JP5773207B2

JP5773207B2 - Human rheumatoid arthritis bilan arthritis model non-human mammal

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Publication number: JP5773207B2
Application number: JP2011537334A
Authority: JP
Inventors: 正美武井; 滋正澤田
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2030-10-21
Also published as: JPWO2011049239A1; WO2011049239A1

Description

本発明は、ヒト関節リウマチ様関節炎であるビラン性関節炎を発症するモデル非ヒト哺乳動物に関する。また本発明は、上記モデル動物を用いた、関節リウマチ治療薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a model non-human mammal that develops biran arthritis, which is human rheumatoid arthritis. The present invention also relates to a screening method for a therapeutic agent for rheumatoid arthritis using the model animal.

ヒト関節リウマチは、関節部における炎症、骨破壊、骨の癒着及び変形等を主体とする、自己免疫性の難治疾患であり、一般に強い慢性化傾向を示す。また、ヒト関節リウマチは血管炎をしばしば合併するため、心筋炎、間質性肺炎及び抹消における血管炎等を引き起こし得る。これらの合併症も難治性であり、その特異的な治療薬の開発が切望されている。
従来、ヒト関節リウマチの治療薬開発等に用いられるモデル動物としては、誘発モデルとして、アジュバント関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎及びプリスタン誘発関節炎等のモデル動物が知られており、自然発症モデルとして、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス関節炎及びＮＺＢ／ＫＮマウス関節炎等のモデル動物が知られている（安倍千之、「関節炎モデル」、出版社：医薬ジャーナル社（東京）、１９９７年、ｐ４６９−４８２）。
しかしながら、上記誘発モデルの場合、自己免疫の発症機構が炎症を急激に誘導することで人為的であり、発症過程を解析するモデルとしては不適当であるうえ、必ずしも同じ抗原が関節リウマチで認識されている保証はない。一方、上記自然発症モデルの場合、自己免疫の発症機構が解析できるという魅力はあるが、発症率が低く、骨の破壊と同時に骨過形成像が観察され、特に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの場合はｆａｓ遺伝子の異常によって起こされるものであり、多くの関節リウマチ患者とはメカニズムが異なっている。このように、上記誘発モデルや自然発症モデルで観察される現象は、ヒト関節リウマチで観察される現象とは根本的に異なるため、発症する関節炎は、関節リウマチの病態と部分的に類似性をもってはいるものの、関節リウマチの病態を再現したものではない。また、ヒトとの種差による薬剤感受性が異なるなどの問題がある。
ところで、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢウイルス；ヒトヘルペスウイルス４）は、γヘルペスウイルスファミリーに属するヒトヘルペスウイルスである。ＥＢウイルスは、感染後ほとんどが潜在化し、その一生を終えるが、免疫抑制剤等の影響下では再活性化し、生体に重篤な状態を起こすことがある。よって、ＥＢウイルスの再活性化は、ＥＢウイルス関連疾患群の難病の病態に関与している可能性があると考えられている。
従来は、ＥＢウイルス感染モデル動物自体、コットントップタマリン等の希少霊長類を用いたものが存在するのみであり（Ｊ．Ａ．ウォルフ〔編集〕，Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ〔原著〕、谷憲三朗〔監修〕、「遺伝子治療学―基礎研究から臨床へ」、出版社：シュプリンガー・ジャパン（株）、１９９８年、ｐ３５６−３６６）、ヒト関節リウマチにおいて見られるような関節炎症状（ビラン性関節炎）を発症するものはなかった。Rheumatoid arthritis is an autoimmune intractable disease mainly composed of inflammation, bone destruction, bone adhesion and deformation in the joint, and generally shows a strong tendency to chronicity. In addition, since rheumatoid arthritis often accompanies vasculitis, it can cause myocarditis, interstitial pneumonia, and vasculitis in the extinction. These complications are also refractory, and the development of specific therapeutic agents is eagerly desired.
Conventionally, as model animals used for development of therapeutic agents for human rheumatoid arthritis, model animals such as adjuvant arthritis, type II collagen-induced arthritis and pristane-induced arthritis are known as induction models, and as spontaneous models, MRL Model animals such as / lpr mouse arthritis and NZB / KN mouse arthritis are known (Abe Chiyuki, “Arthritis Model”, Publisher: Pharmaceutical Journal, Tokyo, 1997, p469-482).
However, in the case of the above induction model, the onset mechanism of autoimmunity is artificially induced by abruptly inducing inflammation, which is inappropriate as a model for analyzing the onset process, and the same antigen is not always recognized in rheumatoid arthritis. There is no guarantee. On the other hand, in the case of the spontaneous development model, it is attractive that the onset mechanism of autoimmunity can be analyzed, but the incidence is low, and bone hyperplasia is observed at the same time as bone destruction, especially in the case of MRL / lpr mice. It is caused by an abnormality in the fas gene, and the mechanism is different from many patients with rheumatoid arthritis. As described above, the phenomenon observed in the induction model and the spontaneous development model is fundamentally different from the phenomenon observed in human rheumatoid arthritis. Therefore, the onset arthritis has a partial similarity to the pathology of rheumatoid arthritis. Yes, but not a reproduction of rheumatoid arthritis. There are also problems such as differences in drug sensitivity due to species differences from humans.
By the way, Epstein-Barr virus (EB virus; human herpesvirus 4) is a human herpesvirus belonging to the γ herpesvirus family. The EB virus is mostly latent after infection and ends its life, but it may be reactivated under the influence of an immunosuppressant or the like to cause a serious state in the living body. Therefore, it is considered that the reactivation of EB virus may be involved in the pathological conditions of intractable diseases in the EB virus-related disease group.
Conventionally, there are only EB virus infection model animals themselves and those using rare primates such as cotton top tamarin (JA Wolf (edit), JA Wolff (original)), Kensaburo Tani [Supervision], "Gene Therapy-From Basic Research to Clinical", Publisher: Springer Japan Co., Ltd., 1998, p356-366), Symptoms of joint inflammation (bilan arthritis) as seen in human rheumatoid arthritis None developed.

そこで、本発明が解決しようとする課題は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢウイルス）の直接感染により得られるモデル非ヒト哺乳動物であって、従来無かった新規な用途に用い得るモデル非ヒト哺乳動物、すなわちヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物を提供することにある。また、本発明は、当該モデル非ヒト哺乳動物を用いた、ヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ヒト免疫化マウスのＥＢウイルス直接感染モデルにおいて、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症するモデルマウスを初めて確認し、本発明を完成した。詳しくは、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症するモデルマウスを、自己免疫現象ではなく、ウイルス感染により初めて得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ヒト免疫化非ヒト哺乳動物にＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを感染させることにより得られ、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症することを特徴とする、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物。
上記（１）のモデル非ヒト哺乳動物としては、例えば、破骨細胞の分化誘導が促進されたものが挙げられる。破骨細胞は、骨融解（骨吸収）を起こす多核細胞である。
上記（１）のモデル非ヒト哺乳動物においては、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを感染させるヒト免疫化非ヒト哺乳動物として、例えば、免疫不全非ヒト哺乳動物にヒト造血幹細胞を移植して得られるものが挙げられる。
また、上記（１）のモデル非ヒト哺乳動物としては、非ヒト哺乳動物が、例えば齧歯類動物、具体的にはマウスであるものが挙げられる。
（２）上記（１）記載の非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、及び当該投与後の非ヒト哺乳動物におけるヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎の病態を評価する工程を含む、ヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法。Therefore, the problem to be solved by the present invention is a model non-human mammal obtained by direct infection with Epstein-Barr virus (EB virus), which can be used for a novel use which has not been heretofore, That is, the object is to provide a non-human mammal model of rheumatoid arthritis-like bilan arthritis. Another object of the present invention is to provide a method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis using the model non-human mammal.
The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, a model mouse that develops human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis was confirmed for the first time in an EB virus direct infection model of a human immunized mouse, and the present invention was completed. Specifically, the present inventors have found that a model mouse that develops human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis can be obtained for the first time not by an autoimmune phenomenon but by viral infection, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
(1) A human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis model non-human mammal obtained by infecting a human immunized non-human mammal with Epstein-Barr virus and developing human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis animal.
Examples of the model non-human mammal of (1) above include those in which osteoclast differentiation induction is promoted. Osteoclasts are multinucleated cells that cause osteolysis (bone resorption).
Examples of the model non-human mammal of (1) above include those obtained by transplanting human hematopoietic stem cells into an immunodeficient non-human mammal as a human immunized non-human mammal that infects Epstein-Barr virus. It is done.
Examples of the model non-human mammal of (1) above include those in which the non-human mammal is, for example, a rodent, specifically a mouse.
(2) Rheumatoid arthritis comprising a step of administering a candidate substance to the non-human mammal described in (1) above and a step of evaluating the pathological condition of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis in the non-human mammal after the administration Screening method for therapeutic and / or prophylactic agent for.

図１は、公知文献（Ｈ．ＰａｔｒｉｃｋＭｃＮｅｉｌｅｔａｌ．，“Ｔｈｅｍｏｕｓｅｍａｓｔｃｅｌｌ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｔｅｔｒａｍｅｒ−ｆｏｒｍｉｎｇｔｒｙｐｔａｓｅｓｍｏｕｓｅｍａｓｔｃｅｌｌｐｒｏｔｅａｓｅ６ａｎｄｍｏｕｓｅｍａｓｔｃｅｌｌｐｒｏｔｅａｓｅ７ａｒｅｃｒｉｔｉｃａｌｍｅｄｉａｔｏｒｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，ｖｏｌ．５８ｉｓｓｕｅ８，ｐ．２３３８−２３４６，２００８Ａｕｇｕｓｔ）に開示されている、従来公知の重症関節炎モデルの関節組織の症状を示す図（ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色）である。突き出した関節腔における、滲出液（図（ａ）中のｅ）、滑膜炎（図（ａ）中のｓ）パンヌス形成（図（ａ）中のｐ）、骨侵食（図（ｂ）中の矢印）を示す。
図２は、ＥＢウイルス感染ＮＯＧマウスのコントロール（ネガティブコントロール）となる、ＥＢウイルス未感染のＮＯＧマウスの関節組織を示す図である。ＮＯＧＮ６９−１、ＮＯＧＮ６９−３、ＮＯＧＮ６９−４、ＮＯＧＮ８７−１は、各ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．である。
図３は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧ７０−１３）の関節炎（滑膜炎）を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。
図４は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧ７０−１３）の関節局所の骨髄の浮腫を示した図（ＨＥ染色）である。ヒト関節リウマチの初期のＭＲＩで認められるものであり、ヒト化マウスで初めて証明できた大変重要な所見である。免疫組織染色により、ＣＤ４Ｔ細胞が主体であると証明されたものである。
図５は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ７９−１）における、ヒト関節リウマチで見られるビラン性関節炎を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。パンヌスと定義されるものであり、肉芽組織の中に、破骨細胞と考えられる多核細胞が認められ、他のマウスでは同様の多核細胞が骨組織に接しているところに多く集族していた。このことは、当該モデルマウスにおいて骨代謝系が活発に働いて、破骨細胞の分化誘導が促進され、骨融解機序がビラン性関節炎の初期に重要な働きをし、慢性関節炎に発展することを意味している。ビラン性関節炎初期の治療としては、炎症を抑える又は過剰な自己免疫現象を抑える治療よりも、破骨細胞の分化誘導を抑える治療の方が、関節炎の進行を抑制できるという可能性を示すものである。
図６は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧ７０−１３）に関して、免疫組織染色によりＴ細胞（ＣＤ３陽性）を見た結果を示す図である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。滑膜炎の部位に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞が誘導されていることが認められる。
図７は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧ７０−１３）に関して、免疫組織染色により、Ｂ細胞（ＣＤ２０）、単球（ＣＤ６８）、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８）を見た結果を示す図である。滑膜炎の部位にはＣＤ２０が少なく、ＣＤ６８も多くなく、このモデルマウスはヒト関節リウマチと異なり単球由来と考えられている滑膜表層細胞（滑膜Ａ型細胞）の増殖が認めらなかった。このことは、ヒトＣＤ３４幹細胞がこのモデルマウスで滑膜表層細胞に分化できないか、これまで考えられていた滑膜細胞の由来が誤っている可能性を示唆するものである。
図８は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧ７０−１３）に関して、免疫組織染色により、滑膜のＣＤ３Ｔ細胞とＣＤ２０Ｂ細胞、関節局所の骨髄のＣＤ４Ｔ細胞の浸潤を示した図である。
図９は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ８２−４）の関節炎（滑膜炎、パンヌス、骨髄の浮腫）を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。
図１０は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ８５−４）の関節炎を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。ＥＢウイルス感染後、ＣＤ３抗体でＴ細胞を殺したモデルマウスであり、他のモデルマウスより強い破壊性関節炎を起こしていることが認められる。このことは、ＥＢウイルス感染量をコントロールしなければならない時期にＴ細胞を除くことにより、重症な破壊性関節炎を惹起する可能性があることを示すものであり、またＴ細胞の制御をすることで、破壊性関節炎を抑制することも悪化させることも可能であることを意味するものでもある。
図１１は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ８７−６）の関節炎を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。このモデルマウスは、パンヌスが強いモデルの例であり、肉芽の骨に接するところに多くの多核細胞（破骨細胞と考えられる）が集まり、骨融解を起こしていることが認められる。
図１２は、ヒト臍帯血ＣＤ３４幹細胞を移植した後のＮＧＯマウス（サンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ８７−４）に、ＥＢウイルスを感染させた又は非感染のモデルマウスの滑膜の状態を示す図（ＨＥ染色）である。図（ａ）が、ＥＢウイルス非感染モデルマウスで、図（ｂ）が、ＥＢウイルス感染モデルマウスである。ＥＢウイルス感染モデルマウスにのみ、滑膜炎が生じていることが認められる。
図１３は、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）感染ヒト免疫化ＮＯＧマウス関節リウマチ（ＲＡ）モデルの作製手順及び症状（関節炎）確認手順の概要をまとめた図である。ＥＢＶｉｎｆｅｃｔｅｄは、ＥＢウイルスを感染させた各ＮＯＧマウス（ＮＯＧ７０−１３、ＮＯＧＮ７９−１及びＮＯＧＮ８５−４など）に関する概要を示している。ｃｏｎｔｒｏｌは、ＥＢウイルス非感染モデル（ＮＯＧＮ６９−１，ＮＯＧＮ６９−３，ＮＯＧＮ６９−４，ＮＯＧＮ８７−１）、正常ヒト末梢単核球を移植したモデル（ＫＳ−ＰＢＭＣ）、及びヒト末梢ＣＤ４を移植したが生着はしていない（ヒト化していない）モデル（ＫＳ−ＣＤ４）に関する概要を示している。
図１４は、ＥＢウイルス感染による本発明のモデルマウス（ＮＯＧマウスのサンプルＮｏ．：ＮＯＧＮ７９−１）に関する、ＥＢＶｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ（ＥＢＥＲ）−１のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。図（ａ）は図（ｂ）の拡大図である。滑膜炎の部位は僅かな陽性のみで、骨髄に多くの陽性細胞が認められた。骨髄にＥＢウイルスの強い感染の場があり、この反応により骨髄と滑膜にある連絡路を通して多分炎症性サイトカインの影響を受け、滑膜の増殖、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導が、骨髄の浮腫やパンヌスの形成、破骨細胞の分化誘導を起こしている（促進している）。これにより、関節リウマチ様のビラン性関節炎を、ＥＢウイルスが直接誘導することが判明したと考えられる。Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＥＢウイルス陽性リンパ節の陽性コントロールである。Figure 1, known in the literature (H.Patrick McNeil et al., "The mouse mast cell-restricted tetramer-forming tryptases mouse mast cell protease 6 and mouse mast cell protease 7 are critical mediators in inflammatory arthritis", Arthritis & Rheumatism, vol 58 (issue 8, p. 2338-2346, August, August) showing a symptom of a joint tissue of a conventionally known severe arthritis model (hematoxylin-eosin (HE) staining). Exudate (e in Fig. (A)), synovitis (s in Fig. (A)) pannus formation (p in Fig. (A)), bone erosion (in Fig. (B)) in the protruding joint cavity Arrow).
FIG. 2 is a view showing a joint tissue of a NOG mouse not infected with EB virus, which serves as a control (negative control) of NOG mice infected with EB virus. NOG N69-1, NOG N69-3, NOG N69-4, and NOG N87-1 are sample Nos. Of NOG mice. It is.
FIG. 3 is a view (HE staining) showing arthritis (synovitis) of a model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG 70-13) caused by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B).
FIG. 4 is a diagram (HE staining) showing bone marrow edema in the joint area of the model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG 70-13) due to EB virus infection. It is recognized by the early MRI of human rheumatoid arthritis and is a very important finding that has been demonstrated for the first time in humanized mice. CD4 T cells have been proved to be the main body by immunohistochemical staining.
Fig. 5 is a diagram (HE staining) showing bilian arthritis observed in human rheumatoid arthritis in a model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG N79-1) caused by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B). It is defined as pannus, and multinucleated cells considered to be osteoclasts were found in the granulation tissue, and in other mice, many of the same multinucleated cells were gathered in contact with the bone tissue. . This means that the bone metabolic system works actively in the model mouse, the differentiation induction of osteoclasts is promoted, and the osteolytic mechanism plays an important role in the early stage of bilan arthritis and develops into chronic arthritis. Means. As an early treatment of biliary arthritis, treatment that suppresses osteoclast differentiation is more likely to suppress the progression of arthritis than treatment that suppresses inflammation or excessive autoimmunity. is there.
FIG. 6 is a view showing the results of looking at T cells (CD3 positive) by immunohistochemical staining of the model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG 70-13) by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B). It can be seen that CD3-positive T cells are induced at the site of synovitis.
FIG. 7 shows B cell (CD20), monocyte (CD68), T cell (CD4, CDG) by immunohistochemical staining of the model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG 70-13) by EB virus infection. It is a figure which shows the result which looked at CD8). There are few CD20 and no CD68 at the site of synovitis, and this model mouse, unlike human rheumatoid arthritis, does not show proliferation of synovial surface cells (synovial type A cells) which are considered to be derived from monocytes. It was. This suggests that human CD34 stem cells cannot differentiate into synovial surface cells in this model mouse or that the origin of synovial cells, which has been considered so far, may be incorrect.
FIG. 8 shows synovial CD3T cells and CD20B cells, and joint bone marrow CD4T cells of a model mouse of the present invention by EB virus infection (NOG mouse sample No .: NOG 70-13) by immunohistochemical staining. It is the figure which showed infiltration.
FIG. 9 is a diagram (HE staining) showing arthritis (synovitis, pannus, bone marrow edema) of a model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG N82-4) caused by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B).
FIG. 10 is a view (HE staining) showing arthritis of a model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG N85-4) caused by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B). It is a model mouse in which T cells were killed with a CD3 antibody after EB virus infection, and it is observed that the destructive arthritis is stronger than other model mice. This indicates that removal of T cells at a time when the amount of EB virus infection must be controlled may cause severe destructive arthritis, and control of T cells. It also means that destructive arthritis can be suppressed or worsened.
FIG. 11 is a diagram (HE staining) showing arthritis of a model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG N87-6) caused by EB virus infection. FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B). This model mouse is an example of a model with a strong pannus, and it is recognized that many multinucleated cells (considered as osteoclasts) are gathered in contact with the granulation bone, causing osteolysis.
FIG. 12 is a diagram showing the condition of synovium of a model mouse in which an EB virus is infected or non-infected in an NGO virus (sample No .: NOG N87-4) after transplantation of human cord blood CD34 stem cells (HE). Dyeing). Fig. (A) is an EB virus non-infected model mouse, and Fig. (B) is an EB virus infected model mouse. It is recognized that synovitis occurs only in the EB virus-infected model mice.
FIG. 13 is a diagram summarizing a procedure for preparing an EB virus (EBV) -infected human immunized NOG mouse rheumatoid arthritis (RA) model and a procedure for confirming symptoms (arthritis). EBV infected shows an overview of each NOG mouse (NOG 70-13, NOG N79-1, NOG N85-4, etc.) infected with the EB virus. The controls are EB virus non-infection models (NOG N69-1, NOG N69-3, NOG N69-4, NOG N87-1), models transplanted with normal human peripheral mononuclear cells (KS-PBMC), and human peripheral CD4. Shows an overview of a model (KS-CD4) that has been implanted but not engrafted (humanized).
FIG. 14 is a view showing the results of in situ hybridization of EBV encoded small nuclear RNA (EBER) -1 with respect to the model mouse of the present invention (NOG mouse sample No .: NOG N79-1) by EB virus infection. . FIG. (A) is an enlarged view of FIG. (B). The site of synovitis was only slightly positive, and many positive cells were found in the bone marrow. There is a strong infection site of the EB virus in the bone marrow, and this reaction is probably influenced by inflammatory cytokines through the connection between the bone marrow and the synovium, and synovial proliferation, induction of CD4 positive T cells, bone marrow edema and Pannus formation and osteoclast differentiation are induced (promoted). Thus, it is considered that the EB virus directly induced rheumatoid arthritis-like bilan arthritis. Control is a positive control for EB virus positive lymph nodes.

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−２４２３２１号明細書（２００９年１０月２１日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物
本発明に係るヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物は、前述した通り、ヒト免疫化非ヒト哺乳動物にＥＢウイルスを感染させることにより得られ、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症することを特徴とするものである。
また本発明は、ヒト免疫化非ヒト哺乳動物にＥＢウイルスを感染させることを特徴とする、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（作出方法）を提供するものでもある。
１−１．ヒト免疫化非ヒト哺乳動物
本発明に用いるヒト免疫化非ヒト哺乳動物は、免疫不全非ヒト哺乳動物にヒト造血幹細胞を移植して得られるものであることが好ましい。
免疫不全非ヒト哺乳動物としては、限定はされず、従来公知の免疫不全動物を使用することができる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウスである場合、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β ２ｍｎｕｌｌマウス（β２ｍ（ｎｕｌｌ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）、ＮＯＧマウス（ＮＫ活性を消失させ且つ樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス；ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス；財団法人実験動物中央研究所より入手可能；Ｙａｊｉｍａｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００８，Ｓｅｐ１，ｖｏｌ．１９８（５），ｐ．６７３−８２を参照）、ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＣｒｌＣｒｌｊマウス；日本チャールス・リバー社より入手可能）、ＩＣＲヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＣｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；日本チャールス・リバー社より入手可能）等が挙げられるが、中でもＮＯＧマウスが好ましい。
ヒト造血幹細胞としては、限定はされないが、例えば、臍帯血から分離された造血幹細胞（具体的には、ＣＤ３４陽性造血幹細胞など）や、市販のＣＤ３４陽性造血幹細胞等を用いることができる。
免疫不全非ヒト哺乳動物へのヒト造血幹細胞の移植は、常法により行えばよく、特に限定はされない。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス等である場合、尾静脈への投与や、静脈からの輸注、骨髄内への注入等により、ヒト造血幹細胞の移植を行うことができる。
本発明に用いる非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物が挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物が好ましく、より好ましくはマウスである。なお、非ヒト哺乳動物としてマウスを用いる場合、その年齢は限定されないが、例えば５〜２０週齢のものが好ましく、より好ましくは６〜１５週齢、さらに好ましくは８〜１２週齢である。
１−２．ＥＢウイルスの感染
本発明においては、上記のヒト免疫化非ヒト哺乳動物に対してＥＢウイルスの直接感染を行う。当該感染の方法は、常法により行えばよく、特に限定はされない。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス等である場合、尾静脈への投与や、静脈からの輸注、骨髄内への注入等により、所定量のＥＢウイルスの直接感染を行うことができる。
ＥＢウイルスの感染量（投与量）は、限定はされないが、例えば、４〜１０００ＴＤ_５０であることが好ましく、低濃度投与でも関節炎を起こし得る。
１−３．ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎の発症
上記ＥＢウイルスの感染を行った非ヒト哺乳動物において、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎が発症しているか否かの確認は、例えば、手指、手、肘、足指、足、膝等の各種関節部位について、Ｘ線やＭＲＩでの観察で手足の骨侵食があることが認められればビラン性関節炎を発症していると評価することができる。また、ＭＲＩで骨髄浮腫が認められる場合も、同様にビラン性関節炎を発症していると評価することができる。本発明のモデル非ヒト哺乳動物においては、組織でヒト関節リウマチのビラン性関節炎で認めるパンヌスと骨のビラン、骨髄浮腫を再現することができるため、臨床で行われている画像診断技術（放射性同位元素によるものや超音波検査など）でも検出することが可能である。
本発明のモデル非ヒト哺乳動物は、前述の通り、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症する非ヒト哺乳動物であり、好ましくは骨融解を起こす破骨細胞の分化誘導が促進された非ヒト哺乳動物である。本発明のモデル非ヒト哺乳動物は、より具体的には、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）等の症状及び病態等が認められるものである。各症状及び病態の確認方法、検査方法等は、従来公知の方法を用いて行うことができる。
（ｉ）滑膜組織の増殖
（ｉｉ）ＲＡ滑膜を使用したＥＢＥＲ−１ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて陽性
（ｉｉｉ）滑膜組織へのＴ細胞の浸潤
（ｉｖ）パンヌスの形成
（ｖ）骨浸食（ビラン）
（ｖｉ）関節局所の骨髄へのＴ細胞浸潤（骨ビラン）
２．ビラン性関節炎の治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法
前述の通り、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物は、ヒトの関節リウマチの病態とよく一致するため、当該疾患の治療薬及び予防薬の開発において極めて有用なものである。そこで本発明は、前記本発明のモデル非ヒト哺乳動物を用いたヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られるヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬を提供する。
本発明において、ヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬をスクリーニングする方法は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む。なお、本発明のスクリーニング方法は、必要に応じ、他の何らかの工程を含んでいてもよい。
（ａ）候補物質を本発明のヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物に投与する工程（投与工程）
（ｂ）上記投与後の非ヒト哺乳動物についてヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎の病態を評価する工程（評価工程）
「ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎の病態を評価する」とは、候補物質を投与した後における本発明のモデル非ヒト哺乳動物のヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎に関する病態を解析することを意味し、同一の本発明のモデル非ヒト哺乳動物について候補物質の投与前後におけるヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎に関する病態を比較検討すること、又は、候補物質を投与した本発明のモデル非ヒト哺乳動物（被験動物）と投与しない本発明のモデル非ヒト哺乳動物（対照動物）との比較検討を行うことの、いずれをも意味するものである。なお、上述した候補物質の投与前後について比較検討する場合に関しては、以下の説明については、投与前の非ヒト哺乳動物を対照動物とみなし、投与後の非ヒト哺乳動物を被験動物とみなして適用されるものとする。
以下に、上記各工程について説明する。
（ａ）投与工程
被験動物及び対照動物は、通常、同種の非ヒト動物を用いる。また、被験動物及び対照動物は、同性及び同齢の動物を用いることが好ましく、同腹のものを用いることがより好ましい。さらに、被験動物及び対照動物は、飼育条件は同様であることが好ましい。
被験動物に投与する候補物質としては、限定はされないが、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。
候補物質の投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、被験動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
（ｂ）評価工程
ヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬をスクリーニングする場合は、候補物質が投与された被験動物、及び候補物質が投与されていない対照動物について、各種評価項目、例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、踵浮腫、組織学的観察、Ｘ線像、ＭＲＩ、放射線同位元素等を比較評価することが好ましい。これら評価項目の評価（測定方法等）は、公知の手段及び手順により行うことができる。
（ｉ）炎症反応評価
被験動物及び対照動物の四肢に関して両動物を比較評価する。
被験動物と対照動物との間で、血清中ＣＲＰのレベルに有意差が無かったときは、被験動物に投与した候補物質は、目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬であると評価できる。一方、被験動物の方が有意に高いレベルを保持したときは、候補物質は目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬ではないと評価できる。
（ｉｉ）関節炎の評価
被験動物及び対照動物の関節炎の発症の有無とその推移に関して両動物を比較評価する。
被験動物と対照動物との間で、足容積測定装置（室町機械株式会社製、ＶｏｌｕｍｅＭｅｔｅｒＭＫ−５５０）を用いてラット両側後肢の足部容積（ｐａｗｖｏｌｕｍｅ）を、採血日ごとに測定し評価する。
なお、容積の増加率は、感作日の平均ｖｏｌｕｍｅに対する両側後肢の平均増加量を算出する。有意差が無かったときは、被験動物に投与した候補物質は、目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬であると評価できる。一方、被験動物の方が有意に高いレベルを保持したときは、候補物質は目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬ではないと評価できる。
（ｉｉｉ）組織学的観察の評価
被験動物及び対照動物の病理組織に関して両動物を比較評価する。
被験動物と対照動物との間で、滑膜、並びに骨及び軟骨組織の炎症に伴う変化のレベルに有意差が無かったときは、被験動物に投与した候補物質は、目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬であると評価できる。一方、被験動物の方が有意に高いレベルを保持したときは、候補物質は目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬ではないと評価できる。
（ｉｖ）ＭＲＩやＸ線による骨ビランや骨髄浮腫の評価
被験動物及び対照動物の四肢に関して両動物を比較評価する。
被験動物と対照動物との間で、ＭＲＩやＸ線により観察される骨ビランや骨髄浮腫のレベルに有意差が無かったときは、被験動物に投与した候補物質は、目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬であると評価できる。一方、被験動物の方が有意に高いレベルを保持したときは、候補物質は目的のヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬ではないと評価できる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these explanations, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention. In addition, this specification includes the whole of Japanese Patent Application No. 2009-242321 specification (filed on October 21, 2009), which is the basis for claiming priority of the present application. In addition, all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, and publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.
1. Bilan arthritis model non-human mammal The human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis model non-human mammal according to the present invention is obtained by infecting a human immunized non-human mammal with an EB virus as described above. It is characterized by developing rheumatoid bilan arthritis.
The present invention also provides a method (production method) for producing a human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis model non-human mammal characterized by infecting a human immunized non-human mammal with an EB virus.
1-1. Human immunized non-human mammal The human immunized non-human mammal used in the present invention is preferably obtained by transplanting human hematopoietic stem cells into an immunodeficient non-human mammal.
The immunodeficient non-human mammal is not limited, and conventionally known immunodeficient animals can be used. For example, when the non-human mammal is a mouse, a nude mouse, a SCID mouse, a NOD / Shi-scid mouse, a NOD / ShiJic-scid mouse, a NOD / LtSz-scid mouse, a NOD / LtSz-scid, β 2m null mouse ( β2m (null) NOD / SCID mice), NOG mice (immuno-deficient mice with abolished NK activity and reduced dendritic cell function; NOD / Shi-scid, IL-2Rγ ^null mice; Central Institute for Experimental Animals) Yajima et al, J. Infect.Dis., 2008, Sep 1, vol.198 (5), p.673-82), SCID mouse (CB17 / Icr-Prkdcscid / CrlCrlj mouse; Charles Japan)・ From River Possible), ICR nude mice (SPF / VAF Crlj: CD1-Foxn1nu; but Charles River Japan available from) and the like, among them NOG mouse is preferred.
Although it does not limit as a human hematopoietic stem cell, For example, the hematopoietic stem cell isolate | separated from cord blood (specifically CD34 positive hematopoietic stem cell etc.), a commercially available CD34 positive hematopoietic stem cell, etc. can be used.
Transplantation of human hematopoietic stem cells into an immunodeficient non-human mammal may be performed by a conventional method and is not particularly limited. For example, when the non-human mammal is a mouse or the like, human hematopoietic stem cells can be transplanted by administration into the tail vein, infusion from the vein, injection into the bone marrow, or the like.
Examples of the non-human mammal used in the present invention include mammals other than humans such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, dogs, cats, monkeys, sheep, cows and horses. Among them, mice, rats and guinea pigs are used. A rodent (murine) animal such as the above is preferable, and a mouse is more preferable. In addition, when using a mouse | mouth as a non-human mammal, the age is not limited, For example, the thing of 5-20 weeks old is preferable, More preferably, it is 6-15 weeks old, More preferably, it is 8-12 weeks old.
1-2. Infection with EB virus In the present invention, the above human immunized non-human mammal is directly infected with EB virus. The infection method may be performed by a conventional method, and is not particularly limited. For example, when the non-human mammal is a mouse or the like, a predetermined amount of EB virus can be directly infected by administration into the tail vein, intravenous infusion, injection into the bone marrow, or the like.
Although the amount of EB virus infection (dose) is not limited, it is preferably, for example, 4 to 1000 TD ₅₀ , and arthritis can occur even when administered at a low concentration.
1-3. Development of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis In non-human mammals infected with the above-mentioned EB virus, whether or not human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis has occurred is confirmed by, for example, fingers, hands, elbows, feet If various joint sites such as fingers, feet, and knees are observed to have bone erosion of the limbs by observation with X-rays or MRI, it can be evaluated that bilian arthritis has developed. Similarly, when bone marrow edema is observed by MRI, it can be similarly evaluated that biliary arthritis has developed. Since the model non-human mammal of the present invention can reproduce pannus, bone bilane, and bone marrow edema that are recognized in the tissue of human rheumatoid arthritis, it can be reproduced. It can also be detected by elemental or ultrasonic inspection.
As described above, the model non-human mammal of the present invention is a non-human mammal that develops rheumatoid arthritis-like bilan arthritis, and preferably a non-human mammal that has been promoted to induce osteoclast differentiation that causes osteolysis. Is an animal. More specifically, the model non-human mammal of the present invention is one in which, for example, the following symptoms (i) to (vi) and the like are observed. The confirmation method of each symptom and disease state, the inspection method, etc. can be performed using a conventionally well-known method.
(I) Proliferation of synovial tissue (ii) Positive in EBER-1 in situ hybridization using RA synovial membrane (iii) T cell infiltration into synovial tissue (iv) Formation of pannus (v) Bone erosion ( Bilan)
(Vi) T cell infiltration into bone marrow in the joint area (bone bilan)
2. As described above, since a non-human mammal model of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis is in good agreement with the pathological condition of human rheumatoid arthritis, the therapeutic and prophylactic agents for the disease It is extremely useful in drug development. Thus, the present invention provides a method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for rheumatoid arthritis using the model non-human mammal of the present invention, and a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis obtained by the method. .
In the present invention, the method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis includes the following steps (a) and (b). Note that the screening method of the present invention may include some other steps as necessary.
(A) A step of administering a candidate substance to a human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis model non-human mammal of the present invention (administration step)
(B) A step of evaluating the pathological condition of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis in the non-human mammal after the administration (evaluation step)
`` Evaluating the pathology of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis '' means analyzing the pathology related to human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis of the model non-human mammal of the present invention after administering the candidate substance, The same model non-human mammal of the present invention is examined for pathological conditions related to human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis before and after administration of the candidate substance, or the model non-human mammal of the present invention administered with the candidate substance (test animal) ) And a non-administered model non-human mammal of the present invention (control animal). In addition, in the case where the above-mentioned candidate substances are compared before and after administration, the following explanation applies to the case where the non-human mammal before administration is regarded as a control animal and the non-human mammal after administration is regarded as a test animal. Shall be.
Below, each said process is demonstrated.
(A) Administration Step Usually, the same kind of non-human animal is used as the test animal and the control animal. Moreover, it is preferable to use animals of the same sex and the same age as the test animal and the control animal, and it is more preferable to use animals of the same litter. Furthermore, it is preferable that the test animal and the control animal have the same rearing conditions.
Candidate substances to be administered to a test animal are not limited, but include various peptides, proteins (including enzymes and antibodies), nucleic acids (polynucleotide (DNA, RNA), oligonucleotides (siRNA, etc.) that are naturally or artificially synthesized. ), Peptide nucleic acids (PNA), etc.), low molecular or high molecular organic compounds, and the like.
The candidate substance can be administered orally or parenterally, and is not limited. In any case, known administration methods, administration conditions, and the like can be adopted. The dose can be appropriately set in consideration of the type and condition of the test animal, the type of candidate substance, and the like.
(B) Evaluation process When screening for a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis, various evaluation items such as CRP (C Reactive protein), sputum edema, histological observation, X-ray image, MRI, radioisotope, and the like are preferably compared. Evaluation (measurement method, etc.) of these evaluation items can be performed by known means and procedures.
(I) Evaluation of Inflammatory Response Both animals are compared and evaluated with respect to the extremities of the test animal and the control animal.
If there is no significant difference in serum CRP levels between the test animal and the control animal, the candidate substance administered to the test animal can be evaluated as a therapeutic and / or prophylactic agent for the intended human rheumatoid arthritis . On the other hand, when the test animal has a significantly higher level, it can be evaluated that the candidate substance is not the intended therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis.
(Ii) Evaluation of arthritis Both animals are compared and evaluated with respect to the presence or absence of arthritis in the test animal and the control animal and their transition.
Between the test animal and the control animal, the foot volume of the rat's both hind limbs (paw volume) was measured for each blood collection day using a paw volume measuring device (Muromachi Kikai Co., Ltd., Volume Meter MK-550). To do.
In addition, the increase rate of a volume calculates the average increase amount of a bilateral hind leg with respect to the average volume of a sensitization day. When there is no significant difference, the candidate substance administered to the test animal can be evaluated as a target therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis. On the other hand, when the test animal has a significantly higher level, it can be evaluated that the candidate substance is not the intended therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis.
(Iii) Evaluation of histological observation Both animals are compared and evaluated with respect to the pathological tissues of the test animals and control animals.
If there is no significant difference between the test animal and the control animal in the level of changes associated with inflammation of the synovium and bone and cartilage tissue, the candidate substance administered to the test animal is the target treatment for rheumatoid arthritis. And / or can be evaluated as a prophylactic agent. On the other hand, when the test animal has a significantly higher level, it can be evaluated that the candidate substance is not the intended therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis.
(Iv) Evaluation of bone villan and bone marrow edema by MRI and X-rays Both animals are compared and evaluated with respect to the extremities of the test animal and the control animal.
When there is no significant difference in the level of bone bilan or bone marrow edema observed by MRI or X-ray between the test animal and the control animal, the candidate substance administered to the test animal is the target treatment for human rheumatoid arthritis. And / or can be evaluated as a prophylactic agent. On the other hand, when the test animal has a significantly higher level, it can be evaluated that the candidate substance is not the intended therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.

１．ヒト免疫化マウスの作製
免疫不全マウスとしてのＮＯＧマウス（８〜１２週齢）を、財団法人実験動物中央研究所より購入した。
ＮＯＧマウスは、ＮＫ活性を消失させ且つ樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウスである（本実施例に用いたマウスについては図１３（具体的には、図中の「ＥＢＶｉｎｆｅｃｔｅｄ」欄及び「ｃｏｎｔｒｏｌ」欄のマウス）参照）。これらのＮＯＧマウスに対し、東京臍帯血バンクより供給された臍帯血から分離したＣＤ３４陽性造血幹細胞を（５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）、尾静脈から投与してヒト免疫系を移植した（図１３参照）。
移植後、３ヶ月経過後、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９陽性細胞数をそれぞれ測定し、ヒト免疫化を確認した。具体的には、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植（〜５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）３ヶ月経過後、末梢血中のヒト細胞の生着を確認（ｈＣＤ１９，ｈＣＤ３，ｈＣＤ４５，ｍＣＤ４５）してヒト免疫化されていることを評価した。
２．Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウイルスの感染
上記１．項で作製した複数のヒト免疫化マウスに対し、感染実験を行う直前に、ヒト細胞の組成をチェックした（ｈＣＤ１９，ｈＣＤ３，ｈＣＤ４５，ｍＣＤ４５）（ｈＣＤ３，ｈＣＤ４，ｈＣＤ８，ｈＣＤ４５）。それぞれ、１０^０、１０^１、１０^２及び１０^３ＴＤ_５０のＥＢウイルスを尾静脈から投与して、当該ウイルスを直接感染させた（図１３参照）。
感染後、１ヶ月〜３ヶ月の間、各マウスの末梢血を定期的に採取し、ＥＢウイルスＤＮＡ量を測定して、感染成立の指標とした。具体的には、末梢血リンパ球の組成、末梢血中ＥＢＶコピー数測定、体重を測定して、ＥＢウイルスの感染を評価した。
なお、上記ヒト免疫化マウスのうちＮＯＧＮ８５−４については、ＥＢウイルスの接種（１０^２ＴＤ_５０）後、抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を殺す実験を行った。具体的には、ウイルス接種の２１日後から、抗ＣＤ３抗体（ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ３ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＪａｎｓｓｅｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ））を、２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙの投与量で、実験終了まで毎日静注投与した。ＯＫＴ３抗体を投与した典型的なマウスでは、投与後２週間で、ヒトＣＤ４５＋細胞の０．１％がＣＤ４＋ＣＤ８−であり、０．８％がＣＤ４−ＣＤ８＋であった。コントロールマウスでは、ヒトＣＤ４５＋細胞の１５．０％がＣＤ４＋ＣＤ８−であり、１２．５％がＣＤ４−ＣＤ８＋であった。すなわち、このＯＫＴ３抗体は、特定の標的細胞の数を顕著に減少させる効果を有するものであった。抗体投与又は非投与のマウスの生存曲線は、ｌｏｇ−ｒａｎｋテストにより統計的に比較した。
３．ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎の発症確認
上記２．項でのＥＢウイルス感染後、１、２、６及び１２ヶ月経過後のマウスを、それぞれＣＯ_２により安楽死させ、手指、手、肘、足指、足及び膝の各関節を摘出した。
これらの各関節について、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色による病理学的検討を行い、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎所見の有無を検討した。その結果、パンヌスを伴う骨ビランと滑膜組織の増殖、骨髄への炎症細胞浸潤を認めた（図３〜５及び９〜１２参照、対照として図１及び２参照）。
また、免疫化学染色（ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ２０，ＣＤ１６，ＣＤ６８）により、関節周辺組織に存在するリンパ球の性状を解析し（図６〜８参照）、ＥＢＥＲｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＥＢウイルスの検出を行った（図１４参照）。その結果、滑膜組織へのＴ細胞（主にＣＤ４陽性細胞）の浸潤や、関節局所骨髄へのＴ細胞（主にＣＤ４陽性細胞）の浸潤を認めた。パンヌスの関節骨の浸食されている部位に多核細胞の誘導が起こっており、つまり破骨細胞の分化誘導が促進されていた。なお、当該ＥＢウイルスのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＥＢＶｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ（ＥＢＥＲ）を検出する標準的な手順及び条件等の下で行った。
以上のことから、本実施例のモデルマウスは、ＥＢウイルス感染のみでヒト関節リウマチに起こるビラン性関節炎の基本的病態を全て備えており、これまで考えられていた自己免疫反応による炎症が主因でなく、ウイルス感染のみでヒト関節リウマチにおけるビラン性関節炎を引き起こすことに成功したものであることが確認された。1. Production of human immunized mice NOG mice (8-12 weeks old) as immunodeficient mice were purchased from the Institute for Experimental Animal Research.
The NOG mouse is an immunodeficient mouse in which NK activity is lost and dendritic cell function is reduced (for the mouse used in this example, see FIG. 13 (specifically, the “EBV infected” column in the figure and See mouse in the "control" column)). To these NOG mice, CD34 positive hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood supplied from the Tokyo umbilical cord blood bank (5 × 10 ⁴ cells / mouse) were administered from the tail vein and transplanted with the human immune system (FIG. 13). reference).
Three months after transplantation, the number of human CD45, CD3, and CD19 positive cells was measured to confirm human immunization. Specifically, after transplanting human CD34 positive hematopoietic stem cells (˜5 × 10 ⁴ cells / mouse) for 3 months, engraftment of human cells in peripheral blood (hCD19, hCD3, hCD45, mCD45) was confirmed. The immunization was evaluated.
2. Infection with Epstein-Barr (EB) virus The composition of human cells was checked immediately before the infection experiment was performed on the plurality of human immunized mice prepared in the section (hCD19, hCD3, hCD45, mCD45) (hCD3, hCD4, hCD8, hCD45). Each of 10 ⁰ , 10 ¹ , 10 ² and 10 ³ TD ₅₀ EB viruses were administered from the tail vein to directly infect the viruses (see FIG. 13).
From 1 month to 3 months after infection, peripheral blood of each mouse was collected periodically, and the amount of EB virus DNA was measured as an index for the establishment of infection. Specifically, EB virus infection was evaluated by measuring peripheral blood lymphocyte composition, peripheral blood EBV copy number measurement, and body weight.
Note that the NOG N85-4 among the human immunized mice, following inoculation with EB virus ⁽¹⁰ 2 _{TD 50),} an experiment was performed to kill T cells with anti-CD3 antibody. Specifically, 21 days after virus inoculation, an anti-CD3 antibody (Orthoclone OKT3 antibody (Janssen Pharmaceutical)) was intravenously administered every day until the end of the experiment at a dose of 2 mg / mouse / day. In typical mice that received the OKT3 antibody, 2% after administration, 0.1% of human CD45 + cells were CD4 + CD8− and 0.8% were CD4-CD8 +. In control mice, 15.0% of human CD45 + cells were CD4 + CD8- and 12.5% were CD4-CD8 +. That is, this OKT3 antibody has an effect of significantly reducing the number of specific target cells. Survival curves of mice with or without antibody were statistically compared by the log-rank test.
3. Confirmation of the onset of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis 2. After the EB virus infection in the section, mice after 1, 2, 6 and 12 months passed were euthanized with CO ₂ , and the joints of fingers, hands, elbows, toes, feet and knees were removed.
Each of these joints was pathologically examined by staining with HE (hematoxylin and eosin), and the presence or absence of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis was examined. As a result, bone billan with pannus, synovial tissue proliferation, and inflammatory cell infiltration into the bone marrow were observed (see FIGS. 3-5 and 9-12, and FIGS. 1 and 2 as controls).
In addition, the properties of lymphocytes present in the tissue around the joint were analyzed by immunochemical staining (CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD68) (see FIGS. 6 to 8), and EB virus was detected by EBER in situ hybridization. Was detected (see FIG. 14). As a result, infiltration of T cells (mainly CD4 positive cells) into the synovial tissue and infiltration of T cells (mainly CD4 positive cells) into the joint local bone marrow were observed. Induction of multinucleated cells occurred in the eroded part of the joint bone of Pannus, that is, differentiation induction of osteoclasts was promoted. The in situ hybridization of the EB virus was performed under standard procedures and conditions for detecting EBV encoded small nucleotide RNA (EBER).
From the above, the model mouse of this example has all the basic pathological conditions of bilian arthritis that occur in human rheumatoid arthritis only by EB virus infection, mainly due to inflammation caused by autoimmune reaction that has been considered so far. In addition, it was confirmed that viral infection alone was successful in causing bilian arthritis in human rheumatoid arthritis.

本発明によれば、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎モデル非ヒト哺乳動物を提供することができる。また、当該モデル非ヒト哺乳動物を用いた、ヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法を提供することもできる。
本発明のモデル非ヒト哺乳動物は、ＥＢウイルスの直接感染により得られる非ヒト哺乳動物としては従来見出されていなかった上記ビラン性関節炎の発症モデル動物である点で、極めて有用なものである。つまり、ヒト関節リウマチ様ビラン性関節炎を発症するモデルマウスが、自己免疫現象ではなく、ウイルス感染により初めて得られることが見出されたことが、極めて重要な点である。
また、本発明のモデル非ヒト哺乳動物は、従来公知のヒト関節リウマチモデル動物に比べて、簡易かつ安価に作製することができ、しかもヒト関節リウマチの治療及び／又は予防薬のスクリーニング方法等の実験に使用し易いという点で、極めて経済性及び実用性にも優れたものである。詳しくは、本発明のモデル非ヒト哺乳動物は、炎症の発症及び進展が緩やかであるため、ヒトにおける症状に近く、病態を解明し及び薬効を見るのに適しており、具体的には、関節軟骨の深い部分まで炎症が進行するため、関節の滑膜表面がビラン状になり、ヒト関節リウマチ様関節炎に非常に近い病態を示すため、極めて実用性に優れたものである。According to the present invention, a human model for rheumatoid arthritis-like bilan arthritis model non-human mammal can be provided. It is also possible to provide a method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis using the model non-human mammal.
The model non-human mammal of the present invention is extremely useful in that it is a model animal for the onset of the above-mentioned bilan arthritis that has not been conventionally found as a non-human mammal obtained by direct infection with an EB virus. . In other words, it is extremely important that a model mouse that develops human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis can be obtained for the first time not by an autoimmune phenomenon but by viral infection.
In addition, the model non-human mammal of the present invention can be prepared more easily and at a lower cost than a conventionally known human rheumatoid arthritis model animal, and a method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis, etc. It is extremely economical and practical in that it is easy to use for experiments. Specifically, since the model non-human mammal of the present invention has a slow onset and progress of inflammation, it is close to the symptoms in humans, and is suitable for elucidating the pathological condition and seeing the drug efficacy. Since inflammation progresses to the deep part of the cartilage, the synovial surface of the joint becomes bilan-like and shows a pathological condition very close to that of human rheumatoid arthritis, so it is extremely practical.

Claims

Human rheumatoid arthritis-like bilanosis obtained by infecting human immunized non-human mammals with Epstein-Barr virus and developing human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis regardless of autoimmune phenomenon Arthritis model non-human mammal.

The non-human mammal according to claim 1, wherein the induction of osteoclast differentiation is promoted.

The non-human mammal according to claim 1 or 2, wherein the human immunized non-human mammal is obtained by transplanting human hematopoietic stem cells into an immunodeficient non-human mammal.

The non-human mammal according to any one of claims 1 to 3, wherein the non-human mammal is a rodent.

The non-human mammal according to claim 4, wherein the rodent is a mouse.

A step of administering a candidate substance to the non-human mammal according to any one of claims 1 to 5, and a step of evaluating a pathological condition of human rheumatoid arthritis-like bilan arthritis in the non-human mammal after the administration. And a method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for human rheumatoid arthritis or bilan arthritis.