JP5686429B2 - Method for producing anodized alumina-enzyme complex - Google Patents
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Description
本発明は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法に関する。 The present invention, anodic alumina - a process for producing enzyme complexes.
陽極酸化アルミナ基板は、直径が５０ｎｍ〜１μｍの貫通孔を有しており（後述の図１参照）、酵素を担持する担体として注目されている。
ここで、既存の陽極酸化アルミナ基板の断面の電子顕微鏡写真を図４〜図７に示す。図４に示すように、陽極酸化アルミナ基板が有する貫通孔は、当該陽極酸化アルミナ基板の厚さ方向に、すなわち、一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通している。表面近傍の断面の拡大写真（図５）と、裏面近傍の断面の拡大写真（図６）と、を比較すると、表面近傍とそれ以外とでは、貫通孔の形状が異なることが分かる。具体的には、表面近傍の断面を更に拡大して得たＳＥＭ写真（図７）から分かるように、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面層では、貫通孔が分岐して複数の微細孔を形成しており、入り組んだ複雑な構造となっている。
The anodized alumina substrate has a through-hole having a diameter of 50 nm to 1 μm (see FIG. 1 described later), and is attracting attention as a carrier for supporting an enzyme.
Here, electron micrographs of cross sections of existing anodized alumina substrates are shown in FIGS. As shown in FIG. 4, the through hole of the anodized alumina substrate penetrates in the thickness direction of the anodized alumina substrate, that is, from one surface (front surface) to the other surface (back surface). Comparing the enlarged photograph of the cross section in the vicinity of the front surface (FIG. 5) and the enlarged photograph of the cross section in the vicinity of the rear surface (FIG. 6), it can be seen that the shape of the through hole is different between the vicinity of the front surface and the others. Specifically, as can be seen from the SEM photograph (FIG. 7) obtained by further enlarging the cross section in the vicinity of the surface, in the surface layer of the existing anodized alumina substrate, the through holes branch to form a plurality of fine holes. It has an intricate and complicated structure.
すなわち、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐの断面を模式的に示すと、図８に示すように、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐの表面層（図８における上面層）は、複数の微細孔Ｑが形成された微細孔層Ｒとなっており、当該微細孔Ｑは、直径が５０ｎｍ〜１μｍの貫通孔１１の先端に接続されている。このように、表面近傍とそれ以外とで、貫通孔の形状が異なるのは、陽極酸化アルミナ基板の製法によるものと考えられる。 That is, when the cross section of the existing anodized alumina substrate P is schematically shown, as shown in FIG. 8, the surface layer (the upper surface layer in FIG. 8) of the existing anodized alumina substrate P has a plurality of fine holes Q. The formed microporous layer R is connected to the tip of the through-hole 11 having a diameter of 50 nm to 1 μm. Thus, it is thought that the shape of the through hole is different between the vicinity of the surface and the other areas because of the manufacturing method of the anodized alumina substrate.
このような微細孔層Ｒを有する既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐに酵素を担持させて、陽極酸化アルミナ−酵素複合体を構成すると、微細孔層Ｒ部分で液体や気体の流路が狭まるため、当該陽極酸化アルミナ−酵素複合体を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用した場合に、酵素が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなって、高速な反応が実施できなくなる。 When an enzyme is supported on an existing anodized alumina substrate P having such a microporous layer R to form an anodized alumina-enzyme complex, the flow path of liquid or gas is narrowed in the microporous layer R portion. When the anodized alumina-enzyme complex is applied to an enzyme sensor, an enzyme biobattery, an enzyme reactor, etc., a liquid or gas containing a specific substance that selectively reacts with an enzyme becomes difficult to permeate, so that a high-speed reaction is achieved. Cannot be implemented.
ところで、微細孔層を有する陽極酸化アルミナ基板を、微細孔層を優先的に溶解する溶液中に浸して、微細孔層を除去する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。 By the way, a method has been proposed in which an anodized alumina substrate having a microporous layer is immersed in a solution that preferentially dissolves the microporous layer to remove the microporous layer (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、特許文献１に記載の方法で微細孔層が除去された陽極酸化アルミナ基板は、酵素を担持するためのものではない。さらに、微細孔層が除去された陽極酸化アルミナ基板に酵素を担持することによって構成された陽極酸化アルミナ−酵素複合体等も提案されていない。
また、特許文献１に記載の方法では、微細孔層部分とその他の部分との組成が異なっている必要があり、微細孔層部分とその他の部分との組成が異ならない場合は、微細孔層だけでなく、その他の部分（その他の部分の一部）も除去されてしまう。
However, the anodized alumina substrate from which the microporous layer has been removed by the method described in Patent Document 1 is not for supporting an enzyme. Furthermore, an anodized alumina-enzyme complex formed by supporting an enzyme on an anodized alumina substrate from which the microporous layer has been removed has not been proposed.
In the method described in Patent Document 1, the composition of the microporous layer portion and the other portion needs to be different, and when the composition of the microporous layer portion and the other portion is not different, In addition, other parts (parts of other parts) are also removed.
本発明の課題は、高速な反応が実施可能な陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法として微細孔層部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても微細孔層のみを除去可能な製造方法を提供することにある。 An object of the present invention, high-speed response feasible anodized alumina - enzymes fine Anaso part as the production method of the complex and even if the composition of the other portions do not differ capable of removing only fine Anaso It is to provide a Do manufacture how.
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
互いに平行な複数の貫通孔を有する陽極酸化アルミナ基板と、
前記貫通孔内に導入された酵素と、を備える陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法であって、
前記貫通孔の先端に接続する微細孔の形成された微細孔層をドライエッチングによって除去して、前記陽極酸化アルミナ基板を作成する除去ステップと、
前記陽極酸化アルミナ基板が有する前記貫通孔内に前記酵素を導入する導入ステップと、
を有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記ドライエッチングは、Ｏ ２ 及びＣＦ ４ を用いた反応性イオンエッチングであることを特徴とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記貫通孔の直径は、５０ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする。
In order to solve the above problems, the invention according to claim 1,
An anodized alumina substrate having a plurality of through holes parallel to each other;
Wherein the enzyme is introduced into the through hole, Ru with the anodized alumina - a process for the preparation of the enzyme complex,
A removal step of creating the anodized alumina substrate by removing the microporous layer formed with micropores connected to the tip of the through-hole by dry etching;
An introducing step of introducing the enzyme into the through-hole of the anodized alumina substrate;
It is characterized by having .
The invention according to claim 2 is the method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to claim 1,
The dry etching is reactive ion etching using O 2 and CF 4 .
Invention of Claim 3 in the manufacturing method of the anodic oxidation alumina-enzyme complex of Claim 1 or 2,
The through hole has a diameter of 50 nm to 1 μm.
請求項４に記載の発明は、請求項１から３の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記貫通孔内に当該貫通孔の内壁に沿って中空糸状のシリカ構造体を形成する形成ステップを、前記除去ステップと前記導入ステップの間に有し、
前記シリカ構造体は、壁面に複数の穴部を有し、
前記酵素は、前記貫通孔内に導入されて前記穴部の内部に固定されていることを特徴とする。
The invention according to claim 4 is the method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to any one of claims 1 to 3 ,
The step of forming the silica structure of the middle empty thread along the inner wall of the through hole in the through-hole, has during the introduction step and the removing step,
The silica structure has a plurality of holes on the wall surface,
The enzyme is introduced into the through hole and fixed inside the hole.
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記穴部のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする。
請求項６に記載の発明は、請求項４又は５に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、
０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体、
２００〜１５００ｍ ２ の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体、又は
全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする。
請求項７に記載の発明は、請求項４から６の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示すシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする。
請求項８に記載の発明は、請求項４から７の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、有機基を有するシリカ系メソ多孔体であり、
前記有機基は、炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、又はビニル基であることを特徴とする。
The invention according to claim 5, anodized alumina according to 請 Motomeko 4 - In the production method of the enzyme complex,
The size of the hole is 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme .
The invention according to claim 6 is the method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to claim 4 or 5,
The silica structure is
A silica-based mesoporous material having a pore volume of 0.1 to 1.5 mL / g,
A silica-based mesoporous material having a specific surface area of 200-1500 m 2 , or
It is a silica-based mesoporous material in which the proportion of the total volume of pores having a diameter in the range of ± 40% of the center pore diameter in the total pore volume is 60% or more.
The invention according to claim 7 is the method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to any one of claims 4 to 6,
The silica structure is a silica-based mesoporous material showing an X-ray diffraction pattern having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more.
The invention according to claim 8 is the method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to any one of claims 4 to 7,
The silica structure is a silica-based mesoporous material having an organic group,
The organic group is a hydrocarbon group, an amide group, an amino group, an imino group, a mercapto group, a sulfone group, a carboxyl group, an ether group, an acyl group, or a vinyl group.
本発明によれば、陽極酸化アルミナ基板は微細孔層が除去されてなるので、陽極酸化アルミナ−酵素複合体を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用しても、酵素が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。 According to the present invention, since the microporous layer is removed from the anodized alumina substrate, even when the anodized alumina-enzyme complex is applied to an enzyme sensor, an enzyme biobattery, an enzyme reactor, etc., the enzyme is selectively selected. A liquid or gas containing a specific substance to be reacted is not easily transmitted, and a high-speed reaction can be performed.
以下、図を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。ただし、発明の範囲は、図示例に限定されない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the scope of the invention is not limited to the illustrated examples.
＜陽極酸化アルミナ−酵素複合体＞
本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、陽極酸化アルミナ基板１０と、当該陽極酸化アルミナ基板１０に担持された酵素３０と、等からなり、例えば、酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクターに好適に適用することができる。
具体的には、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、例えば、図１及び図２に示すように、厚さ方向に貫通する互いに平行な複数の貫通孔１１を有する陽極酸化アルミナ基板１０と、貫通孔１１内に当該貫通孔１１の内壁１１ａに沿って形成された中空糸状のシリカ構造体２０と、貫通孔１１内に導入されてシリカ構造体２０に固定された酵素３０と、を備えて構成される。
<Anodized alumina-enzyme complex>
The anodized alumina-enzyme complex 1 of this embodiment includes an anodized alumina substrate 10, an enzyme 30 supported on the anodized alumina substrate 10, and the like, for example, an enzyme sensor, an enzyme biobattery, an enzyme reactor. It can be suitably applied to.
Specifically, the anodized alumina-enzyme complex 1 includes, for example, an anodized alumina substrate 10 having a plurality of parallel through-holes 11 penetrating in the thickness direction, as shown in FIGS. A hollow fiber-like silica structure 20 formed in the through-hole 11 along the inner wall 11 a of the through-hole 11, and an enzyme 30 introduced into the through-hole 11 and fixed to the silica structure 20. Composed.
陽極酸化アルミナ−酵素複合体１において、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内は、例えば、図２に示すように、酵素３０が固定される固定領域Ａ１と、特定物質（反応物質）及び生成物（反応生成物）が拡散する拡散領域Ａ２と、に分けられる。
固定領域Ａ１は、シリカ構造体２０の壁面部分であり、その壁面部分に形成された穴部２１の内部に酵素３０が固定されている。
拡散領域Ａ２は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通する孔からなる。すなわち、拡散領域Ａ２は、陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に形成されたシリカ構造体２０の中空部分であり、何も充填されていない空洞となっている。
In the anodized alumina-enzyme complex 1, the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10 has, for example, a fixed region A1 to which the enzyme 30 is fixed, a specific substance (reactive substance), and And a diffusion region A2 where the product (reaction product) diffuses.
The fixing region A1 is a wall surface portion of the silica structure 20, and the enzyme 30 is fixed inside a hole portion 21 formed in the wall surface portion.
The diffusion region A2 includes a hole penetrating from one surface (front surface) of the anodized alumina-enzyme complex 1 to the other surface (back surface). That is, the diffusion region A2 is a hollow portion of the silica structure 20 formed in the through-hole 11 of the anodized alumina substrate 10, and is a cavity that is not filled with anything.
したがって、例えば、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の表面から裏面に向かって（或いは、裏面から表面に向かって）、特定物質を含有する液体や気体を強制的に透過させると、当該液体や気体は何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を通過する。そのため、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造（酵素３０が固定された領域を、特定物質や生成物が拡散する構造）の複合体と比較して、圧損が低く、当該液体や気体を高速に透過させることができるので、高速で反応を実施することができる。 Therefore, for example, when a liquid or gas containing a specific substance is forcibly permeated from the front surface to the back surface of the anodized alumina-enzyme complex 1 (or from the back surface to the surface), the liquid or gas Passes through a hollow diffusion region A2 that is not filled with anything. Therefore, compared with a complex having a structure in which the fixed region A1 and the diffusion region A2 are not separated (the structure in which the enzyme 30 is fixed is a structure in which a specific substance or product diffuses), the pressure loss is low, and the liquid Since gas and gas can be permeated at high speed, the reaction can be carried out at high speed.
さらに、当該液体や気体が拡散領域Ａ２を通過する際に、当該液体や気体に含有された特定物質は、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、固定領域Ａ１に固定された酵素３０へと移動し、当該酵素３０と接触する。そして、当該接触によって生じた生成物も、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部へと移動する。そのため、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造の複合体と比較して、内部での特定物質や生成物の拡散性が高くなるので、高速で反応を実施することができる。 Furthermore, when the liquid or gas passes through the diffusion region A2, the specific substance contained in the liquid or gas diffuses through the diffusion region A2 in a hollow state where nothing is filled, and is fixed to the fixing region A1. It moves to the enzyme 30 and comes into contact with the enzyme 30. The product generated by the contact also diffuses in the hollow diffusion region A2 in which nothing is filled, and moves to the outside of the anodized alumina-enzyme complex 1. Therefore, the anodic oxidation alumina-enzyme complex 1 has higher diffusibility of the specific substance and product inside compared to the complex having a structure in which the fixed region A1 and the diffusion region A2 are not separated. The reaction can be carried out at high speed.
また、例えば、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を電解液等に浸漬させ、特定物質を含有する気体を当該電解液等と接触させて、当該電解液等に当該特定物質を溶解させると、当該特定物質は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部を拡散して内部（拡散領域Ａ２）へと移動し、さらに、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、固定領域Ａ１に固定された酵素３０へと移動し、当該酵素３０と接触する。そして、当該接触によって生じた生成物も、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部へと移動する。そのため、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造の複合体と比較して、内部での特定物質や生成物の拡散性が高くなるため、高速で反応を実施することができる。 Further, for example, when the anodized alumina-enzyme complex 1 is immersed in an electrolytic solution or the like, a gas containing the specific substance is brought into contact with the electrolytic solution or the like, and the specific substance is dissolved in the electrolytic solution or the like. The specific substance diffuses outside the anodized alumina-enzyme complex 1 and moves to the inside (diffusion region A2), and further diffuses through the diffusion region A2 in a hollow state in which nothing is filled, thereby fixing the fixed region. It moves to the enzyme 30 fixed to A1, and comes into contact with the enzyme 30. The product generated by the contact also diffuses in the hollow diffusion region A2 in which nothing is filled, and moves to the outside of the anodized alumina-enzyme complex 1. Therefore, the anodized alumina-enzyme complex 1 has higher diffusibility of the specific substance and product in the interior compared to a complex having a structure in which the fixed region A1 and the diffusion region A2 are not separated. The reaction can be carried out at high speed.
＜陽極酸化アルミナ基板＞
陽極酸化アルミナ基板１０は、アルミニウムを含む基板（アルミニウム又はアルミニウム合金からなる基板）を陽極酸化して得た陽極酸化アルミナ基板（陽極酸化アルミナ膜）である。陽極酸化アルミナ基板１０は、例えば、直径が５ｃｍ程度、厚さが５０μｍ程度の円板形状をなしている。
<Anodized alumina substrate>
The anodized alumina substrate 10 is an anodized alumina substrate (anodized alumina film) obtained by anodizing a substrate containing aluminum (a substrate made of aluminum or an aluminum alloy). The anodized alumina substrate 10 has a disk shape with a diameter of about 5 cm and a thickness of about 50 μm, for example.
ここで、陽極酸化アルミナ基板１０は、当該陽極酸化アルミナ基板１０の厚さ方向に貫通する貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒが除去されてなる。
前述したように、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐは、少なくとも一方の面（表面）に、貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒを有している。このような微細孔層Ｒを有する既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを、陽極酸化アルミナ−酵素複合体に用いると、特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなり、高速な反応が実施できなくなる。
Here, the anodized alumina substrate 10 is formed by removing the microporous layer R in which the microholes Q connected to the tips of the through holes 11 penetrating in the thickness direction of the anodized alumina substrate 10 are formed.
As described above, an existing anodized alumina substrate P obtained by anodizing a substrate containing aluminum has a fine structure in which a fine hole Q connected to the tip of the through hole 11 is formed on at least one surface (front surface). It has a pore layer R. If an existing anodized alumina substrate P having such a microporous layer R is used for an anodized alumina-enzyme complex, it becomes difficult for a liquid or gas containing a specific substance to permeate and a high-speed reaction cannot be performed. .
特に、本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１のように、貫通孔１１内に形成されたシリカ構造体２０を備える場合、微細孔層Ｒを有するままだと、微細孔Ｑがシリカ構造体２０で狭められてしまったり、或いは、図９に示すように、塞がれてしまったりする。貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑが塞がれる（或いは、狭められる）と、液体や気体が透過しなくなって（或いは、透過し難くなって）、貫通孔１１及び微細孔Ｑの内部に導入されてシリカ構造体２０に固定された酵素３０に特定物質が供給されなくなったり（或いは、供給され難くなったり）、酵素３０と特定物質との反応により生じた生成物を回収できなくなったり（或いは、回収し難くなったり）して、高速な反応が実施できなくなる。 In particular, when the silica structure 20 formed in the through hole 11 is provided as in the anodized alumina-enzyme complex 1 of the present embodiment, if the fine pore layer R remains, the fine pore Q has a silica structure. It may be narrowed by the body 20 or may be blocked as shown in FIG. When the micro hole Q connected to the tip of the through hole 11 is closed (or narrowed), liquid or gas does not permeate (or becomes difficult to permeate), and the inside of the through hole 11 and the micro hole Q The specific substance is no longer supplied to the enzyme 30 introduced into the silica structure 20 and fixed to the silica structure 20 (or it becomes difficult to supply), or the product generated by the reaction between the enzyme 30 and the specific substance cannot be recovered. (Or it becomes difficult to collect), and high-speed reaction cannot be performed.
そこで、本実施形態では、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐから、微細孔層Ｒを除去することによって形成されてなるものを、陽極酸化アルミナ基板１０として使用することとする。したがって、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１は、陽極酸化によって形成された孔のうちの微細孔Ｑが除去されてなる、陽極酸化アルミナ基板１０の一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通する円筒状（或いは、角筒状）の孔である。
貫通孔１１の直径は、当該貫通孔１１内に導入する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、５０ｎｍ〜１μｍである。
Therefore, in the present embodiment, what is formed by removing the microporous layer R from the existing anodized alumina substrate P obtained by anodizing a substrate containing aluminum is used as the anodized alumina substrate 10. I decided to. Therefore, the through-hole 11 of the anodized alumina substrate 10 has one surface (front surface) to the other surface (surface) of the anodized alumina substrate 10 formed by removing the fine holes Q among the holes formed by anodization. It is a cylindrical (or square tube) hole penetrating through the back surface.
The diameter of the through-hole 11 can be arbitrarily arbitrarily changed according to the type of the enzyme 30 introduced into the through-hole 11, and specifically, for example, 50 nm to 1 μm.
＜シリカ構造体＞
シリカ構造体２０は、ナノメートルオーダーのサイズの細孔（穴部２１）を複数有する多孔性シリカ膜（シリカ製のメッシュ体）を丸めて円筒状（或いは、角筒状）に形成したような形状をなしている。すなわち、シリカ構造体２０は、ナノメートルオーダーのサイズの細孔（穴部２１）を壁面に複数有する中空糸状のシリカ系メソ多孔体である。
シリカ構造体２０は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の内壁１１ａを鋳型として形成される。具体的には、例えば、貫通孔１１の内壁１１ａに、界面活性剤とシリカとの自己組織化によって有機−無機複合体（界面活性剤を含むシリカ層）を形成させ、その後、有機−無機複合体から界面活性剤を焼却除去や溶媒抽出除去することによって、周期構造を有するメソポーラスな多孔質材料（シリカ構造体２０）を形成することができる。
<Silica structure>
The silica structure 20 is formed by rounding a porous silica film (silica mesh body) having a plurality of pores (holes 21) having a size on the order of nanometers to form a cylindrical shape (or a rectangular tube shape). It has a shape. That is, the silica structure 20 is a hollow fiber-like silica-based mesoporous material having a plurality of pores (holes 21) having a size on the order of nanometers on the wall surface.
The silica structure 20 is formed using the inner wall 11a of the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10 as a mold. Specifically, for example, an organic-inorganic composite (a silica layer containing a surfactant) is formed on the inner wall 11a of the through-hole 11 by self-assembly of a surfactant and silica, and then an organic-inorganic composite is formed. By removing the surfactant from the body by incineration and solvent extraction, a mesoporous porous material (silica structure 20) having a periodic structure can be formed.
穴部２１は、界面活性剤のミセルを鋳型として形成された、シリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通する孔である。穴部２１の貫通方向は、例えば、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の貫通方向に対して略垂直となっている。
穴部２１のサイズ（中心細孔直径）は、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、１ｎｍ〜５０ｎｍである。ここで、穴部２１のサイズは、界面活性剤の種類を変えて、界面活性剤のミセルの径を変えることによって制御できる。また、穴部２１のサイズは、例えば、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼンやトリプロピルベンゼンなどの比較的疎水性の分子を添加し、ミセルを膨潤させて、ミセルの径を変えることによって制御できる。
The hole 21 is a hole that is formed using a surfactant micelle as a template and penetrates from the inner wall surface 20 a to the outer wall surface 20 b of the silica structure 20. For example, the penetration direction of the hole 21 is substantially perpendicular to the penetration direction of the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10.
The size (center pore diameter) of the hole 21 can be arbitrarily changed as appropriate according to the type of the enzyme 30 to be fixed inside the hole 21, and specifically, for example, 1 nm to 50 nm. . Here, the size of the hole 21 can be controlled by changing the type of the surfactant and changing the diameter of the micelle of the surfactant. In addition, the size of the hole 21 is controlled by adding a relatively hydrophobic molecule such as trimethylbenzene or tripropylbenzene together with the surfactant to swell the micelle and change the diameter of the micelle. it can.
なお、穴部２１の中心細孔直径とは、穴部２１の断面形状が正円形状であると仮定し、シリカ構造体２０の細孔容積（Ｖ）を穴部２１の直径（Ｄ）で微分した値（ｄＶ／ｄＤ）を穴部２１の直径（Ｄ）に対してプロットした曲線（細孔径分布曲線）の最大ピークにおける細孔直径を意味する。 The central pore diameter of the hole 21 is assumed that the cross-sectional shape of the hole 21 is a perfect circle, and the pore volume (V) of the silica structure 20 is the diameter (D) of the hole 21. It means the pore diameter at the maximum peak of a curve (pore diameter distribution curve) in which the differentiated value (dV / dD) is plotted against the diameter (D) of the hole 21.
穴部２１のサイズは、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素３０のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素３０のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。穴部２１のサイズが酵素３０のサイズの０．５倍未満であると、酵素３０が穴部２１の内部へと入り込み難くなり、酵素３０の固定量が不充分となる傾向がある。また、穴部２１のサイズが酵素３０のサイズの２．０倍よりも大きいと、酵素３０の立体構造が効率よく保持されない傾向がある。
すなわち、シリカ構造体２０が有する穴部２１のサイズを、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同程度）にすることによって、穴部２１の内部への酵素３０の固定（吸着）を効率化でき、また、穴部２１の内部に固定された酵素３０の立体構造の保持が容易となるため酵素３０を安定的に担持することができる。
The size of the hole 21 is preferably about 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 30 immobilized inside the hole 21, and is about 0.7 to 1.4 times the size of the enzyme 30. It is more preferable that it is approximately the same as the size of the enzyme 30. If the size of the hole 21 is less than 0.5 times the size of the enzyme 30, the enzyme 30 becomes difficult to enter the hole 21, and the amount of the enzyme 30 to be fixed tends to be insufficient. In addition, if the size of the hole 21 is larger than 2.0 times the size of the enzyme 30, the three-dimensional structure of the enzyme 30 tends not to be efficiently maintained.
That is, the size of the hole 21 of the silica structure 20 is about 0.5 to 2.0 times (more preferably 0.7 to 1.4 times) the size of the enzyme 30 to be fixed inside the hole 21. (Most preferably about the same level), the efficiency of immobilization (adsorption) of the enzyme 30 inside the hole 21 can be improved, and the three-dimensional structure of the enzyme 30 immobilized inside the hole 21 can be improved. Since the retention becomes easy, the enzyme 30 can be stably supported.
なお、穴部２１の内部に固定する酵素３０が多量体を形成する場合、当該酵素３０のサイズは、多量体のサイズとすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
また、穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズは、当該酵素３０の形状が、球状である場合は酵素３０の直径（例えば、楕円球状のように直径が複数ある場合は、そのうちの何れか１つ）、板状である場合は酵素３０の長辺の長さ、等とすることができるが、これらに限られるものではなく、穴部２１の内部に固定する酵素３０の形状や特性に応じて適宜任意に判断するのが好ましい。
In addition, when the enzyme 30 fixed inside the hole part 21 forms a multimer, the size of the enzyme 30 can be set to the size of the multimer. Here, the multimer refers to a compound in which two or more enzymes (proteins) are bonded directly or via a small molecule such as water, and the bond includes a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, Coordination bonds are included. However, the type of these bonds is not particularly limited.
The size of the enzyme 30 to be fixed inside the hole 21 is the diameter of the enzyme 30 when the shape of the enzyme 30 is spherical (for example, when there are multiple diameters such as an elliptical sphere, any of them) In the case of a plate shape, the length of the long side of the enzyme 30 can be used, but is not limited thereto, and the shape and characteristics of the enzyme 30 fixed inside the hole portion 21 are not limited thereto. It is preferable to arbitrarily make a decision according to the situation.
また、穴部２１の内部に固定する酵素３０の変性を抑制する等の観点から、シリカ構造体２０の酸解離定数（ｐＫａ）は、ｐＫａ５〜１４が好ましい。 Moreover, from the viewpoint of suppressing the denaturation of the enzyme 30 immobilized inside the hole portion 21, the acid dissociation constant (pKa) of the silica structure 20 is preferably pKa5-14.
また、穴部２１の深さ（すなわち、シリカ構造体２０の壁面の厚み）は、穴部２１の内部に固定する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、１ｎｍ以上である。
ここで、シリカ構造体２０の壁面の厚みを決めるファクターとして、シリカ構造体２０の原料となるシリカ源溶液の粘度や液温、シリカ源溶液を陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内に流し込む速度などが挙げられる。例えば、流し込む速度が低下するにつれて、貫通孔１１内に形成される中空糸状のシリカ構造体２０の壁面の厚みは厚くなり、流し込む速度が所定の閾値以下になると、貫通孔１１内には、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離された構造のシリカ系メソ多孔体（中空糸状のシリカ構造体２０）が形成されず、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造のシリカ系メソ多孔体が形成されてしまう。
Moreover, the depth of the hole 21 (that is, the thickness of the wall surface of the silica structure 20) can be arbitrarily changed arbitrarily according to the type of the enzyme 30 to be fixed inside the hole 21, and specifically, For example, it is 1 nm or more.
Here, as factors that determine the thickness of the wall surface of the silica structure 20, the viscosity and temperature of the silica source solution that is the raw material of the silica structure 20, and the silica source solution are poured into the through-holes 11 of the anodized alumina substrate 10. Speed and so on. For example, as the flow rate decreases, the thickness of the wall surface of the hollow fiber-like silica structure 20 formed in the through-hole 11 increases, and when the flow rate falls below a predetermined threshold, the through-hole 11 is fixed in the through-hole 11. A silica-based mesoporous body (hollow fiber-like silica structure 20) having a structure in which the region A1 and the diffusion region A2 are separated is not formed, and a silica-based mesostructure having a structure in which the fixing region A1 and the diffusion region A2 are not separated. A porous body is formed.
シリカ構造体２０は、０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体であることが好ましく、また、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。そして、シリカ構造体２０は、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。
ここで、「全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上」とは、例えば、中心細孔直径が３．００ｎｍである場合、この３．００ｎｍの±４０％、すなわち、１．８０〜４．２０ｎｍの範囲にある細孔の容積の合計が、全細孔容積の６０％以上を占めていることを意味する。
このような条件を満たすシリカ系メソ多孔体は、細孔の直径が非常に均一であることを意味し、このような細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に、酵素３０を吸着させると、酵素３０の安定性及び吸着量（固定量）をより向上させることができる。なお、細孔容積は、例えば、リン酸溶液や硝酸溶液で陽極酸化アルミナ基板１０を溶解させて、析出したシリカ構造体２０を液体窒素温度に冷却して窒素ガスを導入する方法（窒素吸着法）によって算出することができる。
The silica structure 20 is preferably a silica-based mesoporous material having a pore volume of 0.1 to 1.5 mL / g, and is a silica-based mesoporous material having a specific surface area of 200 to 1500 m 2. It is preferable. The silica structure 20 is a silica-based mesoporous material in which the ratio of the total volume of pores having a diameter within a range of ± 40% of the central pore diameter in the total pore volume is 60% or more. Is preferred.
Here, “the ratio of the total volume of pores having a diameter within the range of ± 40% of the center pore diameter in the total pore volume is 60% or more” means that the center pore diameter is 3. When it is 00 nm, it means that the total volume of pores in the range of ± 40% of 3.00 nm, that is, 1.80 to 4.20 nm occupies 60% or more of the total pore volume. To do.
A silica-based mesoporous material satisfying such conditions means that the pore diameter is very uniform, and when the enzyme 30 is adsorbed to the silica-based mesoporous material having such a pore arrangement structure. The stability and the amount of adsorption (fixed amount) of the enzyme 30 can be further improved. The pore volume is determined by, for example, a method in which the anodized alumina substrate 10 is dissolved with a phosphoric acid solution or a nitric acid solution, the precipitated silica structure 20 is cooled to a liquid nitrogen temperature, and nitrogen gas is introduced (nitrogen adsorption method). ).
また、シリカ構造体２０は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示すシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。Ｘ線回折パターンでピークが現われる場合は、そのピーク角度に相当するｄ値の周期構造がシリカ系メソ多孔体中にあることを意味する。
したがって、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークがあることは、細孔が１ｎｍ以上の間隔で規則的に配列していることを意味する。このように、非常に規則的な細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に、酵素３０を吸着させると、酵素３０の安定性及び吸着量をより向上させることが可能になる。
The silica structure 20 is preferably a silica-based mesoporous material that exhibits an X-ray diffraction pattern having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more. When a peak appears in the X-ray diffraction pattern, it means that a periodic structure having a d value corresponding to the peak angle is present in the silica-based mesoporous material.
Therefore, having one or more peaks at a diffraction angle corresponding to a d value of 1 nm or more means that the pores are regularly arranged at intervals of 1 nm or more. As described above, when the enzyme 30 is adsorbed on the silica-based mesoporous material having a very regular pore arrangement structure, the stability and the adsorption amount of the enzyme 30 can be further improved.
なお、シリカ構造体２０における、穴部２１の配列状態（細孔配列構造）は、特に制限されるものではない。シリカ構造体２０としては、例えば、ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するもの、キュービックやディスオーダの細孔配列構造を有するものが例示される。
ここで、シリカ構造体２０がヘキサゴナルの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が六方構造であることを意味する。ヘキサゴナルの細孔配列構造としては、２次元ヘキサゴナル及び３次元ヘキサゴナルが挙げられる。本発明において好適に用いることのできる２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するシリカ構造体２０は、例えば、図１に示すように、２次元ヘキサゴナル配列構造に基づいて、六角柱状の細孔が互いに平行に規則的に形成されている。
また、シリカ構造体２０がキュービックの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が立方構造であることを意味する。
また、シリカ構造体２０がディスオーダの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が不規則であることを意味する。
In addition, the arrangement state (pore arrangement structure) of the holes 21 in the silica structure 20 is not particularly limited. Examples of the silica structure 20 include those having a hexagonal pore arrangement structure and those having a cubic or disorder pore arrangement structure.
Here, the silica structure 20 having a hexagonal pore arrangement structure means that the arrangement of the holes 21 of the silica structure 20 is a hexagonal structure. Examples of the hexagonal pore arrangement structure include two-dimensional hexagonal and three-dimensional hexagonal. The silica structure 20 having a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure that can be suitably used in the present invention has, for example, hexagonal columnar pores based on the two-dimensional hexagonal arrangement structure, as shown in FIG. It is regularly formed in parallel.
Further, the silica structure 20 having a cubic pore arrangement structure means that the arrangement of the holes 21 included in the silica structure 20 is a cubic structure.
Further, the fact that the silica structure 20 has a disordered pore arrangement structure means that the arrangement of the holes 21 included in the silica structure 20 is irregular.
なお、シリカ構造体２０が、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造を有する場合は、穴部２１の全てがこれらの規則的細孔配列構造である必要はない。すなわち、シリカ構造体２０は、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造と、ディスオーダの不規則的細孔配列構造と、の両方を有していることが可能である。しかしながら、全ての穴部２１のうちの８０％以上は、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造となっていることが好ましい。 Note that when the silica structure 20 has a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic, it is not necessary that all of the holes 21 have these regular pore arrangement structures. That is, the silica structure 20 can have both a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic and a disordered irregular pore arrangement structure. However, 80% or more of all the holes 21 preferably have a regular pore arrangement structure such as hexagonal or cubic.
また、シリカ構造体２０としては、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、何れのシリカ系メソ多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素（例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ）を更に含むことができる。なお、何れのシリカ系メソ多孔体であっても、表面にはシラノール基（−ＳｉＯＨ基）が存在している。
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を形成することによって結合しているものをいう。有機基としては、例えば、アルカンやアルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカンなどの炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。
Examples of the silica structure 20 include a silica-based mesoporous material having an organic group and a silica-based mesoporous material having no organic group. In any silica-based mesoporous material, a metal element other than silicon (for example, Al, Zr, Ti) can be further included. In any silica mesoporous material, silanol groups (—SiOH groups) exist on the surface.
The silica-based mesoporous material having an organic group refers to a material in which an organic group is bonded to at least a part of silicon atoms constituting the silica-based mesoporous material by forming a carbon-silicon bond. Examples of the organic group include a hydrocarbon group, an amide group, an amino group, an imino group, a mercapto group, a sulfone group, and a carboxyl group that are generated by removing one or more hydrogens from hydrocarbons such as alkanes, alkenes, alkynes, benzenes, and cycloalkanes. Group, ether group, acyl group, vinyl group and the like.
＜酵素＞
酵素３０は、特定物質と選択的に反応する酵素であれば任意であり、特定物質の種類によって適宜選択可能である。
具体的には、酵素３０は、例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素等の酵素（酵素タンパク質）であるが、これらに限定されるものではない。
また、酵素３０は、例えば、生来の酵素分子であっても良いし、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても良いし、所望によりそれを切断したものであっても良いし、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。
<Enzyme>
The enzyme 30 may be any enzyme as long as it selectively reacts with a specific substance, and can be appropriately selected depending on the type of the specific substance.
Specifically, the enzyme 30 is an enzyme (enzyme protein) such as an oxidoreductase, a hydrolase, a transferase, and an isomerase, but is not limited thereto.
In addition, the enzyme 30 may be, for example, a natural enzyme molecule or an enzyme fragment including an active site. The enzyme molecule or the fragment of the enzyme containing the active site may be, for example, extracted from animals or plants or microorganisms, or may be cleaved if desired, or may be genetic engineering or chemical. It may also be synthesized.
陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に導入してシリカ構造体２０の穴部２１の内部に固定する酵素３０（すなわち、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０）は、１種類の酵素であっても良いし、２種類以上の酵素であっても良い。
また、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０が２種類以上である場合、当該酵素３０は、例えば、同種の特定物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても良いし、異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良いし、同種及び／又は異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
また、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素３０は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する別々の貫通孔１１内に導入されても良いし、同一の貫通孔１１内に導入されても良い。
One type of enzyme 30 (that is, the enzyme 30 constituting the anodized alumina-enzyme complex 1) introduced into the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10 and fixed inside the hole 21 of the silica structure 20 is one kind. Or two or more types of enzymes.
Moreover, when the enzyme 30 which comprises the anodic oxidation alumina-enzyme complex 1 is two or more types, the enzyme 30 may be, for example, two or more types of enzymes that act on the same specific substance (substrate). In addition, two or more kinds of enzymes acting on different specific substances may be used, or two or more kinds of enzymes acting on the same kind and / or different kinds of specific substances may be used.
Further, when there are two or more types of enzymes 30 constituting the anodized alumina-enzyme complex 1, the two or more types of enzymes 30 may be introduced into the separate through holes 11 of the anodized alumina substrate 10. It may be good or introduced into the same through-hole 11.
酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に固定する方法としては、例えば、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０に、酵素３０を含む溶液を滴下するディップ法、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０を、酵素３０を含む溶液に浸漬する浸漬法、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０の表面から裏面に向かって（或いは、裏面から表面に向かって）、酵素３０を含む溶液を透過させる透過法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に固定することができる。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。
As a method for introducing the enzyme 30 into the through-hole 11 and fixing it inside the hole portion 21, for example, a solution containing the enzyme 30 on the anodized alumina substrate 10 in which the silica structure 20 is formed in the through-hole 11. A dip method in which the silica structure 20 is formed in the through hole 11, an immersion method in which the anodized alumina substrate 10 in which the silica structure 20 is formed in the through hole 11 is immersed in a solution containing the enzyme 30, and the silica structure 20 is formed in the through hole 11. Although the permeation | transmission method etc. which permeate | transmit the solution containing the enzyme 30 are mentioned from the surface of the anodized alumina substrate 10 toward the back surface (or from the back surface toward the surface), it is not particularly limited. Thereby, the enzyme 30 can be introduced into the through-hole 11 and can be fixed inside the hole 21 while maintaining the higher-order structure and activity.
Furthermore, if necessary, it can be used in combination with a known enzyme immobilization method (for example, an immobilization method using a conductive polymer, glutaraldehyde, a photocrosslinkable resin or the like).
＜陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法＞
次に、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法について説明する。
陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、陽極酸化アルミナ基板１０を作成し、シリカ構造体２０を貫通孔１１内に形成し、酵素３０を貫通孔１１に導入してシリカ構造体２０に固定することによって製造される。
<Method for producing anodized alumina-enzyme complex>
Next, a method for producing the anodized alumina-enzyme complex 1 will be described.
In the anodized alumina-enzyme complex 1, an anodized alumina substrate 10 is prepared, a silica structure 20 is formed in the through hole 11, and an enzyme 30 is introduced into the through hole 11 to be fixed to the silica structure 20. Manufactured by.
（陽極酸化アルミナ基板の作成）
まず、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する（除去ステップ）。
具体的には、まず、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを用意する。
次いで、Ｏ２及びＣＦ４を用いた反応性イオンエッチング等のドライエッチングによって、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面から微細孔層Ｒを除去して、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する。
(Creation of anodized alumina substrate)
First, the anodized alumina substrate 10 is prepared (removal step).
Specifically, first, an existing anodized alumina substrate P obtained by anodizing a substrate containing aluminum is prepared.
Next, the microporous layer R is removed from the surface of the existing anodized alumina substrate by dry etching such as reactive ion etching using O 2 and CF 4 to create the anodized alumina substrate 10.
ここで、図３に、陽極酸化アルミナ基板１０の電子顕微鏡写真、すなわち、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面を反応性イオンエッチングした後の電子顕微鏡写真を示す。図３に示す電子顕微鏡写真から、反応性イオンエッチングすることによって、微細孔層Ｒを完全に除去できることが分かる。これにより、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを改良して作成した陽極酸化アルミナ基板１０を用いることで、高速な反応が実施可能な陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成できることが分かる。
なお、ウェットエッチング法や微細孔層Ｒを溶解可能な溶液中に浸す方法などの湿式法によって微細孔層Ｒを除去することも可能である。しかしながら、湿式法だと、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合は特に、その他の部分（その他の部分の一部）も除去されてしまって、陽極酸化アルミナ基板１０が薄くなってしまったり、貫通孔１１の径が大きくなってしまったりする場合がある。そのため、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても、その他の部分（すなわち、陽極酸化アルミナ基板１０部分）の形状を維持可能である等の観点から、本実施形態のように、ドライエッチング法等の乾式法によって微細孔層Ｒを除去することが好ましい。
Here, FIG. 3 shows an electron micrograph of the anodized alumina substrate 10, that is, an electron micrograph after reactive ion etching of the surface of the existing anodized alumina substrate. From the electron micrograph shown in FIG. 3, it can be seen that the microporous layer R can be completely removed by reactive ion etching. Thereby, it turns out that the anodic oxidation alumina-enzyme complex 1 which can implement a high-speed reaction can be comprised by using the anodic oxidation alumina substrate 10 produced by improving the existing anodic oxidation alumina substrate P.
The microporous layer R can also be removed by a wet method such as a wet etching method or a method of immersing the microporous layer R in a solution that can be dissolved. However, in the wet method, especially when the composition of the microporous layer R portion and the other portion is not different, the other portion (a part of the other portion) is also removed, and the anodized alumina substrate 10 is formed. In some cases, the thickness of the through hole 11 may be reduced. Therefore, even if the composition of the microporous layer R portion and the other portion is not different, the present embodiment is implemented from the viewpoint that the shape of the other portion (that is, the anodized alumina substrate 10 portion) can be maintained. As in the embodiment, it is preferable to remove the microporous layer R by a dry method such as a dry etching method.
（シリカ構造体の形成）
次に、シリカ構造体２０を貫通孔１１内に形成する。
具体的には、例えば、まず、シリカ構造体２０の原料となるシリカ源溶液を、作成した陽極酸化アルミナ基板１０の一方の面（表面）から流し込んで他方の面（裏面）から排出する操作（或いは、裏面から流し込んで表面から排出する操作）を行う。この際、貫通孔１１の内壁１１ａに残留するシリカ源溶液の厚さが所定の値となるように、シリカ源溶液の粘度や液温、シリカ源溶液を流し込む速度などの条件を調整する。ここで、本実施形態では、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、シリカ源溶液を流し込んで排出する操作を高速で行うことができる。
次いで、例えば、貫通孔１１の内壁１１ａにシリカ源溶液が残留する陽極酸化アルミナ基板１０を加熱し、当該シリカ源溶液を焼き固めることによって、貫通孔１１の内壁１１ａに沿ってシリカ構造体２０を形成する。
(Formation of silica structure)
Next, the silica structure 20 is formed in the through hole 11.
Specifically, for example, first, an operation in which a silica source solution as a raw material of the silica structure 20 is poured from one surface (front surface) of the prepared anodized alumina substrate 10 and discharged from the other surface (back surface) ( Alternatively, an operation of pouring from the back surface and discharging from the front surface is performed. At this time, conditions such as the viscosity of the silica source solution, the liquid temperature, and the speed at which the silica source solution is poured are adjusted so that the thickness of the silica source solution remaining on the inner wall 11a of the through hole 11 becomes a predetermined value. Here, in this embodiment, since the microporous layer R is removed from the anodized alumina substrate 10, the operation of pouring and discharging the silica source solution can be performed at high speed.
Next, for example, by heating the anodized alumina substrate 10 in which the silica source solution remains on the inner wall 11 a of the through hole 11 and baking the silica source solution, the silica structure 20 is formed along the inner wall 11 a of the through hole 11. Form.
（酵素の導入）
次に、酵素３０を貫通孔１１に導入してシリカ構造体２０に固定する（導入ステップ）。
具体的には、まず、酵素３０を含む溶液を作成する。
次いで、例えば、作成した酵素３０を含む溶液を、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０の表面から流し込んで裏面から排出する操作（或いは、裏面から流し込んで表面から排出する操作）を繰り返し行うことによって、当該酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に吸着固定させる。ここで、本実施形態では、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、酵素３０を含む溶液を流し込んで排出する操作を高速で行うことができる。
次いで、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０を洗浄することによって、拡散領域Ａ２内の酵素３０を洗い流す。
以上のようにして、作成した陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に酵素３０を導入して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を製造する。
(Introduction of enzyme)
Next, the enzyme 30 is introduced into the through-hole 11 and fixed to the silica structure 20 (introduction step).
Specifically, first, a solution containing the enzyme 30 is prepared.
Next, for example, an operation of pouring the prepared solution containing the enzyme 30 from the surface of the anodized alumina substrate 10 in which the silica structure 20 is formed in the through-hole 11 and discharging from the back surface (or from the back surface, from the front surface) The enzyme 30 is introduced into the through-hole 11 and is adsorbed and fixed inside the hole 21 by repeatedly performing the discharge operation. Here, in this embodiment, since the microporous layer R is removed from the anodized alumina substrate 10, the operation of pouring and discharging the solution containing the enzyme 30 can be performed at high speed.
Next, the enzyme 30 in the diffusion region A2 is washed away by washing the anodized alumina substrate 10 in which the silica structure 20 is formed in the through hole 11.
As described above, the enzyme 30 is introduced into the through-hole 11 of the prepared anodized alumina substrate 10 to produce the anodized alumina-enzyme complex 1.
なお、上記の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法は、一例であって、これに限られるものではない。 In addition, the manufacturing method of said anodic oxidation alumina-enzyme complex 1 is an example, Comprising: It is not restricted to this.
以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１によれば、互いに平行な複数の貫通孔１１を有する陽極酸化アルミナ基板１０と、貫通孔１１内に導入された酵素３０と、を備え、陽極酸化アルミナ基板１０は、貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒが除去されてなる。
したがって、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用しても、酵素３０が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。
According to the anodized alumina-enzyme complex 1 of the present embodiment described above, the anodized alumina substrate 10 having a plurality of through holes 11 parallel to each other and the enzyme 30 introduced into the through holes 11 are provided. The anodized alumina substrate 10 is formed by removing the microporous layer R in which the microscopic holes Q connected to the tips of the through holes 11 are formed.
Therefore, since the microporous layer R is removed from the anodized alumina substrate 10, the enzyme 30 is selectively used even when the anodized alumina-enzyme complex 1 is applied to an enzyme sensor, an enzyme biobattery, an enzyme reactor, or the like. A liquid or gas containing a specific substance to be reacted is not easily transmitted, and a high-speed reaction can be performed.
また、以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１によれば、貫通孔１１内に当該貫通孔１１の内壁１１ａに沿って形成された中空糸状のシリカ構造体２０を備え、シリカ構造体２０は、壁面に複数の穴部２１を有し、酵素３０は、貫通孔１１内に導入されて穴部２１の内部に固定されている。
したがって、陽極酸化アルミナ基板１０に効率よく安定的に酵素３０を担持させるために、陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内にシリカ構造体２０を形成しても、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、酵素３０が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。
すなわち、本実施形態のように陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内にシリカ構造体２０を形成する場合は特に、微細孔層Ｒを有するままだと、微細孔Ｑがシリカ構造体２０で狭められてしまったり、塞がれてしまったりして、高速な反応が実施できなくなる。これに対し、本実施形態のように、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるものであるとともに、貫通孔１１内に中空糸状のシリカ構造体２０が備えられているので、効率よく安定的に酵素３０を担持できるとともに、高速な反応が実施できる。
Moreover, according to the anodic oxidation alumina-enzyme complex 1 of the present embodiment described above, the hollow fiber-like silica structure 20 formed along the inner wall 11a of the through-hole 11 is provided in the through-hole 11 and silica. The structure 20 has a plurality of holes 21 on the wall surface, and the enzyme 30 is introduced into the through-hole 11 and fixed inside the hole 21.
Therefore, even if the silica structure 20 is formed in the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10 in order to efficiently and stably carry the enzyme 30 on the anodized alumina substrate 10, the anodized alumina substrate 10 has a fine pore. Since the layer R is removed, a liquid or gas containing a specific substance that selectively reacts with the enzyme 30 does not easily permeate, and a high-speed reaction can be performed.
That is, when the silica structure 20 is formed in the through hole 11 of the anodized alumina substrate 10 as in the present embodiment, the fine hole Q is narrowed by the silica structure 20 when the fine hole layer R is left. Being blocked or blocked, it becomes impossible to carry out a high-speed reaction. On the other hand, as in the present embodiment, the anodized alumina substrate 10 is obtained by removing the microporous layer R, and the hollow fiber-like silica structure 20 is provided in the through hole 11. The enzyme 30 can be supported efficiently and stably, and a high-speed reaction can be performed.
また、以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法によれば、微細孔層Ｒをドライエッチングによって除去して、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する除去ステップと、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内に酵素３０を導入する導入ステップと、を有している。
したがって、微細孔層Ｒをドライエッチングによって除去するので、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても、微細孔層Ｒのみを除去でき、その他の部分（すなわち、陽極酸化アルミナ基板１０部分）の形状を維持することができる。
Moreover, according to the manufacturing method of the anodized alumina-enzyme complex 1 of the present embodiment described above, the removing step of removing the microporous layer R by dry etching to create the anodized alumina substrate 10, and the anodization An introduction step of introducing the enzyme 30 into the through hole 11 of the alumina substrate 10.
Accordingly, since removing the microporous layer R by dry etching, even when the composition of the microporous layer R portion and the other portion not different of al, only be removed microporous layer R, other parts (i.e. The shape of the anodized alumina substrate 10 portion) can be maintained.
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately changed without departing from the gist thereof.
シリカ構造体２０が有する穴部２１の貫通方向は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の貫通方向に対して略垂直に限ることはなく、穴部２１が中空糸状のシリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通しているのであれば任意である。
また、シリカ構造体２０が有する穴部２１は、シリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通する細孔に限ることはなく、例えば、シリカ構造体２０の内壁面２０ａに形成された凹部（すなわち、内壁面２０ａ側が開口して外壁面２０ｂ側が閉口した穴）であっても良い。
The through direction of the hole 21 included in the silica structure 20 is not limited to being substantially perpendicular to the through direction of the through hole 11 included in the anodized alumina substrate 10, and the hole 21 has a hollow fiber-like silica structure 20. It is optional as long as it penetrates from the inner wall surface 20a to the outer wall surface 20b.
Moreover, the hole 21 which the silica structure 20 has is not restricted to the pore penetrated from the inner wall surface 20a of the silica structure 20 to the outer wall surface 20b, and is formed on the inner wall surface 20a of the silica structure 20, for example. A concave portion (that is, a hole opened on the inner wall surface 20a side and closed on the outer wall surface 20b side) may be used.
陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に中空糸状のシリカ構造体２０を形成することとしたが、これに限ることはなく、貫通孔１１内に、効率よく安定的に酵素３０を固定するための中空糸状の多孔体が形成されていれば任意であり、例えば、中空糸状のカーボン多孔体が形成されていても良い。
また、必ずしも貫通孔１１内に多孔体を形成する必要はなく、貫通孔１１に直接酵素３０が固定されていても良い。
The hollow fiber-like silica structure 20 is formed in the through-hole 11 of the anodized alumina substrate 10. However, the present invention is not limited to this, and the enzyme 30 is efficiently and stably immobilized in the through-hole 11. As long as the hollow fiber-like porous body is formed, for example, a hollow fiber-like carbon porous body may be formed.
Further, it is not always necessary to form a porous body in the through hole 11, and the enzyme 30 may be directly fixed to the through hole 11.
１ 陽極酸化アルミナ−酵素複合体
１０ 陽極酸化アルミナ基板
１１ 貫通孔
１１ａ 内壁
２０ シリカ構造体
２１ 穴部
３０ 酵素
Ｑ 微細孔
Ｒ 微細孔層
1 Anodized Alumina-Enzyme Complex 10 Anodized Alumina Substrate 11 Through Hole 11a Inner Wall 20 Silica Structure 21 Hole 30 Enzyme Q Micropore R Micropore Layer
Claims (8)
前記貫通孔内に導入された酵素と、を備える陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法であって、
前記貫通孔の先端に接続する微細孔の形成された微細孔層をドライエッチングによって除去して、前記陽極酸化アルミナ基板を作成する除去ステップと、
前記陽極酸化アルミナ基板が有する前記貫通孔内に前記酵素を導入する導入ステップと、
を有することを特徴とする陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。 An anodized alumina substrate having a plurality of through holes parallel to each other;
Wherein the enzyme is introduced into the through hole, Ru with the anodized alumina - a process for the preparation of the enzyme complex,
A removal step of creating the anodized alumina substrate by removing the microporous layer formed with micropores connected to the tip of the through-hole by dry etching;
An introducing step of introducing the enzyme into the through-hole of the anodized alumina substrate;
A method for producing an anodized alumina-enzyme complex characterized by comprising:
前記シリカ構造体は、壁面に複数の穴部を有し、
前記酵素は、前記貫通孔内に導入されて前記穴部の内部に固定されていることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。 The step of forming the silica structure of the middle empty thread along the inner wall of the through hole in the through-hole, has during the introduction step and the removing step,
The silica structure has a plurality of holes on the wall surface,
The method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to any one of claims 1 to 3, wherein the enzyme is introduced into the through hole and fixed inside the hole. .
０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体、 A silica-based mesoporous material having a pore volume of 0.1 to 1.5 mL / g,
２００〜１５００ｍ 200-1500m ２2 の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体、又はA silica-based mesoporous material having a specific surface area of
全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする請求項４又は５に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。 The ratio of the total volume of pores having a diameter in the range of ± 40% of the center pore diameter to the total pore volume is a silica-based mesoporous material having 60% or more. 6. A method for producing an anodized alumina-enzyme complex according to 5.
前記有機基は、炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、又はビニル基であることを特徴とする請求項４から７の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。 The organic group is a hydrocarbon group, an amide group, an amino group, an imino group, a mercapto group, a sulfone group, a carboxyl group, an ether group, an acyl group, or a vinyl group. A method for producing the anodized alumina-enzyme complex according to claim 1.
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