JP5726287B2 - 二重特異性抗体 - Google Patents

Description

本発明は、二重特異性抗体、その産生法、前記抗体を含有する医薬組成物、およびその使用に関する。

ごく近年、非常に多様な多重特異性組換え抗体形式が開発されてきており、例えば、ＩｇＧ抗体形式および一本鎖ドメインの融合による、例えば四価二重特異性抗体がある（例えばＣｏｌｏｍａ， Ｍ．Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５（１９９７）１５９−１６３； ＷＯ ２００１／０７７３４２；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（２００７）１２３３−１２３４を参照されたい）。

抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの他の新規形式、例えばディアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、ミニボディ、２またはそれより多い抗原に結合可能ないくつかの一本鎖形式（ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ）もまた開発されてきている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（２００５）１１２６−１１３６； Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｎ．， Ｌｅｇｅｒ Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４； Ｓｈｅｎ， Ｊ．ら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５−７４； Ｗｕ， Ｃ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（２００７）１２９０−１２９７）。

こうした形式はすべて、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）をさらなる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合させるか、あるいは例えば２つのＦａｂ断片またはｓｃＦｖを融合させるかいずれかのために、リンカーを用いる（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．， Ｌｅｇｅｒ Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４）。天然存在抗体との高い度合いの類似性を維持することによって、Ｆｃ受容体結合を通じて仲介されるエフェクター機能、例えば補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を保持することが望ましい可能性もあることを念頭に置く必要がある。

ＷＯ ２００７／０２４７１５において、操作された多価および多重特異性結合タンパク質としてデュアル可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性である抗体二量体の調製プロセスが、ＵＳ ６，８９７，０４４に報告されている。ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている少なくとも４つの可変ドメインを有する多価Ｆｖ抗体構築物が、ＵＳ ７，１２９，３３０に報告されている。二量体および多量体抗原結合構造は、ＵＳ ２００５／００７９１７０に報告されている。連結構造によって、互いに共有結合している３または４のＦａｂ断片を含む三価または四価単一特異性抗原結合タンパク質であって、天然免疫グロブリンでない前記タンパク質が、ＵＳ ６，５１１，６６３に報告されている。ＷＯ ２００６／０２０２５８において、原核および真核細胞において効率的に発現可能であり、そして療法および診断法において有用である、四価二重特異性抗体が報告されている。２つのタイプのポリペプチド二量体を含む混合物から、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド連結を通じて連結されている二量体を、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド連結を通じては連結されていない二量体から分離するか、または前者を後者より優先的に合成する方法が、ＵＳ ２００５／０１６３７８２に報告されている。二重特異性四価受容体がＵＳ ５，９５９，０８３に報告されている。３またはそれより多い機能性抗原結合部位を持つ操作された抗体が、ＷＯ ２００１／０７７３４２に報告されている。

多重特異性および多価抗原結合ポリペプチドがＷＯ １９９７／００１５８０に報告されている。ＷＯ １９９２／００４０５３は、典型的には同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から調製される、合成架橋によって共有結合されたホモコンジュゲートを報告する。抗原に対する高いアビディティを持つオリゴマー性モノクローナル抗体がＷＯ １９９１／０６３０５に報告されており、ここで典型的にはＩｇＧクラスであるオリゴマーは、２またはそれより多い免疫グロブリン単量体がともに会合して四価または六価ＩｇＧ分子を形成して分泌されている。ヒツジ由来抗体および操作された抗体構築物が、ＵＳ ６，３５０，８６０に報告されており、これは、インターフェロン・ガンマ活性が病原性である疾患を治療するのに使用可能である。ＵＳ ２００５／０１００５４３において、二重特異性抗体の多価キャリアーである、すなわち、ターゲティング可能構築物の各分子が、２またはそれより多い二重特異性抗体のキャリアーとして働きうる、ターゲティング可能構築物が報告されている。

遺伝子操作された二重特異性四価抗体が、ＷＯ １９９５／００９９１７に報告されている。ＷＯ ２００７／１０９２５４において、安定化されたｓｃＦｖからなるかまたは該分子を含む安定化された結合分子が報告されている。

ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体が、Ｌｕ， Ｄ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３１８（２００４）５０７−５１３； Ｌｕ， Ｄ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９（２００４）２８５６−２８６５；およびＬｕ， Ｄ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２００５）１９６６５−７２から知られる。

ＵＳ ２００７／０２７４９８５は、少なくとも２つの一本鎖抗体分子が会合しているヘテロマー抗体を含めて、会合して二量体になっていてもまたよい一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）タンパク質を含む合成抗体分子に関する。

ＷＯ ２００９／０８０２５３は、二重特異性二価抗体に関する。

ＷＯ ２００１／０７７３４２ ＷＯ ２００７／０２４７１５ ＵＳ ６，８９７，０４４ ＵＳ ７，１２９，３３０ ＵＳ ２００５／００７９１７０ ＵＳ ６，５１１，６６３ ＷＯ ２００６／０２０２５８ ＵＳ ２００５／０１６３７８２ ＵＳ ５，９５９，０８３ ＷＯ ２００１／０７７３４２ ＷＯ １９９７／００１５８０ ＷＯ １９９２／００４０５３ ＷＯ １９９１／０６３０５ ＵＳ ６，３５０，８６０ ＵＳ ２００５／０１００５４３ ＷＯ １９９５／００９９１７ ＷＯ ２００７／１０９２５４ ＵＳ ２００７／０２７４９８５ ＷＯ ２００９／０８０２５３

Ｃｏｌｏｍａ， Ｍ．Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５（１９９７）１５９−１６３ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（２００７）１２３３−１２３４ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（２００５）１１２６−１１３６ Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｎ．， Ｌｅｇｅｒ Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４ Ｓｈｅｎ， Ｊ．ら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５−７４ Ｗｕ， Ｃ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（２００７）１２９０−１２９７ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．， Ｌｅｇｅｒ Ｏ．， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４ Ｌｕ， Ｄ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３１８（２００４）５０７−５１３ Ｌｕ， Ｄ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９（２００４）２８５６−２８６５ Ｌｕ， Ｄ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２００５）１９６６５−７２

しかし、多重特異性抗体の異なる問題および側面（例えば薬物動態学的および生物学的特性、安定性、凝集、発現収量、副産物など）を考慮すると、さらなる代替多重特異性抗体形式が必要である。

１つの側面において、本発明は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖；
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖
を含む、二重特異性抗体に関する。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインおよびｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインが、互いに該界面は抗体ＣＨ３ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い、
ここでｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を生じる
そして
ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のＣＨ３ドメインの界面内の腔を生じる
ことでさらに特徴付けられる。

別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
どちらのＣＨ３ドメインも、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位のアミノ酸として、システイン（Ｃ）が導入されることによってさらに改変されている
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ｂ）以下の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、以下の位の間：
ｉ）重鎖可変ドメイン４４位から軽鎖可変ドメイン１００位、
ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位から軽鎖可変ドメイン４３位、または
ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位から軽鎖可変ドメイン１００位
にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結されている重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、ＩｇＧ１の定常領域を含むことで特徴付けられる。
本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が６５％またはそれ未満であることで特徴付けられる。

本発明のさらにさらなる側面は、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物、癌治療のための前記組成物、癌治療のための薬剤製造のための前記二重特異性抗体の使用、癌治療が必要な患者に前記二重特異性抗体を投与することによって、癌に罹患した患者を治療する方法である。

本発明のさらなる側面は、本発明記載の二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子である。
本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において、前記核酸を発現可能な本発明記載の前記核酸を含有する発現ベクター、および本発明記載の二重特異性抗体を組換え的に産生するためのこうしたベクターを含有する宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、本発明記載のベクターを含む、原核または真核宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において、本発明記載の核酸を発現し、そして前記細胞または細胞培養上清から、前記二重特異性抗体を回収することによって特徴付けられる、本発明記載の二重特異性抗体の産生法を含む。本発明はさらに、二重特異性抗体の産生のためのこうした方法によって得られる抗体を含む。

本発明の別の側面は、
ａ）
ａａ）第一の抗原に特異的に結合する第一の全長抗体の重鎖および軽鎖；ならびに
ａｂ）第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に連結している、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖
をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し；そして
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、宿主細胞を培養し；そして
ｃ）前記培養から前記抗体分子を回収する
工程を含む、本発明記載の二重特異性抗体を調製するための方法である。

本発明記載の二重特異性抗体が、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞など）における優れた発現収量、安定性、生物学的または薬理学的活性、薬物動態学的特性などの価値ある特性を有することが、現在、見出されてきている。これらを例えば、癌などの疾患の治療に用いてもよい。３つのポリペプチド鎖を含む、本発明記載のこれらの二重特異性抗体は、特に、哺乳動物細胞における発現中、価値ある副産物プロファイルを有する。

典型的な順序で、可変および定常ドメインを含む、２つの重鎖および軽鎖対を伴い、第一の抗原１に特異的に結合する、ＣＨ４ドメインを含まない全長抗体の模式的構造。 本発明記載の二重特異性抗体の模式的構造。 ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）修飾されたＣＨ３ドメインを含む、本発明記載の二重特異性抗体の模式的構造。 ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）修飾されたＣＨ３ドメインを含む、本発明記載の二重特異性抗体の模式的構造。 ノブを穴へ修飾されたＣＨ３ドメイン、ならびに第二の抗体の重鎖および軽鎖のＶＨおよびＶＬドメインのジスルフィド安定化を含む、本発明記載の二重特異性抗体の模式的構造。 ノブを穴へ修飾されたＣＨ３ドメイン、ならびに第二の抗体の重鎖および軽鎖のＶＨおよびＶＬドメインのジスルフィド安定化を含む、本発明記載の二重特異性抗体の模式的構造。 本発明記載の二重特異性抗体Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６による、ＨＵＶＥＣ増殖の阻害。 本発明記載の二重特異性抗体Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６による、Ｔｉｅ２リン酸化の阻害 ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１のウェスタンブロット（還元）。 ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８のウェスタンブロット（還元）。 親単一特異性抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８または＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と比較した、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴによるＨ３２２Ｍ癌細胞の増殖阻害（用量依存性）。 Ｂｉａｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）−Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ：二重特異性抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、アミン共役型ヒトＥＧＦＲおよびヒトＩＧＦ１Ｒの同時結合を示した（ｘ軸：反応、ｙ軸：時間）。 親単一特異性抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８および＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の組み合わせと比較した、ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴによる、ＢｘＰＣ３異種移植片モデルにおける腫瘍増殖阻害。

１つの側面において、本発明は、
ａ）第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖；
ｂ）第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖
を含む、二重特異性抗体に関する。

用語「全長抗体」は、２つの「全長抗体重鎖」および２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を示す（図１を参照されたい）。「全長抗体重鎖」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略され；そして場合によって、サブクラスＩｇＥの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）が含まれる。好ましくは「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であってもよい。２つの全長抗体鎖は、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメイン間ならびに全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を通じてともに連結される。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの天然抗体である。本発明記載の全長抗体は、単一種、例えばヒト由来であってもよいし、あるいはこれらはキメラ化またはヒト化抗体であってもよい。本発明記載の全長抗体は、どちらも同じ抗原に特異的に結合する、各々、ＶＨおよびＶＬの対によって形成される２つの抗原結合部位を含む。前記全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、前記重鎖または軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。前記全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は、前記重鎖または軽鎖のＮ末端の最後のアミノ酸を示す。

用語「ペプチドリンカー」は、本発明内で用いた際、好ましくは合成起源であるアミノ酸配列を含むペプチドを示す。本発明記載のこれらのペプチドを用いて、第二の全長抗体（第二の抗原に特異的に結合する）の軽鎖Ｃ末端を重鎖Ｎ末端に連結する。第二の全長抗体重鎖および軽鎖内のペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸の長さ、好ましくは３２〜５０アミノ酸の長さのペプチドである。１つの態様において、ペプチドリンカーは、３２〜４０アミノ酸の長さのアミノ酸配列のペプチドである。１つの態様において、前記リンカーは（ＧｘＳ）ｎ、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８，９または１０およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４およびｎ＝６、７または８およびｍ＝０、１、２または３）であり、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６または７およびｍ＝０、１、２または３であり、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７およびｍ＝２である。１つの態様において、前記リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_６Ｇ_２である。好ましくは、本発明記載の二重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１９９６）６１７−６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ， Ａ．Ｍ．ら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（１９９８）６７７−６８１において、いくつかの例を用いて詳述される、「ノブを穴に」技術によって改変されてもよい。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が改変されて、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化が増加する。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々が「ノブ」である一方、他方は「穴」である。ジスルフィド架橋の導入によって、ヘテロ二量体が安定化され（Ｍｅｒｃｈａｎｔ， Ａ．Ｍら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７−６８１； Ａｔｗｅｌｌ， Ｓ．ら Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０（１９９７）２６−３５）、そして収量が増加する。

本発明の１つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、互いに抗体ＣＨ３ドメイン間の元来の界面を含む界面で向き合う、
ことでさらに特徴付けられ；
前記界面は、二重特異性抗体の形成を促進するよう改変されており、ここで該改変は：
ａ）二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元来の界面と出会う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元来の界面内で、
アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を生じる
ように一方の重鎖のＣＨ３ドメインが改変され、
そして
ｂ）二重特異性抗体内の第一のＣＨ３ドメインの元来の界面と出会う、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン内で、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のＣＨ３ドメインの界面内の腔を生じる
ことで特徴付けられる。

したがって、本発明記載の抗体は、好ましくは
ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインおよびｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインが、互いに抗体ＣＨ３ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い；
ここでｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を生じる
そしてここで
ｉｉ）他方の重鎖ＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のＣＨ３ドメインの界面内の腔を生じる
ことで特徴付けられる。

好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
本発明の１つの側面において、どちらのＣＨ３ドメインも、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位のアミノ酸として、システイン（Ｃ）が導入されることによってさらに改変されている。

１つの態様において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中にＴ３６６Ｗ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメイン中にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。例えば「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＹ３４９Ｃ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメイン内にＥ３５６Ｃ突然変異またはＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋もまた用いてもよい（Ｍｅｒｃｈａｎｔ， Ａ．Ｍら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７−６８１）。

別の態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方に、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方に、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。別の好ましい態様において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方に、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方に、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメイン中のさらなるＹ３４９Ｃ突然変異、ならびに他方のＣＨ３ドメイン中のさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ突然変異は鎖間ジスルフィド結合を形成する）（番号付けは常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）。しかしまた、ＥＰ １８７０４５９Ａ１に記載されるような他のノブを穴に技術を別にまたはさらに用いてもよい。したがって、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、および「穴鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（番号付けは常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）。

別の態様において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ突然変異、および「穴鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含み、そしてさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、ならびに「穴鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。

別の態様において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＤ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、あるいは前記三価、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方においてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＤ３ドメインの他方においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を、そしてさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。

１つの態様において、第二の全長抗体（第二の抗原に特異的に結合する）の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位の間：
ｉ）重鎖可変ドメイン４４位から軽鎖可変ドメイン１００位、
ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位から軽鎖可変ドメイン４３位、または
ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位から軽鎖可変ドメイン１００位（番号付けは常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）
にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている。

１つの態様において、第二の全長抗体（第二の抗原に特異的に結合する）の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位の間：重鎖可変ドメイン４４位から軽鎖可変ドメイン１００位にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている。

こうしたさらなるジスルフィド安定化は、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬの間にジスルフィド結合を導入することによって達成される。一本鎖Ｆｖに関する安定化のため、非天然ジスルフィド架橋を導入する技術が、例えばＷＯ ９４／０２９３５０、Ｒａｊａｇｏｐａｌ， Ｖ．ら， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎ． １０（１９９７）１４５３−５９； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｈ．ら， Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２５，（１９９８）３８７−３９３；またはＳｃｈｍｉｄｔ， Ｍ．ら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９）１８， １７１１−１７２１に記載されている。１つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメイン間の場合によるジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン４４位および軽鎖可変ドメイン１００位の間である。１つの態様において、可変ドメイン間の場合によるジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン１０５位および軽鎖可変ドメイン４３位の間である（番号付けは常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）。

１つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬ間の前記の場合によるジスルフィド安定化を伴う、本発明記載の二重特異性抗体が好ましい。

１つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬ間の前記の場合によるジスルフィド安定化を伴わない、本発明記載の二重特異性抗体が好ましい。

本発明記載の二重特異性抗体の両方の部分は、抗原結合部位を含む（第一の全長抗体重鎖および軽鎖が１つの抗原結合部位を含み、そして第二の全長抗体重鎖および軽鎖が１つの抗原結合部位を含む）。用語「結合部位」または「抗原結合部位」は、本明細書において、それぞれの抗原が実際に結合する、本発明記載の前記二重特異性抗体の領域（単数または複数）を示す。第一の全長抗体重鎖および軽鎖ならびに第二の全長抗体重鎖および軽鎖のいずれかの抗原結合部位は、各々、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる対によって形成される。

所望の抗原（例えばＥＧＦＲ）に結合する抗原結合部位は、ａ）抗原に対する既知の抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体）から、あるいはｂ）とりわけ抗原タンパク質もしくは核酸またはその断片のいずれかを用いた新規免疫法によって、あるいはファージディスプレイによって得られる新規抗体または抗体断片から、得られてもよい。

本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位のアフィニティに多様な度合いで貢献する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。配列間の可変性にしたがって領域が定義されているアミノ酸配列の蓄積データベースへの比較によって、ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の度合いを決定する。

抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異性である。用語「二重特異性」抗体は、本明細書において、２またはそれより多い抗原結合部位を有し、そして２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本発明記載の「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。１つの態様において、本発明の抗体は、２つの異なる抗原に対して二重特異性であり、すなわち第一の抗原としてＶＥＧＦそして第二の抗原としてＡＮＧ−２であるか、または例えば第一の抗原としてＥＧＦＲそして第二の抗原としてＩＧＦ−１Ｒであるか、あるいはその逆である。

用語「単一特異性」抗体は、本明細書において、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１またはそれより多い結合部位を有する抗体を指す。
用語「価」は、本出願において、抗体分子における明記された数の結合部位の存在を示す。こうしたものとして、用語「三価」、「四価」、「五価」および「六価」は、抗体分子における、それぞれ、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、および６つの結合部位を示す。例えば天然抗体または本発明記載の二重特異性抗体は、２つの結合部位を持ち、そして二価である。

用語「ＥＧＦＲ」は、本明細書において、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ−１またはＥｒｂ−Ｂ１としてもまた知られる、配列番号１３）を指し、ｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａ膜貫通受容体であり、そして生得的なチロシンキナーゼ活性を示す（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ， Ｈ．ら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３（１９９６）２２８−２３５； Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒ．Ｓ．およびＳｈｉｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３−１６１１）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３はＥＧＦＲの配列を提供する。ＥＧＦＲのアイソフォームおよび変異体（例えば選択的ＲＮＡ転写物、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型、多型等）もまたあり、これには、限定されるわけではないが、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、およびＰ００５３３−４に同定されるものが含まれる。ＥＧＦＲは、α）上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧｆ−アンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレギュリン（Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒ．Ｓ．およびＳｈｉｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３−１６１１； Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｊ．およびＢａｓｅｌｇａ， Ｊ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（２０００）６５５０−６５６５）を含むリガンドに結合することが知られる。ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ仲介性シグナル伝達経路によって多くの細胞プロセスを制御し、こうしたプロセスには、限定されるわけではないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管形成、有糸分裂誘発、および転移を調節するシグナル伝達経路の活性化が含まれる（Ａｔａｌａｙ， Ｇ．ら， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４（２００３）１３４６−１３６３； Ｔｓａｏ， Ａ．Ｓ．およびＨｅｒｂｓｔ， Ｒ．Ｓ．， Ｓｉｇｎａｌ ４（２００３）４−９； Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒ．Ｓ．およびＳｈｉｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３−１６１１； Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ， Ｈ．ら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３（１９９６）２２８−２３５）。

用語「ＩＧＦ−１Ｒ」は、本明細書において、ヒト・インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＤ ２２１抗原；配列番号１４）を指し、膜貫通プロテインチロシンキナーゼのファミリーに属する（ＬｅＲｏｉｔｈ， Ｄ．ら， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｒｅｖ． １６（１９９５）１４３−１６３；およびＡｄａｍｓ， Ｔ．Ｅ．ら， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５７（２０００）１０５０−１０６３）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８０６９はＩＧＦ−１Ｒの配列を提供する。ＩＧＦ−ＩＲは、高アフィニティでＩＧＦ−Ｉに結合し、そしてｉｎ ｖｉｖｏで、このリガンドに対する生理学的反応を開始する。ＩＧＦ−ＩＲはまた、わずかにより低いアフィニティであるが、ＩＧＦ−ＩＩにも結合する。ＩＧＦ−ＩＲ過剰発現は細胞の新生物性形質転換を促進し、そしてＩＧＦ−ＩＲが細胞の悪性形質転換に関与し、そしてしたがって、癌治療のための療法剤開発に有用なターゲットである証拠が存在する（Ａｄａｍｓ， Ｔ．Ｅ．ら， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５７（２０００）１０５０−１０６３）。

本発明の好ましい側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、ヒトＩＧＦ−１ＲならびにヒトＥＧＦＲに特異的に結合する（すなわち、本発明記載の二重特異性抗体は、二重特異性抗ＩＧＦ−ｌＲ／抗ＥＧＦＲ抗体である）。二重特異性抗体は、ヒト＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７； ＷＯ ２００５／００５６３５、＜ＩＧＦ−ｌＲ＞クローンｌ８または＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ ＡＫ１８と略される）およびヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（ＷＯ ２００６／０８２５１５ ＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と略される）である。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３（ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１に関する）；配列番号５、配列番号６、配列番号７（ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８に関する）；配列番号１、配列番号２、配列番号４（ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１＿ＷＴに関する）、および配列番号５、配列番号６、配列番号８（ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴに関する）に提供される。

本発明記載の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体は、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒターゲティング療法が必要なヒト患者に対する利益を示す。本発明記載の抗体は、こうした疾患に罹患した、特に癌に罹患した患者に対する利益を引き起こす、非常に価値ある特性を有する。本発明記載の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体は、例えば、単一特異性親＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体と比較して、ＩＧＦ−１Ｒ受容体の内在化の減少を示す。さらに、これらは、抗原ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ両方を発現している腫瘍細胞の優れたターゲティングを示し、これは抗原ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ両方を発現している癌に罹患した患者に対する、有効性／毒性比に関する利益に相当する。

したがって、本発明の１つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体であり、そして配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体である。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体であり、そして配列番号１、配列番号２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号１、配列番号２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体である。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体であり、そして配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体である。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体であり、そして配列番号５、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号５、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体である。

本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体であり、そして
ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むか
ｂ）配列番号１、配列番号２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むか
ｃ）配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または
ｄ）配列番号５、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列を含む
ことで特徴付けられる。

本発明の１つの態様において、前記二重特異性抗体抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、以下の特性（実施例４および５に記載するようなアッセイにおいて決定される）の１またはそれより多くを有することで特徴付けられる：
−抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）と比較して、５０％またはそれより多く、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を減少させる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号７のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号７の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少している
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号８のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号８の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少している
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲ３Ｈにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号７のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号７の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少している
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲ３Ｈにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号８のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号８の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少している
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号７のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号７の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少しており；
そして以下の特性（実施例４および５に記載するようなアッセイにおいて決定される）
−抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）と比較して、５０％またはそれより多く、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を減少させる
の１またはそれより多くを有することで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号８のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号８の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少しており；
そして以下の特性（実施例４および５に記載するようなアッセイにおいて決定される）
−抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）と比較して、５０％またはそれより多く、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を減少させる
の１またはそれより多くを有することで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲ３Ｈにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号７のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号７の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少しており；
そして以下の特性（実施例４および５に記載するようなアッセイにおいて決定される）
−抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）と比較して、５０％またはそれより多く、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を減少させる
の１またはそれより多くを有することで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は
ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、ＣＤＲ３Ｈにおける１アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号８のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのＫＤ値が、配列番号８の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少しており；
そして以下の特性（実施例４および５に記載するようなアッセイにおいて決定される）
−抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、５ｎＭまたはそれ未満（好ましくは２ｎＭまたはそれ未満）のＩＣ５０で、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する；
−二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ／抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）と比較して、５０％またはそれより多く、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を減少させる
の１またはそれより多くを有することで特徴付けられる。

結合アフィニティのＫＤ値が、非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのＫＤ値と比較した際、等しいかまたは４倍未満減少している配列番号７または配列番号８のＣＤＲ３Ｈのアミノ酸残基置換の例は、例えばＥＰ１０１６６８６０．６に記載される。

用語「ＶＥＧＦ」は、本明細書において、例えばＬｅｕｎｇ， Ｄ．Ｗ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（１９８９）１３０６−９； Ｋｅｃｋ， Ｐ．Ｊ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（１９８９）１３０９−１２およびＣｏｎｎｏｌｌｙ， Ｄ．Ｔ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４（１９８９）２００１７−２４に記載される、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ａ）（配列番号１５）を指す。ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内障害に関連する、正常および異常血管形成および血管新生の制御に関与する（Ｆｅｒｒａｒａ， Ｎ．ら， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １８（１９９７）４−２５； Ｂｅｒｋｍａｎ， Ｒ．Ａ．ら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１（１９９３）１５３−１５９； Ｂｒｏｗｎ， Ｌ．Ｆ．ら， Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ． ２６（１９９５）８６−９１； Ｂｒｏｗｎ， Ｌ．Ｆ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３（１９９３）４７２７−４７３５； Ｍａｔｔｅｒｎ， Ｊ．ら， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ７３（１９９６）９３１−９３４；およびＤｖｏｒａｋ， Ｈ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４６（１９９５）１０２９−１０３９）。ＶＥＧＦは、いくつかの供給源から単離されているホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対して非常に特異的な有糸分裂誘発活性を示す。

用語「ＡＮＧ−２」は、本明細書において、ヒト・アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）（あるいはＡＮＧＰＴ２またはＡＮＧ２と略される）（配列番号１６）と称され、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（１９９７）５５−６０およびＣｈｅｕｎｇ， Ａ．Ｈ．ら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４８（１９９８）３８９−９１に記載される。アンジオポエチン−１および−２ならびにＡＮＧ−２は、血管内皮内で選択的に発現されるチロシンキナーゼファミリーであるＴｉｅに対するリガンドとして発見された。Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．Ｄ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７（２０００）２４２−４８。現在、アンジオポエチン・ファミリーの４つの確定メンバーがある。アンジオポエチン−３および−４（Ａｎｇ−３およびＡｎｇ−４）は、マウスおよびヒトにおいて、同じ遺伝子座の広く分岐した対応物に相当しうる。Ｋｉｍ， Ｉ．ら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ， ４４３（１９９９）３５３−５６； Ｋｉｍ， Ｉ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１９９９）２６５２３−２８。ＡＮＧ−１およびＡＮＧ−２は、元来、それぞれ、アゴニストおよびアンタゴニストとして、組織培養実験中で同定された（ＡＮＧ−１に関しては： Ｄａｖｉｓ， Ｓ．ら， Ｃｅｌｌ ８７（１９９６）１１６１−６９を；そしてＡＮＧ−２に関しては： Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（１９９７）５５−６０を参照されたい）。既知のアンジオポエチンはすべて、主にＴｉｅ２に結合し、そしてＡｎｇ−１および−２はどちらも３ｎＭ（Ｋｄ）のアフィニティでＴｉｅ２に結合する。Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（１９９７）５５−６０。

好ましい態様において、本発明記載の前記二重特異性抗体は、ヒトＶＥＧＦならびにヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する（すなわち本発明記載の二重特異性抗体は、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ−２抗体である）。二重特異性抗体は、好ましくは抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブおよびＡＮＧ２ｉ−ＬＣ０６（ＷＯ２０１０／０４０５０８（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２）に記載され、そしてファージディスプレイを通じて得られた）に基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１（Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳに関する）に、そして配列番号９、配列番号１０、配列番号１２（Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６に関する）に提供される。

したがって、本発明の１つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、そして配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＡＮＧ−２に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号１１のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、
ａ）第一の全長抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、そして配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
ｂ）第二の全長抗体が、ＡＮＧ−２に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号１２のアミノ酸配列を有する
ことで特徴付けられる。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ−２抗体であり、そして配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。

したがって、本発明の１つの態様において、二重特異性抗体は抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ−２抗体であり、そして配列番号９、配列番号１０、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。

本発明の全長抗体は、１またはそれより多い免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥアイソタイプ、ならびにＩｇＧおよびＩｇＡの場合、そのサブタイプが含まれる。好ましい態様において、本発明の全長抗体は、ＩｇＧタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。

用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製を指す。
用語「キメラ抗体」は、１つの供給源または種由来の可変領域、すなわち結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも部分を含み、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される抗体を指す。ネズミ可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれる「キメラ抗体」の他の好ましい型は、定常領域が元来の抗体のものから修飾されているか、または変化しており、本発明記載の特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する特性を生じているものである。こうしたキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、慣用的な組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を伴い、これらの技術は当該技術分野に周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５； ＵＳ ５，２０２，２３８およびＵＳ ５，２０４，２４４を参照されたい。

用語「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較した際、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むよう修飾されてきているものを指す。好ましい態様において、ネズミＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」が調製されてきている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８−２７０を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上に示される抗原を認識する配列に相当するものに対応する。本発明に含まれる「ヒト化抗体」の他の型は、定常領域が元来の抗体のものからさらに修飾されているか、または変化しており、本発明記載の特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する特性を生じているものである。

用語「ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むよう意図される。ヒト抗体は、当該技術分野において周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｍ．Ａ．およびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｊ．Ｇ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ５（２００１）３６８−３７４）。ヒト抗体はまた、免疫に際して、内因性免疫グロブリン産生を伴わずに、ヒト抗体の全レパートリーまたは選択を産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）においても産生可能である。こうした生殖系列突然変異体マウスにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをトランスファーすると、抗原曝露に際してヒト抗体の産生が生じるであろう（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１−２５５５； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５−２５８； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．ら， Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７（１９９３）３３−４０）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ， Ｇ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７（１９９２）３８１−３８８； Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２（１９９１）５８１−５９７を参照されたい）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒト・モノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である（Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ．７７（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ， Ｐ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（１９９１）８６−９５）。本発明記載のキメラおよびヒト化抗体に関してすでに言及したように、用語「ヒト抗体」は、本明細書において、また、例えば「クラススイッチング」によって、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異によって（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域が修飾されて、本発明記載の特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関する特性を生じている抗体も含む。

用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離されるすべてのヒト抗体、例えばＮＳ０またはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から単離された、あるいは宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現されたヒト免疫グロブリン遺伝子または抗体に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体を含むよう意図される。こうした組換えヒト抗体は、再編成された形の可変および定常領域を有する。本発明記載の組換えヒト抗体はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞超変異に供されてきている。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、そしてこれらに関連する一方、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない可能性もある。

「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、本明細書において、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖および重鎖対各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖は同じ一般構造を有し、そして各ドメインは、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結された、その配列が広く保存された４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート・コンホメーションを採用し、そしてＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってその三次元構造に保持され、そして他方の鎖由来のＣＤＲと一緒に、抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明記載の抗体の結合特異性／アフィニティにおいて特に重要な役割を果たし、そしてしたがって本発明のさらなる目的を提供する。

用語「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」は、本明細書において、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書に定義するような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、こうしたフレームワークアミノ酸によって分離される。特に、重鎖ＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）の標準的定義にしたがって決定される。

本明細書において、用語「に結合する」または「に特異的に結合するもの」または「に特異的に結合する」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ スウェーデン・ウプサラ）における、抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。結合のアフィニティは、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋ_Ｄ（解離定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_Ｄ／ｋａ）によって定義される。１つの態様において、結合または特異的結合は、１０^−８ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９Ｍ〜１０^−１３ｍｏｌ／ｌの結合アフィニティ（Ｋ_Ｄ）を意味する。したがって、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくは、１０^−８ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９Ｍ〜１０^−１３ｍｏｌ／ｌの結合アフィニティ（Ｋ_Ｄ）で、特異的である各抗原に対して特異的に結合する。

ＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ スウェーデン・ウプサラ）によって調べてもよい。結合のアフィニティは、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、ｋ_Ｄ（解離定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_Ｄ／ｋａ）によって定義される。

用語「エピトープ」には、抗体への特異的結合が可能ないかなるポリペプチド決定因子も含まれる。特定の態様において、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的活性表面基が含まれ、そして該因子は、特定の態様において、特異的三次元構造特性およびまたは特異的電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体が結合する、抗原の領域である。

特定の態様において、抗体が、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物において、ターゲット抗原を優先的に認識する場合、該抗体は、抗原に特異的に結合すると言われる。

用語「定常領域」は、本出願において、可変領域以外の抗体ドメインの合計を示す。定常領域は、抗原の結合には直接関与しないが、多様なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体はクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分けられ、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられうる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。５つの抗体クラスすべてに見出されうる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。

用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本出願において、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域および／または定常軽鎖カッパまたはラムダ領域を示す。こうした定常領域は、当該技術分野において知られ、そして例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．によって記載される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．およびＷｕ， Ｔ．Ｔ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８（２０００）２１４−２１８； Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５−２７８８を参照されたい）。

用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうしたＦｃ部分結合部位は当該技術分野において知られる（上記を参照されたい）。こうしたＦｃ部分結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３は、通常、Ｃ１ｑおよびＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑおよび／またはＣ３に結合しない。

ＩｇＧ４サブクラスの抗体は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合減少を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の喪失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５は、改変された場合、やはりＦｃ受容体結合減少を提供する残基である（Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（２００１）６５９１−６６０４； Ｌｕｎｄ， Ｊ．ら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９（１９９５）１１５−１１９； Ｍｏｒｇａｎ， Ａ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４； ＥＰ ０ ３０７ ４３４）。

１つの態様において、本発明記載の抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、ＦｃＲ結合減少を有し、そして全長親抗体は、ＦｃＲ結合に関して、ＩｇＧ４サブクラスあるいはＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＦｃＲ結合のため、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５に突然変異を伴い、そして／またはＰＶＡ２３６突然変異を含有する。１つの態様において、全長親抗体における突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である。別の態様において、全長親抗体は、ＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ、ならびにＩｇＧ１ Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。

さらなる態様において、本明細書記載の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスであることで特徴付けられる。
用語「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下での本発明記載の抗体によるヒト・ターゲット細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の調製物を、新鮮に単離されたＰＢＭＣなどのエフェクター細胞またはバフィーコート由来の精製エフェクター細胞、例えば単球またはナチュラルキラー細胞、あるいは永続的に増殖しているＮＫ細胞株の存在下、本発明記載の抗体で処理することによって測定される。

用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうしたＦｃ部分結合部位は当該技術分野において知られる（上記を参照されたい）。こうしたＦｃ部分結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３は、通常、Ｃ１ｑおよびＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑおよび／またはＣ３に結合しない。

抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうした定常領域結合部位は、当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｌｕｋａｓ， Ｔ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２７（１９８１）２５５５−２５６０； Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ， Ｒ．およびＣｅｂｒａ， Ｊ． Ｊ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６（１９７９）９０７−９１７； Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ．Ｒ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８−３４４； Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ， Ｊ．Ｅ．ら， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３７（２０００）９９５−１００４； Ｉｄｕｓｏｇｉｅ， Ｅ．Ｅ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４（２０００）４１７８−４１８４； Ｈｅｚａｒｅｈ， Ｍ．ら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５（２００１）１２１６１−１２１６８； Ｍｏｒｇａｎ， Ａ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４；およびＥＰ ０ ３０７ ４３４によって記載される。こうした定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがう）によって特徴付けられる。

１つの態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくはヒト起源由来のＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラス（好ましくはＩｇＧ１サブクラス）の定常領域を含む。１つの態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくはヒト起源由来のＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラス（好ましくはＩｇＧ１サブクラス）のＦｃ部分を含む。

モノクローナル抗体の抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、Ｕｍａｎａ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（１９９９）１７６−１８０、およびＵＳ ６，６０２，６８４に記載されるように、オリゴ糖構成要素を操作することによって増進されうる。最も一般的に用いられる療法抗体であるＩｇＧ１型の抗体は、各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７で保存されたＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に包埋され、ポリペプチド主鎖と伸長された接触を形成し、そしてその存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を仲介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙ， Ｍ．Ｒ．ら， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５）８１３−８２２； Ｊｅｆｆｅｒｉｓ， Ｒ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １６３（１９９８）５９−７６； Ｗｒｉｇｈｔ， Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５（１９９７）２６−３２）。Ｕｍａｎａ， Ｐ．ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（１９９９）１７６−１８０およびＷＯ ９９／１５４３４２は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、二分岐オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）を過剰発現させると、抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性が有意に増加することを示した。Ａｓｎ２９７炭水化物の組成の改変またはその除去はまた、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの結合にも影響を及ぼす（Ｕｍａｎａ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（１９９９）１７６−１８０； Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．ら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７４（２００１）２８８−２９４； Ｍｉｍｕｒａ， Ｙ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（２００１）４５５３９−４５５４７； Ｒａｄａｅｖ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（２００１）１６４７８−１６４８３； Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（２００１）６５９１−６６０４； Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（２００２）２６７３３−２６７４０； Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｌ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３（２００２）１３３−１４７）。

フコースの量を減少させることによって、モノクローナル抗体の細胞仲介性エフェクター機能を増進させる方法が、例えば、ＷＯ ２００５／０１８５７２、ＷＯ ２００６／１１６２６０、ＷＯ ２００６／１１４７００、ＷＯ ２００４／０６５５４０、ＷＯ ２００５／０１１７３５、ＷＯ ２００５／０２７９６６、ＷＯ １９９７／０２８２６７、ＵＳ ２００６／０１３４７０９、ＵＳ ２００５／００５４０４８、ＵＳ ２００５／０１５２８９４、ＷＯ ２００３／０３５８３５、ＷＯ ２０００／０６１７３９、Ｎｉｗａ， Ｒ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６（２００５）１５１−１６０； Ｓｈｉｎｋａｗａ， Ｔ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８（２００３）３４６６−３４７３； ＷＯ ０３／０５５９９３またはＵＳ ２００５／０２４９７２２に記載される。

ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のグリコシル化は、最大２つのＧａｌ残基で終わる、コア・フコシル化二分岐複合体オリゴ糖グリコシル化として、Ａｓｎ２９７で起こる。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．（１９９１）によって、そしてＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６（１９８７）１３５１−１３６１； Ｌｏｖｅ， Ｔ．Ｗ．ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８（１９８９）５１５−５２７によって詳細に報告される。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−またはα−１，３−）、またはＧ２グリカン残基と称される（Ｒａｊｕ， Ｔ．Ｓ．， Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ． １（２００３）４４−５３）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Ｒｏｕｔｉｅｒ， Ｆ．Ｈ．， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． １４（１９９７）２０１−２０７に記載される。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞において組換え的に発現される抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化される。全長親抗体の修飾オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体であってもよい。好ましくは、二分岐、還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。別の態様において、二分岐、還元／非フコシル化オリゴ糖は複合体である。

本発明にしたがって、「フコース量」は、Ａｓｎ２９７での糖鎖内での前記糖の量を意味し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定され、そして平均値として計算される、Ａｓｎ２９７に付着したすべての糖構造（例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計に関連する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（実施例１０を参照されたい）による、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料において同定されるすべての糖構造（例えばそれぞれ、複合体、ハイブリッドならびにオリゴおよび高マンノース構造）に関連するフコース含有構造の割合である。

本発明記載の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体は、親＜ＥＧＦＲ＞および／または＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体と比較して、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ受容体の内在化の減少を示す。したがって、本発明の１つの好ましい態様において、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体は、Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化され（ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラス、好ましくはＩｇＧ１サブクラス）、それによって、前記糖鎖内でのフコースの量は６５％またはそれより少ない（番号付けはＫａｂａｔにしたがう）。別の態様において、前記糖鎖内のフコースの量は、５％〜６５％の間、好ましくは２０％〜４０％の間である。本発明記載の「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域中の２９７位周囲に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の重要でない配列変動に基づいて、Ａｓｎ２９７はまた、２９７位の上流または下流、すなわち２９４位〜３００位の間に位置するいくつかのアミノ酸であってもよい（通常、±３アミノ酸より大きくない）。こうした糖操作抗体はまた、本明細書において、無フコシル化抗体とも呼ばれる。

本発明記載の無フコシル化二重特異性抗体は、Ｆｃ領域において、オリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量のＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された糖修飾宿主細胞において発現可能である。１つの態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは、宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を、ＵＳ ６，９４６，２９２にしたがって減少させるかまたは排除して、糖修飾宿主細胞を生成してもよい。例えば発酵条件（例えば発酵時間）によって、または異なるフコシル化量を持つ少なくとも２つの抗体の組み合わせによってのいずれかで、抗体フコシル化の量をあらかじめ決定してもよい。こうした無フコシル化抗体およびそれぞれの糖操作法は、ＷＯ ２００５／０４４８５９、ＷＯ ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Ｕｍａｎａ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（１９９９）１７６−１８０、ＷＯ ９９／１５４３４２、ＷＯ ２００５／０１８５７２、ＷＯ ２００６／１１６２６０、ＷＯ ２００６／１１４７００、ＷＯ ２００５／０１１７３５、ＷＯ ２００５／０２７９６６、ＷＯ ９７／０２８２６７、ＵＳ ２００６／０１３４７０９、ＵＳ ２００５／００５４０４８、ＵＳ ２００５／０１５２８９４、ＷＯ ２００３／０３５８３５、ＷＯ ２０００／０６１７３９に記載される。これらの糖操作抗体ではＡＤＣＣが増加している。本発明記載の無フコシル化抗体を生じる他の糖操作法は、例えば、Ｎｉｗａ， Ｒ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６（２００５）１５１−１６０； Ｓｈｉｎｋａｗａ， Ｔ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８（２００３）３４６６−３４７３； ＷＯ ０３／０５５９９３またはＵＳ ２００５／０２４９７２２に記載される。

１つの態様は、ＷＯ ２００５／０４４８５９、ＷＯ ２００４／０６５５４０、ＷＯ ２００７／０３１８７５、Ｕｍａｎａ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（１９９９）１７６−１８０、ＷＯ ９９／１５４３４２， ＷＯ ２００５／０１８５７２、ＷＯ ２００６／１１６２６０、ＷＯ ２００６／１１４７００、ＷＯ ２００５／０１１７３５、ＷＯ ２００５／０２７９６６、ＷＯ ９７／０２８２６７、ＵＳ ２００６／０１３４７０９、ＵＳ ２００５／００５４０４８、ＵＳ ２００５／０１５２８９４、ＷＯ ２００３／０３５８３５ ｏｒ ＷＯ ２０００／０６１７３９に記載される方法を用いた、Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化され、それによって前記糖鎖内のフコースの量が６５％またはそれ未満である、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。

１つの態様は、Ｎｉｗａ， Ｒ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６（２００５）１５１−１６０； Ｓｈｉｎｋａｗａ， Ｔ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８（２００３）３４６６−３４７３； ＷＯ ０３／０５５９９３またはＵＳ ２００５／０２４９７２２に記載される方法を用いた、Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化され、それによって前記糖鎖内のフコースの量が６５％またはそれ未満である、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。

本発明記載の抗体は、組換え手段によって産生される。したがって、本発明の１つの側面は、本発明記載の抗体をコードする核酸であり、そしてさらなる側面は、本発明記載の抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換え産生のための方法は、当該技術分野に広く知られ、そして原核および真核細胞におけるタンパク質発現に続く抗体の単離、および通常は薬学的に許容されうる純度までの精製を含む。宿主細胞における前述のような抗体の発現のため、それぞれの修飾軽鎖および重鎖をコードする核酸を、標準法によって発現ベクター内に挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞などの適切な原核または真核宿主細胞において、発現を行い、そして抗体を細胞（上清または溶解後の細胞）から回収する。抗体の組換え産生のための一般的な方法が当該技術分野において周知であり、そして例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．Ｃ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １７（１９９９）１８３−２０２； Ｇｅｉｓｓｅ， Ｓ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ８（１９９６）２７１−２８２； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（２０００）１５１−１６１； Ｗｅｒｎｅｒ， Ｒ．Ｇ．， Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８（１９９８）８７０−８８０の総説に記載される。

本発明記載の二重特異性抗体は、慣用的な免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティ・クロマトグラフィーなどの慣用的な免疫グロブリン精製法によって、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、慣用的な方法を用いて、容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として働きうる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに挿入してもよく、これを次いで、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクションして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得る。

抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって、二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体（または突然変異体）を調製する。こうした修飾は、しかし、非常に制限された範囲でのみ実行可能である。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプおよび抗原結合などの上述の抗体特性を改変しないが、組換え体産生収量、タンパク質安定性を改善するか、または精製を容易にすることは可能である。

用語「宿主細胞」は、本出願において、本発明記載の抗体を生成するように操作可能である任意の種類の細胞系を示す。１つの態様において、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞を宿主細胞として用いる。

本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」は、交換可能に用いられ、そしてすべてのこうした名称には子孫が含まれる。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、初代対象細胞、およびトランスファー数に関わらず、そこから由来する培養物が含まれる。計画的なまたは偶発性の突然変異のため、すべての子孫が、ＤＮＡ内容物において、正確に同一でない可能性もあることもまた理解される。元来の形質転換された細胞において、スクリーニングされるのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別個の呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ．Ｍ．ら， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９−１２３； Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ．Ｍ．ら， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７３（２００１）２６１−２７０に記載される。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ．ら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３０（２００２）Ｅ９に記載される。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３−３８３７； Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５−４２８９；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ， Ｌ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７−８７に記載される。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）が、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ， Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｋ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１−８３に、そしてＳｃｈｌａｅｇｅｒ， Ｅ．−Ｊ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１−１９９に記載される。

原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られる。

核酸は、別の核酸配列と機能する関連で配置された場合、「機能可能であるように連結されて」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているならば、ポリペプチドに関するＤＮＡに機能可能であるように連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能可能であるように連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に「機能可能であるように連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合、連続しており、そして読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続である必要はない。連結は、慣用的な制限部位での連結によって達成される。こうした部位が存在しない場合、慣用的な実施にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。

細胞構成要素または他の混入物質、例えば他の細胞核酸またはタンパク質を除去するため、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野に周知の他のものを含む標準技術によって、抗体の精製を行う。Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら監修 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。タンパク質精製に関する異なる方法がよく確立され、そして広く用いられており、例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティ・クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティ・クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合様式交換）、チオ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着（例えばベータ−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニル−セファロース、アザ−アレノ親和性（ａｒｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティ・クロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）アフィニティ材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）がある（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ， Ｍ．Ａ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７５（１９９８）９３−１０２）。

用語「形質転換」は、本明細書において、宿主細胞内へのベクター／核酸のトランスファープロセスを指す。厄介な細胞壁バリアを持たない細胞が宿主細胞として用いられる場合、トランスフェクションは、例えば、Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ．およびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．Ｊ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６ｆｆに記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法によって行われる。しかし、核注入によるかまたはプロトプラスト融合によるものなどの、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法もまた使用可能である。原核細胞または実質的な細胞壁構成を含有する細胞を用いる場合、例えばトランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ， Ｆ．Ｎら， ＰＮＡＳ． ６９（１９７２）７１１０ｆｆに記載されるような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

本明細書において、「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（転写物とも称される）が続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれうる。

「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間でトランスファーする核酸分子、特に自己複製性の核酸分子である。該用語には、主に、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入（例えば染色体組込み）のために機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。やはり含まれるのは、記載するような機能の１より多くを提供するベクターである。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入された際、転写され、そしてポリペプチドに翻訳されうることが可能なポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、機能して所望の発現産物を生じることが可能な発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。

本発明記載の二重特異性抗体が、哺乳動物細胞における優れた発現収量、安定性、生物学的または薬理学的活性、薬物動態学的特性または毒性などの価値ある特性を有することが現在、見出されてきている。これらは、例えば、癌などの疾患の治療に使用可能である。本発明記載の抗体、特に二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体は、受容体ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲ両方を発現している癌細胞の増殖阻害、および癌に罹患した患者に利益を引き起こす抗腫瘍有効性のような非常に価値ある特性を示す。本発明記載の二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体は、受容体ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲ両方を発現している癌細胞に対して、親単一特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜ＥＧＦＲ＞抗体と比較した際、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ受容体両方の内在化の減少を示す。

本発明の１つの側面は、本発明記載の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の側面は、医薬組成物製造のための、本発明記載の抗体の使用である。本発明のさらなる側面は、本発明記載の抗体を含む医薬組成物の製造法である。別の側面において、本発明は、本発明記載の抗体を含有する組成物、例えば薬学的キャリアーと一緒に配合された、医薬組成物を提供する。

本発明の１つの態様は、癌治療のための本発明記載の二重特異性抗体である。
本発明の別の側面は、癌治療のための前記医薬組成物である。
本発明の別の側面は、癌治療用の薬剤製造のための本発明記載の抗体の使用である。

本発明の別の側面は、癌治療が必要な患者に、本発明記載の抗体を投与することによる、癌に罹患した患者の治療法である。
本明細書において、「薬学的キャリアー」には、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、キャリアーは、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば注射または注入による）に適切である。

本発明の組成物を当該技術分野に知られる多様な方法によって投与してもよい。当業者に認識されるであろうように、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて多様であろう。特定の投与経路によって、本発明の化合物を投与するため、化合物を、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、またはこうした物質とともに化合物を共投与する必要がありうる。例えば、化合物を適切なキャリアー、例えばリポソーム、または希釈剤中で、被験体に投与してもよい。薬学的に許容されうる希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的キャリアーには、無菌水性溶液または分散剤、および無菌注射可能溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのこうした媒体および剤の使用が当該技術分野に知られる。

句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書において、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、通常、注射により、そして限定なしに、静脈内、筋内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨下注射および注入が含まれる。

用語、癌は、本明細書において、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ、ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平細胞癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫を指し、上記癌いずれかの難治性型、あるいは上記癌の１またはそれより多くの組み合わせが含まれる。

これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの佐剤もまた含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記滅菌法によって、そしてかつ多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含むことによって、確実にされうる。等張性剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含むことが望ましい可能性もまたある。さらにモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を含むことによって、注射可能薬学的型の延長された吸収を達成してもよい。

選択した投与経路に関わらず、適切な水和型で使用可能な本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られる慣用的な方法によって、薬学的に許容されうる投薬型に配合される。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に関して、望ましい療法反応を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように、多様であることも可能である。選択される投薬レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、治療期間、他の薬剤、使用する特定の組成物と組み合わせて用いられる化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態および以前の病歴、ならびに医学業に知られる同様の要因を含む、多様な薬物学的要因に応じるであろう。

組成物は、無菌であり、そして組成物をシリンジで送達可能である度合いまで流動性でなければならない。水に加え、キャリアーは、好ましくは等張緩衝生理食塩水溶液である。

適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合、必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持されうる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。

アミノ酸配列の説明
配列番号１ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ 重鎖、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１（＋ＷＴ）
配列番号２ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ 軽鎖、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１（＋ＷＴ）
配列番号３ ＜ＥＧＦＲ＞ ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１のジスルフィド安定化ＶＨ４４／ＶＬ１００を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号４ ＜ＥＧＦＲ＞ ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１＿ＷＴのペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号５ ＜ＥＧＦＲ＞ 重鎖、ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８（＋ＷＴ）
配列番号６ ＜ＥＧＦＲ＞ 軽鎖、ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８（＋ＷＴ）
配列番号７ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ ＶＨ４４／ＶＬ１００−ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８のジスルフィド安定化を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号８ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴのペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号９ ＜ＶＥＧＦ＞ 重鎖、Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６（＋ＳＳ）
配列番号１０ ＜ＶＥＧＦ＞ 軽鎖、Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６（＋ＳＳ）
配列番号１１ ＜ＡＮＧ−２＞ Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳのジスルフィド安定化ＶＨ４４／ＶＬ１００を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号１２ ＜ＡＮＧ−２＞ Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６のペプチドで連結された重鎖および軽鎖
配列番号１３ ヒトＥＧＦＲ
配列番号１４ ヒトＩＧＦ−１Ｒ
配列番号１５ ヒトＶＥＧＦ
配列番号１６ ヒトＡＮＧ−２
以下の実施例、配列表および図は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法において、修飾を作製することが可能であることが理解される。

材料および方法
組換えＤＮＡ技術
標準法を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９に記載されるようにＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。

ＤＮＡおよびタンパク質配列分析、ならびに配列データ管理
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は： Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， （１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２に提供される。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付けにしたがって番号付けられる（Ｅｄｅｌｍａｎ， Ｇ．Ｍ．ら， ＰＮＡＳ ６３（１９６９）７８−８５； Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， （１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２）。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）ソフトウェアパッケージ、バージョン１０．２およびＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅパッケージソフト、バージョン８．０を配列生成、マッピング、分析、アノテーションおよび例示のために用いた。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（ドイツ・ファターシュテッテン）およびＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ・レーゲンスブルク）で行った二本鎖配列決定によって決定された。

遺伝子合成
Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ・レーゲンスブルク）によって、自動化遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から所望の遺伝子セグメントを調製した。非修飾ＶＨドメインまたはｓｃＦａｂ抗体断片、ならびに抗体軽鎖と組み合わせて、ＣＨ３ドメインにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を所持する「ノブを穴に」抗体重鎖、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異を所持する「ノブを穴に」重鎖をコードする遺伝子セグメントに単一制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩまたはＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ）を隣接させ、そしてｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローニングした。形質転換細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＵＶ分光によって濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。すべての構築物が、真核細胞における分泌のためにタンパク質をターゲティングするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’端ＤＮＡ配列を含むよう設計した。

発現プラスミドの構築
すべての「ノブを穴に」重鎖の構築物にＲｏｃｈｅ発現ベクター、ならびに抗体軽鎖をコードする発現プラスミドを用いた。該ベクターは、以下の要素を含む：
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点
−大腸菌におけるアンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子、
−ヒト・サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト１−免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−ユニークなＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位。

記載するように、遺伝子合成によって、「ノブを穴に」重鎖と非修飾ＶＨドメインまたはｓｃＦａｂ断片ならびに非修飾軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子を調製し、そしてｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローニングした。合成ＤＮＡセグメントおよびＲｏｃｈｅ発現ベクターを所持するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩまたはＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動に供した。次いで、精製された「ノブを穴に」重鎖および非修飾軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを単離Ｒｏｃｈｅ発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩまたはＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片に連結して、最終発現ベクターを生じた。最終発現ベクターを大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、そして制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌ ＬＢ−Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）、そして配列完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。

ＨＥＫ２９３細胞における二重特異性抗体の一過性発現
製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にしたがって、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３発現系を用いて、ヒト胚性腎２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって、組換え二重特異性抗体を発現させた。簡潔には、懸濁ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３−Ｆ細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３発現培地中、３７℃／８％ＣＯ_２で培養し、そしてトランスフェクションした日に、１〜２ｘ１０^６生存細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地中に植え付けた。２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積に関して、３２５μｌの２９３フェクチン^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ）、ならびに１：１：１または１：２：１のモル比の２５０μｇの「ノブを穴に」重鎖１および２、ならびに軽鎖プラスミドＤＮＡを用いて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）中、「ノブを穴に」ＤＮＡ−２９３フェクチン複合体を調製した。１４０００ｇで３０分間の遠心分離によって、抗体を含有する細胞培養上清をトランスフェクション７日後に採取し、そして無菌フィルター（０．２２μｍ）を通じてろ過した。上清を精製するまで−２０℃で保存した。

二重特異性抗体の精製
プロテインＡ−セファロース^ＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いたアフィニティ・クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。簡潔には、無菌ろ過細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ ＫＨ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰ（５ｍｌ）カラム上に適用した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄した。抗体および抗体変異体を０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ２．８で溶出させ、そしてタンパク質含有分画を０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で中和した。次いで、溶出したタンパク質分画をプールし、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で体積３ｍｌまで濃縮して、そして２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ １２０ｍｌ １６／６０ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に装填した。５％未満の高分子量凝集体しか含まない精製二重特異性抗体を含有する分画をプールし、そして−８０℃で、１．０ｍｇ／ｍｌアリコットとして保存した。

精製タンパク質の分析
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定することによって精製タンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオスレイトール）の存在下および非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、二重特異性抗体および対照抗体の純度および分子量を分析した。製造者の指示にしたがって、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いた（４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル）。２５℃で、２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分析用サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）を用いた高性能ＳＥＣによって、二重特異性および対照抗体試料の凝集物含量を分析した。２５μｇのタンパク質を流速０．５ｍｌ／分でカラム上に注入し、そして均一濃度で５０分間に渡って溶出させた。安定性分析のため、１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製タンパク質を４℃および４０℃で７日間インキュベーションし、そして次いで、高性能ＳＥＣによって評価した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）での酵素処理によってＮ−グリカンを除去した後、ナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析によって、還元された二重特異性抗体軽鎖および重鎖のアミノ酸主鎖の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を検証した。

表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン・ウプサラ）などの標準的結合アッセイを用いて、２５℃で、結合アフィニティを決定する。アフィニティ測定のため、ＳＰＲ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００）上の標準的アミンカップリングおよびブロッキング化学によって、ＣＭ−５センサーチップの表面に、３０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃγ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をカップリングした。コンジュゲート化後、単一または二重特異性Ｈｅｒ３／ｃＭｅｔ抗体を２５℃、流速５μＬ／分で注入し、その後、３０μＬ／分で、ヒトＨＥＲ３またはｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤの希釈シリーズ（０ｎＭ〜１０００ｎＭ）を注入した。結合実験のためのランニング緩衝液として、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを用いた。次いで、６０ｓパルスの１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液でチップを再生した。

ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−１Ｒ表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用いて、ＳＰＲ実験を行った。標準的アミンカップリング化学を用いて、ＣＭ５バイオセンサーチップの表面上に、ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＦＲを固定した。２００ＲＵ（ＩＧＦ−１Ｒ）または１００ＲＵ（ＥＧＦＲ）を目指す固定化ウィザード法を用いて、１μｇ／ｍｌで、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で、ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＦＲを注入した。参照対照フローセルを同じ方式だがビヒクル緩衝液のみで処理した。抗体を１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）中で希釈し、そして３０μｌ／分の流速で、３．１２５〜５０ｎＭの間の増加する濃度で注入した。接触時間（会合期）は３分間（ＥＧＦＲ結合）および５分間（ＩＧＦ−１Ｒ結合）であり、解離時間は１０分間（ＥＧＦＲ）および３分間（ＩＧＦ−１Ｒ）であった。流速５μｌ／分で３０ｓ、０．８５％リン酸を注入することでＥＧＦＲ結合を再生した。５μｌ／分で１分間、４Ｍ塩化マグネシウムを注入することでＩＧＦ−１Ｒ結合を再生した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを用いることによって、動力学速度定数および平衡解離定数を計算した。

同時結合を立証するため、二重特異性抗体を、５μｌ／分の流速で、２５ｎＭで１分間、ＥＧＦＲ表面上に注入する。ＥＧＦＲ表面に抗体を捕捉した後、ＩＧＦ−１Ｒを、流速３０μｌ／分で、２．５〜８０ｎＭの間の増加する濃度で注入する。流速５μｌ／分で３０ｓ、０．８５％リン酸を注入することで、表面を再生する。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを用いることによって、動力学速度定数および平衡解離定数を計算する。

ＡＮＧ−２結合表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用いて、表面プラズモン共鳴によって、抗原、例えばヒトＡＮＧ−２に対する抗体の結合を調べる。簡潔には、アフィニティ測定のため、ヒトＡＮＧ−２に対する抗体の提示のため、アミンカップリングを通じて、ＣＭ５チップ上にヤギ＜ｈＩｇＧ−Ｆｃガンマ＞ポリクローナル抗体を固定した。ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４））中、２５℃で、結合を測定した。精製したＡＮＧ−２−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓまたは社内精製）を、溶液中、６，２５ｎＭ〜２００ｎＭの間の多様な濃度で添加した。３分間のＡＮＧ−２注入によって会合を測定し；チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３分間洗浄することによって解離を測定し、そして１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を概算した。ＡＮＧ−２調製物の不均一性のため、１：１結合はまったく観察不能であり；ＫＤ値はしたがって、相対的概算でしかない。系に生得的なベースライン・ドリフトの補正およびノイズシグナル減少のため、陰性対照データ（例えば緩衝液曲線）を試料曲線から減じた。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア、バージョン１．１．１を、ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍの分析のため、そしてアフィニティデータの計算のため、用いた。あるいは、アミンカップリング（ＢＳＡ不含）を通じてＣＭ５チップ上に固定したＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ−Ａｂ、ＢＳＡ不含、Ｑｉａｇｅｎ第３４６６０号）を通じて、Ａｎｇ−２を２０００〜１７００ＲＵ捕捉レベルで捕捉することも可能である（以下を参照されたい）。

ＶＥＧＦ結合表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）
以下のプロトコルにしたがって、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置上での表面プラズモン共鳴技術を用いて、二重特異性＜ＶＥＧＦ−Ａｎｇ−２＞抗体のＶＥＧＦ結合を分析し、そしてＴ１００ソフトウェアパッケージを用いて分析する：簡潔には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪＩＲ １０９−００５−０９８）への結合を通じて、ＣＭ５−Ｃｈｉｐ上で＜ＶＥＧＦ＞抗体を捕捉した。以下のように標準的アミノカップリングを用いて、アミノカップリングによって捕捉抗体を固定した：ＨＢＳ−Ｎ緩衝液はランニング緩衝液として働き、７００ＲＵのリガンド密度を目指してＥＤＣ／ＮＨＳの混合物によって活性化を行った。捕捉抗体をカップリング緩衝液ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、ｃ＝２μｇ／ｍＬ中で希釈し、最後に、１Ｍエタノールアミンの注入によって、なお活性化されているカルボキシル基をブロッキングした。流速５μＬ／分およびｃ（Ｍａｂｓ＜ＶＥＧＦ＞）＝１０ｎＭでＭａｂ＜ＶＥＧＦ＞抗体の捕捉を行い、ランニング緩衝液＋１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで希釈し；およそ３０ＲＵの捕捉レベルに達しなければならなかった。ｒｈＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９３−ＶＥ）を分析物として用いた。＜ＶＥＧＦ＞抗体に対するＶＥＧＦ結合の動力学的性質決定を、ランニング緩衝液としてのＰＢＳ＋０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中、３７℃で行った。３００〜０．２９ｎＭの一連の濃度のｒｈＶＥＧＦとともに、試料を、５０μＬ／分の流動ならびに８０秒間の会合時間および１２００秒間の解離時間で注入した。各分析物サイクル後、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５および接触時間６０秒で、未結合捕捉抗体表面の再生を行った。通常の二重参照法（対照参照：捕捉分子ヤギ抗ヒトＩｇＧに対するｒｈＶＥＧＦの結合、測定フローセル上でのブランク、ｒｈＶＥＧＦ濃度「０」、モデル：ラングミュア結合１：１（捕捉分子結合のため、Ｒｍａｘを局所に設定した））。

ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２細胞株の生成
ＡＮＧ２に刺激されたＴｉｅ２リン酸化および細胞上のＴｉｅ２に対するＡＮＧ２の結合への、アンジオポエチン−２抗体の干渉を決定するため、組換えＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ細胞株を生成した。簡潔には、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＣＭＶプロモーターおよびネオマイシン耐性マーカーの調節下で、全長ヒトＴｉｅ２（配列番号１０８）をコードするｐｃＤＮＡ３に基づくプラスミド（ＲＢ２２−ｐｃＤＮＡ３ Ｔｏｐｏ ｈＴｉｅ２）をＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションし、そして耐性細胞をＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で選択した。クローニング・シリンダーを通じて、個々のクローンを単離し、そして続いて、ＦＡＣＳによって、Ｔｉｅ２発現に関して分析した。Ｇ４１８の非存在下であってさえ、高くそして安定なＴｉｅ２発現を持つクローンとしてクローン２２を同定した（ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２クローン２２）。ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２クローン２２を、続いて、細胞アッセイ：ＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化およびＡＮＧ２細胞性リガンド結合アッセイに用いた。

ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
ＶＥＧＦ抗体の細胞機能を測定するために、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ−１２２００）増殖を選択した。簡潔には、９６ウェルあたり５０００ ＨＵＶＥＣ細胞（低継代数、≦５継代）を、１００μｌ飢餓培地（ＥＢＭ−２内皮基本培地２、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ−２２２１１、０．５％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中、コラーゲンＩでコーティングしたＢＤ ＢｉｏｃｏａｔコラーゲンＩ ９６ウェル・マイクロタイタープレート（ＢＤ＃３５４４０７／３５６４０）中で一晩インキュベーションした。多様な濃度の抗体をｒｈＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ最終濃度、ＢＤ＃３５４１０７）と混合し、そして室温で１５分間プレインキュベーションした。続いて、混合物をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、そしてこれらを３７℃で７２時間、５％ＣＯ２でインキュベーションした。分析当日、プレートを室温に３０分間平衡化させ、そしてマニュアル（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７１／２／３）にしたがって、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存度アッセイキットを用いて、細胞生存度／増殖を決定した。分光光度計において、発光を決定した。

ＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化アッセイ
以下のアッセイ原理にしたがって、二重特異性＜ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ＞抗体によるＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化の阻害を測定した。ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２クローン２２を、＜ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ＞抗体の非存在下または存在下で、ＡＮＧ２で５分間刺激し、そしてサンドイッチＥＬＩＳＡによってＰ−Ｔｉｅ２を定量化した。簡潔には、１００μｌ ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μｇ／ｍｌジェネティシン中、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェル・マイクロタイタープレート上で、ウェルあたり２ｘ１０５ ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２クローン２２細胞を一晩増殖させた。翌日、＜ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ＞抗体の力価決定列をマイクロタイタープレート中に調製し（４倍濃縮、７５μｌ最終体積／ウェル、２つ組）、そして７５μｌのＡＮＧＰＴ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃６２３−ＡＮ）希釈（４倍濃縮溶液として３．２μｇ／ｍｌ）と混合した。抗体およびＡＮＧ２を室温で１５分間プレインキュベーションした。１００μｌの混合物をＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２クローン２２細胞（１ｍＭ ＮａＶ３Ｏ４、Ｓｉｇｍａ ＃Ｓ６５０８と５分間プレインキュベーションした）に添加し、そして３７℃で５分間インキュベーションした。続いて、ウェルあたり２００μｌの氷冷ＰＢＳ＋１ｍＭ ＮａＶ３Ｏ４で細胞を洗浄し、そして氷上でウェルあたり１２０μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＶ３Ｏ４、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌアプロチニン）を添加することによって溶解した。マイクロタイタープレート振盪装置上、４℃で３０分間細胞を溶解し、そして１００μｌ溶解物を、あらかじめ遠心分離をせず、そして総タンパク質決定をせずに、ｐ−Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒ＆Ｄ ＃ＤＹ９９０）内に直接トランスファーした。製造者の指示にしたがって、Ｐ−Ｔｉｅ２量を定量化し、そしてＥｘｃｅｌ用のＸＬｆｉｔ４分析プラグイン（用量反応一部位、モデル２０５）を用いて阻害に関するＩＣ５０値を決定した。

細胞力価グローアッセイ
細胞力価グローアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞生存度および増殖を定量化した。製造者の指示にしたがってアッセイを実行した。簡潔には、所望の期間、総体積１００μＬ中、９６ウェルプレート中で細胞を培養した。増殖アッセイのため、細胞をインキュベーターから取り出し、そして室温に３０分間置いた。１００μＬの細胞力価グロー試薬を添加し、そしてマルチウェルプレートを軌道振盪装置上に２分間置いた。マイクロプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ）上に１５分間置いた後、発光を測定した。

実施例１ａ
二重特異性二価＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞抗体分子の発現および精製
上記の材料および方法に記載する方法にしたがって、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞抗体分子Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳおよびＡｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６を発現させ、そして精製した。＜ＶＥＧＦ＞部分のＶＨおよびＶＬは、ベバシズマブに基づく。＜ＡＮＧ２＞部分のＶＨおよびＶＬは、ＡＮＧ２ｉ−ＬＣ０６（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２号に記載され、そしてファージディスプレイを通じて得られた）のＶＨおよびＶＬ配列に基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１（Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳに関する）、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１２（Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６に関する）に提供される。Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳおよびＡｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６の発現はウェスタンブロットによって確認された。Ａｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６ＳＳおよびＡｎｇ２−ＶＥＧＦ ＯＡ−Ａｖａ−Ｎ−ｓｃＦａｂＬＣ０６の精製は、以下の収量を導いた。

＊質量分析：ホモ二量体重鎖二量体はまったく検出されなかった。
結合および他の特性を記載するように決定した。
実施例１ｂ
二重特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体分子の発現および精製
表：二重特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体分子の概要

上記の材料および方法に記載する方法にしたがって、二重特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体分子、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１およびＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８を１：１：１プラスミド比で発現し、そして精製した。二重特異性抗体は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７； ＷＯ ２００５／００５６３５、＜ＩＧＦ−ｌＲ＞クローン１８または＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＡＫ１８と略される）およびヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（ＷＯ ２００６／０８２５１５ ＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と略される）の抗原結合部位に基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３（ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１に関する）、および配列番号５、配列番号６、配列番号７（ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８に関する）に提供される。ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１およびＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８の発現はウェスタンブロットによって確認された。細胞培養上清のプロテインＡ精製後、両構築物は、分析用ＳＥＣによって検出した際、およそ１４８ｋＤａの予期される分子量を持つ、５０〜５８％の間の二重特異性抗体、および分子量１００ｋＤａの多量の半抗体を示した。ＳＥＣ精製後、両構築物は、１４８ｋＤａの分子量を持つ８６〜９０％の均質な単量体、および１００ｋＤａの残りの副産物を示した。また、ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８を１：２：１プラスミド比でも発現し、そしてプロテインＡおよびＳＥＣ精製に供した。１：１：１発現比と比較して、プロテインＡ後の半抗体の量は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃａｌｉｐｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって検出した際、１：２：１発現レベルでは、３０％から６％に減少した。ＳＥＣ精製タンパク質の質量分析によって、トランスフェクションに際するプラスミド比の変化により、半重鎖１ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２抗体が効率的に除去されることが確認された。ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８精製収量は、ＨＥＫ２９３細胞における発現に際して、１：２：１プラスミド比で４０％増加した。

二重特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体分子ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴ（適切な軽鎖および重鎖アミノ酸配列が配列番号５、配列番号６、配列番号８に提供される）を、同様に１：１：１および１：２：１プラスミド比で発現し、そして精製した。

１：２：１プラスミド比に関する結果：

３つのプラスミドのみを用いたＯＡ−ｓｃＦａｂ構築物は、４つの発現プラスミドを用いて二重特異性分子を生成する、ノブを穴へ技術を用いた類似のヘテロ二量体アプローチに勝る、価値ある副産物プロファイルの利点を有する（例えばＷＯ ２００９／０８０２５３を参照されたい）。本発明記載の抗体は、誤って対形成した軽鎖または軽鎖を欠く抗体の完全な不在を示す（データ未提示）。

記載する１：２：１法は、高純度の二重特異性分子および半抗体の明確な減少、ならびに誤って対形成した軽鎖または軽鎖を欠く抗体の完全な非存在を生じることが示された（データ未提示）。

結合および他の特性を、記載するように決定した。
二重特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体分子、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１＿ＷＴ（適切な軽鎖および重鎖アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号４に提供される（ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１＿ＷＴに関する））を同様に発現し、そして精製してもよい。

実施例２
両抗原に対する二重特異性抗体の（同時）結合
異なる二重特異性抗体形式の結合を、結合モジュールおよび二重特異性抗体が由来する「野生型」ＩｇＧの結合と比較した。上述のような表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を適用することによって、これらの分析を実行した。ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲに対する二重特異性抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴの同時結合を検出可能である。

装置：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｔ２００感受性増進
ソフトウェア：Ｔ２００制御、バージョン１．０
ソフトウェア：Ｔ２００評価、バージョン１．０
チップ：ＣＭ５−チップ
アッセイ
製造者の指示にしたがった、フローセル１〜４上の標準的アミンカップリング：ランニング緩衝液：ＨＢＳ−Ｎ緩衝液、リガンド密度を目指すＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化。ＥＧＦＲをカップリング緩衝液ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝１５μｇ／ｍＬ中で希釈し；最後に維持された活性化カルボキシル基を１Ｍエタノールアミンの注入によってブロッキングした。

フローセル１上のアミンカップリング化ＥＧＦＲを、ありうる緩衝液効果または非特異的結合の補正のための参照対照表面として用いた。
流速３０μＬ／分、２５℃で、同時結合を測定した。ｃ＝１０ｎＭの濃度で２分間、二重特異性Ａｂを注入した直後、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＧＦ１Ｒの連続注入を行った（会合時間：２分間、解離時間：３分間、ｃ＝１５０ｎＭ）。

ランニング緩衝液＋１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡですべての試料を希釈した。
各周期後、１５ｍＭ ＮａＯＨ、接触時間１分間、流速３０μＬ／分を用いて再生を行った。陰性対照：ＩＧＦ１Ｒの代わりに、陰性対照として希釈緩衝液を注入した。

結果
二重特異性Ａｂ：ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、アミンカップリング化ヒトＥＧＦＲおよびヒトＩＧＦ１Ｒに同時結合を示した（図９のｓｅｎｓｏｇｒａｍを参照されたい）。

実施例３ａ
ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ−Ｍａｂ Ｔｉｅ２リン酸化阻害
上述のアッセイ原理にしたがって、二重特異性＜ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ＞抗体によるＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の阻害を測定した。結果を図５に示す。

実施例３ｂ
ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ−Ｍａｂ Ｔｉｅ２リン酸化阻害
上述のアッセイ原理にしたがって、二重特異性＜ＡＮＧ２−ＶＥＧＦ＞抗体によるＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化の阻害を測定した。結果を図６に示す。

実施例４
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内在化／下方制御
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）は、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を阻害し、そしてＩＧＦ−１Ｒの内在化およびそれに続く下方制御を誘導する。二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御の度合いを分析した。

腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の量に対する本発明の抗体の影響を検出するため、ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲ特異的抗体を用いた経時実験およびそれに続くＥＬＩＳＡ分析を行った。

ヒトＨ３２２Ｍ腫瘍細胞（ＮＣＩから得た）を９６ウェルプレート中（１ｘ１０^４細胞／ウェル）で、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補ったＲＰＭＩ培地中、３７℃および５％ＣＯ_２で一晩培養した。

培地を注意深く除去し、そして総体積１００μｌ中、ＲＰＭＩ培地中で希釈した二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体溶液によって置換した。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で少なくとも３時間だが２４時間を超えずにインキュベーションした。

吸引によって培地を注意深く除去し、そして細胞を１２０μｌ／ウェルの冷ＭＥＳ溶解緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、６０ｎＭオクチルグルコシド、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）で溶解した。プレートをさらなる分析まで−２０℃で保存した。

ＩＧＦ−１Ｒ検出のため
ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中、最終濃度２．４μｇ／ｍｌの１：２００希釈の抗体ＡＫ１ａ−ビオチニル化（ＷＯ２００４／０８７７５６に記載される＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１ａ（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８６）、Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を、ストレプトアビジンでコーティングしたＭＴＰ（Ｒｏｃｈｅ ＩＤ番号：１１９６５８９１００１）の各ウェルに添加した。ストレプトアビジンＭＴＰをＲＴで１時間攪拌し、そして次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するウェルあたり２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。

ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を除去した後、１００μｌの細胞溶解物を抗体でコーティングしたストレプトアビジン−ＭＴＰの各ウェルに添加した。
次いで、ＭＴＰをＲＴでさらに１時間攪拌しながらインキュベーションし、そして続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。

ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で１：７５０希釈したＩＧＦ−１Ｒβウサギ抗体（２００μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−７１３）を用いて、捕捉抗体ＡＫ１ａが結合したＩＧＦ−１Ｒを検出した。ウェルあたり１００μｌを添加し、そして一定の攪拌を伴いながらＲＴで１時間インキュベーションした。続いて溶液を除去し、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する２００μｌのＰＢＳでウェルを３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ カタログ番号７０７４）を、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の希釈で二次検出抗体として用いた。このうち１００μｌを各ウェルに添加し、そして攪拌しながらＲＴで１時間インキュベーションした。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで６回、プレートを洗浄した。ウェルあたり１００μｌのペルオキシダーゼ基質３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｒｏｃｈｅ、ＢＭ−Ｂｌｕｅ ＩＤ番号：１１４８４５８１）を添加し、そして攪拌しながらＲＴで２０分間インキュベーションした。ウェルあたり２５μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加し、そしてＲＴでさらに５分間インキュベーションすることによって、発色性（ｃｏｌｏｕｒｉｇｅｎｉｃ）反応を停止した。４５０ｎｍで吸光度を測定した。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８よりも少ない下方制御を誘導する。ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴによる下方制御は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８と比較して＞５０％減少した。

実施例５
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体によるＥＧＦＲならびにＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路の阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）は、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を阻害し、そしてヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲによるシグナル伝達を阻害する。二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、両方の経路に向かうシグナル伝達の阻害の度合いを分析した。

１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中、ヒト腫瘍細胞（Ｈ３２２Ｍ、３ｘ１０^４細胞／ウェル）を、９６ウェル・マイクロタイタープレート中に植え付け、そして３７℃および５％ＣＯ_２で一晩培養した。

培地を注意深く除去し、そして１００μｌの血清不含ＤＭＥＭ培地（１ｍｇ／ｍｌ ＲＳＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補充）によって置換し、そして３７℃および５％ＣＯ_２で、少なくとも２．５時間インキュベーションした。

培地を再び注意深く除去し、そして総体積５０μｌで、血清不含ＤＭＥＭ培地中、二重特異性抗体、および対照抗体（最終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８および＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２）の希釈物によって置換し、その後、３７℃および５％ＣＯ_２で、３０分間インキュベーションした。５０μｌ ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）またはＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（血清不含ＤＭＥＭ培地中で希釈）の添加によって、細胞を刺激し、そして３７℃および５％ＣＯ_２で１０分間インキュベーションした。

培地を注意深く除去し、そして１００μｌ／ウェルの氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌ／ウェル ＢｉｏＲａｄ細胞溶解緩衝液（ＢｉｏＲａｄ細胞溶解キット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１７１−３０４０１２））の添加によって細胞を溶解した。さらに分析するまで、プレートを−２０℃で保存した。

５００ｇ５分間の遠心分離によって、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳフィルタープレートを通じて細胞溶解物をろ過することによって、細胞破片を除去した。ＥＧＦＲリン酸化の分析のため、Ｐ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ）ビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号４６−６０３）を、そしてＩＧＦ−１Ｒリン酸化の分析のため、Ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｔｙｒ１１３１）ビーズキット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１７１Ｖ２７３４３）を用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ系でろ過細胞溶解物におけるＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒリン酸化を分析した。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞に対して、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化（ＩＣ５０：１ｎＭ、最大阻害：＞７０％）およびＥＧＦＲのリン酸化（ＩＣ５０：１ｎＭ、最大阻害＞９０％）を効率的に阻害した。

実施例６
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体による３Ｄ培養におけるＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の増殖阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する（ＷＯ ２００５／００５６３５）。同様の方式で、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されてきている（ＷＯ ２００６／０８２５１５）。腫瘍細胞株の増殖アッセイにおいて、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、ＥＧＦＲならびにＩＧＦ−１Ｒを発現するＨ３２２Ｍ細胞における阻害の度合いを分析した。

１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、ドイツ・ダルムシュタット）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、ドイツ・シュタインハイム）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（ＰＡＡ、オーストリア・パッシング）中で、Ｈ３２２Ｍ肺癌細胞（ＮＣＩ）を培養した。２５０００細胞／ウェルを、培地を含有する９６ウェル・ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルバニア州ワーリントン））コーティング・プレートに植え付けた。同時に、異なる濃度の二重特異性抗体を添加し、そして７日間インキュベーションした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）アッセイを用いて、製造者の指示にしたがって、細胞のＡＴＰ含量を測定することによって、細胞生存度を検出した。

結果を図８に示した。二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、Ｈ３２２Ｍ細胞の増殖を用量依存性に阻害する。１０００ｎＭの用量で、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、親単一特異性抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８または＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と比較した際、増殖阻害の改善を示した。

実施例７
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ発現を伴う皮下異種移植片モデルにおける、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する（ＷＯ ２００５／００５６３５）。同様の方式で、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されてきている（ＷＯ ２００６／０８２５１５）。ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖に対する、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、ＥＧＦＲならびにＩＧＦ−１Ｒの発現によって特徴付けられる皮下異種移植片モデルＢｘＰＣ−３を用いた。

１０％ウシ胎児血清（Ｓｅｒａ Ｐｌｕｓ； ＰＡＮ^ＴＭ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＰＡＮ^ＴＭ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（ＰＡＮ^ＴＭ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣから得た）の細胞を、５％ＣＯ_２の水飽和大気中、３７℃で培養した。接種当日、培養フラスコからＢｘＰＣ−３腫瘍細胞を採取し（１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、そして培地内に移し、遠心分離し、１回洗浄し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を注射するため、最後の力価を１ｘ１０^８細胞／ｍｌに調整した。続いてこの懸濁物１００μｌ（１ｘ１０^７細胞に対応する）をメスＳＣＩＤベージュマウスの右脇腹内に皮下注射した。腫瘍が確立され、そして平均サイズ１５０〜２５０ｍｍ^３に到達した後、ビヒクル、＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体および対照抗体（＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８および＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２）での治療を開始した。腫瘍体積を週２回測定し、そして平行して動物体重を監視した。単一治療および単一抗体の組み合わせを、二重特異性抗体での療法と比較した。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴ（２０ｍｇ／ｋｇ； ｉ．ｐ．、毎週１回（ｑ７ｄ））は、ｓ．ｃ． ＢｘＰＣ３異種移植片モデルにおいて、強い抗腫瘍有効性を示し（図１０および以下の表を参照されたい）、そして単一特異性抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（１０ｍｇ／ｋｇ； ｉ．ｐ．、毎週１回（ｑ７ｄ））および＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（１０ｍｇ／ｋｇ； ｉ．ｐ．、毎週１回（ｑ７ｄ））の組み合わせよりわずかに優れて、腫瘍増殖を阻害した。

実施例８
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖操作誘導体の調製
リン酸カルシウム・トランスフェクション・アプローチを用いて、哺乳動物抗体重鎖および軽鎖発現ベクターで、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を同時トランスフェクションすることによって、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖操作誘導体を産生した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をリン酸カルシウム法によってトランスフェクションした。非修飾抗体の産生のため、１：１比の抗体重鎖および軽鎖発現ベクターのみで細胞をトランスフェクションした。糖操作抗体の産生のため、細胞を４つのプラスミド、それぞれ４：４：１：１の比の、抗体発現のための２つ、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のための１つ、およびマンノシダーゼＩＩ発現のための１つで同時トランスフェクションする。１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地を用い、Ｔフラスコ中、接着単層培養として細胞を増殖させ、そしてこれらが５０〜８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）である際にトランスフェクションした。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションのため、７５０（〜８００）万細胞を、ＦＣＳ（１０％Ｖ／Ｖ最終で）を補充したおよそ１４ｍｌ ＤＭＥＭ培地（最終的に２５０μｇ／ｍｌネオマイシン）中にトランスフェクション２４時間前に植え付け、そして５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に、３７℃で一晩、細胞を入れた。トランスフェクションしようとする各Ｔ７５フラスコに関して、軽鎖および重鎖発現ベクター間で等しく分けた４７μｇ総プラスミドベクターＤＮＡ、２３５μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を混合し、そして最終体積４６９μｌまで水を添加することによって、ＤＮＡ溶液、ＣａＣｌ２および水を調製した。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液、ｐＨ７．０５を添加し、直ちに１０秒間混合し、そして室温で２０秒間静置した。２％ＦＣＳを補充したおよそ１２ｍｌのＤＭＥＭで懸濁物を希釈し、そして存在する培地の代わりに、Ｔ７５に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベーションし、次いで、培地をおよそ１２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳで置換した。トランスフェクション５〜７日後に馴化培地を採取し、２１０〜３００＊ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌ろ過し（あるいは１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、４０００ｒｐｍで１０分間、２回目の遠心分離をし）、そして４℃に維持した。

プロテインＡアフィニティ・クロマトグラフィー、ならびに緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、そして純粋な単量体ＩｇＧ１抗体を収集するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の最終サイズ排除クロマトグラフィー工程によって、分泌抗体を精製した。２８０ｎｍでの吸光度から、分光光度計を用いて、抗体濃度を概算する。２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン溶液、ｐＨ６．７中で抗体を配合する。

抗体発現ベクターとともに、ＧｎＴ−ＩＩＩグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターを、またはＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクターに加えてゴルジ・マンノシダーゼＩＩ発現ベクターを同時トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体の糖操作変異体を産生した。糖操作抗体を精製し、そして非糖操作抗体に関して上述したように配合した。以下に記載するようなＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって、抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖を分析して、フコースの量を決定した。

ＰＮＧアーゼＦ消化によって抗体からオリゴ糖が酵素的に放出され、抗体はＰＶＤＦ膜上に固定されるかまたは溶液中にあるかいずれかである。
放出されたオリゴ糖を含有する生じた消化溶液を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用に直接調製するか、またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用に試料を調製する前に、エンドＨグリコシダーゼでさらに消化するかいずれかを行う。すべての本発明記載の二重特異性抗体に関して、ＧＥは糖操作を意味する。

実施例９
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体のＦｃｇＲＩＩＩａへの結合およびＡＤＣＣ適格性
所定の抗体によるＡＤＣＣ仲介の度合いは、結合した抗原だけに依存するのではなく、ＡＤＣＣ反応を誘発するＦｃ受容体として知られるＦｃｇＲＩＩＩａに対する定常領域のアフィニティにも応じる。ＦｃｇＲＩＩＩａに対する二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合分析のため、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を適用する。この技術によって、組換え的に産生されたＦｃｇＲＩＩＩａドメインに対する二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合を評価する。

すべての表面プラズモン共鳴測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）上、２５℃で行う。ランニングおよび希釈緩衝液は、ＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）、ｐＨ６．０、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０であった。可溶性ヒトＦｃｇＲＩＩＩａを１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に希釈し、そして標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）を用いてＣＭ５バイオセンサー上に固定して、およそ１０００ＲＵのＦｃｇＲＩＩＩａ表面密度を得た。ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％サーファクタントＰ２０； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）を固定中のランニング緩衝液として用いる。ＸＧＦＲ二重特異性抗体を、ＰＢＳ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０で４５０ｎＭの濃度に希釈し、そして流速３０μｌ／分で３分より長く注入する。次いで、ＰＢＳ、ｐＨ８．０、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で１分間、センサーチップを再生する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ、スウェーデン）を用いて、データ分析を行う。

ＦｃｇＲＩＩＩａに対する二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞のどのくらいの度合いの結合適格性が、また、腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性に相当する（ｔｒａｎｓｌａｔｅｓ）かを分析するため、細胞アッセイにおいて、ＡＤＣＣ適格性を決定する。これらのアッセイに関して、糖修飾誘導体二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体を調製し（上記を参照されたい）、そしてＢＩＡｃｏｒｅ ＡＤＣＣ適格性アッセイ形式で、そしてまた以下に記載するようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイで試験する。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用い、そして本質的に製造者の指示にしたがって、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌｅｕｃｏｓｅｐ ＃２２７２８８）を用いて調製した。簡潔には、健康な志願者から、ヘパリン処理シリンジを用いて静脈血を採取する。血液をＰＢＳ（Ｃａ^＋＋またはＭｇ^＋＋を含有しない）で１：０．７５〜１．３に希釈して、そしてＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７に上層する。ブレーキを使用せず、室温（ＲＴ）で３０分間、８００ｘｇで勾配を遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する中間相を収集し、そしてＰＢＳ（２つの勾配由来の細胞あたり５０ｍｌ）で洗浄し、そして４００ｘｇで１０分間、ＲＴで遠心分離することによって採取する。ペレットをＰＢＳに再懸濁した後、ＰＢＭＣを計数し、そして４００ｘｇで１０分間、ＲＴで遠心分離することによって、２回目の洗浄を行う。次いで、続く方法のため、適切な培地中に、細胞を再懸濁する。

ＡＤＣＣアッセイに用いるエフェクター対ターゲット比は、ＰＢＭＣに関して２５：１である。丸底９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌを添加するため、適切な濃度で、ＡＩＭ−Ｖ培地中、エフェクター細胞を調製する。ターゲット細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させたヒトＥＧＦＲ／ＩＧＦＲ発現細胞（例えばＨ３２２Ｍ、Ａ５４９、またはＭＣＦ−７）であった。

ターゲット細胞をＰＢＳ中で洗浄し、計数し、そして１ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌに調整する。３７℃／５％ＣＯ２、カルセインＡＭ（１０μＭ）で細胞を３０分間標識する。細胞を標識した後、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして９６ウェル丸底プレート中、５０μｌ（ＡＩＭ−Ｖ培地）中で、５０００細胞／ウェルに植え付ける。抗体をＡＩＭ−Ｖ中で希釈し、あらかじめプレーティングしたターゲット細胞に、５０μｌで添加する。次いでエフェクター細胞を添加し、そして５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃で４時間、プレートをインキュベーションする。インキュベーション期間後、プレートを２００ｇで１０分間遠心分離し、そして８０μｌ上清を黒い蛍光プレート／透明な底に移し、そしてＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ読み取り装置で、蛍光（Ｅｘ ４８５ｎｍ／Ｅｍ ５３５ｎｍ）を測定する。

以下の対照をアッセイに含める：
−バックグラウンド：細胞を標識した後の５０μｌ上清アリコット＋１００μｌ培地
−自然溶解：５０μｌターゲット細胞懸濁物＋１００μｌ培地
−最大溶解：５０μｌターゲット細胞懸濁物＋１００μｌ培地／１．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
−抗体を含まない溶解対照：５０μｌターゲット細胞懸濁物＋５０μｌ培地＋５０μｌ ＰＢＬ
抗体依存性細胞傷害性％を以下のように計算する：
ＡＤＣＣ％＝ｘ−自然放出／最大溶解−自然溶解ｘ１００
実施例１０
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖構造の分析
フコースおよび非フコース（無フコース）含有オリゴ糖構造の相対的な比を決定するため、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析によって、精製抗体物質の放出されたグリカンを分析する。このため、タンパク質主鎖からオリゴ糖を放出させるため、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中、５ｍＵ Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ＃ＧＫＥ−５０１０Ｂ）と、３７℃で一晩、抗体試料（約５０μｇ）をインキュベーションする。続いて、放出されるグリカン構造を単離し、そしてＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ（Ｇｌｙｇｅｎから得た： ＮｕＴｉｐ１−１０μｌ、カタログ番号ＮＴ１ＣＡＲ）を用いて脱塩する。第一の段階として、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップは、３μＬ １Ｍ ＮａＯＨでこれらを洗浄し、その後、２０μＬの純水（例えばＢａｋｅｒ、＃４２１８からのＨＰＬＣ−勾配等級）、３μＬの３０％ｖ／ｖ酢酸および再び２０μｌ純水が続く。このため、それぞれの溶液をＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ中のクロマトグラフィー物質の最上部に装填し、そして圧力を掛けて通す（ｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ）。その後、上述のようなＮ−グリコシダーゼＦ消化物を約４〜５回、引き上げ、そして引き下ろすことによって、１０μｇ抗体に対応するグリカン構造をＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップに結合させる。ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ中の物質に結合したグリカンを上述と同じ方式で２０μＬ純水で洗浄し、そしてそれぞれ０．５μＬの１０％および２．０μＬの２０％アセトニトリルで段階的に溶出させる。この工程のため、溶出溶液を０．５ｍＬ反応バイアル中に満たし、そして各々４〜５回、引き上げ、そして引き下ろす。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析による分析のため、両方の溶出物を合わせる。この測定のため、０．４μＬの合わせた溶出物を、１．６μＬ ＳＤＨＢマトリックス溶液（２０％エタノール／５ｍＭ ＮａＣｌ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解させた、２，５−ジヒドロキシ安息香酸／２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ＃２０９８１３］）とともに、ＭＡＬＤＩターゲット上で混合し、そして適切にチューニングしたＢｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ装置で分析する。ルーチンには、５０〜３００ショットを記録し、そして単一の実験に合計する。ｆｌｅｘ分析ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）によって、得たスペクトルを評価し、そして検出したピーク各々に関して、質量を決定する。続いて、計算した質量、およびそれぞれの構造（例えばそれぞれ、フコースを含むおよび含まない、複合体、ハイブリッド、およびオリゴまたは高分子量マンノース）に理論的に予期される質量を比較することによって、ピークをフコースまたは無フコース（非フコース）含有グリコール構造に割り当てる。

ハイブリッド構造の比を決定するため、抗体試料をＮ−グリコシダーゼＦで消化し、そしてエンド−グリコシダーゼＨとＮ−グリコシダーゼＦは、併用されると、すべてのＮ連結グリカン構造（複合体、ハイブリッドならびにオリゴおよび高マンノース構造）をタンパク質主鎖から放出させ、そしてエンド−グリコシダーゼＨは、さらにグリカンの還元端の２つのＧｌｃＮＡｃ残基間のすべてのハイブリッド型グリカンを切断する。この消化物を続いて、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化試料に関して上述したのと同じ方式で、処理し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析によって分析する。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化物および併用Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンドＨ消化物のパターンを比較することによって、特定の糖構造のシグナルの減少度合いを用いて、ハイブリッド構造の相対含量を概算する。

個々のグリコール構造のピークの高さおよび検出されたすべての糖構造のピークの高さの合計の比から、各糖構造の相対量を計算する。フコース量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料中で同定されるすべての糖構造（例えば、それぞれ、複合体、ハイブリッド、ならびにオリゴおよび高マンノース構造）に関連するフコース含有構造の割合である。無フコシル化の量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料において同定されるすべての糖構造（例えば、それぞれ、複合体、ハイブリッド、ならびにオリゴおよび高マンノース構造）に関連するフコース欠如構造の割合である。

ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴに関して決定されるフコースの量は、２５％〜４０％の間であった。
実施例１１
異なるＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ発現を示す細胞への二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７）は、ＩＧＦ−１Ｒを発現している細胞に結合し、そしてヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２は、表面上にＥＧＦＲを発現する細胞に結合する。ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒに対する単一特異性二価抗体と比較して、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合特性を評価するため、異なるＩＧＦ−１Ｒ／ＥＧＦＲ発現比を持つ細胞に対して、競合的結合アッセイを行った。

氷冷緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）中で希釈したヒト腫瘍細胞（例えばＡ５４９、ＴＣ−７１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、２ｘ１０５細胞／ウェル）を、９６ウェル・マイクロタイタープレート中、標識単一特異性抗体（ＨＵＭＡＢクローン１８またはヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ６２）（最終濃度１μｇ／ｍｌ）および異なる濃度の非標識＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体または非標識単一特異性抗体または対照としてのＦａｂ断片の混合物（１００〜０．００２μｇ／ｍｌの最終力価範囲）に添加した。１５０〜２００μｌの緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）を添加することによって細胞を２回洗浄し、そして続いて遠心分離した（３００ｇ； ５分間、４℃）。次いで、６．２５μｌ／ｍｌ ７−ＡＡＤ（ＢＤ＃５５９９２５）を含有する２００μｌの固定緩衝液（１ｘＣｅｌｌＦｉｘ、ＢＤ＃３４０１８１）中に細胞を再懸濁し、そして氷上で１０〜２０分間インキュベーションして、固定および死んだ細胞における７−ＡＡＤの浸透を可能にした。ＦＡＣＳによって、試料の蛍光シグナルを分析し、そしてＩＣ５０値を計算した。

＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＩＣ５０値）に対する競合結合分析の結果を表Ｘに示す。ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲの両方を発現するＡ５４９腫瘍細胞上、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴの結合は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（〜３ｘ）より優れており、そして＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８ Ｆａｂ断片（〜３０ｘ）より優れており、これはおそらく、二重特異性抗体が、ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲの両方に同時に結合する能力を有するためである（アビディティ効果）。ＩＧＦ−１Ｒを発現するが、ＥＧＦＲを発現しないＴＣ−７１腫瘍細胞上、＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴの結合は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８ Ｆａｂ断片に匹敵した。この設定では、ＩＧＦ−１Ｒのみが発現され、ＥＧＦＲが発現されず、ＯＡ−ＧＡ２０１−ｓｃＦａｂ−Ａｋ１８＿ＷＴは、一つの結合アームでＩＧＦ−１Ｒに結合可能であるのみである。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体が、ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲを発現する細胞に、より強く結合するこの能力を利用して、腫瘍組織に対する優れたターゲティングを達成し、そして単一特異性ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲターゲティング抗体と比較して、潜在的に、好ましい安全プロファイルおよびＰＫ特性を生じることも可能である。

Claims (27)

1. ａ）第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖；
   ｂ）第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖
   を含む、二重特異性抗体。
2. ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインおよびｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインが、互いに抗体ＣＨ３ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い、
   ここでｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
   アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を生じる
   そして
   ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
   アミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のＣＨ３ドメインの界面内の腔を生じる
   ことで特徴付けられる、請求項１記載の抗体。
3. より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択され、そして
   より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される
   ことで特徴付けられる、請求項２記載の抗体。
4. どちらのＣＨ３ドメインも、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位のアミノ酸として、システイン（Ｃ）が導入されることによってさらに改変されている
   ことで特徴付けられる、請求項２又は３記載の抗体。
5. ｂ）以下の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、以下の位の間：
   ｉ）重鎖可変ドメイン４４位から軽鎖可変ドメイン１００位、
   ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位から軽鎖可変ドメイン４３位、または
   ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位から軽鎖可変ドメイン１００位
   にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている
   ことで特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
6. 前記抗体がＩｇＧ１の定常領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
7. ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
   ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を有する
   ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
8. ａ）第一の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
   ｂ）第二の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列を有する
   ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
9. ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
   ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号７のアミノ酸配列を有する
   ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
10. ａ）第一の全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして配列番号５のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
    ｂ）第二の全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列を有する
    ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
11. ａ）第一の全長抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、そして配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
    ｂ）第二の全長抗体が、ＡＮＧ−２に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号１１のアミノ酸配列を有する
    ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
12. ａ）第一の全長抗体が、ＶＥＧＦに特異的に結合し、そして配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そして
    ｂ）第二の全長抗体が、ＡＮＧ−２に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号１２のアミノ酸配列を有する
    ことで特徴付けられる、請求項１記載の二重特異性抗体。
13. Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が６５％またはそれ未満である、請求項６〜１０のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項記載の抗体を含む、医薬組成物。
15. 癌治療のための、請求項１４項記載の医薬組成物。
16. 癌の治療のための薬剤調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項記載の二重特異性抗体の使用。
17. 請求項１〜１３のいずれか１項記載の二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子。
18. 請求項１７記載の核酸を含有し、原核または真核宿主細胞において前記核酸を発現可能な発現ベクター。
19. 請求項１８記載のベクターを含む、原核または真核宿主細胞。
20. ａ）
    ａａ）第一の抗原に特異的に結合する第一の全長抗体の重鎖および軽鎖；ならびに
    ａｂ）第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖
    をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し；そして
    ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、宿主細胞を培養し；そして
    ｃ）前記培養から前記抗体分子を回収する
    工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の二重特異性抗体を調製するための方法。
21. 配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体。
22. 配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体。
23. 配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体。
24. 配列番号５、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびヒトＥＧＦＲに特異的に結合する二重特異性抗体。
25. Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が６５％またはそれ未満である、請求項２１〜２４いずれか一項記載の二重特異性抗体。
26. 配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＶＥＧＦおよびヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する二重特異性抗体。
27. 配列番号９、配列番号１０および配列番号１２のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトＶＥＧＦおよびヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する二重特異性抗体。