JP5714206B2

JP5714206B2 - 抗酸化剤

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Publication number: JP5714206B2
Application number: JP2008307557A
Authority: JP
Inventors: 峰彦横山; 幸夫浅見; 光助紀
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2015-05-07
Anticipated expiration: 2028-12-02
Also published as: JP2010132574A

Description

本発明は抗酸化剤、具体的には乳タンパク質中に見いだされるアミノ酸配列からなるORAC活性を有するペプチドに関する。

ORACとは、Oxygen Radical Absorbance Capacityの頭文字であり、１９９２年に米国のNational Institute on Aging（国立老化研究所）でGuohua Caoらによって開発された。ORACは日本語では活性酸素吸収能力（以下「ORAC活性」）と呼ばれ、食品などに含まれる種々の抗酸化物質（カテキン、フラボノイド、ビタミンＥなど）の抗酸化能力を表す一方法である。この方法は、親水性と親油性の抗酸化能力を分別定量できる方法である。そして、食品やサプリメントの抗酸化能力を科学的に分析する基準として世界において用いられるようになってきている。事実、米国においてはORAC活性値を表記した多くの食品が上市されており、その数値が具体的に表示されている。

これまで、アミノ酸の抗酸化作用については、例えば非特許文献１〜６に報告があるが、これらの文献はORAC活性を指標とするものではなく、ORACを指標とするものではわずかに非特許文献５や６の報告があるのみである。これらの報告のうち、非特許文献５では、乳タンパク質であるβ−カゼインやβ−ラクトグロブリンの脂質酸化抑制作用が調べられ、Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ileのアミノ酸配列（配列番号３１）を有するペプチドが、抗酸化物質としてよく知られているＢＨＡ（Butylated Hydroxyanisole）とほぼ同様な活性を示すことが開示されている。また、このペプチド以外にも、Met-His-Ile-Arg-Leuのアミノ酸配列（配列番号３２）を有するペプチドやTyr-Val-Glu-Glu-Leuのアミノ酸配列（配列番号３３）を有するペプチドもORAC活性を示すことが示されている。

しかしながら、配列番号３１で示されるペプチドのORAC活性値は、トリプトファン単独のORAC値よりも小さく、当該ペプチドを構成するアミノ酸の混合物のORAC活性値と比べても小さいことが示されている（非特許文献１）。これらのことはペプチド結合やペプチドの立体構造の影響によるものと推測されている。また、配列番号３２や配列番号３３で示されるペプチドのORAC活性値も同様に、当該ペプチドを構成するアミノ酸の混合物が示すORAC活性値の総和よりも小さく、計算上の合計値であるORAC理論値に比べても小さい。さらに、これらのペプチドが有するORAC活性値は各アミノ酸が有するORAC活性値の計算上の合計値（ORAC理論値：各アミノ酸のORAC活性値の総和）に比べてかなり小さいことも理解される（表３参照）。

また、非特許文献６では、配列番号３１で示されるペプチドを基礎として、このペプチドのＣ末端側から、ペプチドを構成するアミノ酸を２個、３個と順に１つずつ除去したペプチドについてのORAC活性が示されている。そして、これらのペプチドを構成するアミノ酸の混合物が有するORAC活性値とこれらのペプチドのORAC活性値との比較が行われている。その結果、Trp-Tyrのアミノ酸配列（配列番号３５）を有するペプチド、Trp-Tyr-Serのアミノ酸配列（配列番号３６）を有するペプチド、Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Metのアミノ酸配列（配列番号３９）を有するペプチドのORAC活性値が、個々のアミノ酸混合物のORAC活性値よりも有意に大きいことが示されている。そして、これは既に非特許文献７において報告されているSer-Ala-Leu-Ala-Metのアミノ酸配列（配列番号３４）を有するペプチドのORAC活性値の約３倍であることが示されている。

これらのことより、配列番号３９で示されるペプチドにおいては、ORAC活性値の高いTrp及びTyrの存在及びその位置が重要な要素であるとされている。また、配列番号３６及び３７で示されるペプチドのうちSerの欠落がORAC活性値の増加に重要な要素であると結論づけられている。

富田裕一郎, 鹿児島大学農学部学術報告, １９７１ Levine R.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 15036-15040(1996) Park EY. et al., J. Agric. Food Chem., 53, 8334-8341(2005) Ellas RJ. et al. J. Agric. Food Chem., 53, 10248-10253(2005) Hernandez-Ledesma B. et. al., J. Agric. Food Chem., 53, 588-593(2005) Hernandez-Ledesma B. et. al., J. Agric. Food Chem., 55, 3392-3397(2007) Davalos, A., J. Food Prot., 67, 1939-1944(2004)

以上のように、ペプチドの有するORAC活性値とペプチドを構成するアミノ酸の混合物が有するORAC活性値や各アミノ酸が有するORAC活性値から計算されるORAC理論値とは全く関係がなく、ペプチドのORAC活性値は特定のアミノ酸の有無及びこれらのアミノ酸の位置に依存するものと考えられる。

本発明者らは栄養価に優れた乳中に含まれる乳タンパク質に着目し、非特異性のペプチダーゼにより任意の位置で切断されたペプチドから、ORAC活性値の高いペプチドを分離してこれらを利用することができれば、抗酸化活性にすぐれたより有効な乳製品を提供できると考えた。

そこで、本発明者らは、乳タンパク質を構成するアミノ酸について独自にORAC活性を測定すると共に、高いORAC活性を示したTrp、Tyr、Met、Cys、Hisの５つのアミノ酸に着目し、これらのアミノ酸を含むペプチドについてORAC活性を測定したところ、ORAC活性に優れた数多くのペプチドを見つけ出した。そして、これらペプチドの有するアミノ酸配列には共通する特徴があることを見いだし、本願発明を完成するに至った。

本発明の抗酸化剤は、
（１）乳タンパク質中のアミノ酸配列中に見いだされる３〜６つのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであって、
（２）Ｗ、Ｙ、Ｍからなる群から選ばれるアミノ酸をＮ末端に有し、
（３）Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸をＣ末端に有し、
（４）ＯＲＡＣ活性がＢＨＡが有するＯＲＡＣ活性以上であって、
（５）前記乳タンパク質が、α−Ｓ１カゼイン（α−S1 Casein）、β−カゼイン（β−Casein）、γ−カゼイン（γ−Casein）、κ−カゼイン（κ−Casein）、α−ラクトアルブミン（α−Lactalbumin）及びβ−ラクトグロブリン（β−Lactoglobulin）からなる群から選ばれることを特徴とするものである。
（６）但し、ＷＹＳＬＡＭのアミノ酸配列を有するペプチドを除く。

本発明によると新規な抗酸化剤が提供される。これらの抗酸化剤は、乳タンパク質をペプチダーゼにより酵素分解すれば得ることができるものであり、ＢＨＡに比べると同等な抗酸化力を有しながらそれよりも安全なものであると考えられる。また、乳製品の新たな用途を提供する道を開くものである。

本発明の抗酸化剤は、
（１）乳タンパク質中に見いだされる３〜６つのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とするものであり、次の（２）〜（６）の特徴を有する。
（２）Ｗ、Ｙ、Ｍからなる群から選ばれるアミノ酸をＮ末端に有する。
（３）Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸をＣ末端に有する。
（４）ＯＲＡＣ活性がＢＨＡが有するＯＲＡＣ活性以上であって、
（５）前記乳タンパク質が、α−Ｓ１カゼイン（α−S1 Casein）、β−カゼイン（β−Casein）、γ−カゼイン（γ−Casein）、κ−カゼイン（κ−Casein）、α−ラクトアルブミン（α−Lactalbumin）及びβ−ラクトグロブリン（β−Lactoglobulin）からなる群から選ばれる。
（６）但し、ＷＹＳＬＡＭのアミノ酸配列を有するペプチドを除く。

本発明の抗酸化剤であるペプチドは、乳タンパク質、具体的に言えば、α−カゼイン（α−Casein）、β−カゼイン（β−Casein）、γ−カゼイン（γ−Casein）、κ−カゼイン（κ−Casein）、α−ラクトアルブミン（α−Lactalbumin）及びβ−ラクトグロブリン（β−Lactoglobulin）中から見いだされるアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに具体的には、配列番号１〜６で示されるペプチドはα−Ｓ１カゼイン中に、配列番号７〜１１で示されるペプチドはγ−カゼイン中に、配列番号１２〜１４で示されるペプチドはβ−カゼイン中に、配列番号１５〜２１で示されるペプチドはκ−カゼイン中に、配列番号２２〜２５で示されるペプチドはα−ラクトアルブミン中に、配列番号２６〜２９で示されるペプチドはβ−ラクトグロブリン中に見いだされる。なお、これらペプチドを構成するアミノ酸はＬ型であるのが望ましい。

これらのペプチドは、上記の乳タンパク質を基質非特異性のペプチダーゼによって消化し、クロマトグラフィーなどの適当な分離手段を用いた分取により得られる。また、各種のペプチド合成法、例えば固相合成法や液相合成法などによる合成により得られる。

本発明者らは、必須アミノ酸のORAC活性を測定したところ、Met(メチオニン：「Ｍ」で示される)、Cys（システイン：「Ｃ」で示される）、Tyr（チロシン：「Ｙ」で示される）、Trp（トリプトファン：「Ｗ」で示される）、His（ヒスチジン：「Ｈ」で示される）が、高いORAC活性を示した（図１及び表１参照）。これは、非特許文献５で示されたのとほぼ同様の傾向であった。

本発明の抗酸化剤となるペプチドは、上記ORAC活性の高いアミノ酸を数多く含むアミノ酸配列を乳タンパク質中から見いだしたものである。この結果、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸を２つ以上含み、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸をＮ末端及びＣ末端に有するか、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸を２個連続して有する３〜６つのアミノ酸からなるペプチドが高いORAC活性を示した。そして、これらのペプチドのなかから、抗酸化物質として汎用されているＢＨＡのORAC活性値以上の活性値を有するペプチドを見いだすことができた。なお、ＢＨＡのORAC活性値は非特許文献５によると２.４３（μmol Trolox/μmol BHA）とされているが、本願発明者らの実験によるとＢＨＡのそれは２.２０７±０.１４２（μmol Trolox/μmol BHA）であった。

すなわち、表１に各アミノ酸のORAC値が示されたが、これらのアミノ酸の中でもＷ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈは他のアミノ酸に比べて高いORAC値を示す。従って、これらのアミノ酸を多く含めば含むほどペプチドのORAC活性は大きくなることが予想される。しかしながら、非特許文献５、６に示されているように、必ずしもＷ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈのアミノ酸を含むからと言えども、ペプチドのORAC活性値は高くなるものではない。例えば、既報で述べられているように配列番号３１のペプチドはＷ、Ｙ、Ｍの３つのアミノ酸を含むが、このペプチドのORAC活性値は各アミノ酸のORAC活性値の総和（ORAC理論値）よりも小さく、理論値の約４０％の活性値しか示さない（表３参照）。また、これらの５つのアミノ酸の何れか１つ又は２つを有していても、配列番号３２や３３に示されるペプチドでは大きくてもORAC理論値の５０％程度の活性値しか有しない。

しかしながら、本願発明者らによると、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈからなる群から選ばれるアミノ酸を２つ以上含む場合であって、ペプチドのＮ末端及びＣ末端にこれら５つのアミノ酸のいずれかを有するものが、各アミノ酸のORAC活性値の総和とほぼ同じかそれ以上、良好なものであれば理論値の８０％以上、少なくとも理論値の７０％以上のORAC活性を有するようになる。その一方で、ペプチドのＮ末端及びＣ末端にこれら５つのアミノ酸のいずれかを有しなくても、アミノ酸配列中にこれら５つのアミノ酸のいずれかが連続していると、各アミノ酸のORAC活性値の総和とほぼ同じかそれ以上、少なくとも理論値の６０％、良好なものであれば理論値の８０％以上のORAC活性を有する傾向にある。例えば配列番号１５や１６、２３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。もっとも、ＢＨＡとほぼ同等ないしそれよりも小さいORAC活性のペプチドではこれに当てはまらない場合もある。例えば配列番号２９、３０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドでは、ORAC理論値の５０％程度の活性しか発揮しない。

これらのうち、Ｙが２つ連続する場合には（例えば配列番号１６や１７）、各アミノ酸のORAC活性値の総和よりも大きくなる傾向があり、少なくとも理論値の８０％以上のORAC活性値が得られるようになる。また、上記ペプチドのうち、Ｃ末端やＮ末端にＹを有するペプチドが理論値の７０％のORAC活性を有する傾向にある。

本発明の抗酸化剤は、乳タンパク質中のアミノ酸配列から見いだされたものであり、乳タンパク質を基質非特異性のペプチダーゼで処理することにより得ることができるものである。従って、このペプチダーゼによる乳タンパク質の酵素消化物を用いることによって、栄養価が高く、しかも抗酸化活性を有する種々の機能性食品が提供される。

もちろん、本発明の抗酸化剤はそのまま摂取することもできるが、通例は、スターチなどの賦形剤やスクロースなどの矯味料、着色料や酸化防止剤などの保存料等を用いて、錠剤や顆粒剤、カプセルなど医薬品類似の形態をしたいわゆる健康食品と称される人工的に作られた組成物として提供されうる。また、チーズやヨーグルト、発酵乳、牛乳、アイスクリームなどの乳製品その他の食品中に添加して用いることもできる。

次に本発明について以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
〔ORAC活性の測定〕
ORAC活性の測定は、Albert Davalosらの方法（Davalos, A. et al. J. Agric. Food Chem., 48-54 (2004)）に準じて行われた。

（試薬の調製）
１）Trolox標準溶液
Trolox(6-hyrodxy-2,5,7,8-tetoramethyl-chroman-2-carboxilic acid, CALBIOCHEM社製)５０mgを、１０mLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に溶解して２０mmol/Lとした。使用時にこの液１００μLを７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）で２０倍希釈して１mmol/L溶液とし、さらにこの溶液５０μLを９５０μLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）で２０倍希釈し、最終的に５０μmol/Lとした。

２）活性酸素溶液
活性酸素試薬AAPH（2,2'-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride, 和光純薬社製）１０８mgを、１０mLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に溶解して４０mmol/Lとした（用時調製）。

３）蛍光試薬
蛍光試薬（Sodium Fluorescein, 和光純薬社製）２２ｍｇを、５０mLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に溶解して１.１７mmol/Lとした。使用時に、この溶液０.１mLを９.９mLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）で１００倍希釈して１１.７μmol/Lとし、さらにこの溶液０.１mLを９.９mLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）で１００倍希釈して、最終濃度１１７nmol/Lとした。

（ペプチドの合成）
ORAC活性の高いアミノ酸を含む配列として、表２に示すペプチドが合成された。合成は（株）ベックス社によって行われた。合成ペプチドの純度は、配列番号２８のペプチドが９３.１％、配列番号９のペプチドが９５.０％であった他、その他のペプチドは純度がほぼ１００％であった。

（試料溶液の調製）
各ペプチド及び各アミノ酸並びにＢＨＡをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して、最終濃度を５mmol/Lとした。この溶液５０μLを、４５０μLの７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）で１０倍希釈し、５００μmol/Lとした。その後、この溶液１０μLを７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）でさらに５０倍希釈して、最終濃度１０μmol/Lの試料溶液を調製した。なお、Cysteineについては、還元型のCysteine(Cys)及び酸化型のCystine（Cys-Cys）の両者について測定を行った。

（ORAC活性の測定）
ORAC活性の測定は、Perkin-Elmaer社製のARVOsx 1420 Multi Label Counter が用いられた。Labsystem社製 White Combiplate 8の各wellに、蛍光試液を１２０μLを分注し、Troloxの標準溶液又は試料溶液を、各wellに２０μLずつを添加した。また、バックグランドには、７５mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を２０μLを添加した。

このプレートを測定機器にセットして１５分間のプレインキュベーションを行った後、機器に設定されたプログラムに従って測定が行われた。
〔設定条件〕
活性酸素溶液の分注料：６０μL
測定温度：３７℃
反復測定回数：４０回
測定間インターバル：１分
プレート撹拌時間：５秒 Fast
Excitation波長：４８５ｎｍ
Emission波長：５３５ｎｍ

アミノ酸の測定結果が図１及び表１に、ペプチドの測定結果が図２及び表２、表３に示された。図中及び表中のORAC活性は、μmol Trolox/μmol Amino Acid or Peptideを意味している。なお、表３はORAC活性値が大きい順にペプチドを並べたものであって、表３には公知であるペプチドも含まれる。また、表３中、配列番号に網掛けされたペプチドは、非特許文献５，６に例示されたペプチド（参考例）であり、アミノ酸配列中の網掛けは、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｃ、Ｈで示されるアミノ酸を示している。標準的な抗酸化性物質であるＢＨＡ（butylated hydroxyanisole）のORAC活性は、２.２０７μmol Trolox/μmol BHA（S.D.＝±０.１４２）であった。また、表３に示されるORAC理論値は、配列番号１〜３０のアミノ酸配列を有するペプチドでは、本願発明者等が実施したアミノ酸のORAC値を元にして算出されたものであり、配列番号３１〜４０のアミノ酸配列を有するペプチドでは、非特許文献５に示されたアミノ酸のORAC値を元にして算出されたものである。

抗酸化物質として代表的なものであるＢＨＡの抗酸化力（ORAC活性値）は、非特許文献５の記載によると２.４３（μmol Trolox/μmol BHA）であるのに対し、本願発明者の実施によると２.２０７（μmol Trolox/μmol BHA）でありほぼ同等の結果が得られた。表３から理解されるように、配列番号１〜２８に示されたペプチドは、非特許文献５に記載されたＢＨＡのORAC活性値や本願発明者の実施によるＢＨＡのORAC活性値のいずれよりも強い抗酸化力が認められた。また、配列番号１〜２８に示された本発明のペプチドの抗酸化活性（ORAC活性値）は、各アミノ酸のORAC活性値の総和（ORAC理論値）の少なくとも６０％以上の活性が認められた。一方、比較例と言える配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＢＨＡよりも抗酸化活性が劣るものであって、ORAC理論値の５０％程度の活性しかなかった。さらに、比較例と言える配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ORAC理論値に比べると非常に高い活性を有するものであったが、ＢＨＡに比べてほとんど抗酸化活性がないと判断されるものであった。

本発明によれば、安全性かつ有効性の高い抗酸化剤が提供される。本発明の抗酸化剤は、乳タンパク質のアミノ酸配列中に存在するので、栄養価が高くなおかつ新たな効能を有する乳製品の提供が期待される。

アミノ酸のORAC活性を示す図である。ペプチドのORAC活性を示す図である。

Claims

配列番号０１、０３、０５〜１２、１４、１７〜２２、２４〜２６、２８の何れかの配列番号で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗酸化剤。