JP5686429B2 - 陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法に関する。

陽極酸化アルミナ基板は、直径が５０ｎｍ〜１μｍの貫通孔を有しており（後述の図１参照）、酵素を担持する担体として注目されている。
ここで、既存の陽極酸化アルミナ基板の断面の電子顕微鏡写真を図４〜図７に示す。図４に示すように、陽極酸化アルミナ基板が有する貫通孔は、当該陽極酸化アルミナ基板の厚さ方向に、すなわち、一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通している。表面近傍の断面の拡大写真（図５）と、裏面近傍の断面の拡大写真（図６）と、を比較すると、表面近傍とそれ以外とでは、貫通孔の形状が異なることが分かる。具体的には、表面近傍の断面を更に拡大して得たＳＥＭ写真（図７）から分かるように、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面層では、貫通孔が分岐して複数の微細孔を形成しており、入り組んだ複雑な構造となっている。

すなわち、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐの断面を模式的に示すと、図８に示すように、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐの表面層（図８における上面層）は、複数の微細孔Ｑが形成された微細孔層Ｒとなっており、当該微細孔Ｑは、直径が５０ｎｍ〜１μｍの貫通孔１１の先端に接続されている。このように、表面近傍とそれ以外とで、貫通孔の形状が異なるのは、陽極酸化アルミナ基板の製法によるものと考えられる。

このような微細孔層Ｒを有する既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐに酵素を担持させて、陽極酸化アルミナ−酵素複合体を構成すると、微細孔層Ｒ部分で液体や気体の流路が狭まるため、当該陽極酸化アルミナ−酵素複合体を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用した場合に、酵素が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなって、高速な反応が実施できなくなる。

ところで、微細孔層を有する陽極酸化アルミナ基板を、微細孔層を優先的に溶解する溶液中に浸して、微細孔層を除去する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００５−３０７３４０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法で微細孔層が除去された陽極酸化アルミナ基板は、酵素を担持するためのものではない。さらに、微細孔層が除去された陽極酸化アルミナ基板に酵素を担持することによって構成された陽極酸化アルミナ−酵素複合体等も提案されていない。
また、特許文献１に記載の方法では、微細孔層部分とその他の部分との組成が異なっている必要があり、微細孔層部分とその他の部分との組成が異ならない場合は、微細孔層だけでなく、その他の部分（その他の部分の一部）も除去されてしまう。

本発明の課題は、高速な反応が実施可能な陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法として微細孔層部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても微細孔層のみを除去可能な製造方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
互いに平行な複数の貫通孔を有する陽極酸化アルミナ基板と、
前記貫通孔内に導入された酵素と、を備える陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法であって、
前記貫通孔の先端に接続する微細孔の形成された微細孔層をドライエッチングによって除去して、前記陽極酸化アルミナ基板を作成する除去ステップと、
前記陽極酸化アルミナ基板が有する前記貫通孔内に前記酵素を導入する導入ステップと、
を有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記ドライエッチングは、Ｏ _２ 及びＣＦ _４ を用いた反応性イオンエッチングであることを特徴とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記貫通孔の直径は、５０ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする。

請求項４に記載の発明は、請求項１から３の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記貫通孔内に当該貫通孔の内壁に沿って中空糸状のシリカ構造体を形成する形成ステップを、前記除去ステップと前記導入ステップの間に有し、
前記シリカ構造体は、壁面に複数の穴部を有し、
前記酵素は、前記貫通孔内に導入されて前記穴部の内部に固定されていることを特徴とする。

請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記穴部のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする。
請求項６に記載の発明は、請求項４又は５に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、
０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体、
２００〜１５００ｍ ^２ の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体、又は
全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする。
請求項７に記載の発明は、請求項４から６の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示すシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする。
請求項８に記載の発明は、請求項４から７の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法において、
前記シリカ構造体は、有機基を有するシリカ系メソ多孔体であり、
前記有機基は、炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、又はビニル基であることを特徴とする。

本発明によれば、陽極酸化アルミナ基板は微細孔層が除去されてなるので、陽極酸化アルミナ−酵素複合体を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用しても、酵素が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。

本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の構成を示す模式図である。 本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の要部構成を説明するための断面模式図である。 本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体を構成する陽極酸化アルミナ基板のＳＥＭ写真、すなわち、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面を反応性イオンエッチングした後のＳＥＭ写真である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の断面のＳＥＭ写真である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の表面近傍の断面のＳＥＭ写真である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の裏面近傍の断面のＳＥＭ写真である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の表面近傍の断面のＳＥＭ写真である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の断面を示す模式図である。 既存の陽極酸化アルミナ基板の断面を示す模式図であって、シリカ構造体を形成した場合の図である。

以下、図を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。ただし、発明の範囲は、図示例に限定されない。

＜陽極酸化アルミナ−酵素複合体＞
本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、陽極酸化アルミナ基板１０と、当該陽極酸化アルミナ基板１０に担持された酵素３０と、等からなり、例えば、酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクターに好適に適用することができる。
具体的には、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、例えば、図１及び図２に示すように、厚さ方向に貫通する互いに平行な複数の貫通孔１１を有する陽極酸化アルミナ基板１０と、貫通孔１１内に当該貫通孔１１の内壁１１ａに沿って形成された中空糸状のシリカ構造体２０と、貫通孔１１内に導入されてシリカ構造体２０に固定された酵素３０と、を備えて構成される。

陽極酸化アルミナ−酵素複合体１において、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内は、例えば、図２に示すように、酵素３０が固定される固定領域Ａ１と、特定物質（反応物質）及び生成物（反応生成物）が拡散する拡散領域Ａ２と、に分けられる。
固定領域Ａ１は、シリカ構造体２０の壁面部分であり、その壁面部分に形成された穴部２１の内部に酵素３０が固定されている。
拡散領域Ａ２は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通する孔からなる。すなわち、拡散領域Ａ２は、陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に形成されたシリカ構造体２０の中空部分であり、何も充填されていない空洞となっている。

したがって、例えば、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の表面から裏面に向かって（或いは、裏面から表面に向かって）、特定物質を含有する液体や気体を強制的に透過させると、当該液体や気体は何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を通過する。そのため、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造（酵素３０が固定された領域を、特定物質や生成物が拡散する構造）の複合体と比較して、圧損が低く、当該液体や気体を高速に透過させることができるので、高速で反応を実施することができる。

さらに、当該液体や気体が拡散領域Ａ２を通過する際に、当該液体や気体に含有された特定物質は、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、固定領域Ａ１に固定された酵素３０へと移動し、当該酵素３０と接触する。そして、当該接触によって生じた生成物も、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部へと移動する。そのため、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造の複合体と比較して、内部での特定物質や生成物の拡散性が高くなるので、高速で反応を実施することができる。

また、例えば、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を電解液等に浸漬させ、特定物質を含有する気体を当該電解液等と接触させて、当該電解液等に当該特定物質を溶解させると、当該特定物質は、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部を拡散して内部（拡散領域Ａ２）へと移動し、さらに、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、固定領域Ａ１に固定された酵素３０へと移動し、当該酵素３０と接触する。そして、当該接触によって生じた生成物も、何も充填されていない空洞状態の拡散領域Ａ２を拡散して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の外部へと移動する。そのため、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造の複合体と比較して、内部での特定物質や生成物の拡散性が高くなるため、高速で反応を実施することができる。

＜陽極酸化アルミナ基板＞
陽極酸化アルミナ基板１０は、アルミニウムを含む基板（アルミニウム又はアルミニウム合金からなる基板）を陽極酸化して得た陽極酸化アルミナ基板（陽極酸化アルミナ膜）である。陽極酸化アルミナ基板１０は、例えば、直径が５ｃｍ程度、厚さが５０μｍ程度の円板形状をなしている。

ここで、陽極酸化アルミナ基板１０は、当該陽極酸化アルミナ基板１０の厚さ方向に貫通する貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒが除去されてなる。
前述したように、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐは、少なくとも一方の面（表面）に、貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒを有している。このような微細孔層Ｒを有する既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを、陽極酸化アルミナ−酵素複合体に用いると、特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなり、高速な反応が実施できなくなる。

特に、本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１のように、貫通孔１１内に形成されたシリカ構造体２０を備える場合、微細孔層Ｒを有するままだと、微細孔Ｑがシリカ構造体２０で狭められてしまったり、或いは、図９に示すように、塞がれてしまったりする。貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑが塞がれる（或いは、狭められる）と、液体や気体が透過しなくなって（或いは、透過し難くなって）、貫通孔１１及び微細孔Ｑの内部に導入されてシリカ構造体２０に固定された酵素３０に特定物質が供給されなくなったり（或いは、供給され難くなったり）、酵素３０と特定物質との反応により生じた生成物を回収できなくなったり（或いは、回収し難くなったり）して、高速な反応が実施できなくなる。

そこで、本実施形態では、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐから、微細孔層Ｒを除去することによって形成されてなるものを、陽極酸化アルミナ基板１０として使用することとする。したがって、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１は、陽極酸化によって形成された孔のうちの微細孔Ｑが除去されてなる、陽極酸化アルミナ基板１０の一方の面（表面）から他方の面（裏面）にかけて貫通する円筒状（或いは、角筒状）の孔である。
貫通孔１１の直径は、当該貫通孔１１内に導入する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、５０ｎｍ〜１μｍである。

＜シリカ構造体＞
シリカ構造体２０は、ナノメートルオーダーのサイズの細孔（穴部２１）を複数有する多孔性シリカ膜（シリカ製のメッシュ体）を丸めて円筒状（或いは、角筒状）に形成したような形状をなしている。すなわち、シリカ構造体２０は、ナノメートルオーダーのサイズの細孔（穴部２１）を壁面に複数有する中空糸状のシリカ系メソ多孔体である。
シリカ構造体２０は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の内壁１１ａを鋳型として形成される。具体的には、例えば、貫通孔１１の内壁１１ａに、界面活性剤とシリカとの自己組織化によって有機−無機複合体（界面活性剤を含むシリカ層）を形成させ、その後、有機−無機複合体から界面活性剤を焼却除去や溶媒抽出除去することによって、周期構造を有するメソポーラスな多孔質材料（シリカ構造体２０）を形成することができる。

穴部２１は、界面活性剤のミセルを鋳型として形成された、シリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通する孔である。穴部２１の貫通方向は、例えば、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の貫通方向に対して略垂直となっている。
穴部２１のサイズ（中心細孔直径）は、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、１ｎｍ〜５０ｎｍである。ここで、穴部２１のサイズは、界面活性剤の種類を変えて、界面活性剤のミセルの径を変えることによって制御できる。また、穴部２１のサイズは、例えば、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼンやトリプロピルベンゼンなどの比較的疎水性の分子を添加し、ミセルを膨潤させて、ミセルの径を変えることによって制御できる。

なお、穴部２１の中心細孔直径とは、穴部２１の断面形状が正円形状であると仮定し、シリカ構造体２０の細孔容積（Ｖ）を穴部２１の直径（Ｄ）で微分した値（ｄＶ／ｄＤ）を穴部２１の直径（Ｄ）に対してプロットした曲線（細孔径分布曲線）の最大ピークにおける細孔直径を意味する。

穴部２１のサイズは、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素３０のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素３０のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。穴部２１のサイズが酵素３０のサイズの０．５倍未満であると、酵素３０が穴部２１の内部へと入り込み難くなり、酵素３０の固定量が不充分となる傾向がある。また、穴部２１のサイズが酵素３０のサイズの２．０倍よりも大きいと、酵素３０の立体構造が効率よく保持されない傾向がある。
すなわち、シリカ構造体２０が有する穴部２１のサイズを、当該穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同程度）にすることによって、穴部２１の内部への酵素３０の固定（吸着）を効率化でき、また、穴部２１の内部に固定された酵素３０の立体構造の保持が容易となるため酵素３０を安定的に担持することができる。

なお、穴部２１の内部に固定する酵素３０が多量体を形成する場合、当該酵素３０のサイズは、多量体のサイズとすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
また、穴部２１の内部に固定する酵素３０のサイズは、当該酵素３０の形状が、球状である場合は酵素３０の直径（例えば、楕円球状のように直径が複数ある場合は、そのうちの何れか１つ）、板状である場合は酵素３０の長辺の長さ、等とすることができるが、これらに限られるものではなく、穴部２１の内部に固定する酵素３０の形状や特性に応じて適宜任意に判断するのが好ましい。

また、穴部２１の内部に固定する酵素３０の変性を抑制する等の観点から、シリカ構造体２０の酸解離定数（ｐＫａ）は、ｐＫａ５〜１４が好ましい。

また、穴部２１の深さ（すなわち、シリカ構造体２０の壁面の厚み）は、穴部２１の内部に固定する酵素３０の種類等に応じて適宜任意に変更可能であり、具体的には、例えば、１ｎｍ以上である。
ここで、シリカ構造体２０の壁面の厚みを決めるファクターとして、シリカ構造体２０の原料となるシリカ源溶液の粘度や液温、シリカ源溶液を陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内に流し込む速度などが挙げられる。例えば、流し込む速度が低下するにつれて、貫通孔１１内に形成される中空糸状のシリカ構造体２０の壁面の厚みは厚くなり、流し込む速度が所定の閾値以下になると、貫通孔１１内には、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離された構造のシリカ系メソ多孔体（中空糸状のシリカ構造体２０）が形成されず、固定領域Ａ１と拡散領域Ａ２とが分離されていない構造のシリカ系メソ多孔体が形成されてしまう。

シリカ構造体２０は、０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体であることが好ましく、また、２００〜１５００ｍ^２の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。そして、シリカ構造体２０は、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。
ここで、「全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上」とは、例えば、中心細孔直径が３．００ｎｍである場合、この３．００ｎｍの±４０％、すなわち、１．８０〜４．２０ｎｍの範囲にある細孔の容積の合計が、全細孔容積の６０％以上を占めていることを意味する。
このような条件を満たすシリカ系メソ多孔体は、細孔の直径が非常に均一であることを意味し、このような細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に、酵素３０を吸着させると、酵素３０の安定性及び吸着量（固定量）をより向上させることができる。なお、細孔容積は、例えば、リン酸溶液や硝酸溶液で陽極酸化アルミナ基板１０を溶解させて、析出したシリカ構造体２０を液体窒素温度に冷却して窒素ガスを導入する方法（窒素吸着法）によって算出することができる。

また、シリカ構造体２０は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示すシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。Ｘ線回折パターンでピークが現われる場合は、そのピーク角度に相当するｄ値の周期構造がシリカ系メソ多孔体中にあることを意味する。
したがって、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークがあることは、細孔が１ｎｍ以上の間隔で規則的に配列していることを意味する。このように、非常に規則的な細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体に、酵素３０を吸着させると、酵素３０の安定性及び吸着量をより向上させることが可能になる。

なお、シリカ構造体２０における、穴部２１の配列状態（細孔配列構造）は、特に制限されるものではない。シリカ構造体２０としては、例えば、ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するもの、キュービックやディスオーダの細孔配列構造を有するものが例示される。
ここで、シリカ構造体２０がヘキサゴナルの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が六方構造であることを意味する。ヘキサゴナルの細孔配列構造としては、２次元ヘキサゴナル及び３次元ヘキサゴナルが挙げられる。本発明において好適に用いることのできる２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するシリカ構造体２０は、例えば、図１に示すように、２次元ヘキサゴナル配列構造に基づいて、六角柱状の細孔が互いに平行に規則的に形成されている。
また、シリカ構造体２０がキュービックの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が立方構造であることを意味する。
また、シリカ構造体２０がディスオーダの細孔配列構造を有するとは、シリカ構造体２０が有する穴部２１の配置が不規則であることを意味する。

なお、シリカ構造体２０が、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造を有する場合は、穴部２１の全てがこれらの規則的細孔配列構造である必要はない。すなわち、シリカ構造体２０は、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造と、ディスオーダの不規則的細孔配列構造と、の両方を有していることが可能である。しかしながら、全ての穴部２１のうちの８０％以上は、ヘキサゴナルやキュービックなどの規則的細孔配列構造となっていることが好ましい。

また、シリカ構造体２０としては、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、何れのシリカ系メソ多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素（例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ）を更に含むことができる。なお、何れのシリカ系メソ多孔体であっても、表面にはシラノール基（−ＳｉＯＨ基）が存在している。
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を形成することによって結合しているものをいう。有機基としては、例えば、アルカンやアルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカンなどの炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。

＜酵素＞
酵素３０は、特定物質と選択的に反応する酵素であれば任意であり、特定物質の種類によって適宜選択可能である。
具体的には、酵素３０は、例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素等の酵素（酵素タンパク質）であるが、これらに限定されるものではない。
また、酵素３０は、例えば、生来の酵素分子であっても良いし、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても良いし、所望によりそれを切断したものであっても良いし、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。

陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に導入してシリカ構造体２０の穴部２１の内部に固定する酵素３０（すなわち、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０）は、１種類の酵素であっても良いし、２種類以上の酵素であっても良い。
また、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０が２種類以上である場合、当該酵素３０は、例えば、同種の特定物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても良いし、異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良いし、同種及び／又は異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
また、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成する酵素３０が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素３０は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する別々の貫通孔１１内に導入されても良いし、同一の貫通孔１１内に導入されても良い。

酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に固定する方法としては、例えば、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０に、酵素３０を含む溶液を滴下するディップ法、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０を、酵素３０を含む溶液に浸漬する浸漬法、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０の表面から裏面に向かって（或いは、裏面から表面に向かって）、酵素３０を含む溶液を透過させる透過法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に固定することができる。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。

＜陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法＞
次に、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法について説明する。
陽極酸化アルミナ−酵素複合体１は、陽極酸化アルミナ基板１０を作成し、シリカ構造体２０を貫通孔１１内に形成し、酵素３０を貫通孔１１に導入してシリカ構造体２０に固定することによって製造される。

（陽極酸化アルミナ基板の作成）
まず、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する（除去ステップ）。
具体的には、まず、アルミニウムを含む基板を陽極酸化して得た既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを用意する。
次いで、Ｏ_２及びＣＦ_４を用いた反応性イオンエッチング等のドライエッチングによって、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面から微細孔層Ｒを除去して、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する。

ここで、図３に、陽極酸化アルミナ基板１０の電子顕微鏡写真、すなわち、既存の陽極酸化アルミナ基板の表面を反応性イオンエッチングした後の電子顕微鏡写真を示す。図３に示す電子顕微鏡写真から、反応性イオンエッチングすることによって、微細孔層Ｒを完全に除去できることが分かる。これにより、既存の陽極酸化アルミナ基板Ｐを改良して作成した陽極酸化アルミナ基板１０を用いることで、高速な反応が実施可能な陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を構成できることが分かる。
なお、ウェットエッチング法や微細孔層Ｒを溶解可能な溶液中に浸す方法などの湿式法によって微細孔層Ｒを除去することも可能である。しかしながら、湿式法だと、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合は特に、その他の部分（その他の部分の一部）も除去されてしまって、陽極酸化アルミナ基板１０が薄くなってしまったり、貫通孔１１の径が大きくなってしまったりする場合がある。そのため、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても、その他の部分（すなわち、陽極酸化アルミナ基板１０部分）の形状を維持可能である等の観点から、本実施形態のように、ドライエッチング法等の乾式法によって微細孔層Ｒを除去することが好ましい。

（シリカ構造体の形成）
次に、シリカ構造体２０を貫通孔１１内に形成する。
具体的には、例えば、まず、シリカ構造体２０の原料となるシリカ源溶液を、作成した陽極酸化アルミナ基板１０の一方の面（表面）から流し込んで他方の面（裏面）から排出する操作（或いは、裏面から流し込んで表面から排出する操作）を行う。この際、貫通孔１１の内壁１１ａに残留するシリカ源溶液の厚さが所定の値となるように、シリカ源溶液の粘度や液温、シリカ源溶液を流し込む速度などの条件を調整する。ここで、本実施形態では、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、シリカ源溶液を流し込んで排出する操作を高速で行うことができる。
次いで、例えば、貫通孔１１の内壁１１ａにシリカ源溶液が残留する陽極酸化アルミナ基板１０を加熱し、当該シリカ源溶液を焼き固めることによって、貫通孔１１の内壁１１ａに沿ってシリカ構造体２０を形成する。

（酵素の導入）
次に、酵素３０を貫通孔１１に導入してシリカ構造体２０に固定する（導入ステップ）。
具体的には、まず、酵素３０を含む溶液を作成する。
次いで、例えば、作成した酵素３０を含む溶液を、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０の表面から流し込んで裏面から排出する操作（或いは、裏面から流し込んで表面から排出する操作）を繰り返し行うことによって、当該酵素３０を貫通孔１１内に導入して穴部２１の内部に吸着固定させる。ここで、本実施形態では、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、酵素３０を含む溶液を流し込んで排出する操作を高速で行うことができる。
次いで、貫通孔１１内にシリカ構造体２０が形成された陽極酸化アルミナ基板１０を洗浄することによって、拡散領域Ａ２内の酵素３０を洗い流す。
以上のようにして、作成した陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に酵素３０を導入して、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を製造する。

なお、上記の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法は、一例であって、これに限られるものではない。

以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１によれば、互いに平行な複数の貫通孔１１を有する陽極酸化アルミナ基板１０と、貫通孔１１内に導入された酵素３０と、を備え、陽極酸化アルミナ基板１０は、貫通孔１１の先端に接続する微細孔Ｑの形成された微細孔層Ｒが除去されてなる。
したがって、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、陽極酸化アルミナ−酵素複合体１を酵素センサ、酵素バイオ電池、酵素リアクター等に適用しても、酵素３０が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。

また、以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１によれば、貫通孔１１内に当該貫通孔１１の内壁１１ａに沿って形成された中空糸状のシリカ構造体２０を備え、シリカ構造体２０は、壁面に複数の穴部２１を有し、酵素３０は、貫通孔１１内に導入されて穴部２１の内部に固定されている。
したがって、陽極酸化アルミナ基板１０に効率よく安定的に酵素３０を担持させるために、陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内にシリカ構造体２０を形成しても、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるので、酵素３０が選択的に反応する特定物質を含有する液体や気体が透過し難くなることがなく、高速な反応が実施できる。
すなわち、本実施形態のように陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内にシリカ構造体２０を形成する場合は特に、微細孔層Ｒを有するままだと、微細孔Ｑがシリカ構造体２０で狭められてしまったり、塞がれてしまったりして、高速な反応が実施できなくなる。これに対し、本実施形態のように、陽極酸化アルミナ基板１０は微細孔層Ｒが除去されてなるものであるとともに、貫通孔１１内に中空糸状のシリカ構造体２０が備えられているので、効率よく安定的に酵素３０を担持できるとともに、高速な反応が実施できる。

また、以上説明した本実施形態の陽極酸化アルミナ−酵素複合体１の製造方法によれば、微細孔層Ｒをドライエッチングによって除去して、陽極酸化アルミナ基板１０を作成する除去ステップと、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１内に酵素３０を導入する導入ステップと、を有している。
したがって、微細孔層Ｒをドライエッチングによって除去するので、微細孔層Ｒ部分とその他の部分との組成が異ならない場合であっても、微細孔層Ｒのみを除去でき、その他の部分（すなわち、陽極酸化アルミナ基板１０部分）の形状を維持することができる。

なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。

シリカ構造体２０が有する穴部２１の貫通方向は、陽極酸化アルミナ基板１０が有する貫通孔１１の貫通方向に対して略垂直に限ることはなく、穴部２１が中空糸状のシリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通しているのであれば任意である。
また、シリカ構造体２０が有する穴部２１は、シリカ構造体２０の内壁面２０ａから外壁面２０ｂにかけて貫通する細孔に限ることはなく、例えば、シリカ構造体２０の内壁面２０ａに形成された凹部（すなわち、内壁面２０ａ側が開口して外壁面２０ｂ側が閉口した穴）であっても良い。

陽極酸化アルミナ基板１０の貫通孔１１内に中空糸状のシリカ構造体２０を形成することとしたが、これに限ることはなく、貫通孔１１内に、効率よく安定的に酵素３０を固定するための中空糸状の多孔体が形成されていれば任意であり、例えば、中空糸状のカーボン多孔体が形成されていても良い。
また、必ずしも貫通孔１１内に多孔体を形成する必要はなく、貫通孔１１に直接酵素３０が固定されていても良い。

１ 陽極酸化アルミナ−酵素複合体
１０ 陽極酸化アルミナ基板
１１ 貫通孔
１１ａ 内壁
２０ シリカ構造体
２１ 穴部
３０ 酵素
Ｑ 微細孔
Ｒ 微細孔層

Claims (8)

1. 互いに平行な複数の貫通孔を有する陽極酸化アルミナ基板と、
   前記貫通孔内に導入された酵素と、を備える陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法であって、
   前記貫通孔の先端に接続する微細孔の形成された微細孔層をドライエッチングによって除去して、前記陽極酸化アルミナ基板を作成する除去ステップと、
   前記陽極酸化アルミナ基板が有する前記貫通孔内に前記酵素を導入する導入ステップと、
   を有することを特徴とする陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
2. 前記ドライエッチングは、Ｏ _２ 及びＣＦ _４ を用いた反応性イオンエッチングであることを特徴とする請求項１に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
3. 前記貫通孔の直径は、５０ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
4. 前記貫通孔内に当該貫通孔の内壁に沿って中空糸状のシリカ構造体を形成する形成ステップを、前記除去ステップと前記導入ステップの間に有し、
   前記シリカ構造体は、壁面に複数の穴部を有し、
   前記酵素は、前記貫通孔内に導入されて前記穴部の内部に固定されていることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
5. 前記穴部のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする請求項４に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
6. 前記シリカ構造体は、
   ０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するシリカ系メソ多孔体、
   ２００〜１５００ｍ ^２ の比表面積を有するシリカ系メソ多孔体、又は
   全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上のシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする請求項４又は５に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
7. 前記シリカ構造体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示すシリカ系メソ多孔体であることを特徴とする請求項４から６の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。
8. 前記シリカ構造体は、有機基を有するシリカ系メソ多孔体であり、
   前記有機基は、炭化水素基、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、又はビニル基であることを特徴とする請求項４から７の何れか一項に記載の陽極酸化アルミナ−酵素複合体の製造方法。