JP5844529B2

JP5844529B2 - 血中ｇｉｐ濃度上昇抑制剤

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Publication number: JP5844529B2
Application number: JP2011004317A
Authority: JP
Inventors: 琴美石丸; 澤田　和久; 和久澤田; 紀子大崎
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2011-01-12
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2031-01-12
Also published as: JP2012144486A

Description

本発明は、血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤に関する。

ＧＩＰ(Gastric inhibitory polypeptideまたはglucose-dependent insulinotrophic polypeptide）は、消化管ホルモンの一つであり、摂食時に小腸に存在するＫ細胞から分泌される。ＧＩＰには、胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用が知られている（非特許文献１〜３参照）。
また、ＧＩＰは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られている。そのため、ＧＩＰの作用が肥満の一要因になっているとも考えられ、事実、ＧＩＰの機能を阻害すると、肥満が抑制されるとの報告がある（非特許文献４参照）。
さらに、ＧＩＰはインスリン抵抗性の一因となることが報告されている（非特許文献４参照）。インスリン抵抗性を発症すると、インスリンによる糖の吸収作用が低下し、その結果、高インスリン血症を引き起こす。高インスリン血症は、肥満をはじめとする様々な生活習慣病の発症につながる根本的な原因であるとも言われており、インスリン抵抗性の予防・改善は生活習慣病のリスク軽減の面からも重要である。

このように、ＧＩＰを効果的に抑制することができれば、消化促進、胃もたれの改善、肥満やインスリン抵抗性の予防・改善等の効果が期待できる。
これまでの研究によって、ＧＩＰの機能を阻害する物質として、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オール（ＢＭＰＰ）やピラゾロピリミジン化合物が知られている。また、食後ＧＩＰの分泌を抑制するものとして、グアガム等が知られている（特許文献１及び２、非特許文献５〜１０参照）。しかしながら、これらの物質は、安全性や効果の面で十分とはいえない。

一方、ポリグルタミン酸は、その保水力の高さから保湿剤、吸収剤等として食品、医療、化粧品等の分野において広く使用されており、安全性の高い生分解性ポリマーとして注目されている。その他、ポリグルタミン酸には、小腸からのカルシウム吸収促進作用や血圧上昇抑制作用があることが報告されている（例えば、特許文献３、４参照）。また、血糖値上昇を抑制するために、ポリグルタミン酸を用いた血糖値改善剤が提案されている（特許文献５参照）。更に、ポリグルタミン酸に中性脂質の吸収を抑制する効果があり、高中性脂肪血症の治療、改善、発症の抑制に使用できることが報告されている（特許文献６参照）。

しかし、ポリグルタミン酸の特定の塩に関する血中ＧＩＰ濃度上昇抑制作用についてはこれまで報告がない。

国際公開第０１／８７３４１号パンフレット特表２００６−２１３５９８号公報特開平５−９５７６７号公報特開２００８−２５５０６３号公報特開２００５−２００３３０号公報特開２００９−１７３６３４号公報

J．C．Brownら、Canadian J Physiol Pharmacol 47：113-114，1969 J．M．Falkoら、J．Clin Endocrinol Metab 41(2)：260-265，1975 織田敏次ら、消化管機能と病態、1981年、中外医学社、P205−216 Miyawaki Kら、Nat Med．8(7)：738-42，2002 Gagenby S Jら、Diabet Med．13(4)：358-64，1996 Ellis PRら、Br J Nutr．74(4):539-56，1995 Simoes Nunes Cら、Reprod Nutr Dev．32(1)：11-20，1992 Morgan LMら、Br J Nutr．64(1)：103-10，1990 Requejo Fら、Diabet Med．7(6)：515-20，1990 Morganら、Br J Nutr．53(3)：467-75，1985

本発明は、医薬又は食品用途として有用な血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤を提供することを課題とする。具体的には、本発明は、食後に血中ＧＩＰ濃度が上昇した結果引き起こされる、胃もたれの発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置、消化の促進、または肥満やインスリン抵抗性の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置のための医薬又は非医薬用途である食品用途として有用な血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、ポリグルタミン酸及びその塩のＧＩＰ分泌抑制作用について検討したところ、ポリグルタミン酸のカルシウム塩が、食後のＧＩＰ分泌を顕著に抑制し、消化促進、胃もたれ改善、または肥満やインスリン抵抗性の予防・改善に特に有用であることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。

本発明は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤に関する。

本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤によれば、血中のＧＩＰ濃度上昇、特に食後における血中ＧＩＰ濃度の上昇を抑制することができる。さらに、本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、血中のＧＩＰ濃度上昇を効果的に抑制することで、胃もたれの発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置、消化の促進、および肥満やインスリン抵抗性の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置に有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。
発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する。ポリグルタミン酸は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基とα位のアミノ基がペプチド結合したもので、その構造式は(-NH-CH(COOH)-CH₂-CH₂-CO-)nで表されるが、本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、前記構造式におけるカルボキシル基の水素原子の５０％以上がカルシウムに置換されたものである。本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、前記構造式においてカルボキシル基の水素原子の６０％がカルシウムに置換されたものであることが好ましく、さらに上記カルボキシル基の水素原子の７０％以上、さらに８０％以上、さらに９０％以上、さらに９５％以上、殊更９９％以上がカルシウムに置換されたものであることが好ましいが、実質的にすべてのカルボキシル基がカルシウムに置換されたものであることが特に好ましい。また、前記構造式において末端に位置することになるカルボキシル基も、カルシウムで置換されたものであることが好ましい。また、前記構造式において末端に位置することになるカルボキシル基も、カルシウムで置換されたものであることが好ましい。
ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、ポリグルタミン酸や、他のポリグルタミン酸の塩に比べて血中のＧＩＰ濃度上昇を顕著に抑制する作用を有する。従って、当該ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、血中のＧＩＰ濃度上昇抑制剤として使用することができ、また、当該ＧＩＰ上昇抑制剤を製造するために使用することができる。ポリグルタミン酸のカルシウム塩に血中ＧＩＰ濃度の上昇を抑制する作用があることは今まで知られていなかった。また、ポリグルタミン酸のカルシウム塩に肥満やインスリン抵抗性の予防・改善効果があることも知られていない。

本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、特に、食後の血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制するために好適に用いることができる。具体的には、脂質及び糖質を共に含む食事、特に脂質を多く含む食事、そのなかでもトリアシルグリセロールを多く含む食事を摂取した後の血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制するために好適に用いることができる。
食事中に含まれるトリアシルグリセロールについては特に制限はなく、トリアシルグリセロールを多く含む脂質成分としては、具体的には、バター、ラード、魚油、コーン油、なたね油、オリーブ油、ごま油などが挙げられる。
食事中に含まれる糖質成分についても特に制限はなく、具体的には、米飯、澱粉、小麦粉、砂糖、果糖、ぶどう糖、グリコーゲンなどが挙げられる。
また、上記脂質及び糖質の摂取量としては、通常の食事に含まれる範囲の摂取量であれば特に制限されない。
本発明において、「血中ＧＩＰ濃度上昇抑制」とは、主として、食後に生じる血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制することをいう。食後の血中ＧＩＰ濃度上昇の抑制は、食後に引き起こされる血中ＧＩＰの濃度の上昇を必ずしも完全に抑制することを意味するものではなく、本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤を投与していない場合に比べて、血中ＧＩＰ濃度の上昇度合を穏やかにすることをも含む概念である。そして、本発明における「血中ＧＩＰ濃度上昇抑制作用」は、消化管からのＧＩＰ分泌を抑制することで血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制するＧＩＰ分泌抑制作用、及び血中ＧＩＰ濃度を低下させることにより血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制するＧＩＰ低下作用のいずれをも含む概念である。

ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、その分子量に関わらず全般的に血中ＧＩＰ濃度上昇抑制効果を有しうる。
本発明において用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、重量平均分子量が約５００以上であることが好ましく、１，０００以上であることがより好ましく、２,０００以上であることがさらに好ましく、４,０００以上であることがさらに好ましく、６，０００以上であることがさらに好ましく、８，０００以上であることが特に好ましい。
使用されるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量の上限は約５，０００，０００であるのが好ましいが、製造面、及び本発明の血中インスリン濃度上昇抑制剤を経口用液体製剤としたときの喉ごし、ぬるつき、嚥下のしやすさなどの観点から、その粘度が比較的低い方が好ましく、使用されるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量は１，０００,０００以下であることがより好ましく、５００,０００以下であることがさらに好ましく、１００，０００以下であることがさらに好ましく、５０，０００以下であることが特に好ましく、３０，０００以下であることが殊更好ましい。
より具体的には、本発明に用いるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量は５００〜５，０００，０００であることが好ましく、１，０００〜１，０００,０００であることがより好ましく、２，０００〜５００,０００であることがさらに好ましく、４，０００〜１００,０００であることがさらに好ましく、６，０００〜５０,０００であることが特に好ましく、８，０００〜３０,０００、さらに８，０００〜２０，０００であることが殊更好ましい。
重量平均分子量の測定は、例えば、ゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。

本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、化学的合成や微生物によって生産したポリグルタミン酸又はその塩、あるいは市販されているポリグルタミン酸又はその塩を、後述する実施例に記載されているように水酸化カルシウム水溶液を用いて中和することで得ることができる。また、カルシウムを含有する混合培地で培養した微生物によって生産することもできる。ポリグルタミン酸のカルシウム塩を構成するグルタミン酸の光学活性はＤ体でもＬ体でもよく、それらの混合物でもよい。天然のポリグルタミン酸は、グルタミン酸がγ位で結合した重合体であり、野生型でポリグルタミン酸を生産する微生物としては、例えば、納豆菌を含む一部のバチルス（Bacillus）属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis var．chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる［Ashiuchi，M.，et al.:Appl．Microbiol．Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)］。また、遺伝子組換え技術を用いたポリグルタミン酸の生産例としては、プラスミドにて遺伝子導入された組換え枯草菌（Bacillus subtilis ISW1214株）において約9g/L/5日［Ashiuchi，M.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，70，pp.1794-1797(2006)］、プラスミドにて遺伝子導入された組換え大腸菌において約4g/L/1.5日[Jiang，H.，et al.:Biotechnol．Lett.，28，pp.1241-1246(2006)]の生産性が得られることが知られている。或いは、ポリグルタミン酸は、食品添加物、化粧品素材及び増粘剤等として商業的に生産されており、国内及び海外のポリグルタミン酸メーカーが供給するポリグルタミン酸を購入することもできる（例えば、国内メーカー：日本ポリグル、一丸ファルコス、明治フードマテリア等、海外メーカー：バイオリーダース等）。

本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、糖質、脂質及び／又は蛋白質を摂取した後のＧＩＰ分泌を抑制することができ、これにより血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制する。しかもその抑制効果は、ポリグルタミン酸や他のポリグルタミン酸塩と比較して顕著に優れている。

本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、前記ポリグルタミン酸のカルシウム塩そのものであってもよい。また、本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩の他に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を含んでもよい。本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤中のポリグルタミン酸のカルシウム塩の含有量は特に制限されないが、０．０１〜１００質量％含まれるのが好ましく、０．１〜９５質量％含まれるのがより好ましく、１〜９０質量％含まれるのが更に好ましく、１０〜８５質量％含まれるのが特に好ましい。

本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤を食品や医薬品等の用途に用いる場合、ポリグルタミン酸のカルシウム塩を単体でヒト及び動物に、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等により投与できる他、各種食品、医薬品、ペットフード等に有効成分として配合して摂取することができる。食品としては、一般食品のほか、胃もたれの発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置、消化促進、および肥満やインスリン抵抗性の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置をコンセプトとし、必要に応じてその旨表示した美容食品、病者用食品、特定保健用食品等の食品に応用できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。

なお、経口用固形製剤を調製する場合には、ポリグルタミン酸のカルシウム塩に、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。

上記各食品や製剤中のポリグルタミン酸のカルシウム塩の配合量は特に制限されないが、０．０１〜１００質量％含まれるのが好ましく、０．０３〜９０質量％含まれるのがより好ましく、０．１〜８０質量％含まれるのが更に好ましく、０．３〜７０質量％含まれるのが特に好ましく、１〜６０質量％含まれるのが殊更好ましい。
上記各食品や製剤中の有効投与（摂取）量は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩として、１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重〜１．０ｇ／ｋｇ体重とするのが好ましく、０．００３ｇ／ｋｇ体重〜０．５ｇ／ｋｇ体重とするのがより好ましく、０．０１ｇ／ｋｇ体重〜０．２ｇ／ｋｇ体重とするのが更に好ましい。また、本発明の血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤は、食前・食中・食後に用いることができるが、食前もしくは食中に用いることが好ましく、食前１時間から食中に用いることがより好ましい。
投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬ以上、空腹時血中トリグリセリド値が１００ｍｇ／ｄＬ以上、及び／又は、空腹時血中ＧＩＰ値が１０ｐｇ／ｍＬ以上の者が好ましい。また、肥満やメタボリックシンドローム者やその予備群も投与又は摂取対象者として好ましい。肥満の基準としては、日本においては、標準とされるＢＭＩは２２とされているため、ＢＭＩ＝２２以上の者が好ましく、ＢＭＩ＝２５以上の者がより好ましい。一方、欧米においては、肥満の基準としては、ＢＭＩが２５以上は過体重とされているため、ＢＭＩ＝２５以上の者が好ましく、ＢＭＩ＝３０以上の者がより好ましい。メタボリックシンドロームの診断基準では、日本人の場合、男性であればウエストが８５ｃｍ以上、女性であれば９０ｃｍ以上の者であって、（１）血中トリグリセリドが１５０ｍｇ/ｄＬ以上又はＨＤＬコレステロールが４０ｍｇ/ｄＬ未満であること、（２）高血糖（空腹時血糖が１１０ｍｇ/ｄＬ以上）であること、（３）高血圧（１３０/８５ｍＨｇ以上）であることの３項目のうち１項目以上が当てはまる者が予備群とされ、２項目以上が当てはまる者がメタボリックシンドロームに該当するとされていることから、これらの者を投与又は摂取対象者とすることが好ましい。米国の場合は、腹囲（男性で１０２ｃｍ以上、女性で８８ｃｍ以上）、高中性脂肪、低ＨＤＬ、高血圧、高空腹時血糖のうち、３つ以上を満たすものがメタボリックシンドロームに該当するとされていることから、２つ以上に該当する予備群のものを含め、これらの者を投与又は摂取対象者とすることが好ましい。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔分析方法〕
ポリグルタミン酸のカルシウム塩の定量法及び重量平均分子量測定法：
ポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量測定は、Ｄ−６０００（日立ハイテクノロジーズ社製）ＨＰＬＣシステムを用いてゲルろ過法にて実施した。分析条件は、分析カラムにＴＳＫＧｅｌＧ３０００ＰＷＸＬゲルろ過カラム（商品名、東ソー社製）を用い、溶離液に０．１Ｍ硫酸ナトリウムを使用し、流速０．８ｍＬ／分、カラム温度５０℃とし、ＵＶ検出波長を２１０ｎｍとした。重量平均分子量は、プルラン（商品名：ＳｈｏｄｅｘＳＴＡＮＤＡＲＤＰ−８２、昭和電工社製）を用いて予め重量平均分子量を求めたポリグルタミン酸（明治フードマテリア社製、分子量９ｋ）、ポリーヒドロキシプロリン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、分子量４ｋ）を標準品として用い測定した。

〔調製例〕ポリグルタミン酸カルシウム塩の調製
重量平均分子量９，０００のポリグルタミン酸のナトリウム塩（明治フードマテリア社製）を初発材料として、２０％（ｗ／ｗ）水溶液を１２５ｍＬ作製し、氷冷下にて塩酸を用いてｐＨ２以下に調整した。続いて、生成した酸沈殿物を８，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離（商品名：ｈｉｍａｃＣＲ２１ＧＩＩＩ、日立工機社製）にて回収し、得られた沈殿物を同量の蒸留水を用いて洗浄し、再度遠心分離に供した。この洗浄操作を２回繰り返し行なった後、得られた沈殿物を３００ｍLの蒸留水に懸濁し、これをｐＨ７以上となるように水酸化カルシウムを用いてそれぞれ中和した。この上記酸処理および水酸化カルシウムによる中和処理を再度実施し、得られた中和試料に対して２．５倍量のエタノールを添加し、氷冷下にて一晩放置した。このエタノール添加により生成した沈殿物を１４，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離（同上）にて回収し、回収試料を減圧乾燥に供して、カルシウム塩として１９．０ｇの固形物を得た。この試料の重量平均分子量は前述の分析方法により、１１,０００と算出された。

〔試験例〕ポリグルタミン酸のカルシウム塩の血中トリグリセリド濃度上昇抑制作用
重量平均分子量１１，０００（調製例１で調製）のポリグルタミン酸のカルシウム塩と、重量平均分子量９，０００のポリグルタミン酸のナトリウム塩（明治フードマテリア社製）を用いて下記のように経口投与サンプルを調製した。
また、８週齢の雄性マウス（C57BL/6J Jcl：日本クレア社製）を各群７匹ずつ用いて下記のように経口投与試験を行った。

経口投与サンプルの調製：
グルコース（関東化学社製）とトリオレイン（Glyceryl trioleate：Sigma社製）をレシチン（卵製、和光純薬社製）とアルブミン(ウシ血清由来、Sigma社製)を用いて乳化し、乳液を調製した。この乳液に、ポリグルタミン酸塩試料を添加し、最終濃度がポリグルタミン酸塩試料５（ｗ/ｗ）％、グルコース５（ｗ/ｗ）％、トリオレイン５（ｗ/ｗ）％、乳化剤（レシチン０．２（ｗ/ｗ）％、アルブミン１．０（ｗ/ｗ）％）となるよう、経口投与サンプルを調製した。なお、コントロールサンプルとして、ポリグルタミン酸塩の代わりに水を添加したサンプルを調製した。

経口投与試験：
一晩絶食させたマウスをエ−テル麻酔下、眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（VITREX社製）を用い、初期採血を行った。その後、経口投与サンプルを経口ゾンデ針にて経口投与し、１０分、３０分、１時間、２時間後にエーテル麻酔下、眼窩静脈より採血を行った。マウスに対する経口投与量を下記の表１に示す。

ヘパリン処理ヘマトクリット毛細管で採取した血液は血漿分離まで氷冷下で保存後、１１０００ｒｐｍにて５分間遠心し、血漿を得た。得られた血漿から、Rat/Mouse GIP（Total）ELISAキット（Linco Research/Millipore co.製、ELISA法)を用いて血中ＧＩＰ濃度を測定した。
サンプル経口投与後の２時間後までの血中ＧＩＰ濃度を測定した結果、血中ＧＩＰの濃度が最大となるのは投与後１０もしくは３０分後であることがわかった。そこで、血中ＧＩＰ濃度の最大値（投与１０分もしくは３０分後）と初期値（初期採血時）の差（Δ値）を最大ＧＩＰ濃度上昇と定義し、コントロール群を１００としたときの値を表２に示した。

得られた最大ＧＩＰ濃度上昇の値をもとに、群間の統計学的有意差についても検討し、その結果も表２に示した。分散分析によって有意性（Ｐ＜０．０５）が認められた場合、多重比較検定（Bonferroni／Dunn法）により、コントロール群と各ポリグルタミン酸塩投与群との間、及びナトリウム塩投与群とカルシウム塩投与群との間での検定を行い、得られた結果から、Ｐ＜０．０５を有意な差として有意性を判断した。

表２の結果から、ポリグルタミン酸カルシウム塩はコントロール群と比較して、顕著に血中ＧＩＰ濃度上昇を抑制していることが分かった。さらにその効果は、ポリグルタミン酸のナトリウム塩と比較しても顕著に優れていた。

前述のように、ＧＩＰは胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込み亢進、インスリン抵抗性の誘引といった働きを担っていることが知られている。そのため、前記ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、血中ＧＩＰ濃度の上昇を効果的に抑制することで、消化促進、胃もたれの予防・改善、肥満やインスリン抵抗性の予防・改善に好適に用いることができる。

Claims

ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤。
ポリグルタミン酸のカルシウム塩からなる血中ＧＩＰ濃度上昇抑制剤。