JP5658866B2 - 評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、角層の保湿状態を判断する新規評価方法に関し、さらには該評価方法を利用した保湿剤のスクリーニング方法に関する。

従来、保湿剤の評価方法として、下記方法がよく用いられている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、（１）被評価物質を一定湿度環境下に放置し、吸水された水の重量を測定することにより評価する方法、（２）被評価物質を水に溶解し、一定環境下での水分の蒸散を重量測定により評価する方法（例えば、特許文献１参照）、（３）水分活性を測定する方法（例えば、非特許文献１参照）等が挙げられる。また、ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、被評価物質を皮膚に塗布して、塗布前後の水分量を皮膚の電気的特性等で測定する方法（例えば、特許文献２参照）が挙げられる。

しかし、皮膚化粧料や医薬品の皮膚外用剤に配合する保湿剤の作用部位は角層であるところ、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏによる方法では、被評価物質そのものの吸水量を測定することは可能であるが、角層構成成分と相互作用する水の評価はできない。一方、ｉｎ ｖｉｖｏによる方法では、角層構成成分と相互作用する水を評価しているのか、被評価物質と相互作用する水を評価しているのかの判別はできない。現状では、本来見るべきである角層に必要な保湿剤を評価する方法、即ち角層構成成分と水の相互作用に基いて保湿剤を評価する方法は存在していない。

特開２００２−０６０３３５号公報 特開２００７−０４５７７６号公報

フレグランスジャーナル臨時増刊Ｎｏ．９、フレグランスジャーナル出版、１９８８年、ｐ．１３７

上記事情において、本来見るべきである角層の構成成分と水との相互作用に基いて角層の保湿状態を評価する方法、それに基く保湿剤のスクリーニング方法が求められていた。即ち、本発明の課題は、角層構成成分と水との相互作用に基いた角層の保湿状態の評価方法と、該評価方法を用いた保湿剤のスクリーニング方法を提案することにある。

本発明者らは上記事情に鑑み、鋭意研究した結果、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量が、角層構成成分と相互作用が可能な水の量の指標となり得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、角層構成成分と相互作用が可能な水の量を判断基準とする角層の保湿状態の評価方法であって、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量を角層構成成分と相互作用が可能な水の量の指標とする評価方法にある。

より具体的には、本発明は、上記評価方法において、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量が、下記（ａ）〜（ｅ）の手順によって求められる、解析対象ピークのＩＲスペクトル強度の変化量又は変化率により見積られる評価方法にある。
（ａ）角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定する。
（ｂ）角層を重水処理する。
（ｃ）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定する。
（ｄ）ＩＲスペクトル中の、重水処理により影響を受けにくい角層構成成分の官能基に由来する吸収ピーク（標準ピーク）の強度を指標として、スペクトル１及びスペクトル２を補正する（夫々、補正スペクトル１及び補正スペクトル２）。
（ｅ）補正スペクトル１及び補正スペクトル２中の角層構成成分の官能基に由来する吸収ピークで、該官能基が重水との間で水素交換を行うことが可能な水素原子を有する官能基に由来する吸収ピーク（解析対象ピーク）の強度を補正スペクトル１、２間で比較し、その変化量又は変化率を求める。

本発明は、上記評価方法における解析対象ピークが＞ＮＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ₃ ⁺、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、（Ｐ）−ＯＨ、（Ｓ）−ＯＨ及び−ＳＨから選ばれるいずれかの官能基に由来するものである評価方法、さらに上記評価方法における解析対象ピークがアミドＩＩ、アミドＩＩＩ又は１３４０ｃｍ^-1に検出されるピークである評価方法にある。

本発明は、上記評価方法における角層構成成分が、ケラチン、フィラグリン若しくはコーニファイドエンベロープ由来のタンパク質、細胞間脂質又は皮脂である評価方法にある。

また本発明は、上記評価方法により評価された角層の保湿状態を判断基準として用いる保湿剤のスクリーニング方法にある。

本発明により、角層構成成分と相互作用する水の量に基いて角層の保湿状態を評価することが可能となり、角層の保湿化により効果的な保湿剤の探索、従来の保湿剤の評価方法では効果が認められていなかった物質の化粧料への応用が可能となる。更に、ＩＲ計測を利用した場合は、保湿に作用している水が角層のどの構成成分と関係しているかを確認することも可能となる。従って、乾燥やあれ肌、アトピー等の肌の状態毎に角層構成成分と水との相互作用の特徴を捉えることにより、それに基いて肌状態に応じた適切な保湿剤の適用も可能となる。

天然保湿因子抽出処理した角層における、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した重水処理前と後のＩＲスペクトルである。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、未処理、天然保湿因子抽出処理及び乳酸塩処理間で角層ケラチンへの重水素置換率の比較を行った結果である。 Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、未処理、天然保湿因子抽出処理間での角層ケラチンへの重水素置換率の比較を行った結果である。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、５種類の保湿剤間での角層ケラチンへの重水素置換率の比較を行った結果である。

角層が保湿された状態とは角層構成成分の近傍に水が存在している状態であり、この近傍に存在する水の量の多寡が角層の保湿状態を決定している。角層構成成分の近傍に水が存在するとは、角層構成成分と水との間で何らかの相互作用を及ぼしあっているということを意味する。本発明では、その相互作用の程度が近傍に存在する水の量に依存するという考えのもとに、角層構成成分と相互作用可能な水の量を判断基準として角層の保湿状態を評価しようとするものである。ここで相互作用とは、角層を構成する成分のいずれかと水分子との間で及ぼしあっている何らかの物理的又は化学的な関係であれば特に限定されない。以下で、角層構成成分とその近傍の水分子との間の水素交換を相互作用とした場合の本発明の角層の保湿状態の評価方法について説明する。

角層構成成分中には、近傍に存在する水分子との間で水素交換できる水素原子を有する官能基が存在する。水素交換は、その官能基自体の性質に依存するとともに、角層構成成分の近傍に存在して角層構成成分と相互作用が可能な水の量にも依存する。角層構成成分の近傍に存在する水が重水素を有する重水であった場合、角層構成成分の官能基の水素原子との間で水素交換が起こると、角層構成成分が重水素化されることになる。一方、角層構成成分中の官能基は、角層のＩＲスペクトルを測定した場合に、特定の吸収ピークとして検出することができる。官能基の有する水素原子が重水素化されると、官能基の質量が変化して赤外線の吸収特性も変わるため、重水素化前後で吸収ピークの強度が変化する。本発明では、この重水素化に伴うＩＲスペクトルの吸収強度の変化を、角層構成成分と相互作用する水の量、即ち角層を保湿している水の量（＝角層の保湿状態）の指標とするものである。以下、ＩＲスペクトル測定を利用した例により、さらに本発明の角層の保湿状態の評価方法について説明する。

評価に供する角層については、様々な形態のものを使用することが可能である。例えば、動物の場合、マウス、ラット又はブタ等から様々な方法により採取した角層が挙げられる。ヒトの場合、踵より採取した角層や皮膚から様々な方法により採取した角層が挙げられる。また、これら採取した角層については採取した形態そのものや、粉砕して粉末状にした形態も可能である。更に、ヒトの場合、角層を採取せず、ｉｎ ｖｉｖｏで非侵襲的に腕や顔面等の角層に対して直接評価することも可能である。

角層のＩＲスペクトルの測定方法については透過型測定やＡＴＲ等の反射型測定が知られており、評価に供する角層の形態に応じて様々な測定方法を選択することができ、特に限定されない。

角層のＩＲスペクトルを測定することにより、様々な角層構成成分由来の吸収ピークを取得することができる。それらピークには、アミド基やＯＨ基等の既知の官能基に由来するピークの他に、未同定のピークも存在する。未同定ピークについては、様々な手法を用いることにより同定が可能である。このように、ピークを同定することにより、角層構成成分のどのような成分由来の官能基であるかが確認可能である。

重水は水と同じような物理化学的特性を持っている。この重水を用いる重水置換法は、タンパクの構造解析によく用いられている手法のひとつである。これは重水置換前後において、タンパクのＩＲスペクトル等を測定し、それらのスペクトルを重水置換前後で比較することにより、その構造変化を解析する手法である。

角層のＩＲスペクトル測定により検出される吸収ピークにおいても、吸収ピークが由来する角層構成成分の官能基が水素原子を有し且つ水分子との間で水素交換が可能であれば、角層を重水処理することにより重水素置換が起こり、その吸収ピークに変動をもたらす。重水素置換量は角層構成成分と相互作用が可能な水の量に依存しており、本発明の角層の保湿状態の評価方法では、角層構成成分と相互作用が可能な水の量の指標として、この重水素置換量を利用する。角層構成成分において重水素置換され得る官能基としては、例えば＞ＮＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ₃ ⁺、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、（Ｐ）−ＯＨ、（Ｓ）−ＯＨ、−ＳＨが挙げられる。本発明では、このような重水との間で重水素交換を行うことが可能な水素原子を有する官能基に由来する吸収ピークを解析対象ピークとして、重水処理前後における解析対象ピークのＩＲスペクトル強度の変化量又は変化率を用いて重水素置換量を見積もる。特に本発明では、解析対象ピークとして、主にタンパク質のアミド結合（Ｎ−Ｈ）に由来し一般にアミドＩＩ、アミドＩＩＩと呼ばれる吸収ピーク、又は１３４０ｃｍ^-1に検出されケラチンに由来すると見られるピークが好ましく用いられる。

ＩＲスペクトルを測定する場合、測定する角層や測定時の状態に影響を受け、スペクトルの測定感度に変動が生じる場合がある。そのため、ＩＲスペクトルを比較する場合、ＩＲスペクトル中のいずれかの吸収ピークの強度を基準としてスペクトルを補正することが必要となる場合がある。角層を重水処理すると、水素原子を持つ官能基に由来する吸収ピークは重水素置換によりピーク強度が変化する可能性を有する。そこで、水素原子を持たず重水素置換による影響を受けにくい官能基に由来する吸収ピークを標準ピークとし、その強度を基準としてＩＲスペクトルの補正を行う。アミド結合（−ＣＯ−Ｎ＜）に由来し、一般にアミドＩと呼ばれる吸収ピークは、主としてＣ＝Ｏ伸縮振動に由来し、その強度は重水素置換の影響を受けにくいため、標準ピークとして良く用いられる。標準ピークはこれに限定されるものではなく、重水処理による影響を受けにくい吸収ピークであればいずれも使用可能である。

以下に、角層構成成分と水との相互作用を評価する方法について、さらに具体的に説明する。まず評価対象となる角層の重水処理前のＩＲスペクトルを測定する（スペクトル１）。

次に一定時間、重水処理を実施する。重水処理の時間は処理する角層の形態により適宜決定すればよい。例えば、採取した角層を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の場合、数秒から数日間処理することが可能である。一方、腕や顔面等に対するｉｎ ｖｉｖｏ評価の場合、被験者への負担を考慮し、数秒から数十分間処理することが可能である。重水処理終了後、角層のＩＲスペクトルを重水処理前と同様に測定する（スペクトル２）。

得られたＩＲスペクトルを元に、重水素置換の程度を解析する。解析を始めるに当り、スペクトル強度の補正を実施する。補正は重水処理によって影響されにくい吸収ピークを標準ピークとし、その強度を基準として行う。スペクトル１及びスペクトル２における標準ピーク強度がそれぞれ同一強度となるようにスペクトル１及びスペクトル２を補正し、補正スペクトル１及び補正スペクトル２を得る。

補正スペクトル１と補正スペクトル２より解析対象ピーク（例えば、アミドＩＩ（主にＮ−Ｈ変角振動）等）の吸光強度を読み取り、それらの差（変化量）又は比（変化率）を計算し、これらを角層構成成分への重水素置換量の相対的な見積もりとして利用する。

本発明において、角層構成成分とは角層という構造体の構成に係るもの全てを指し、特に限定されない。角層構成成分としては、ケラチン、フィラグリン若しくはコーニファイドエンベロープ由来のタンパク質、細胞間脂質等の他、皮脂腺から分泌され２次的に角層構成成分の一員となっている皮脂等も挙げられる。

次に、本発明に係る保湿剤のスクリーニング方法について説明する。本発明のスクリーニング方法は、角層構成成分と相互作用が可能な水の量によって判断される角層の保湿状態をスクリーニングにおける判定の指標とすることを特徴とするものである。具体的には、被評価物質を角層に適用して、適用後の角層の保湿状態を上述の本発明の評価方法に従って評価する。角層に被評価物質を適用する際、角層として採取したものを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ系で行う場合、被評価物質を溶解させた溶液に角層を一定時間浸漬させれば良い。一方、ｉｎ ｖｉｖｏ系で角層として腕や顔面等の角層を直接使用する場合は、適当な方法により被評価物質に浸漬させるだけでなく、塗布により処理することも可能である。

被評価物質の保湿剤としての保湿能力の判定は、被評価物質の適用前又は無処理角層の保湿状態と被評価物質適用後の角層の保湿状態を比較することにより行うことができる。また、各種の被評価物質を適用して被評価物質間で保湿能力を比較してもよい。スクリーニングに用いる角層は、そのままでも良いが、被評価物質による効果を判定しやすくするため、角層の保湿状態を低下させることが知られている処理を、予め評価に用いる角層に対して施しておいてもよい。また、角層の保湿状態を低下させる処理と同時に被評価物質を適用し、保湿状態の低下を抑制するという観点から被評価物質の保湿能力を判定してもよい。角層の保湿状態を低下させる処理としては、角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）を抽出する処理である水抽出処理等が挙げられる。

本発明に係る保湿剤のスクリーニング方法は、角層構成成分と相互作用が可能な水の量に基いて評価される角層の保湿状態をスクリーニングにおける判定基準とするため、本発明のスクリーニング方法により保湿効果が確認された保湿剤は、本当の意味で角層の保湿作用に優れたものといえるものであり、該保湿剤を配合した化粧料は、優れた保湿効果を皮膚に与えることができる。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
ヒト踵からナイフで角層を採取し、それら角層を下記水溶液に２４時間浸漬させた。浸漬後、それら角層を真空デシケーターに放置し、乾燥させた。乾燥させた角層のＡＴＲ−ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。その後、おおよそ１００％重水環境下に１時間放置して重水処理を実施した。１時間後、再度ＡＴＲ−ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）（水処理の場合の重水処理前と後におけるＩＲスペクトルを、図１に示す。）。図１に示すように、重水処理の影響を受けにくいアミドＩの吸収ピークは重水処理の前後でほとんど変化しないのに対し、アミドＩＩ、アミドＩＩＩ、１３４０ｃｍ^-1付近の吸収ピークは、重水処理の前後で強度が変化していることがわかる。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正し補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとして１３４０ｃｍ^-1（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［重水置換後の吸光強度／重水置換前の吸光強度］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量の目安として、各種処理間で比較した。

（１）未処理（何も前処理しない角層）
（２）水処理（＝天然保湿因子を抽出した角層）
（３）１００ｍｍｏｌ／Ｌ 乳酸カリウム処理
（４）１００ｍｍｏｌ／Ｌ 乳酸ナトリウム処理

上記４種類の処理を比較した結果を図２に示す。未処理（図２（１））と比較すると、天然保湿因子を抽出した角層（図２（２））では重水素置換されにくいことが分った。これは、天然保湿因子が角層ケラチンにおいて水との相互作用に深く係っていることを示している。また、乳酸塩処理した角層ケラチン（図２（３）、（４））は、天然保湿因子を抽出した角層と比較して重水置換されやすいことが分かった。このことは、乳酸カリウムなどの保湿剤が角層ケラチンと水の相互作用、即ち角層の保湿状態に影響を与えることを示している。更に、同じ乳酸塩でも、カウンターイオンの違いにより角層ケラチンと水の相互作用の大きさに差異をもたらすことが示された。

実施例２
角層として、ヒトの前腕屈部側部の角層を使用した。未処理部位と天然保湿因子抽出部位を設定し、天然保湿因子抽出部位は水による５分間の抽出処理を行い３０分乾燥させた。未処理部位と天然保湿因子抽出部位それぞれのＡＴＲ−ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。次に、未処理部位と天然保湿因子抽出部位をそれぞれ重水で５分間浸漬し、重水処理を行った。重水処理後、再度ＡＴＲ−ＩＲスペクトルを取得した（スペクトル２）。以下実施例１と同様にして補正スペクトル１、２を得、解析対象ピークの吸光強度から吸光強度変化率を求めた。

結果を図３に示す。踵から採取した角層を用いて行ったｉｎ ｖｉｔｒｏ系での評価結果（実施例１）と同様に、未処理部位と比較して、天然保湿因子を抽出した部位では角層ケラチンは重水素置換されにくいことが分かった。このように採取した角層を用いた場合と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏ系においても本発明の評価方法が利用できることが示された。

実施例３
ヒト踵からナイフで角層を採取し、それら角層を下記の各種保湿剤水溶液に２４時間浸漬させた。浸漬後、それら角層を真空デシケーターに放置し、乾燥させた。乾燥させた角層のＡＴＲ−ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。その後、おおよそ１００％重水環境下に１時間放置して重水処理を実施した。１時間後、再度ＡＴＲ−ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正し補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとして１３４０ｃｍ^-1（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［重水置換後の吸光強度／重水置換前の吸光強度］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量の目安として、各種保湿剤処理間で比較した。

使用した保湿剤水溶液
（１）１００ｍｍｏｌ／Ｌ 乳酸カリウム処理
（２）１００ｍｍｏｌ／Ｌ 乳酸ナトリウム処理
（３）１００ｍｍｏｌ／Ｌ グリセロール処理
（４）１００ｍｍｏｌ／Ｌ ピロリドンカルボン酸ナトリウム（ＰＣＡＮａ）処理
（５）１００ｍｍｏｌ／Ｌ 尿素処理

本発明の評価方法を用いて上記５種の保湿剤の保湿能力を比較した結果を図４に示す。これらの保湿剤は全て公知の保湿剤であるが、図４の重水処理による重水素置換率の差に示されるように、保湿剤によって角層ケラチンと水との相互作用に及ぼす影響に差があることが示された。本発明の評価方法では、角層ケラチンと水の相互作用の強さに及ぼす影響力（＝保湿能力）は（乳酸カリウム処理）＝（ＰＣＡＮａ処理）＞尿素処理であるが、従来の方法で保湿能力を比較した結果では（乳酸カリウム処理）＞（ＰＣＡＮａ処理）＝尿素処理であることが報告されている（第２３回ＩＦＳＣＣ論文集、２００４年、ｐ．４０）。このことは、従来の方法で確認される保湿能力と本発明の評価方法により確認される保湿能力は必ずしも一致するものではなく、従来の方法では確認することのできなかった本来見るべきである角層に必要な保湿を与える保湿剤（角層構成成分と水との相互作用を高める保湿剤）の開発が、本発明により可能となることを示している。

本発明により、従来の方法では確認できなかった、角層構成成分と水との相互作用に基く角層の保湿状態の評価が可能となり、角層構成成分に対する保湿という観点からの新しい保湿剤のスクリーニング評価及び開発に利用できる。

Claims (3)

1. 角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量を判断基準とする角層の保湿状態の評価方法であって、
   角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換量が、下記（ａ）〜（ｅ）の手順によって求められる解析対象ピークのＩＲスペクトル強度の重水処理前後の変化量又は変化率により見積られる、評価方法：
   （ａ）角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定する；
   （ｂ）角層を重水処理する；
   （ｃ）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定する；
   （ｄ）スペクトル１及びスペクトル２中のアミドＩの吸収ピークを標準ピークとして、該標準ピーク強度を指標としてスペクトル１及びスペクトル２を補正し、補正スペクトル１及び補正スペクトル２を得る；
   （ｅ）補正スペクトル１及び補正スペクトル２中のアミドＩＩ若しくはアミドＩＩＩの吸収ピーク、又は１３４０ｃｍ ^-1 に検出されるピークを解析対象ピークとして、該解析対象ピークの強度を補正スペクトル１、２間で比較し、その変化量又は変化率を求める。
2. 角層構成成分が、ケラチン、フィラグリン若しくはコーニファイドエンベロープ由来のタンパク質、細胞間脂質又は皮脂である、請求項１記載の評価方法。
3. 保湿剤のスクリーニング方法であって、請求項１又は２記載の方法により評価される角層の保湿状態を、スクリーニングにおける判定の指標として用いるスクリーニング方法。

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