like polypeptide solution diluted to 5 μg / ml was added and left at room temperature for 2 hours.
上記のように処置した各９６穴プレートをＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’ テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗ＡＧＥ抗体（Ｔｒａｎｓ Ｇｅｎｉｃ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）、抗ペントシジン抗体（Ｔｒａｎｓ Ｇｅｎｉｃ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を各ＲＡＧＥ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。 Each 96-well plate treated as described above was thoroughly washed with TBS, and then a 100,000 × diluted solution of horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Roche, Germany) was added at 100 μl / well. Left at room temperature for 1 hour. After thorough washing with TBS, 3,3 ′, 5,5 ′ tetramethylbenzidine (TMB (Sigma-Aldrich, USA)), a chromogenic substrate for HRP, was added at 50 μl / well, and after confirming color development, the reaction stop solution As a comparative control, commercially available anti-AGE antibody (TransGenic Inc., USA) and anti-pentocidin antibody (TransGenic Inc., USA) were used for each RAGE. Used instead of polypeptide, HRP-labeled secondary antibody was used instead of HRP-streptavidin when using the antibody.
その結果、４箇所に変異を導入したｍＲＡＧＥ１にも天然型のＲＡＧＥに遜色がない認識能が確認された。さらに、可溶性ポリペプチドとして調製可能であったＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、およびＲＡＧＥ７も認識能を有していた。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６もまた、ＡＧＥ認識能を有していた。ｍＲＡＧＥ１については、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲において非常に検出感度が高かったために、さらに低い濃度（０、０．００１、０．００４、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８および１μｇ／ｍｌ）（ＴＢＳ希釈））でも実験を行ったところ、非常に微量のリガンドを認識できることが分かった（図１９Ａ）。 As a result, it was confirmed that mRAGE1 introduced with mutations at four positions also has a recognition ability comparable to that of natural RAGE. Furthermore, RAGE2, RAGE3, and RAGE7, which could be prepared as soluble polypeptides, also had recognition ability. RAGE143, RAGE223 and RAGE226 also had AGE recognition ability. For mRAGE1, since the detection sensitivity was very high in the range of 0.1 to 10 μg / ml, lower concentrations (0, 0.001, 0.004, 0.01, 0.02, 0.04, 0 .08, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 and 1 μg / ml) (TBS dilution)), it was found that very small amounts of ligand could be recognized (FIG. 19A). .
以下の表９は、可溶性ポリペプチドとして発現されるＲＡＧＥ様ポリペプチドについての結果を示す。いずれもネガティブコントロールであるｃＢＳＡはほとんど認識せず、特異性が強いことが示された。いずれのＲＡＧＥでも反応のバックグランドが高いという難点はあるが、検出感度もよく、０．１μｇ／ｍｌ（ウェル当たりでは１０ｎｇ）でも十分に検出可能であり、また、生体内における反応性 Ｒ−ＡＧＥ ＞ Ｆ−ＡＧＥ ＞ Ｇ−ＡＧＥと一致した反応の強度を示した。また、バックグラウンドが高く、リガンドごとに値が異なるため、各実験においてリガンドを添加しなかった場合のＡ４５０もまた表中に示した。ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６については、その検出感度をそれぞれ、図１９Ａ〜Ｄにグラフに示す。ＲＡＧＥ１４３は、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインを欠いているにも関わらず、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能も大差は無かった。ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６は、Ｃ２ドメインを欠いているにも関わらず、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能にも遜色が無かった。 Table 9 below shows the results for RAGE-like polypeptides expressed as soluble polypeptides. In either case, the negative control cBSA was hardly recognized, indicating a high specificity. Although any RAGE has a drawback that the background of the reaction is high, the detection sensitivity is good, it can be sufficiently detected even at 0.1 μg / ml (10 ng per well), and the in vivo reactivity R-AGE > F-AGE> The intensity of the reaction was consistent with G-AGE. In addition, since the background is high and the value differs for each ligand, A450 when no ligand was added in each experiment is also shown in the table. For mRAGE, RAGE143, RAGE223, and RAGE226, the detection sensitivities are shown in graphs in FIGS. Although RAGE143 lacked the C1 domain and C2 domain, it showed the same recognition characteristics as RAGE1 and the recognition ability was not much different. Although RAGE223 and RAGE226 lacked the C2 domain, they showed the same recognition characteristics as RAGE1, and their recognition ability was not inferior.
さらに、市販の抗ＡＧＥ抗体も検出に使用可能であったが、検出感度はＲＡＧＥの方が高かった。抗ペントシジン抗体は、いずれのタイプのＡＧＥとの反応も確認できず、ＥＬＩＳＡ系への適用は難しいことが示された。 Furthermore, although commercially available anti-AGE antibodies could be used for detection, the detection sensitivity was higher with RAGE. The anti-pentosidine antibody could not be confirmed to react with any type of AGE, indicating that application to the ELISA system was difficult.
総ＡＧＥを捕捉した後、総ＡＧＥに占める各種ＡＧＥ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＲＡＧＥ様ポリペプチドの有効性を検討した。 After capturing the total AGE, the effectiveness of the RAGE-like polypeptide in the sandwich ELISA system was examined in order to clarify the possibility of detecting various AGE molecular species in the total AGE.
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（各ＲＡＧＥ様ポリペプチド）溶液を１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、Ｐｒｏｅｔｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤で１時間ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、Ｃ−ＢＳＡ、Ｒ−ＢＳＡ、Ｆ−ＢＳＡ、Ｇ−ＢＳＡの各ＡＧＥを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄し、抗ＡＧＥ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質とて添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＡＧＥを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総ＡＧＥを分類可能なことが示された（表１０）。 Receptor (each RAGE-like polypeptide) solution diluted with TBS to a concentration of 5 μg / ml was added to a 96-well plate at 100 μl / well. After standing at 4 ° C. overnight, blocking with Proetin-Free blocking agent for 1 hour and washing with TBS, each AGE of C-BSA, R-BSA, F-BSA, G-BSA was added, and 2 at room temperature. Reacted for hours. Washed thoroughly with TBS, reacted with anti-AGE antibody, washed thoroughly with TBS, then reacted with HRP-labeled secondary antibody and washed thoroughly with TBS. To this 96-well plate, TMB was added as a substrate, and the absorbance of A450 was measured as described above. As explained above, due to the low specificity of the antibodies used, complete typing was not possible, but after capturing various AGEs, using molecules such as antibodies with different specificities, It was shown that the total AGE captured in the first stage can be classified (Table 10).
（３）ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるＡＧＥの検出および認識能の比較
上記（２）と同様に、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるＡＧＥ（ｃＢＳＡ、Ｒ−ＡＧＥ、Ｆ−ＡＧＥおよびＧ−ＡＧＥ）の検出を行った。その結果をそれぞれ図２０Ａ〜Ｄに示す。これら図から明らかなように、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６はいずれも、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能にも遜色が無いことが実証された。
(3) Comparison of AGE detection and recognition ability by RAGE143, RAGE223, and RAGE226 As in (2) above, detection of AGE (cBSA, R-AGE, F-AGE, and G-AGE) by RAGE143, RAGE223, and RAGE226 went. The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, it was demonstrated that all of RAGE143, RAGE223, and RAGE226 showed the same recognition characteristics as RAGE1 and the recognition ability was not inferior.
（４）ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるヘモグロビンＡ１ｃの検出
ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）はアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含され、血糖コントロールの指標として用いられている。そこで、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６の各分子が、ヘモグロビンＡ１ｃを特異的に検出するか否かを決定した。
(4) Detection of hemoglobin A1c by RAGE143, RAGE223, and RAGE226 Although hemoglobin A1c (HbA1c) is an Amadori transfer compound, it is included in AGE and used as an indicator of blood glucose control. Accordingly, it was determined whether each molecule of RAGE143, RAGE223, and RAGE226 specifically detects hemoglobin A1c.
ＨｂＡ１ｃ（ＫＡＭＩＹＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＣＡＭＰＡＮＹ，ＵＳＡ、 ＫＡＩ−０９８Ｃ）をプレート上に固定し、上記（２）のＡＧＥ検出の場合と同様にして、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６で検出した。結果を図２１に示す。各ＲＡＧＥ様分子によりＨｂＡ１ｃが検出可能なことが示された。 HbA1c (KAMIYA BIOMEDICAL CAMPANY, USA, KAI-098C) was immobilized on the plate and detected by RAGE143, RAGE223, and RAGE226 in the same manner as in the case of AGE detection in (2) above. The results are shown in FIG. It was shown that HbA1c can be detected by each RAGE-like molecule.
（５）ＲＡＧＥ様ポリペプチドと種々の抗体によるＡＧＥの検出
ＡＧＥの構造は、変性ＬＤＬ以上に多様であるため、ＡＧＥを定量可能な優れた抗体および特定の構造のＡＧＥ分子種を識別可能な特異性の高い抗体に関する報告は少なく、ＡＧＥ分子種の定量と各分子の識別の両方を可能にするパネル開発は、酸化ＬＤＬ分子種に関するパネル開発以上に困難である。従って、現時点で実現可能なＡＧＥ様分子種の定量および各分子種の識別を可能にするパネルを作製するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、多様な構造のＡＧＥ様分子種の定量および各分子種の識別を可能にするパネル作製を試みた。
(5) Detection of AGE with RAGE-like polypeptide and various antibodies The structure of AGE is more diverse than that of denatured LDL. Therefore, an excellent antibody capable of quantifying AGE and a specific that can distinguish AGE molecular species with a specific structure There are few reports on highly antibodies, and panel development that enables both quantification of AGE molecular species and identification of each molecule is more difficult than panel development for oxidized LDL molecular species. Therefore, in order to create a panel that enables the quantification of AGE-like molecular species that can be realized at the present time and the identification of each molecular species, sandwich ELISA is performed, and quantification of AGE-like molecular species of various structures and An attempt was made to make a panel that allowed identification.
（ａ）抗ＨｂＡ１ｃ抗体；
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をプレート上に固定化し、抗ＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体（ＥＸＯＣＥＬＬ，ＩＮＣ，ＵＳＡ、 Ｅ８５Ａ）でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。一般的な検出工程は、上記（２）と同様である。ただし、抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
(A) an anti-HbA1c antibody;
RAGE143, RAGE223, and RAGE226 were immobilized on the plate, and sandwich ELISA was performed with anti-HbA1c mouse monoclonal antibody (EXOCELL, INC, USA, E85A). The general detection process is the same as (2) above. However, since the anti-HbA1c antibody was not labeled with HRP, it was detected using an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody.
結果を図２２に示す。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６のいずれもＨｂＡ１ｃを濃度依存的に検出可能なことが実証された。 The results are shown in FIG. It was demonstrated that all of RAGE143, RAGE223, and RAGE226 can detect HbA1c in a concentration-dependent manner.
（ｂ）抗ＡＧＥ抗体；
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をプレート上に固定化し、抗ＡＧＥマウスモノクローナル抗体（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ Ｉｎｃ.，日本 ６Ｄ１２）でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。一般的な検出工程は、上記（２）と同様である。ただし、抗ＡＧＥ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
(B) an anti-AGE antibody;
RAGE143, RAGE223, and RAGE226 were immobilized on a plate, and sandwich ELISA was performed with an anti-AGE mouse monoclonal antibody (TransGenic Inc., Japan 6D12). The general detection process is the same as (2) above. However, since the anti-AGE antibody is not labeled with HRP, it was detected using an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as the secondary antibody.
結果を図２３Ａおよび図２３Ｂに示す。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６のいずれも、ｃＢＳＡに対してはほとんど反応せず、Ｒ−ＡＧＥに対して高い反応性を有することが実証された。 The results are shown in FIGS. 23A and 23B. None of RAGE 143, RAGE 223, and RAGE 226 demonstrated little reactivity to cBSA and high reactivity to R-AGE.
（実施例１２：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥ含有溶液からのＡＧＥの除去）
溶液中に存在するＡＧＥなどの除去にｍＲＡＧＥ１などが有効であるか明らかにする目的で、ＲＡＧＥ様ポリペプチドをビーズ上に固定化し、この固定化ビーズにＡＧＥ（Ｒ−ＢＳＡ）を結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ Ｍａｔｒｉｘと１０μｌ（５０％ スラリー）とビオチン化ネイティブＲＡＧＥまたはビオチン化ｍＲＡＧＥ１（５μｇ／１００μｌ ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳにて繰り返し洗浄した。続いて、Ａｌｅｘａ６３３標識Ｒ−ＢＳＡと５分間反応させた後、Ｍａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとしてＲＡＧＥもｍＲＡＧＥ１も結合させていないＭｕｔｅｉｎ Ｍａｔｒｉｘ １０μｌ（５０％ スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＲＡＧＥもしくはｍＲＡＧＥを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＲＡＧＥおよびｍＲＡＧＥによりＡＧＥ溶液中から完全に除去されたことが示された（表１１）。
(Example 12: Removal of AGE from AGE-containing solution by RAGE-like polypeptide)
In order to clarify whether mRAGE1 or the like is effective for removing AGE or the like present in the solution, RAGE-like polypeptide was immobilized on the beads, and AGE (R-BSA) was bound to the immobilized beads. Mutin Matrix and 10 μl (50% slurry) were reacted with biotinylated native RAGE or biotinylated mRAGE1 (5 μg / 100 μl TBS) at 4 ° C. for 30 minutes. The Matrix was recovered by centrifugation with a swing rotor at 2,500 rpm × 5 minutes, and then repeatedly washed with cold TBS. Subsequently, after reacting with Alexa633-labeled R-BSA for 5 minutes, Matrix and the supernatant were recovered. As a control, an experimental section was prepared in which only 10 μl of Mute Matrix (50% slurry) to which neither RAGE nor mRAGE1 had been bound was added. The recovered supernatant (100 μl) was dispensed into a fluorescence-free microtiter plate, and the fluorescence intensity was measured with a microphotometer (Molecular Device) compatible with the microtiter plate. As a result, almost no fluorescence was detected from the supernatant reacted with Matrix to which RAGE or mRAGE was bound, and it was shown that RAGE and mRAGE were completely removed from the AGE solution (Table 11).
（実施例１３：リフォールディングされたＣＴＬＤ様ポリペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬまたはＡＧＥの検出）
（１）Ｒｅ−ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出
上記実施例７において作製したリフォールディングした分子も可溶性ポリペプチドと同様に、変性ＬＤＬを検出できるか否かを確認した。検出方法は、上記実施例９に記載されるとおりである。予備試験の結果、ＣＴＬＤ様ポリペプチドおよびリフォールディングしたＣＴＬＤ様ポリペプチドの場合は、全てＴＢＳを使用した。
Example 13: Detection of denatured LDL or AGE with refolded CTLD-like polypeptide or RAGE-like polypeptide
(1) Detection of denatured LDL by Re-CTLD-like polypeptide It was confirmed whether the refolded molecule produced in Example 7 above could detect denatured LDL as well as the soluble polypeptide. The detection method is as described in Example 9 above. As a result of preliminary tests, TBS was used in all cases of CTLD-like polypeptides and refolded CTLD-like polypeptides.
結論として、リフォールディングされたＣＴＬＤ様ポリペプチドは、可溶性ＣＴＬＤ様ポリペプチドと何ら遜色のない反応性を示した（表１２）。さらにリフォールディングにより得られた分子には、リフォールディング過程で使用した界面活性剤が結合している。そのため、その物性が可溶性ポリペプチドとして発現した受容体と異なっていた。その特徴は、ＥＬＩＳＡの結果から観察された。 In conclusion, the refolded CTLD-like polypeptide showed no inferior reactivity with the soluble CTLD-like polypeptide (Table 12). Furthermore, the surfactant used in the refolding process is bound to the molecule obtained by refolding. Therefore, its physical properties were different from those of receptors expressed as soluble polypeptides. The characteristics were observed from the ELISA results.
リフォールディングに使用した界面活性剤のＥＬＩＳＡへの影響をＣＴＬＤの場合、ＣＴＡＢ，ＳＢ３−１４に関して検討した（表１４）。可溶化にはＳＢ３−１４も有効であったが、ＥＬＩＳＡの結果からＣＴＡＢによるリフォールディングが検出系としては有効であることが示された。 In the case of CTLD, the influence of the surfactant used for refolding on ELISA was examined for CTAB and SB3-14 (Table 14). SB3-14 was also effective for solubilization, but ELISA results showed that CTAB refolding was effective as a detection system.
表１２の結果から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤおよびＲｅ−ＣＴＬＤ１４の種々の変性ＬＤＬに対する特異性は非常に高いので、さらに低い濃度（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８、１、１．５μｇ／ｍｌ）の各変性ＬＤＬを調製して、基本的には実施例７（２）に記載されるように検出を行った。測定は、通常使用されるマイクロプレートリーダーを用いて行った。結果をそれぞれ、図２４Ａおよび２４Ｂに示す。 As evident from the results in Table 12, the specificity of Re-CTLD and Re-CTLD14 for various modified LDLs is so high that even lower concentrations (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0 0.04, 0.08, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 1.5 μg / ml) of each modified LDL was prepared, and basically, Example 7 (2) Detection was performed as described in. The measurement was performed using a commonly used microplate reader. The results are shown in FIGS. 24A and 24B, respectively.
これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤおよびＲｅ−ＣＴＬＤ１４は、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬなど、代表的な変性ＬＤＬをプレート上で認識可能であることが確認された。また測定は、通常のマイクロプレートリーダーで行えるため、実験室、病院、その他医療検査機関において容易に行うことができる。 As is clear from these figures, it was confirmed that Re-CTLD and Re-CTLD14 can recognize typical modified LDL such as fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, and malondialdehyde LDL on the plate. . Moreover, since the measurement can be performed with a normal microplate reader, it can be easily performed in a laboratory, a hospital, or other medical examination institutions.
Ｒｅ−ＣＴＬＤ１４については、リフォールディング直後では、Ｒｅ−ＣＴＬＤより感度が高かったが、数週間以上の冷蔵保存時には沈殿が生じ、活性が低下したが、リフォールディング直後に固相上で乾燥させた場合には、安定であると考えられる。 For Re-CTLD14, the sensitivity was higher than that of Re-CTLD immediately after refolding, but precipitation occurred during refrigerated storage for several weeks or more, and the activity decreased. However, when it was dried on the solid phase immediately after refolding It is considered stable.
（２）Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤおよび／またはＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤと、種々の抗体とによる変性ＬＤＬの検出
（Ｉ）材料および方法
本実施例において使用する抗体のうち、（ａ）〜（ｃ）については、従来からＬＤＬの生体内修飾に伴って生じると報告がある変性ＬＤＬの成分（もしくは変性ＬＤＬ自体）に結合する抗体である。（ｄ）〜（ｈ）については、最近、ＬＤＬの生体内修飾に伴って生じると報告がある変性ＬＤＬの成分に結合する抗体である。「動脈硬化症」というグループに属するとしても、脳血管系の動脈硬化症と心臓血管系の動脈硬化症では、生じる変性ＬＤＬの種類が異なるとの報告もあり、ＣＴＬＤと各成分に特異的な抗体とを組み合わせることで、多様な変性ＬＤＬ分子種の検出および定量を可能にするパネルが作製可能であると考えられる。この可能性を探るための基礎として、本実施例を行った。
(2) Detection of denatured LDL with Re-biotinylated CTLD and / or non-Re-biotinylated CTLD and various antibodies (I) Materials and methods Among the antibodies used in this example, (a) to (c) ) Is an antibody that binds to a component of denatured LDL (or denatured LDL itself) that has been reported to occur with in vivo modification of LDL. About (d)-(h), it is an antibody which couple | bonds with the component of modified | denatured LDL which has been reported recently with the in vivo modification | denaturation of LDL. Even though it belongs to the group of “arteriosclerosis”, there is a report that the type of degenerated LDL produced differs between cerebrovascular arteriosclerosis and cardiovascular arteriosclerosis, which is specific to CTLD and each component. By combining with antibodies, it is considered that a panel that enables detection and quantification of various denatured LDL molecular species can be produced. This example was performed as a basis for exploring this possibility.
本実施例では、具体的には、全てサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて各変性ＬＤＬ（完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬ）を検出した。Ｒｅ−ＣＴＬＤ（１５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をプレートに分注後、４℃で一晩放置した。ビオチン化されている場合には、予めストレプトアビジンを固定化したプレートを準備し、ストレプトアビジンを介して方向性を維持して固定した。その後、１％ＢＳＡ/０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ（３００μｌ／ウェル）を加え、４℃で１晩ブロッキングした。各変性ＬＤＬ（濃度：０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８、１０μｇ／ｍＬ）を、１００μｌ／ウェル添加し、３７℃で反応後、以下に示す各抗体（１００μｌ／ウェル）と反応させた後、最終的にはＨＲＰ−ＴＭＢによる発色で認識能を検出した。各反応の間は、ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。 In this example, specifically, each modified LDL (fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, MDA-LDL) was detected using a sandwich ELISA. Re-CTLD (15 [mu] g / ml, 50 [mu] l / well) was dispensed onto the plate and allowed to stand overnight at 4 [deg.] C. When biotinylated, a plate on which streptavidin was immobilized in advance was prepared, and the plate was immobilized while maintaining directionality via streptavidin. Thereafter, 1% BSA / 0.02% Tween20-containing TBS (300 μl / well) was added, followed by blocking at 4 ° C. overnight. Each modified LDL (concentration: 0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 2, 4, 8, 10 μg / mL) was added at 100 μl / well. After reacting at 37 ° C., each antibody (100 μl / well) shown below was reacted, and finally the recognition ability was detected by color development with HRP-TMB. Between each reaction, it was washed 5 times with TBS-Tween.
（ＩＩ）結果
（ａ）抗ＡｐｏＢ抗体による検出
現在報告のある酸化ＬＤＬ検出用ＥＬＩＳＡは、検出に抗ＡｐｏＢ抗体を使用するのが一般的であるので、本実験では、各酸化ＬＤＬを検出するために、ＨＲＰ標識抗ＡｐｏＢウサギポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）， ＧＴＸ４００４７）とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤと組み合わせて使用した。
(II) Results (a) Detection with anti-ApoB antibody The currently reported ELISA for detection of oxidized LDL generally uses an anti-ApoB antibody for detection. HRP-labeled anti-ApoB rabbit polyclonal antibody (GeneTex, Inc. (USA), GTX40047) and Re-biotinylated CTLD or Re-biotinylated CTLD were used in combination.
結果をそれぞれ図２５Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤと抗ＡｐｏＢとの組み合わせは、変性ＬＤＬを高感度で検出できることが示された。しかし、抗ＡｐｏＢ抗体を用いた場合、変性ＬＤＬ内のＡｐｏＢも脂質同様に酸化などの修飾を受けている可能性が高く、抗ＡｐｏＢ抗体による検出が最適であるかは疑問がある。従って、抗ＡｐｏＢ抗体以外にも、さらに種々の変性ＬＤＬの成分に結合する抗体を用いて、Ｒｅ−ＣＴＬＤとの併用によって、変性ＬＤＬを高感度で検出し得るか否かを確認した。 The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, it was shown that CTLD without Re-biotinylation or a combination of Re-biotinylated CTLD and anti-ApoB can detect denatured LDL with high sensitivity. However, when an anti-ApoB antibody is used, there is a high possibility that ApoB in the modified LDL is also modified, such as oxidation, like lipids, and there is a question as to whether detection with an anti-ApoB antibody is optimal. Therefore, in addition to anti-ApoB antibodies, it was confirmed whether or not denatured LDL can be detected with high sensitivity by using antibodies that bind to various denatured LDL components in combination with Re-CTLD.
（ｂ）抗酸化ＬＤＬ（抗ＯｘＬＤＬ）抗体による検出
抗ＯｘＬＤＬ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（ビオチン化なしのＣＴＬＤ）
上記実施例９（２）に示されるように、抗ＯｘＬＤＬ抗体の変性ＬＤＬ認識特異性は低い。抗酸化ＬＤＬ抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ系も販売されてはいる（ＭｅｒｃｏｄｉａＯｘｉｄｉｚｅｄＬＤＬＣｏｍｐｅｔｉｔｉｃｅＥＬＩＳＡ, Ｍｅｒｃｏｄｉａ（Ｓｗｅｄｅｎ））が、このキットも含めて、抗酸化ＬＤＬ抗体の特異性は高くない。しかし、優れた抗体が得られれば、抗ＡｐｏＢ抗体に代わる検出系となり得る。そこで、本実験では、比較的特性の高い抗体として、抗ＯｘＬＤＬウサギポリクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）， ＮＢ６００−１３３２）を選択し、このポリクローナル抗体とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(B) Detection by Antioxidant LDL (Anti-OxLDL) Antibody Sandwich ELISA using anti-OxLDL antibody (CTLD without biotinylation)
As shown in Example 9 (2) above, the specificity of the anti-OxLDL antibody for recognition of denatured LDL is low. A competitive ELISA system using an antioxidant LDL antibody is also available on the market (Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA, Mercodia (Sweden)), but the specificity of the antioxidant LDL antibody is not high including this kit. However, if an excellent antibody can be obtained, a detection system can be substituted for the anti-ApoB antibody. Therefore, in this experiment, an anti-OxLDL rabbit polyclonal antibody (NOVUS Biologicals, Inc (USA), NB600-1332) was selected as an antibody having relatively high characteristics, and this polyclonal antibody was combined with CTLD or Re-biotin without Re-biotinylation. In combination with conjugated CTLD, the reaction with an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody was further reacted at 37 ° C. for 1 hour to detect recognition of denatured LDL.
結果を図２６Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤと上記抗ＯｘＬＤＬウサギポリクローナル抗体との組み合わせは、変性ＬＤＬを高感度で検出できることが示された。 The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, it was shown that the combination of Re-CTLD and the anti-OxLDL rabbit polyclonal antibody can detect denatured LDL with high sensitivity.
（ｃ）抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体による検出
抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は市販されており、この抗体の特異性は高いと報告されている。そこで、本実験では、市販の抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体（ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＳＨＯＰ（Ｄｅｎｍａｒｋ）、 ＨＹＢ２６２）とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(C) Detection with anti-MDA-LDL antibody Anti-MDA-LDL antibody is commercially available, and the specificity of this antibody is reported to be high. Therefore, in this experiment, a commercially available anti-MDA-LDL mouse monoclonal antibody (ANTIBODY SHOP (Denmark), HYB262) was used in combination with non-Re-biotinylated CTLD or Re-biotinylated CTLD, and HRP labeled as a secondary antibody. Recognition of denatured LDL was detected by further reacting with an anti-mouse IgG antibody at 37 ° C. for 1 hour.
結果を図２７Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤと抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを極めて特異的に検出できることが示された。 The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, it was shown that the combination of Re-CTLD and anti-MDA-LDL mouse monoclonal antibody can detect only MDA-LDL very specifically.
（ｄ）抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体による検出
アクロレイン（ＡＣＲ）は、脂質の過酸化反応により生成し、動脈硬化巣における存在が確認されている。そこで、市販の抗アクロレインマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(D) Detection with anti-acrolein (ACR) antibody Acrolein (ACR) is produced by lipid peroxidation, and its presence in atherosclerotic lesions has been confirmed. Therefore, a commercially available anti-acrolein mouse monoclonal antibody (Nippon Oil Co., Ltd., Japan) and Re-biotinylated CTLD are used in combination and reacted with an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody at 37 ° C. for 1 hour. Was used to detect the recognition of denatured LDL.
結果を図２８に示す。抗ＡＣＲモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。 The results are shown in FIG. The combination with anti-ACR monoclonal antibody was demonstrated to detect MDA-LDL significantly.
（ｅ）抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体による検出
クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）は、生体内の脂質の酸化反応などにより生じることが報告された。そこで市販の抗ＣＲＡマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(E) Detection with anti-crotonaldehyde (CRA) antibody It has been reported that crotonaldehyde (CRA) is produced by, for example, lipid oxidation in vivo. Therefore, by using a combination of a commercially available anti-CRA mouse monoclonal antibody (NOF Corporation, Japan) and Re-biotinylated CTLD and reacting with an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody at 37 ° C. for 1 hour. , Recognition of denatured LDL was detected.
結果を図２９に示す。抗ＡＣＲモノクローナル抗体との組み合わせは、酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。 The results are shown in FIG. The combination with anti-ACR monoclonal antibody was demonstrated to significantly detect oxidized LDL and MDA-LDL.
（ｆ）抗マロンジアルデヒド（ＭＤＬ）抗体による検出
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、脂質の酸化により生じる。本実施例１３（２）（ｃ）の抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（すなわちＭＤＡ化ＬＤＬ）に結合する抗体であるが、本実験において使用する抗ＭＤＡモノクローナル抗体は、ＭＤＡがタンパク質のリジン残基と反応して生じるジヒドロピリジン−リジン誘導体（ＤＨＰ−Ｌｙｓ）に高い反応性を示す抗体である。そこで市販の抗ＭＤＡマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(F) Detection with anti-malondialdehyde (MDL) antibody Malondialdehyde (MDA) is produced by lipid oxidation. The anti-MDA-LDL antibody of Example 13 (2) (c) is an antibody that binds to MDA-LDL (that is, MDA-modified LDL). However, the anti-MDA monoclonal antibody used in this experiment is a protein whose MDA is a protein. This antibody is highly reactive to a dihydropyridine-lysine derivative (DHP-Lys) produced by reacting with a lysine residue. Therefore, by using a combination of a commercially available anti-MDA mouse monoclonal antibody (NOF Corporation, Japan) and Re-biotinylated CTLD and reacting with an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody at 37 ° C. for 1 hour. , Recognition of denatured LDL was detected.
結果を図３０に示す。抗ＭＤＡモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。 The results are shown in FIG. The combination with anti-MDA monoclonal antibody was demonstrated to significantly detect MDA-LDL.
（ｇ）抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体による検出；
不飽和脂肪酸が酸化ストレスを受けて生成する酸化二次生成物である４−ヒドロキシノ−２−ノネナール（ＨＥＮ）は、タンパク質のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓのアミノ基と比較的安定な反応物（マイケル付加化合物）を形成し、抗ＨＮＥモノクローナル抗体は、この反応物を認識する。そこで、市販の抗ＨＮＥマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(G) detection with anti-4-hydroxynonenal (HNE) antibody;
4-Hydroxyno-2-nonenal (HEN), an oxidized secondary product produced by unsaturated fatty acids under oxidative stress, is a relatively stable reactant (Michael) with amino groups of protein Lys, Cys, and His. Anti-HNE monoclonal antibody recognizes this reaction. Therefore, a commercially available anti-HNE mouse monoclonal antibody (Nippon Oil Co., Ltd., Japan) and Re-biotinylated CTLD are used in combination and reacted with an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody at 37 ° C. for 1 hour. Was used to detect the recognition of denatured LDL.
結果を図３１に示す。抗ＨＮＥモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。 The results are shown in FIG. The combination with anti-HNE monoclonal antibody was demonstrated to significantly detect MDA-LDL and oxidized LDL.
（ｈ）抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体による検出；
脂質の過酸化による生じる４−ヘキサノールは、Ｌｙｓと反応して、ヘキサノイル−Ｌｙｓを形成する。抗ＨＥＬモノクローナル抗体は、このヘキサノイル−Ｌｙｓを認識する。そこで、市販の抗ＨＥＬマウスモノクローナル抗体（日研ザイル株（日本）、日本老化制御研究所）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
(H) detection with anti-hexanoyllysine (HEL) antibody;
4-Hexanol produced by lipid peroxidation reacts with Lys to form hexanoyl-Lys. The anti-HEL monoclonal antibody recognizes this hexanoyl-Lys. Therefore, a commercially available anti-HEL mouse monoclonal antibody (Nikken Zile (Japan), Japan Senescence Control Laboratories) and Re-biotinylated CTLD are used in combination, and an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody and a further 37 are used as secondary antibodies. Recognition of denatured LDL was detected by reacting at 1 ° C. for 1 hour.
結果を図３２に示す。抗ＨＥＬモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。 The results are shown in FIG. The combination with anti-HEL monoclonal antibody was demonstrated to significantly detect MDA-LDL and oxidized LDL.
（３）市販の酸化ＬＤＬ測定キットとの比較
本実施例においては、市販のキットとして、協和メデックス社（日本、東京）製の酸化ＬＤＬ測定試薬「ＭＸ」を使用した。このキットでは、抗酸化ホスファチジルコリン（ＰＣ）マウス抗体がプレート上に固定化されており、ＨＲＰ標識抗ヒトＡｐｏＢヤギ抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡにより酸化ＬＤＬを検出する。このキットにおいて使用されている抗酸化ＰＣ抗体部分を可溶性ＰＲ−ＣＴＬＤ、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化の有りおよびなし両者）に置き換えて、上記抗ＡｐｏＢ抗体と本発明のＲｅ−ＣＴＬＤとを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを作製して、市販のキットと比較し、本発明のＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬに対する特異性を確認した。
(3) Comparison with commercially available oxidized LDL measuring kit In this example, an oxidized LDL measuring reagent “MX” manufactured by Kyowa Medex Co., Ltd. (Tokyo, Japan) was used as a commercially available kit. In this kit, an antioxidant phosphatidylcholine (PC) mouse antibody is immobilized on a plate, and oxidized LDL is detected by sandwich ELISA with an HRP-labeled anti-human ApoB goat antibody. Replacing the antioxidant PC antibody portion used in this kit with soluble PR-CTLD and Re-PR-CTLD (both with and without biotinylation), the anti-ApoB antibody and the Re-CTLD of the present invention were used. The sandwich ELISA was prepared, and compared with a commercially available kit, the specificity of the Re-CTLD of the present invention for the modified LDL was confirmed.
結果を図３３に示す。この図から明らかなように、抗ＰＣ抗体を本発明のＰＲ−ＣＴＬＤで置き換えても、上記キットと同様の感度で変性ＬＤＬを検出可能なことが実証された。よって、本発明のＰＲ−ＣＴＬＤは、大腸菌のような細菌で大量かつ安価に製造できるため、ＰＲ−ＣＴＬＤを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡの方が安定に供給できる。 The results are shown in FIG. As is clear from this figure, it was demonstrated that even when the anti-PC antibody was replaced with PR-CTLD of the present invention, denatured LDL could be detected with the same sensitivity as the above kit. Therefore, since the PR-CTLD of the present invention can be produced in large quantities and at low cost with bacteria such as E. coli, the sandwich ELISA using PR-CTLD can be supplied more stably.
（４）市販の抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を用いて作製した酸化ＬＤＬ測定キットとの比較
本実施例においては、市販のキットにおいて使用される予定である抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と本発明のＲｅ−ＣＴＬＤとを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを作製し、同じサンドイッチＥＬＩＳＡ機構を用いる発売予定のキットと比較して、本発明のＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬに対する特異性を確認した。。発売が予定されているキットでは、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体がプレート上に固定化されており、抗ＡｐｏＢ抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡにより酸化ＬＤＬ（特にＭＤＡ−ＬＤＬ）を検出する。本発明のＲｅ−ＣＴＬＤを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行うにあたって、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固定化したプレートを作製し、以下の４つの系のサンドイッチＥＬＩＳＡを設計した：
１．酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）と反応させた後、抗ＡｐｏＢ抗体で検出する系（市販のキットと同じ）；
２．Ｏｘ−ＬＤＬと反応させた後、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化）と反応させる系；
３．ＭＤＡ−ＬＤＬと反応させた後、抗ＡｐｏＢ抗体で検出する系（市販のキットと同じ）；
４．ＭＤＡ−ＬＤＬと反応させた後、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化）と反応させる系。
(4) Comparison with oxidized LDL measurement kit prepared using commercially available anti-MDA-LDL antibody In this example, the anti-MDA-LDL antibody to be used in a commercially available kit and the Re-CTLD of the present invention And the specificity of Re-CTLD of the present invention for modified LDL was confirmed by comparison with a kit to be released using the same sandwich ELISA mechanism. . In a kit scheduled to be released, anti-MDA-LDL antibody is immobilized on a plate, and oxidized LDL (particularly MDA-LDL) is detected by sandwich ELISA with anti-ApoB antibody. In conducting sandwich ELISA using the Re-CTLD of the present invention, a plate on which an anti-MDA-LDL antibody was immobilized was prepared, and the following four systems of sandwich ELISA were designed:
1. A system that detects an anti-ApoB antibody after reacting with oxidized LDL (Ox-LDL) (same as a commercially available kit);
2. A system that reacts with Ox-LDL and then reacts with Re-PR-CTLD (biotinylation);
3. A system that is detected with an anti-ApoB antibody after reacting with MDA-LDL (same as a commercially available kit);
4). A system for reacting with MDA-LDL and then reacting with Re-PR-CTLD (biotinylated).
結果を図３４に示す。抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体を使用した発売予定の系に準じた検出系（検出系１：菱形、検出系３：四角）の場合、高いＯＤ値を与えるものの、酸化ＬＤＬとＭＤＡ−ＬＤＬの識別が極めて低かった。一方、ＣＴＬＤを使用した検出系（検出系２：三角、検出系４：×）では、ＭＤＡ−ＬＤＬに対する認識能が高く、ＭＤＡ−ＬＤＬに特異的な検出系として優れていた。バックグランドが高いという欠点はあるが、低濃度範囲における認識能も高く、感度的にも優れていることが実証された。 The results are shown in FIG. In the case of a detection system (detection system 1: rhombus, detection system 3: square) according to a planned release system using an anti-ApoB monoclonal antibody, although a high OD value is given, discrimination between oxidized LDL and MDA-LDL is extremely low. It was. On the other hand, the detection system using CTLD (detection system 2: triangle, detection system 4: ×) has high recognition ability for MDA-LDL and was excellent as a detection system specific to MDA-LDL. Although it has the disadvantage of high background, it has been demonstrated that it has high recognition ability in the low concentration range and is excellent in sensitivity.
（実施例１４：Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出）
（１）Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出
上記実施例８において作製したリフォールディングしたＲＡＧＥ様ポリペプチドも可溶性ポリペプチドと同様に、ＡＧＥを検出できるか否かを確認した。検出方法は、上記実施例１１（２）に記載されるとおりである。予備試験の結果、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドに限り、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用した場合に安定して活性が検出されたので、本試験においては、ＥＬＩＳＡにおける洗浄、希釈溶液は全てＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）を使用した。上記実施例において可溶性ポリペプチドとして発現したＲＡＧＥ様ポリペプチドの場合は、ＴＢＳを使用した。
(Example 14: Detection of AGE with Re-RAGE-like polypeptide)
(1) Detection of AGE with Re-RAGE-like polypeptide It was confirmed whether the refolded RAGE-like polypeptide produced in Example 8 above could detect AGE as well as the soluble polypeptide. The detection method is as described in Example 11 (2) above. As a result of the preliminary test, only the Re-RAGE-like polypeptide detected stable activity when TBS-Tween was used. Therefore, in this test, all washing and dilution solutions in the ELISA were TBS-Tween (0 0.02% Tween 20) was used. In the case of the RAGE-like polypeptide expressed as a soluble polypeptide in the above examples, TBS was used.
結論として、リフォールディングされたＲＡＧＥ様ポリペプチド（Ｒｅ−ＲＡＧＥ）は、可溶性ＲＡＧＥ様ポリペプチドと何ら遜色のない反応性を示した（表１３）。さらリフォールディングにより得られた分子には、リフォールディング過程で使用した界面活性剤が結合している。そのため、その物性が可溶性ポリペプチドとして発現した受容体と異なっていた。その特徴は、ＥＬＩＳＡの結果から観察された。ことにＲＡＧＥに顕著であるが、界面活性剤と結合したことで、バックグランド値の低下がもたらされ、測定のＳ／Ｎ比が上昇する結果となった（表１３）。 In conclusion, the refolded RAGE-like polypeptide (Re-RAGE) showed no inferior reactivity with the soluble RAGE-like polypeptide (Table 13). Furthermore, the surfactant used in the refolding process is bound to the molecule obtained by refolding. Therefore, its physical properties were different from those of receptors expressed as soluble polypeptides. The characteristics were observed from the ELISA results. Although particularly prominent in RAGE, binding to the surfactant resulted in a decrease in the background value, resulting in an increase in the S / N ratio of the measurement (Table 13).
さらに、可溶性ポリペプチドとしての取得が不可能であったＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しても認識能の検証が可能になった。その結果、ＲＡＧＥ８でも、ＡＧＥの検出に使用することができるが、Ｖ領域のみのＲＡＧＥ９では、ほとんど認識能が確認されず、Ｖ領域のみでは十分に機能し得ないことが示された。 Furthermore, the recognition ability of RAGE8 and RAGE9, which could not be obtained as soluble polypeptides, can be verified. As a result, RAGE8 can also be used for AGE detection, but RAGE9 with only the V region shows almost no recognition ability, indicating that the V region alone cannot function sufficiently.
ＲＡＧＥに関しては、ＲＡＧＥ７に関して４種類の界面活性剤の影響を検討した。ＣＴＡＢ以外に、Ｔｗｅｅｎ４０，６０の系もＳ／Ｎ比が向上しており使用可能であることが示された（表１５）。使用する界面活性剤により、精製効率、検出系としての優位性、分子の安定性が異なることから、リフォールディング過程で目的分子と複合体を形成した界面活性剤が分子の特性に影響していることが示された。 Regarding RAGE, the influence of four types of surfactants on RAGE7 was examined. In addition to CTAB, it was shown that the Tween 40 and 60 systems also have an improved S / N ratio and can be used (Table 15). Depending on the surfactant used, purification efficiency, superiority as a detection system, and stability of the molecule differ, so the surfactant that has formed a complex with the target molecule during the refolding process affects the properties of the molecule. It was shown that.
さらに、Ｒｅ−ｍｉｎｉＲＡＧＥのリガンド認識能を詳細に比較した。リガンドとして、表１３に示される濃度より低い濃度（０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８μｇ／ｍＬ）のコントロールＢＳＡ（ｃ−ＢＳＡ）、ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ、Ｆ−ＡＧＥおよびＧ−ＡＧＥ）を調製し（実施例１１（１）を参照のこと）、そして市販のＣＭＬ−ＢＳＡ（ＣｙｃＬｅｘ Ｃｏ．， Ｌｔｄ（カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５４（長野、日本））およびＨｂＡ１ｃを（ＫＡＭＩＹＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＣＡＭＰＡＮＹ，ＵＳＡ、 ＫＡＩ−０９８Ｃ）を上記と同じ濃度に調製し、実施例１１（２）に記載されるように検出を行った。測定は、通常使用されるマイクロプレートリーダーを用いて行った。結果を図３５Ａ〜Ｃ、図３６Ａ〜Ｄ、および図３７Ａ〜Ｂに示す。 Furthermore, the ligand recognition ability of Re-miniRAGE was compared in detail. As ligands, concentrations lower than those shown in Table 13 (0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 2, 4, 8 μg / mL) Control BSA (c-BSA), AGE (R-AGE, F-AGE and G-AGE) were prepared (see Example 11 (1)) and commercially available CML-BSA (CycLex Co., Ltd. (Catalog No. CY-R2054 (Nagano, Japan)) and HbA1c (KAMIYA BIOMEDICAL CAMPANY, USA, KAI-098C) were prepared at the same concentration as above and detected as described in Example 11 (2) The measurement was carried out using a commonly used microplate reader, and the results are shown in Figs 35A-C, 36A-D, and 37A-B.
図３５Ａ〜Ｃまたは表１３から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ １，３，７は、可溶性ＲＡＧＥと同様に、ＡＧＥを認識した。しかし、図３６Ａから明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ３についてはバックグラウンド値が高いものの、いずれのＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドも、ｃＢＳＡを濃度依存的に検出しなかった。また、図３６Ｂ〜Ｄから認められるように、Ｖドメインを欠くＲＡＧＥ４はＡＧＥに対する認識能を有しておらず、この事実から、Ｖドメインは、ＡＧＥ認識に必須であると考えられる。図３７Ａ〜Ｂから明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、ＣＭＬ−ＢＳＡおよびＨｂＡ１ｃを認識することが示された。 As is clear from FIGS. 35A-C or Table 13, Re-RAGE 1, 3, and 7 recognized AGE, similar to soluble RAGE. However, as is clear from FIG. 36A, although Re-RAGE3 has a high background value, none of Re-RAGE-like polypeptides detected cBSA in a concentration-dependent manner. Also, as can be seen from FIGS. 36B to 36D, RAGE4 lacking the V domain does not have the ability to recognize AGE. From this fact, it is considered that the V domain is essential for AGE recognition. As is clear from FIGS. 37A-B, Re-RAGE-like polypeptide was shown to recognize CML-BSA and HbA1c.
（２）Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６によるＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）の検出および認識能の比較
Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６と抗ＡＧＥ抗体とを使用して実施例１１（５）に記載されるようなサンドイッチＥＬＩＳＡを行う以外は、上記実施例１１（２）と同様に検出を行った。ただし、抗Ｒ−ＡＧＥ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
(2) Comparison of AGE (R-AGE) detection and recognition ability with Re-RAGE 143, 223 and 226 As described in Example 11 (5) using Re-RAGE 143, 223 and 226 and anti-AGE antibodies Detection was performed in the same manner as in Example 11 (2) except that sandwich ELISA was performed. However, since the anti-R-AGE antibody was not labeled with HRP, it was detected using an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody.
結果を図３８Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６はいずれも、コントロールＢＳＡ（Ｃ−ＢＳＡ）は殆ど認識せず（図３８Ａ）、Ｒ−ＡＧＥに対する特異的認識能が回復している（図３８Ｂ）ことが実証された。 The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, Re-RAGE 143, 223 and 226 hardly recognize control BSA (C-BSA) (FIG. 38A), and the specific recognition ability for R-AGE is restored (FIG. 38A). FIG. 38B) was demonstrated.
上記と同様に調製したプレートをクリーンベンチで１日乾燥させたものを使用して、同様にＡＧＥに対する認識能を調べた。 Using the plate prepared in the same manner as above and dried on a clean bench for 1 day, the ability to recognize AGE was similarly examined.
結果を図３８Ｃ〜Ｄに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６はいずれも、安定してＡＧＥを認識し、図３８Ａ〜Ｂに示されるのと同様に、コントロールＢＳＡ（Ｃ−ＢＳＡ）は殆ど認識せず（図３８Ｃ）、Ｒ−ＡＧＥに対する特異的認識能が回復している（図３８Ｄ）ことが実証された。 The results are shown in FIGS. As is clear from these figures, Re-RAGE 143, 223, and 226 all recognize AGE stably, and control BSA (C-BSA) hardly recognizes, as shown in FIGS. (FIG. 38C), it was demonstrated that the specific recognition ability for R-AGE was restored (FIG. 38D).
（３）市販のＡＧＥ検出キットとの比較
本実施例においては、市販のＣｙｃＬｅｘ社製のＣｉｒｃｕＬｅｘＴＭ ＣＭＬ／Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＣＹ−８０６６）を使用した。このキットでは、ＣＭＬ−ＨＳＡがプレート上に固定化されており、競合ＥＬＩＳＡの原理に基づいてＣＭＬ−ＨＳＡ量を定量する。よって、ＣＭＬ−ＨＳＡ量に対してＡ４５０は減少する。
(3) In the comparative embodiment with commercial AGE detection kit, it made commercial CycLex Co. CircuLex TM CML / N ε - was used (carboxymethyl) lysine ELISA kit (Cat # CY-8066). In this kit, CML-HSA is immobilized on a plate, and the amount of CML-HSA is quantified based on the principle of competitive ELISA. Therefore, A450 decreases with respect to the amount of CML-HSA.
この市販のキットを用いた競合ＥＬＩＳＡを行う前に、カルボキシメチルリジンを結合したリガンド分子、ＣＭＬ−ＢＳＡ（カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５２、ＣｙｃＬｅｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）およびＣＭＬ−ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ならびにＣＭＬ化リジンと同様にＡＧＥの一つとして知られるＣＥＬ（カルボキシエチル）化リジンを結合したリガンド分子、ＣＥＬ−ＢＳＡおよびＣＥＬ−ＨＳＡ（それぞれ、カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５４およびＣＹ−Ｒ２０６７、ＣｙｃＬｅｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）を、種々の濃度（０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、および８μｇ／ｍＬ）に調製してプレート上に固定し、ｍｉｎｉＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１、２、３、４、７、および８）でこれら分子に対する認識能を調べた。結果をそれぞれ図３９Ａ〜Ｄに示す。いずれのリガンド分子に関しても、ＲＡＧＥ１、３は、認識能が高かった。ＲＡＧＥ７でも認識は可能であった。また、ｍｉｎｉＲＡＧＥは、ＣＥＬ化分子よりもＣＭＬ化分子に対する認識能が高かった。 Before conducting a competitive ELISA using this commercially available kit, ligand molecules conjugated with carboxymethyllysine, CML-BSA (Catalog No. CY-R2052, CycLex Co., Ltd.) and CML-HSA (human serum albumin), And CEL (carboxyethyl) lysine-linked ligand molecules known as one of AGEs as well as CML lysine, CEL-BSA and CEL-HSA (catalog numbers CY-R2054 and CY-R2067, CycLex Co., respectively). , Ltd.) to various concentrations (0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 2, 4, and 8 μg / mL) Fixed on the plate and paired with miniRAGE (RAGE 1, 2, 3, 4, 7, and 8). That examined the recognition ability. The results are shown in FIGS. For all ligand molecules, RAGE 1 and 3 had high recognition ability. Recognition was possible with RAGE7. In addition, miniRAGE was more capable of recognizing CML molecules than CEL molecules.
第二に、上記キットと本発明のＲｅ−ＲＡＧＥとを比較するために、以下の実験を行った。この市販のキットを用いた競合ＥＬＩＳＡについては、製造業者の説明書で推奨されるように行った。本発明のＲｅ−ＲＡＧＥを用いる実験については、その市販のキット中に含まれる抗ＣＭＬ付加物モノクローナル抗体ＫＭ−２Ａ９をプレートに固定化し、この抗体に直接ＣＭＬ−ＨＳＡを認識させ、続いてビオチン化Ｒｅ−ＲＡＧＥ１を反応させ、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（実施例９（２）に示されるように調製）と反応させ、最終的にＨＲＰの基質であるＴＭＢを加え、発色を比色した。結果を図４０に示す。市販のキットの方が吸光度の値としては高かった。しかし、本発明のＲｅ−ＲＡＧＥの場合、０．１μｇ／ｍｌ以下の領域でも検出可能である点など、感度的には遜色がなかった。 Second, in order to compare the kit with the Re-RAGE of the present invention, the following experiment was performed. Competition ELISA using this commercially available kit was performed as recommended in the manufacturer's instructions. For experiments using Re-RAGE of the present invention, the anti-CML adduct monoclonal antibody KM-2A9 contained in the commercially available kit was immobilized on a plate, and this antibody was directly recognized by CML-HSA, followed by biotinylation. Re-RAGE1 was reacted, reacted with HRP-labeled streptavidin (prepared as shown in Example 9 (2)), and finally TMB, a substrate for HRP, was added to colorize the color development. The results are shown in FIG. The commercially available kit had a higher absorbance value. However, in the case of Re-RAGE of the present invention, the sensitivity was not inferior in that it could be detected even in the region of 0.1 μg / ml or less.
（実施例１５：（Ｒｅ−）ＲＡＧＥは、変性ＬＤＬをも認識する）
（１）ｍｉｎｉＲＡＧＥの変性ＬＤＬに対する認識能
ＲＡＧＥ１の変性ＬＤＬに対する認識能
ＡＧＥの代わりに変性ＬＤＬをリガンドとして使用して、ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ＲＡＧＥ１）による変性ＬＤＬの検出を行った。各リガンド（完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬ）を、０、０．００１、０．００４、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８および１μｇ／ｍＬの濃度でＴＢＳで希釈した後プレート上に固定し、ＲＡＧＥ１で検出した。基本的な検出工程は、実施例９（２）と同様であった。結果を図４１に示す。
(Example 15: (Re-) RAGE also recognizes denatured LDL)
(1) Recognizing ability of miniRAGE for denatured LDL Recognizing ability of RAGE1 for denatured LDL Using denatured LDL instead of AGE as a ligand, denatured LDL was detected by a RAGE-like polypeptide (RAGE1). Each ligand (fully oxidized LDL, partially oxidized LDL, MDA-LDL) is changed to 0, 0.001, 0.004, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1, 0.2. , 0.4, 0.8 and 1 μg / mL, diluted with TBS, fixed on the plate, and detected with RAGE1. The basic detection process was the same as in Example 9 (2). The results are shown in FIG.
ＲＡＧＥはマルチリガンドレセプターであるものの、意外なことに、この図から明らかなように、酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬなど、本来ＣＴＬＤにより検出される変性ＬＤＬ分子も効果的に認識可能であった。酸化ＬＤＬに対する特異性の高い優れた抗体が多くないという現状に鑑みれば、ＲＡＧＥ様ポリペプチドとＣＴＬＤ様ポリペプチドとを組み合わせることにより、特異性の高いサンドイッチＥＬＩＳＡを組むことの可能性が示された。 Although RAGE is a multi-ligand receptor, surprisingly, as is clear from this figure, modified LDL molecules originally detected by CTLD, such as oxidized LDL and MDA-LDL, could also be recognized effectively. In view of the current situation that there are not many excellent antibodies with high specificity against oxidized LDL, the possibility of combining sandwich ELISA with high specificity by combining RAGE-like polypeptide and CTLD-like polypeptide was shown. .
（２）Ｒｅ−ＲＡＧＥの変性ＬＤＬに対する認識能
本実験においては、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１〜９を使用した以外は、上記（１）と同様に、ＡＧＥの代わりに完全酸化ＬＤＬをリガンドとして、ＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出を行った。結果を図４２に示す。この図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１および３による完全酸化ＬＤＬの認識が高かった。Ｒｅ−ＲＡＧＥ２および７は、Ｒｅ−ＲＧＡＥ１および３には劣るが、認識能が認められた。よって、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６も、変性ＬＤＬに対する認識能を有し、変性ＬＤＬの検出用素子として機能すると考えられる。
(2) Recognizing ability of Re-RAGE for modified LDL In this experiment, except that Re-RAGE 1 to 9 were used, RAGE-like poly (RAGE) was used with fully oxidized LDL as a ligand instead of AGE as in (1) above. Detection of denatured LDL by peptide was performed. The results are shown in FIG. As is clear from this figure, the recognition of fully oxidized LDL by Re-RAGE 1 and 3 was high. Re-RAGE 2 and 7 were inferior to Re-RGAE 1 and 3, but recognized ability. Therefore, Re-RAGE 143, 223, and 226 are also considered to have recognition ability for denatured LDL and function as a detection element for denatured LDL.
（３）ＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの変性ＬＤＬの除去
Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ ２０μｌ（５０％スラリー）とＲｅ−ＲＡＧＥ１（５μｇ／１００μｌ ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのビーズを回収後、冷ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで繰り返し洗浄した。
(3) Removal of denatured LDL from denatured LDL-containing plasma model by RAGE-like polypeptide Ni-agarose beads 20 μl (50% slurry) and Re-RAGE1 (5 μg / 100 μl TBS) were reacted at 4 ° C. for 30 minutes. The beads were collected by centrifugation with a swing rotor at 2500 rpm × 5 minutes, and then washed repeatedly with cold TBS-Tween.
大過剰の酸化ＬＤＬを添加した血漿中（１２０μｌ）にＲｅ−ＲＡＧＥ１を固定化したＮｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ ２０μｌ（５０％スラリー）を添加し、３０分間４℃で反応させた後、遠心（２，８００ｒｐｍ×５分間）し、上清に回収される血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を、受容体がＲｅ−ＲＡＧＥ１であることを除いて、上記実施例９（３）に記載されるようにＲｅ−ＲＡＧＥ１−抗ＡｐｏＢ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定し、含有酸化ＬＤＬ除去効率を求めた。結果を図４３に示す。 After adding 20 μl (50% slurry) of Ni-agarose beads immobilized with Re-RAGE1 in plasma (120 μl) with a large excess of oxidized LDL, the mixture was reacted at 4 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged (2,800 rpm X5 min) and the concentration of oxidized LDL in plasma recovered in the supernatant was determined as described in Example 9 (3) above except that the receptor is Re-RAGE1. Measurement was performed by sandwich ELISA using an anti-ApoB antibody, and the removal efficiency of contained oxidized LDL was determined. The results are shown in FIG.
Ｒｅ−ＲＡＧＥ１固定化ビーズにより、２０μｇ／ｍｌ程度までの酸化ＬＤＬであれば、変性ＬＤＬ含有血漿モデルから酸化ＬＤＬを１００％回収可能なことが確認された。１００μｇ／ｍｌという異常な高濃度を含有するモデル血漿においても、含有変性ＬＤＬのうちの８０％以上は回収可能であった。 With Re-RAGE1 immobilized beads, it was confirmed that oxidized LDL could be recovered 100% from a modified LDL-containing plasma model with oxidized LDL up to about 20 μg / ml. Even in model plasma containing an abnormally high concentration of 100 μg / ml, more than 80% of the contained modified LDL was recoverable.
（４）ＲＡＧＥ様ポリペプチドとＣＴＬＤ様ポリペプチドとの組み合わせによる変性ＬＤＬの検出
ＣＴＬＤは変性ＬＤＬのみではなく、ＡＧＥ認識能も有している。一方、ＲＡＧＥはＡＧＥのみではなく、変性ＬＤＬ認識能を有している。そこで両者を組み合わせ、サンドイッチＥＬＩＳＡによる検出系を組み立てた。
(4) Detection of denatured LDL by combination of RAGE-like polypeptide and CTLD-like polypeptide CTLD has not only denatured LDL but also AGE recognition ability. On the other hand, RAGE has not only AGE but also denatured LDL recognition ability. Therefore, a detection system by sandwich ELISA was assembled by combining both.
抗ＡｐｏＢ抗体の代わりにＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドを使用することを除いて、実施例９（３）に記載されるように、変性ＬＤＬの検出を行った。 Detection of denatured LDL was performed as described in Example 9 (3) except that Re-RAGE-like polypeptide was used instead of anti-ApoB antibody.
Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤをプレート上に固定化し、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、ｃＢＳＡ、Ｒ−ＡＧＥ（濃度０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬ）と反応させた。続いてＲｅ−ビオチン化ＲＡＧＥ１（５μｇ／ｍＬ；１００μｌ／ウェル）と反応させ、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（実施例９（２）に示されるように調製）と反応後、最終的には比色定量を行った。結果を図４４に示す。 Re-PR-CTLD was immobilized on a plate, and LDL, fully oxidized LDL, cBSA, R-AGE (concentration 0, 0.01, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 , 1, 2, 4, 8 and 10 μg / mL). Subsequent reaction with Re-biotinylated RAGE1 (5 μg / mL; 100 μl / well) and further reaction with HRP-labeled streptavidin (prepared as shown in Example 9 (2)), and finally colorimetric determination Went. The results are shown in FIG.
図から明らかなように、ＬＤＬに比して完全酸化ＬＤＬに対する認識が有意に高く、ｃＢＳＡに比してＲ−ＡＧＥに対する認識能が有意に高かった。現時点では、バックグラウンド値が高いなどの問題はあるが、さらに条件を至適化することによって、バックグラウンド値の低い、より特異性の高い変性ＬＤＬ検出系が開発可能であると考えられる。 As is clear from the figure, the recognition of fully oxidized LDL was significantly higher than that of LDL, and the recognition ability of R-AGE was significantly higher than that of cBSA. At present, there are problems such as a high background value, but it is considered that a more specific denatured LDL detection system with a low background value can be developed by further optimizing the conditions.
（実施例１６：Ｒｅ−ＣＴＬＤを固定化した基材の安定性および種々の抗体を用いた変性ＬＤＬの検出）
（１）Ｒｅ−ＣＴＬＤ固定化ビーズの保存期間による変性ＬＤＬ認識能の変化
検出用ビーズとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＣＴＬＤをＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズに固定化したものを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。
(Example 16: Stability of substrate on which Re-CTLD is immobilized and detection of denatured LDL using various antibodies)
(1) Change in denatured LDL recognition ability depending on storage period of Re-CTLD-immobilized beads For the purpose of verifying the stability as a detection bead, Re-CTLD was immobilized on Ni-Agarose beads and denatured. It was investigated whether LDL could be detected stably.
実施例１０（２）に従って、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ固定化Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（２０μｌ×５；５０％スラリー）を調製した。このように調製したビーズを４℃で保存した。上記５連で調製したビーズのうち１連を調製直後（０週間とする）に変性ＬＤＬ検出のために使用して、検出安定性の基準とした。残りのビーズのうちの４連を、調製後１、２、４、６週間の間、４℃で保存し、保存期間による変性ＬＤＬ検出の安定性の変化を測定した。変性ＬＤＬ含有血漿モデルは、実施例７（２）に従って測定時に調製した。結果を図４５に示す（０週間で測定した場合の結果を１００％として示した）。 Re-PR-CTLD immobilized Ni-Agarose beads (20 μl × 5; 50% slurry) were prepared according to Example 10 (2). The beads thus prepared were stored at 4 ° C. One of the beads prepared in the above 5 series was used for detection of denatured LDL immediately after preparation (set to 0 week), and used as a standard for detection stability. Four of the remaining beads were stored at 4 ° C. for 1, 2, 4 , 6 weeks after preparation, and the change in the stability of denatured LDL detection with the storage period was measured. A modified LDL-containing plasma model was prepared at the time of measurement according to Example 7 (2). The results are shown in FIG. 45 (the results when measured at 0 weeks are shown as 100%).
Ｒｅ−ＣＴＬＤは４℃で保存時に、数週間で一部が沈殿することがあるが、図から明らかなように、固相上へ固定すると分子の安定性が上昇し、６週間経過しても、変性ＬＤＬ認識能の９７％が保持され、固相上で極めて安定であることが示された。 When Re-CTLD is stored at 4 ° C., a part of it may precipitate within a few weeks, but as is clear from the figure, the stability of the molecule increases when immobilized on a solid phase, even after 6 weeks. 97% of the ability to recognize denatured LDL was retained and shown to be very stable on the solid phase.
（２）Ｒｅ−ＣＴＬＤ固定化乾燥プレートの保存期間による変性ＬＤＬ認識能の変化
ＥＬＩＳＡプレートとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＣＴＬＤを９６穴プレートに固定化し、一旦乾燥させたプレートを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。検出工程は、基本的には実施例９（３）に示されるとおりである。使用した受容体、検出するまでのプレートの保存期間および使用する二次抗体は、以下のとおりである。
（ａ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：０（すなわち、乾燥直後）、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｂ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｃ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｄ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＯｘＬＤＬ抗体
（ｅ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＭＤＡ ＬＤＬ抗体
９６穴のプレートに、１５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化ありまたはなし））溶液を５０μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、１％ＢＳＡ/０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳで４℃で一晩ブロッキングし、ブロッキング溶液を除去した。その後、クリーンベンチ内でプレートを乾燥させ、使用時まで、４℃で保存しておいた。上記の条件で認識能が維持されているか否かを確認した。（ａ）〜（ｅ）についての結果を、それぞれ、図４６Ａ〜Ｅに示す。
(2) Change in recognition ability of denatured LDL depending on storage period of Re-CTLD-immobilized dry plate For the purpose of verifying the stability as an ELISA plate, Re-CTLD was immobilized on a 96-well plate and once dried. Thus, it was investigated whether denatured LDL could be detected stably. The detection process is basically as shown in Example 9 (3). The receptors used, the plate storage period until detection, and the secondary antibodies used are as follows.
(A) Receptor: Re-CTLD, storage period: 0 (ie, immediately after drying), secondary antibody: anti-ApoB antibody (b) receptor: Re-CTLD, storage period: 1 week, secondary antibody: anti-ApoB Antibody (c) receptor: Re-biotinylated CTLD, storage period: 1 week, secondary antibody: anti-ApoB antibody (d) receptor: Re-biotinylated CTLD, storage period: 1 week, secondary antibody: anti-OxLDL Antibody (e) Receptor: Re-biotinylated CTLD, Storage period: 1 week Secondary antibody: Anti-MDA LDL antibody Receptor diluted with TBS to a concentration of 15 μg / ml in a 96-well plate (Re-PR -CTLD (with or without biotinylation) solution was added at 50 μl / well. After standing at 4 ° C. overnight, blocking was performed overnight at 4 ° C. with 1% BSA / 0.02% Tween 20-containing TBS to remove the blocking solution. Thereafter, the plate was dried in a clean bench and stored at 4 ° C. until use. It was confirmed whether the recognition ability was maintained under the above conditions. The results for (a) to (e) are shown in FIGS.
これら図から明らかなように、ストレプトアビジンを介した固定のあるなしに拘わらず、乾燥過程を経たＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートにおいても、実施例１３（１）のように乾燥過程を経ていないＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートと同様に安定して変性ＬＤＬを検出可能であり、乾燥状態での保存、輸送が可能であることが示された。 As is clear from these figures, Re-CTLD-immobilized plates that have undergone a drying process, regardless of whether or not they are immobilized via streptavidin, also have a Re- that has not undergone a drying process as in Example 13 (1). It was shown that denatured LDL can be detected stably similarly to the CTLD-immobilized plate, and can be stored and transported in a dry state.
（実施例１７：Ｒｅ−ｍｉｎｉＲＡＧＥを固定化した基材の安定性および種々の抗体を用いた変性ＬＤＬの検出）
実施例１６（１）と同様に、ｍｉｎｉＲＡＧＥにおいても検出用ビーズとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１をＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズに固定化したものを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。
(Example 17: Stability of substrate on which Re-miniRAGE is immobilized and detection of denatured LDL using various antibodies)
Similarly to Example 16 (1), in miniRAGE, the denatured LDL is stably detected by using Re-RAGE1 immobilized on Ni-Agarose beads for the purpose of verifying the stability as a detection bead. We investigated whether it was possible.
実施例１０（２）に従って、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１固定化Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（２０μｌ×５；５０％スラリー）を調製した。このように調製したビーズを４℃で保存した。上記５連で調製したビーズのうち１連を調製直後（０週間とする）に変性ＬＤＬ検出のために使用して、検出安定性の基準とした。残りのビーズのうちの４連を、調製後１、２、４、６週間の間、４℃で保存し、保存期間による変性ＬＤＬ検出の安定性の変化を測定した。結果を図４５に示す（０週間で測定した場合の結果を１００％として示した）。 Re-RAGE1 immobilized Ni-Agarose beads (20 μl × 5; 50% slurry) were prepared according to Example 10 (2). The beads thus prepared were stored at 4 ° C. One of the beads prepared in the above 5 series was used for detection of denatured LDL immediately after preparation (set to 0 week), and used as a standard for detection stability. Four of the remaining beads were stored at 4 ° C. for 1, 2, 4, 6 weeks after preparation, and the change in the stability of denatured LDL detection with the storage period was measured. The results are shown in FIG. 45 (the results when measured at 0 weeks are shown as 100%).
図から明らかなように、固相上へ固定すると分子の安定性が上昇し、６週間経過しても、変性ＬＤＬ認識能の９６％が保持され、固相上で極めて安定であることが示された。 As is apparent from the figure, the stability of the molecule increases when immobilized on the solid phase, and 96% of the denatured LDL recognition ability is retained even after 6 weeks, indicating that it is extremely stable on the solid phase. It was done.
（実施例１８：Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の動脈硬化診断への応用）
実施例１３（２）（Ｉ）に示されるようにＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートを調製し、変性ＬＤＬ測定用サンプルとして、正常血清（１２０μｌ）中に０、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．５、１、２および４μｇ／ｍＬ血漿となるように完全酸化ＬＤＬを添加し、変性ＬＤＬ含有血漿モデルを調製した。変性ＬＤＬの検出工程は、基本的に実施例１３（２）（Ｉ）に従って、抗ＡｐｏＢ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。結果を図４７に示す。
(Example 18: Application of Re-PR-CTLD and PR-CTLD14 to arteriosclerosis diagnosis)
Re-CTLD-immobilized plates were prepared as shown in Example 13 (2) (I), and 0, 0.02, 0.05, 0.00 in normal serum (120 μl) as a sample for measuring denatured LDL. Denatured LDL-containing plasma models were prepared by adding fully oxidized LDL to 1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2 and 4 μg / mL plasma. The detection process of denatured LDL was performed by sandwich ELISA using anti-ApoB antibody basically according to Example 13 (2) (I). The results are shown in FIG.
図から明らかなように、プレートに固定化したＲｅ−ＣＴＬＤが血漿中の成分に妨害されずに酸化ＬＤＬを認識可能なことが実証された。また血漿中には大量のＬＤＬが存在するが、ＣＴＬＤの親和性は酸化ＬＤＬに対して圧倒的に高いため、膨大な量のＬＤＬより先に酸化ＬＤＬが結合することが検証された。 As is clear from the figure, it was demonstrated that Re-CTLD immobilized on a plate can recognize oxidized LDL without being disturbed by components in plasma. Although a large amount of LDL is present in plasma, the affinity of CTLD is overwhelmingly higher than that of oxidized LDL. Therefore, it was verified that oxidized LDL binds before a large amount of LDL.
これらの結果と、動脈硬化の疑いがある患者から得られた血漿で得られた値とを比較することにより、患者血清中に含まれる変性ＬＤＬの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、上記患者が動脈硬化および他の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。 By comparing these results with values obtained with plasma obtained from a patient suspected of having arteriosclerosis, the relative amount of denatured LDL contained in the patient's serum is calculated. By comparing these values with those used in clinical tests, it can be predicted whether the patient suffers from diseases caused by arteriosclerosis and other degenerative LDL.
（実施例１９：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの糖尿病性血管障害への応用）
受容体としてＲｅ−ＲＡＧＥを使用することを除いて、実施例１３（２）（Ｉ）に示されるようにＲｅ−ＲＡＧＥ固定化プレートを調製し、ＡＧＥ測定用サンプルとして、正常血清（１２０μｌ）中に０、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．５、１、２および４μｇ／ｍＬ血漿となるようにＡＧＥを添加し、ＡＧＥ含有血漿モデルを調製した。ＡＧＥの検出工程は、基本的に実施例１１（５）に従って、抗ＡＧＥ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより行う。
(Example 19: Application of RAGE-like polypeptide to diabetic vascular disorder)
A Re-RAGE-immobilized plate was prepared as shown in Example 13 (2) (I) except that Re-RAGE was used as a receptor. Add AGE to 0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2 and 4 μg / mL plasma to prepare AGE-containing plasma model did. The AGE detection step is basically performed by sandwich ELISA using an anti-AGE antibody according to Example 11 (5).
プレートに固定化したＲｅ−ＲＡＧＥが血漿中の成分に妨害されずにＡＧＥを認識可能なことが実証される。 It is demonstrated that Re-RAGE immobilized on a plate can recognize AGE without being disturbed by components in plasma.
これらの結果と、糖尿病性血管障害の疑いがある患者から得られた血漿で得られた値とを比較することにより、患者血清中に含まれるＡＧＥの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、上記患者が糖尿病性血管障害および他のＡＧＥによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。 By comparing these results with the values obtained with plasma obtained from a patient suspected of having diabetic vascular injury, the relative amount of AGE contained in the patient serum is calculated. By comparing these values with those used in clinical tests, it can be predicted whether the patient suffers from diabetic vascular disorders and other diseases caused by AGE.
ＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、動脈硬化、糖尿病性血管障害などの早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野で活用できる。 CTLD-like polypeptide-surfactant binding complex and RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex are based on early diagnosis of arteriosclerosis, diabetic vascular disorder, etc. It can be used in various fields such as evaluation of therapeutic effects.
配列番号１：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤをコードする核酸配列
配列番号２：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１をコードする核酸配列
配列番号４：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１のアミノ酸配列
配列番号５：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４をコードする核酸配列
配列番号６：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列
配列番号７：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックをコードする核酸配列
配列番号８：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックのアミノ酸配列
配列番号９：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥをコードする核酸配列
配列番号１０：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８をコードする核酸配列
配列番号１２：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１をコードする核酸配列
配列番号１４：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１６：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１７：AviTagのアミノ酸配列
配列番号１８：Streptagのアミノ酸配列
配列番号１９：StreptagIIのアミノ酸配列
配列番号２０：ＣＴＬＤの順方向プライマー
配列番号２１：ＣＴＬＤの逆方向プライマー
配列番号２２：ＲＡＧＥの順方向プライマー
配列番号２３：ＲＡＧＥの逆方向プライマー
配列番号２４：ｍｉｎｉＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６）の順方向プライマー
配列番号２５：ＲＡＧＥ１の逆方向プライマー
配列番号２６：ＲＡＧＥ２の逆方向プライマー
配列番号２７：ＲＡＧＥ３の逆方向プライマー
配列番号２８：ＲＡＧＥ７の逆方向プライマー
配列番号２９：ＲＡＧＥ８の逆方向プライマー
配列番号３０：ＲＡＧＥ９の逆方向プライマー
配列番号３１：ＲＡＧＥ４の順方向プライマー
配列番号３２：ＲＡＧＥ４の逆方向プライマー
配列番号３３：ＲＡＧＥ１４３の逆方向プライマー
配列番号３４：ＲＡＧＥ２２３の逆方向プライマー
配列番号３５：ＲＡＧＥ２２６の逆方向プライマー
配列番号３６：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２をコードする核酸配列
配列番号３７：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２のアミノ酸配列
配列番号３８：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３をコードする核酸配列
配列番号３９：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３のアミノ酸配列
配列番号４０：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４をコードする核酸配列
配列番号４１：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４のアミノ酸配列
配列番号４２：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７をコードする核酸配列
配列番号４３：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７のアミノ酸配列
配列番号４４：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３をコードする核酸配列
配列番号４５：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３のアミノ酸配列
配列番号４６：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３をコードする核酸配列
配列番号４７：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３のアミノ酸配列
配列番号４８：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６をコードする核酸配列
配列番号４９：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 1: Nucleic acid sequence encoding PR-CTLD or CTLD SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of PR-CTLD or CTLD SEQ ID NO: 3: Nucleic acid sequence encoding PR-Lox-1 or Lox-1 SEQ ID NO: 4: PR- Lox-1 or Lox-1 amino acid sequence SEQ ID NO: 5: Nucleic acid sequence encoding PR-CTLD14 or CTLD14 SEQ ID NO: 6: PR-CTLD14 or CTLD14 amino acid sequence SEQ ID NO: 7: Lox-1 CTLD + neck or PR-CTLD + Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 8: Lox-1 CTLD + Neck or PR-CTLD + Neck amino acid sequence SEQ ID NO: 9: Nucleic acid sequence encoding RAGE or mRAGE SEQ ID NO: 10: RAGE or mRAGE amino acid sequence SEQ ID NO: 11 RAGE Or nucleic acid sequence SEQ ID NO: which encode mRAGE8 12: RAGE8 or MRAGE8 amino acid sequence SEQ ID NO 13: RAGE1 or mRAGE1 nucleic acid sequence SEQ ID NO: which encode 14: RAGE1 or mRAGE1 amino acid sequence SEQ ID NO 15: Gly-Gly-Gly-Ser
Sequence number 16: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
SEQ ID NO: 17: AviTag amino acid sequence SEQ ID NO: 18: Streptag amino acid sequence SEQ ID NO: 19: Streptag II amino acid sequence SEQ ID NO: 20: CTLD forward primer SEQ ID NO: 21: CTLD reverse primer SEQ ID NO: 22: RAGE forward direction Primer SEQ ID NO: 23: Reverse primer of RAGE SEQ ID NO: 24: Forward primer of miniRAGE (RAGE1, RAGE2, RAGE3, RAGE7, RAGE8, RAGE9, RAGE143, RAGE223 and RAGE226) SEQ ID NO: 25: Reverse primer sequence number 26 of RAGE1 : Reverse primer of RAGE2 SEQ ID NO: 27: Reverse primer of RAGE3 SEQ ID NO: 28: Reverse primer of RAGE7 SEQ ID NO: 29: Reverse primer of RAGE8 SEQ ID NO: 30: RAGE Reverse primer SEQ ID NO: 31: RAGE4 forward primer SEQ ID NO: 32: RAGE4 reverse primer SEQ ID NO: 33: RAGE143 reverse primer SEQ ID NO: 34: RAGE223 reverse primer SEQ ID NO: 35: RAGE226 reverse primer sequence No. 36: Nucleic acid sequence encoding RAGE2 or mRAGE2 SEQ ID NO: 37: Amino acid sequence of RAGE2 or mRAGE2 SEQ ID NO: 38: Nucleic acid sequence encoding RAGE3 or mRAGE3 SEQ ID NO: 39: Amino acid sequence of RAGE3 or mRAGE3 SEQ ID NO: 40: RAGE4 or mRAGE4 SEQ ID NO: 41: amino acid sequence of RAGE4 or mRAGE4 SEQ ID NO: 42: nucleic acid sequence encoding RAGE7 or mRAGE7 3: Amino acid sequence of RAGE7 or mRAGE7 SEQ ID NO: 44: Nucleic acid sequence encoding RAGE143 or mRAGE143 SEQ ID NO: 45: Amino acid sequence of RAGE143 or mRAGE143 SEQ ID NO: 46: Nucleic acid sequence encoding RAGE223 or mRAGE223 SEQ ID NO: 47: RAGE223 or mRAGE223 Amino acid sequence SEQ ID NO: 48: Nucleic acid sequence encoding RAGE226 or mRAGE226 SEQ ID NO: 49: Amino acid sequence of RAGE226 or mRAGE226
Claims (36)
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、検出剤。 A late glycation reaction product (AGE) detector comprising a late glycation reaction product receptor (RAGE) -like polypeptide-surfactant binding complex, wherein the RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex comprises:
(P1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
(P2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (P3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% or more nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, wherein the amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence are An amino acid sequence retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 12;
(Q1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;
(Q2) Natural RAGE activity comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95, 206 and 250 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 And (Q3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% or more nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and position 92 in the encoded amino acid sequence , Amino acids at positions 95, 206 and 250 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 14;
(R1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37;
(R2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 sequence; and (R3) SEQ ID NO: 36 nucleic acid sequence shown in the an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% nucleic acid sequence identity, position 92 in the amino acid sequence the cord, 95 of And amino acids at positions 206 retain the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 37;
(S1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39;
(S2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, an amino acid showing the activity of natural RAGE, including one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 sequence; and (S3) SEQ ID NO: 38 nucleic acid sequence shown in the an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% nucleic acid sequence identity, position 92 in the amino acid sequence the cord, 95 of And the amino acid at position 206 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 39;
(U1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43;
(U2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (U3) SEQ ID NO: 42 nucleic acid sequence shown in the an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% nucleic acid sequence identity, position 92 and position 95 of the amino acid in the amino acid sequence the code An amino acid sequence retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 43;
(V1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45;
(V2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; (V3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 44, wherein the amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence are An amino acid sequence retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 45;
(W1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47;
(W2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (W3) SEQ ID NO: 46 nucleic acid sequence shown in the an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% nucleic acid sequence identity, the amino acid at position 92 and position 95 in the amino acid sequence the code An amino acid sequence retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 47;
(X1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49;
(X2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49, an amino acid sequence showing the activity of natural RAGE, comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at amino acid positions other than positions 92 and 95; and (X3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% or more nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 48, wherein the amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence are An amino acid sequence retaining the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 49;
A detection agent comprising a polypeptide comprising a sequence selected from the group consisting of:
酸配列である、請求項５に記載の検出剤。 The detection agent according to claim 5, wherein the linker sequence is an amino acid sequence represented by Gly-Gly-Ser, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16.
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤；または
（２）請求項１１に記載のデバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、該ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）該複合体を検出する工程、
を包含する、方法。 A method for detecting AGE, the method comprising:
(A) providing a sample isolated from a subject;
(B) The sample and the following:
(1) The detection agent according to any one of claims 1 to 10; or (2) the device according to claim 11,
Contacting with any of the above to form a complex of the polypeptide and the AGE; and (C) detecting the complex;
Including the method.
（Ａ）糖尿病性血管障害に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）糖尿病性血管障害に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤；
（２）請求項１１に記載のデバイス；または
（３）請求項２８に記載の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、該ＲＡＧＥ様ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）該複合体を検出する工程、
（Ｅ）該被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、該コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、該被験体中のＡＧＥの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含する、方法。 A method for assisting in the diagnosis of a disease caused by AGE comprising:
(A) providing a sample isolated from a subject suspected of suffering from diabetic vascular disorder;
(B) providing a sample isolated from a control subject not suffering from diabetic vascular disorder;
(C) the sample and the following:
(1) The detection agent according to any one of claims 1 to 10;
(2) the device according to claim 11; or (3) the diagnostic agent for diabetic vascular disorder according to claim 28,
Contacting with any of the above to form a complex of the RAGE-like polypeptide and the AGE; and (D) detecting the complex;
(E) comparing the amount of complex in a sample isolated from the subject with the amount of complex in a sample isolated from the control subject to determine the amount of AGE in the subject; Calculating a relative value for the control subject;
Including the method.
Ａ）前記ポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）該封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含する方法。 A method for producing the detection agent according to any one of claims 1 to 10,
A) producing the polypeptide as an inclusion body in a bacterial host cell; and B) refolding the inclusion body with a surfactant and cycloamylose to obtain a RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex. ,
Including the method.
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