JP5876469B2 - Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−ホスファートを含む化粧品および医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、化粧品および療法の分野に関する。

Ｄ−グルコサミン（グルコサミン）は、アミノ糖であり、グリコシル化されたタンパク質および脂質の生化学的合成における重要な前駆体である。Ｄ−グルコサミンは、その治療有効性が普遍的に受け入れられていないにもかかわらず、骨関節炎の治療において一般的に使用されている。グルコサミンは、軟骨の形成および修復を促進すると信じられている。２００１年に刊行された、骨関節炎を有する２１２人の患者に対する３年間の二重盲検式治験（非特許文献１）により、グルコサミン群において症状の２０〜２５％の改善が見られたのに対し、プラセボ群においてはわずかに悪化したことが報告された。膝の放射線写真は、グルコサミンを摂取する患者の半分について、著しい関節腔狭小化（疾患進行の兆候）を示した。

Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−アセチルグルコサミン）は、比較的安定性の良いグルコサミン誘導体である。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンは、生物化学過程における主要な代謝生成物であり、ヒトおよび動物の構造重合体中に存在している。これらの重合体のうち、グリコサミノグリカンは、反復する二糖類単位からなる長い非分岐多糖類である。この反復単位は、ヘキソサミン（Ｎ−アセチルグルコサミンなどの窒素を含む六炭糖）に結合したヘキソース（六炭糖）またはヘキスロン酸である。グリコサミノグリカンの例としては、コンドロイチン硫酸（弾性軟骨、硝子軟骨、骨、真皮、角質層）、デルマタン硫酸（真皮、腱、間膜、線維軟骨）、ケラタン硫酸（軟骨、角質層）、ヘパリン／ヘパラン硫酸（肝臓、肺、大動脈）、およびヒアルロナン（皮膚）が挙げられる。

グリコサミノグリカンは、結合組織の重要な構成要素を形成し、有機物の最大３０％を占める可能性がある。グリコサミノグリカン鎖は、タンパク質に共有結合してプロテオグリカンを形成してもよい。糖サブユニットの密度と、陰イオンを引き付けるそれらの電荷とにより、水がグリコサミノグリカンに結び付き、これにより、組織の圧力耐性が高くなる。グリコサミノグリカンの使用例としては、抗凝固剤としてのヘパリン、結合組織、軟骨、および腱において見いだされ得るコンドロイチン、ならびに、皮膚の細胞外構造物の一構成要素であり関節における滑液潤滑剤であるヒアルロナンが挙げられる。

グリコサミノグリカンは、その力学的、構造的、および、生理的機能により、生命にとっては重要な重合体であり、その代謝の制御は、ヒトおよび動物の健康における重要な要素である。したがって、グリコサミノグリカン産生の調節を可能にする組成物は絶えず必要とされている。

興味深いことに、Ｎ−アセチルグルコサミンは、ヒアルロナン合成を促進するというその能力により、健康および化粧品の分野において様々な用途に用いられている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、エビおよびカニの殻に含まれるキチンを（後にアセチル化され得る少なくともグルコサミンについて）酸加水分解、または、発酵させることにより産生される。特許文献１に、Ｎ−アセチルグルコサミンの局所製剤が開示されている。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、Ｎ−アセチルグルコサミンのＣ６−リン酸化形態である。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカンの合成における中間体であることが示されている。この特定の経路において、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとして活性化されて重合体に取り込まれる前に、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−ホスファートに異性化される（図１参照）。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、細胞中に産生され（内因性化合物であり）、細胞周囲空間に排泄されるようには合成されていない中間体代謝生成物である。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、哺乳動物細胞によってはＮ−アセチルグルコサミンから直接産生されないと思われる。

リン酸化された糖類は、いくつかの代謝経路の交差路において細胞により使用される周知の高エネルギー化合物である。これらのリン酸化された糖類の多くは、細胞により持続的に再利用されるグルコース−６−ホスファートおよびフルクトース−６−ホスファートなどの過渡的成分である。中間体代謝生成物は細胞中に在るので、リン酸化された糖類は、試験できる十分な量を合理的コストで単離することが難しい。また、リン酸化された糖類は、不安定であり、細胞型および細菌型のホスファターゼによってその対応する非リン酸化糖類に急速に加水分解されるので、その直接の使用は除外される。

１つの文献、１９６２年の特許文献２だけが、Ｎ−アセチルグルコサミンの誘導体のうちのＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを用いて創傷治癒を促進することについて（この化合物についての実験データを何も提供せずに）言及しているが、我々の知る限り、治療的な、または、化粧品としての潜在的効果についてのＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの評価を記載した、公共における、または、科学団体に知られている文献は無い。

したがって、グリコサミノグリカンの産生を調節する化粧品組成物および医薬組成物の開発は絶えず必要とされており、その使用範囲は非常に広い。

米国特許公開第２００８／００２０９９７号明細書 英国特許第８９６９４０号明細書

Ｒｅｇｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｌａｎｃｅｔ、３５７、２５１−６

本願発明者らは、ヒト細胞における外因性化合物としてのＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの驚くべき予想外の特性、とりわけ、グリコサミノグリカン産生に関する特性を開示し、それに関して、健康および美容に対する有益な効果を促進するために、単独で、または、他の化合物、特に、ビタミンＡ群の化合物との組み合わせで、医薬組成物、獣医学的組成物、および化粧品組成物におけるその有用性を実証する。本願発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ群の化合物との組み合わせの相乗効果も実証する。

したがって、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、化粧品的に許容可能なその塩を含み、ビタミンＡ群の化合物を任意に含む化粧品組成物の、乾燥皮膚を治療するため、もしくは、皮膚または付属肢の老化を治療または防止するため、特に皺、特に深い皺および／または細かい皺を治療または防止するため、皮膚の弾力性および／または色調を向上するため、皮膚を引き締めるため、ならびに／または、真皮・表皮接合部を再生／強化するため、および／もしくは、皮膚細胞（特に、ケラチノサイトおよび線維芽細胞）増殖を増進するため、および／もしくは、構造高分子（特に、ヒアルロナンおよび／またはコラーゲン）の合成を増進するための使用に関する。

より詳細には、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、化粧品的に許容可能なその塩を含む化粧品組成物に関する。この化粧品組成物は、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されることが好ましいビタミンＡ群の化合物をさらに含んでいてもよい。より好ましい形態においては、このビタミンＡ群の化合物は、レチノール、その塩、そのアルコール、またはそのエステルである。前記組成物は、局所的投与、経口投与、または注射可能な経路による投与（特に、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、および／または微量注入法）に適していればよい。

また、本発明は、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節疾患、軟骨欠失に関係する疾患、滑液浸出の治療において使用するため、炎症反応を調節するため、関節内補充療法のため、および、特に眼、皮膚、および腹部における、好ましくは眼の、外科的な、または、術後の処置に関連する治療における、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、薬学的に許容可能なその塩を含む、医薬的または獣医学的な組成物に関する。好ましくは、この医薬的または獣医学的な組成物は、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されることが好ましいビタミンＡ群の化合物をさらに含んでいてもよい。より好ましい形態において、このビタミンＡ群の化合物は、レチノール、その塩、そのアルコール、またはそのエステルである。前記組成物は、局所的投与、経口投与、または注射可能な経路による投与（特に、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、微量注入法、および／または関節内注射）に適していればよい。

また、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、薬学的に許容可能なその塩と、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されることが好ましいビタミンＡ群の化合物とを含む、医薬的または獣医学的な組成物に関する。より好ましい形態において、このビタミンＡ群の化合物は、レチノール、その塩、そのアルコール、またはそのエステルである。本発明は、損傷組織の修復および／または再生のためのこの形態に係る組成物に関する。

本発明は、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節疾患、軟骨欠失に関係する疾患、滑液浸出の治療において使用するため、炎症反応を調節するため、関節内補充療法のための、および、特に、眼、および腹部における、好ましくは眼の、外科手術に関連する治療における医薬的または獣医学的な組成物、もしくは、薬を調製するために、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは薬学的に許容可能なその塩を、ビタミンＡ群の化合物と任意に組み合わせて使用することに関する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたはその塩が、組成物または薬においてビタミンＡ群の化合物と組み合わせられていない場合、前記使用を、ビタミンＡ群の化合物と組み合わせて行えばよい。また、本発明は、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節疾患、軟骨欠失に関する疾患、滑液浸出の治療において使用するため、炎症反応の調節のため、関節内補充療法のため、および、特に、眼、および腹部の外科手術に関連する治療において同時に、個別に、または時間的に割り振って使用するための併用製品としての、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、薬学的に許容可能なその塩と、ビタミンＡ群の化合物とを含む製品に関する。

最後に、本発明は、本発明に係る医薬的、獣医学的、または化粧品的な組成物、好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは薬学的に許容可能なその塩と、ビタミンＡ群の化合物とを含む組成物を含む装置であって、注射（好ましくは、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、微量注入法、および／もしくは関節内注射）、または局所的投与に適している装置に関する。

哺乳類細胞におけるヒアルロナン合成の経路を示す図である。 Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによる治療後の皮膚形態の分析を示す図である。 Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによる治療後の皮膚におけるグリコサミノグリカン産生の分析を示す図である。 Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによる治療後の皮膚におけるＣＤ４４受容体発現の分析を示す図である。

発明者らは、外因性化合物としての（すなわち、人体の何らかの構成要素を伴わない技術的な方法によって得られた）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートのヒト細胞における効果を初めて試験し、同定した。発明者らは、この化学物質を、医薬組成物、外皮用組成物、獣医学的な組成物、および化粧品組成物において、単独で、または、他の化合物と組み合わせて、特に、ビタミンＡ群の化合物と組み合わせて、
−ヒアルロナンおよびコラーゲン、特にプロコラーゲン１などのグリコサミノグリカンを含む人体の構造高分子の合成の刺激；
−ＣＤ４４であるヒアルロン酸受容体の産生の増加；
−細胞、特にケラチノサイトおよび線維芽細胞の分裂の刺激；および、
−真皮・表皮接合部の強化
を含む様々なメカニズムによって健康および美容に対する有益な効果を促進するために使用してもよい、ということを驚くべき方法で示した。

さらに具体的には、発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートがケラチノサイトまたは線維芽細胞によってヒアルロナン産生を増加させる能力を実証した。さらに、発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートが線維芽細胞の細胞分裂を刺激する能力を実証した。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、線維芽細胞によって、特に、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ群の化合物との組み合わせによって処理されたケラチノサイトの上清によって線維芽細胞が処理されている場合に、コラーゲン、特にプロコラーゲン１の合成も増進させる。最終的に、ヒトの皮膚モデルにおいて、発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによる治療がグリコサミノグリカン合成を真皮全体によく分布するように刺激し、真皮・表皮接合部を刺激し、真皮および表皮におけるＣＤ４４受容体の発現を刺激する、ということを示した。

発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ群の化合物、特に、レチノールとの組み合わせの相乗効果または増強効果をさらに実証した。

一方、Ｎ−アセチルグルコサミンは、単独では、または、ビタミンＡ群の化合物との組み合わせでは、不都合な効果を有している、または、効果を有していない、または、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの効果に匹敵する効果を有していない。

コラーゲンは、人体における非常に大きな群の構造重合体も表す。コラーゲンは、体における最も豊富なタンパク質であり、全身のタンパク質含有量の２５％〜３５％を占めている。コラーゲンは、結合組織細胞により産生される。プロコラーゲン１は特に、腱、皮膚、動脈壁、横紋筋原線維の筋内膜、線維軟骨、ならびに、骨および歯の有機的部分に見いだされる。プロコラーゲン１は、構造用支持材の役割を果たす、真皮の細胞外基質の主成分である。皮膚の老化は、表皮の萎縮によるものであり、ケラチノサイト増殖の速度低下の結果である。それは、コラーゲンの低減にもつながり、それゆえ、真皮の薄層化につながり、このことは、太陽およびＵＶに晒されることによって、および、喫煙によって一層深刻化する。コラーゲンおよびヒアルロン酸は、皺および細かい皺に抗する作用因子として知られている。

真皮・表皮接合部も、表皮の適切な栄養摂取および皮膚の弾力性のために重要である。

それゆえ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、ビタミンＡ群の化合物と任意に組み合わせられて、皮膚および付属肢、特に、髪の老化の影響を防止または低減することを目的とする化粧品組成物において非常に注目されている。したがって、このような組成物は、皺、特に深い皺および／または細かい皺を防止または低減するため、皮膚の弾力性を向上させるため、皮膚を引き締めるために有用である。本発明の組成物を（特に微量注入法によって）注射する一形態においては、本発明の組成物を、皺および細かい皺を満たすため、および、唇の体積を増すために使用することができる。この形態においては、本発明の組成物は、充填剤製品、特に、ヒアルロン酸、脂質、コラーゲンもしくはタンパク質などの再吸収可能な製品、または、ポリアクリルアミドゲルもしくはシリコーンなどの再吸収不可能な作用物質をさらに含んでいてもよく、または、これと組み合わせて使用されてもよい。また、本発明の組成物は、真皮・表皮接合部を再生または強化するために使用されてもよい。本発明の組成物は、皮膚細胞（特に、メラノサイト、ケラチノサイト、および／または線維芽細胞）を、例えば、それらの増殖、および／または細胞移動、および／または構造高分子、特にコラーゲンおよびヒアルロナンの合成を増加することにより刺激するために使用されてもよい。したがって、このような組成物により、真皮および／または表皮を維持および／または強化すること、これらの厚みを維持または増大すること、皮膚の色調および弾力性を維持および／または強化することが可能になる。このような組成物は、体、顔、首、および／または髪のケアに適している。

第１の特定の形態においては、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、組成物の唯一の活性成分または活性剤であってもよい。第２の特定の形態においては、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートおよびビタミンＡ群の化合物は、組成物の唯一の活性成分または活性剤であってもよい。他の特定の形態においては、組成物は、他の活性成分または活性剤を含んでいる。これら他の活性成分または活性剤の例を以下に記載する。活性成分または活性剤は、生物学的作用を有する化合物を意味すると理解されるものとする。

本願において、化粧品組成物は、経口経路による投与、皮膚、頭皮、もしくは髪における局所的経路による投与、または、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、および／もしくは微量注入法による投与に適するように製剤されていればよい。

局所的投与用の本発明に係る化粧品組成物は、水溶液、含水アルコール溶液、エマルジョン［水中油（Ｏ／Ｗ）、油中水（Ｗ／Ｏ）または複合（例えば、３つＯ／Ｗ／ＯまたはＷ／Ｏ／Ｗ）］、ナノエマルジョン、水性ゲル、または水相における脂肪相分散として調剤されていてもよい。この化粧品組成物は、事実上、液体クリーム、ゲル、ヒドロゲル、（特に、塗布されたときに水を捕捉し、ゲルを形成する性質を有する高分子量ヒアルロン酸を含む）膜形成製品、ローション、マスク、乳液、オイル、軟膏、ワックス、発泡体、ペースト、セラム、バーム、エアロゾル、スティック、石鹸、またはシャンプーとして調剤されていてもよい。

局所的投与に適した化粧品組成物は、機械的な構成要素、例えば、製品の浸透を簡単化するための機械的マッサージ動作を伴い、且つ、製品の循環を活性化するマッサージローラー装置、または、皮膚の反応を活性化する、もしくは、製品の効果を直接的に高める（光、低周波、赤外振動などの）波放出システムなどと組み合わせて使用されてもよい。

経口投与用の本発明に係る化粧品組成物は、小袋、ピル、カプセル、シロップ、または錠剤の形態であってもよい。

注射可能な投与用の本発明に係る化粧品組成物は、滅菌形態で調剤されていることが好ましい。また、この化粧品組成物は、溶剤が使用直前に添加される粉末の形態であってもよい。

化粧品組成物の成分およびその割合は、当業者によりその一般的知識に基づいて簡単に選択されるであろう。例えば、組成物は、脱イオン水、マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、キサンタンガム、ナイロン−１２、ナトリウムＰＣＡ、プロピレングリコール、赤色酸化鉱、タルク、鉄黄、黒色酸化鉄、二酸化チタン、グリセロールステアラート、ステアリン酸、ＤＥＡ−セチルホスファート、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、イソプロピルパラベン、イソブチルパラベン、ネオペンタン酸イソステアリル、イソプロピルパルミテート、エチレン／プロピレン／スチレン、共重合体、ブチレン／プロピレン／スチレン共重合体、フェノキシエタノール、トコフェリル酢酸、グリセリン、トリエチルアミン、ステアリン酸、ステアリン酸プロピレングリコール、鉱油、ジアゾリジニル尿素、水添ポリイソブテン、パルミチン酸オクチル、ネオペンタン酸トリデシル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、香料、メトキシ桂皮酸オクチル、ベンゾフェノン、サリチル酸オクチル、イソステアリン酸イソプロピル、イソセテス−３−アクテタート、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよいが、これらに限定されない。

また、該化粧品組成物は、所望の方法の投与に適した装置に含まれていてもよい。

このような装置は、局所的投与に適するものでもよい。これら装置は、特に、パッチ、密封包帯、密封小室などを含んでいる。パッチは、当業者に知られている任意の種類のパッチを意味すると理解されるものとし、特に、皮膚に貼られた場合に皮膚に軽度の電流を生じるものであり、これにより、製品の皮膚への浸透を促進するものである。密封小室は、皮膚に付着し、化粧品組成物が満たされた小さなポケット状の装置であって、皮膚に拡散する製品の量を増やすために、大量の前記組成物を皮膚に接触した状態で維持することのできる装置を意味すると理解されるものとする。

他の装置は、注射、特に、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、および／または微量注入法に適するであろう。このような装置は、針、極微針を備えていてもよいし、または、無針注射装置でもよい。このような装置は、メソセラピーにおいて周知である。本発明は、本発明に係る組成物と、シリンジ装置または注射装置とを含むキットに関する。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、任意にはビタミンＡ群の化合物との組み合わせで含む組成物は、インビトロまたはエクスビボでの人体組織、特に、例えば組織工学分野における合成皮膚の産生にも有用であればよい。したがって、本発明は、人体組織、好ましくは、皮膚組織または結合組織を産生するための方法であって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを任意にはビタミンＡ群の化合物との組み合わせで含む組成物に、組織の細胞を接触させる、または、この組成物によって組織を形成させることを含む方法に関する。これらの細胞は、ケラチノサイトおよび／または線維芽細胞を含むことが好ましい。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせでの、グリコサミノグリカン、特にヒアルロナンの合成に対する効果により、このような（１つまたは複数の）活性成分を含む医薬的または獣医学的な組成物は、関節疾患または軟骨欠失に関係する関節疾患、例えば、関節炎、関節症、骨関節炎、および骨関節炎などを治療または防止するため、天然潤滑剤の合成を刺激するため、関節内補充療法のため、および／または、ヒトおよび動物における滑液浸出を治療するために使用されてもよい。本願において、対象となる動物は、哺乳類、例えば、馬、または、犬および猫などのペットとしての動物であることが好ましい。したがって、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせた使用であって、関節疾患または軟骨欠失に関係する関節疾患、例えば、関節炎、関節症、骨関節炎、および骨関節炎などを治療または防止することを目的とした医薬的または獣医学的な組成物を調製するため、天然潤滑剤の合成を刺激するため、関節内補充療法のため、および／または、ヒトおよび動物における滑液浸出を治療するための使用に関する。あるいは、本発明は、使用または投与についての先述の適用を目的とする医薬的または獣医学的な組成物を調製するために、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、ビタミンＡ群の化合物と組み合わせて使用することも開示する。さらに、本発明は、有効量のＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせて投与する工程を含む、関節疾患または軟骨欠失に関係する関節疾患、例えば、関節炎、関節症、骨関節炎、および骨関節炎などを治療するための方法、滑液浸出を治療するための方法、関節内補充療法または天然潤滑剤の合成の刺激を、これを必要とするヒトまたは動物において行うための方法に関する。この形態に含まれる応用では、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせて、局所的投与、経口投与、または注射に適した形態で投与または製剤されてもよい。注射は、例えば、関節内、皮下、筋肉内の経路によって行われてもよい。

また、皮膚に対するＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの有益な効果に鑑みて、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせて含む医薬的、皮膚科学的、または獣医学的な組成物は、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、または乾燥皮膚の治療または防止のために使用されてもよい。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ群の化合物との組み合わせの、特に、ケラチノサイトおよび線維芽細胞によるヒアルロナン産生と、線維芽細胞の細胞分裂と、線維芽細胞によるコラーゲン産生とに対する特別な効果に鑑みて、本願は、より具体的には、上記組み合わせを含む医薬的、皮膚科学的、または獣医学的な組成物を提供する。この組成物は、損傷組織の再生に有用である。したがって、本発明は、損傷組織を再生することを目的とした医薬的、皮膚科学的、または獣医学的な組成物を調製するためのＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートおよびビタミンＡ群の化合物の使用と、損傷組織の再生を、これを必要とする対象において行うための、有効量のＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートおよびビタミンＡ群の化合物を投与する工程を含む方法とに関する。

特に、本発明に係る医薬的、皮膚科学的、または獣医学的な組成物は、眼の（例えば、角膜移植、緑内障、網膜剥離または白内障の）外科手術に伴う治療、または、該外科手術後の治療、皮膚に対する外科的または皮膚科学的な処置（例えば、リフティング、充填物の注入、ピーリング、ホワイトニング、削皮術、座瘡治療）、腹部の外科手術において使用されてもよい。この形態においては、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ群の化合物と組み合わせた医薬的または獣医学的な組成物が好ましいであろう。

本願で説明される全ての応用について、以下の文言は全て互換性があるとみなされるものとする：
−〜に使用するための、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたはその薬学的に許容可能な塩を、任意にはビタミンＡ群の化合物との組み合わせで含む医薬的または獣医学的な組成物
−〜のための医薬的または獣医学的な組成物を調製するための、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは薬学的に許容可能なその塩の、任意にはビタミンＡ群の化合物との組み合わせでの使用
−〜のために同時に、個別に、または時間的に割り振って使用するための併用製品としての、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは薬学的に許容可能なその塩と、ビタミンＡ群の化合物とを含む製品
−有効量の薬学的に許容可能なＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、任意にはビタミンＡ群の化合物と組み合わせて、これを必要とする対象に投与する工程を含む、〜のための方法。

全てのこれらの応用について、一形態は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートおよびビタミンＡ群の化合物、特にレチノールの組み合わせ使用と、このような組み合わせを含む組成物とに基づいている。

この医薬的または獣医学的な組成物は、経口経路、吸入、局所的経路（特に、皮膚、頭皮、眼、または粘膜における、例えば経口腔、経膣または経鼻）、経直腸による投与、または、非経口、表皮内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、もしくは頭蓋内の注射による投与、または、注入技法による投与に適するように調剤されていてもよい。好ましくは、この医薬的または獣医学的な組成物は、経口経路、吸入、局所的経路（特に、皮膚、頭皮、眼、または粘膜における、例えば経口腔、経膣または経鼻）、経直腸による投与、または、表皮内、皮内、経皮、皮下、関節内、もしくは関節滑液嚢内の注射による投与に適するように製剤されていてもよい。例えば、この医薬的または獣医学的な組成物は、小袋、錠剤、カプセル、シロップ、クリーム、ローション、ゲルの形態で製剤されていてもよい。組成物は、賦形剤を含んでいてもよく、該賦形剤は、タルク、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、モノステアリン酸グリセロール、膠状のまたは沈殿した二酸化ケイ素、網状ポリビニルピロリドン、二塩基性リン酸カルシウム二水和物、微結晶性セルロース、デンプン、ポビドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、乳酸、カルボマー、セチルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、イソプロピルパルミテート、グルコース、ブドウ糖、トリエチルアミン、グリセリン、フルクトース、ショ糖、重合体、およびナノ構造を含むが、これらに限定はされない。また、この医薬的または獣医学的な組成物は、所望の投与方法に適した装置に含まれていてもよい。化粧品組成物について説明した製剤は、この医薬的または獣医学的な組成物に適用可能である。

経口製剤の場合、および、特に、錠剤の場合、担体は、ラクトースおよびデンプンを含むことが多い。ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤も添加されている。カプセルの場合、希釈剤は、ラクトースおよびデンプンを含む。水性懸濁液については、活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされている。甘味料、着色剤、および香味料を包含することも可能である。

坐薬などの直腸製剤の場合、これらの製剤は、室温においては固体であるが直腸温度においては液体である適切な賦形剤に活性成分を混合することにより調製されてもよい。このような材料は、カカオ脂、密蝋、およびポリエチレングリコールを含む。

局所的投与のためには、組成物は、適切な担体に溶解または懸濁された活性成分を含む特に軟膏の形態で製剤されていてもよい。このような担体は、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化剤ワックス、および水を含むが、これらに限定はされない。あるいは、組成物は、適切な担体に溶解または混濁された活性成分を含むクリームまたはローションとして製剤されていてもよい。このような担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水を含むが、これらに限定はされない。

眼科の応用については、組成物は、調節されたｐＨにおいて無菌等張食塩水中の微粉化懸濁液として、好ましくは、調節されたｐＨにおいて無菌等張食塩水中の溶液として、塩化ベンザルコニウムなどの抗菌保存剤と共に、または、この抗菌保存剤無しで製剤されていてもよい。あるいは、組成物は、ワセリンなどの材料を含む軟膏として製剤されてもよい。

注射可能な形態においては、組成物は、水性懸濁液または油性混濁液でもよい。このような懸濁液は、湿潤剤または分散剤および懸濁剤を用いて当業者に周知の方法により調剤されてもよい。組成物は、無菌の溶液または懸濁液であることが好ましい。許容可能な溶媒および担体は、水、リンゲル液、および等張食塩水を含むが、これらに限定はされない。さらに、無菌不揮発性油は、多くの場合、懸濁培地または溶媒において使用されている。このため、モノおよびジグリセリドなどの任意の混合不揮発性油を使用してもよい。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸のほか、薬学的に許容可能なオリーブ油、ヒマシ油などの天然油、特に、それらのポリオキシエチレン化された形態も、注射可能な組成物を調製するために使用される。これらの油性溶液は、エマルジョンおよび懸濁液を製剤するためのカルボキシメチルセルロースなどの懸濁剤または希釈剤を含んでいてもよい。トゥイーンなどの界面活性剤、乳化剤、バイオアベイラビリティを増大させる薬剤も含まれていてもよい。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、多量に入手できない化合物である。したがって、国際公開第０８／１４２１５５号（特に、実施例１）に記載の方法によって調製されることが好ましい。なお、国際公開第０８／１４２１５５号の内容を参照により本願に引用する。特に、（エビまたはカニのキチンから派生する）海産物由来のＮ−アセチルグルコサミンは、選択された無機リン酸塩および適切なリン酸化酵素と、水および塩を含む反応器中で、数時に亘って混合される。この反応中に、酵素は、リン酸基をＮ−アセチルグルコサミンに添加してＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを産生する。次に、この化合物を、様々なアルコール（イソプロパノールおよび／またはエタノールなど）を用いる複数の沈殿工程によって精製することができる。最終的な水溶液を、イオン交換樹脂上で精製して、残留イオンを除去する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを、水中で濃縮させ、精密濾過法（０．２μｍのフィルタ）によって滅菌することができる。最終的な純度を分析法によって評価することができる。この方法により、濃縮水溶液から直接使用可能な、または、任意の水性製剤に迅速に溶解する結晶性粉末を得るために乾燥可能なＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを調製することができる。

Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、本発明に係る組成物および製品において、塩、特に、薬学的または化粧品的に許容可能な塩の形態で使用されてもよい。例えば、このような塩は、特に、酸付加塩、塩基性付加塩、金属塩、およびアンモニウムまたはアルキルアンモニウム塩、特に、薬学的または化粧品的に許容可能なこれらのものを含む。酸付加塩は、無機塩および有機塩を含む。適切な無機酸の代表的な例としては、塩酸、臭化水素酸、沃素酸、リン酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表的な例としては、酢酸、蟻酸、プロピオン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、琥珀酸、酒石酸、クエン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などが挙げられる。有機または無機の酸付加塩の他の例は、Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．、１９７７、６６、２、および、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｕｓｅ」、Ｐ． Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＳｔａｈｌおよびＣａｍｉｌｌｅ Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ、ｅｄｓ．、２００２に記載されている。金属塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウムまたはアルキルアンモニウム塩の例としては、アンモニウム、メチル−アンモニウム、ジメチル−アンモニウム、トリメチル−アンモニウム、エチル−アンモニウム、ヒドロキシエチル−アンモニウム、ジエチル−アンモニウム、ブチル−アンモニウム、テトラメチル−アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基の例としては、リシン、アルギニン、グアニジン、ジエタノールアミンなどが挙げられる。

本発明の化粧品的、薬学的、皮膚科学的、または獣医学的な何れの組成物も、生理的に許容可能な、好ましくは化粧品的、薬学的、皮膚科学的、または獣医学的な分野においてそれぞれ許容可能な担体を含んでいてもよい。

本願の精神において、「ビタミンＡ群の化合物」とは、レチノール（ビタミンＡとしても知られる）、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸（トランス）、レチンアルデヒド、イソトレチノイン（シス−レチノイン酸）、アダパレン、トレチノイン（トランス−レチノイン酸）、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される化合物を意味すると理解されるものとする。化合物は、レチノール、レチナールおよびレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、レチンアルデヒド、イソトレチノイン、トレチノイン、それらの塩および誘導体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。ビタミンＡ誘導体は、ビタミンＡエステル（例えば、ビタミンＡアセテート、ビタミンＡプロピオナート、またはビタミンＡパルミチン酸）、ビタミンＡホスファート、またはプロ−ビタミンＡ（例えば、β−カロチン）でもよい。ある特定の形態において、ビタミンＡ群の化合物は、レチノール、その塩、そのアルコール、またはそのエステルである。

本発明の組成物および製品において使用されるＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの量は、化粧品的および治療的な効果に応じており、したがって、様々であってもよい。特定の一形態においては、組成物の約０．００１ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇを上回り約１０００ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれ、好ましくは、約０．０１ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇを上回り約１００ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれ、より好ましくは、組成物の約０．１ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇを上回り約１０ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれるＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート濃度が、特に局所的投与には適切だと思われる。

より好ましい形態では、ビタミンＡ群の化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートと、相乗作用または増強作用のある量で組み合わせられる。

特定の一形態においては、ビタミンＡ群の化合物、特にレチノール、そのエステル、またはその塩は、組成部の約３μｇ／Ｌまたはμｇ／ｋｇを上回り約３ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれる、好ましくは、組成物の約１００ｍｇ／Ｌまたはｍｇ／ｋｇを上回り約１．５ｇ／Ｌまたはｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれる濃度で組成物中に存在している。

レチノールの欠点の１つは、レチノールが不都合な副作用、特に、皮膚刺激を引き起こすということである。相乗効果または増強効果は、低濃度で、特に、化粧品および治療において一般的に使用される濃度よりも低い濃度で実証されている。したがって、好ましい一形態では、ビタミンＡ群の化合物は、組成物の最終的な使用に応じて、中毒性の無い、または、比較的低い中毒性の、無刺激または低刺激の量でＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートに組み合わせられる。したがって、この特定の形態では、ビタミンＡ群の化合物、特にレチノール、そのエステル、またはその塩は、組成物の約３μｇ／Ｌまたはμｇ／ｋｇを上回り約５０ｍｇ／Ｌまたはｍｇ／ｋｇ未満の範囲、好ましくは、組成物の約３μｇ／Ｌまたはμｇ／ｋｇを上回り約１０ｍｇ／Ｌまたはｍｇ／ｋｇ未満の範囲に含まれる濃度で組成物中に存在している。

本発明の組成物およびキットは、その他の成分、特に、効果を有する化合物をさらに含んでいてもよい。特に、この組成物およびキットは、例えば、遊離基捕捉剤、好ましくは、米国特許出願公開第２００９／０２３３８７６号明細書に記載のような安定化ポリフェノールを含んでいてもよい。さらに、この組成物およびキットは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートがＮ−アセチルグルコサミン、例えばシステインに分解するのを回避するためにホスファターゼ阻害剤も含んでいてもよい。この組成物およびキットは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、例えば、６−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸、アスコルビン酸６−ヘキサデカン酸塩の刺激下において産生された新規合成ヒアルロナンの分解を防止または低減するためのヒアルロニダーゼ阻害剤も含んでいてもよい。この組成物およびキットは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートにより刺激されたヒアルロナンの合成を加速するために、ヒアルロナンシンターゼ活性化剤を含んでいてもよく、これらの活性化剤、例えば、プロスタグランジンＥ２などのエイコサノイドまたはレチノイン酸（トランス）との相乗作用を有していてもよい。この組成物およびキットは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートにより刺激されたヒアルロナンの合成を加速するため、および、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとの相乗効果を有するために、グルクロン酸誘導体、例えば、グルクロン酸、その塩、そのエステル、およびそのアミド、またはＵＤＰ−グルクロン酸などを含んでいてもよい。

本発明は、本発明の特定の形態および特定の利点のみを説明する、限定を意味するものではない、例示的目的で提供される以下の実施例においてより明らかになるであろう。

実施例
実施例１：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートにより処理されるヒトケラチノサイトによるヒアルロン酸産生の刺激
１．テストの原則
正常なヒトケラチノサイトを培養して融合細胞にした。この細胞を、テスト製品によって４８時間に亘って処理した。ヒアルロン酸を含む上清を収集してすぐに検定した。ヒアルロン酸を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートによって定量化した。

タンパク質含有量を、マイクロタイタープレートの各ウェルについて測定した。

２．テストした製品
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート（ＮＡＧ６Ｐ）を、２０ｍＭ、１０ｍＭ、よび５ｍＭの濃度でテストした。

３．細胞の調製
正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）の原始培養株を、美容整形手術により皮膚標本から分離された細胞から得た。

ＮＨＫを、２４−ウェルプレートにおける特定のＫＳＦＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。プレートを、湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）内に２４時間置いた。

４．細胞の処理
各濃度の様々な製品（ＫＳＦＭ培地に希釈した、６００μｌ）を、４８時間に亘って細胞に接触させた。未処理の細胞をコントロール条件として使用した。

各処理条件を、３つのウェルのＮＨＫ細胞に基づいて評価した。

５．ヒアルロン酸検定
２４時間の処理後、２２０μlの上清の中間体サンプルを各ウェルから除去し、プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に戻した。

４８時間の処理後、残りの上清（≒３５０μl）を収集し、遠心分離した。

細胞上清を、ヒアルロナン酵素結合免疫吸着検定法キット（ＨＡ−ＥＬＩＳＡ、Ｅｃｈｅｌｏｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．社）に記載の方法に従って検定した。
これは、４０５ｎｍでの分光光度的検出を伴うＥＬＩＳＡ検定である（Ｓａｆｉｒｅ、Ｔｅｃａｎ社）。

この検定を、各ウェルについて重複して行った。

６．結果の発現
各サンプルにおいて測定した光学密度（ＯＤ）を、グラフにプロットした（キットにおける具体的な標準曲線）。ヒアルロン酸濃度を、ｎｇ／ｍｌで表した。

７．タンパク質合成
これは、上清の細胞ペレットにおけるタンパク質含有量を測定することを含む。なお、この上清の細胞ペレットについて、ヒアルロン酸が検定される。

結果を、１ウェルにつきμg単位のタンパク質として表した。

ビシンコニン酸（ＢＣＡ）方法を使用した。この方法は、ローリー法に原則的には類似している。

７．１．原則
タンパク質は、Ｃｕ^＋＋をＣｕ^＋に用量依存的に還元する。ビシンコニン酸は、Ｃｕ^＋イオンに対する特異性の高い色素体であり、ビシンコニン酸は、Ｃｕ^＋イオンと共に、着色された複合体を形成し、この複合体の吸光度は、５５０ｎｍで測定される。

７．２．試薬
ビシンコニン酸および硫酸銅という２つの溶液を検定において使用した。これら２つの試薬を混合した場合、これらは、緑色の溶液を生成し、この溶液は、Ｃｕ^＋イオンの存在下において紫色に還元される。

これらの試薬を、Ｓｉｇｍａ社のＢＣＡ−１検定キットに供給した。標準的なタンパク質溶液（０．１５ＭのＮａＣｌ中に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）も供給した。

７．３．タンパク質検定
４８時間の処理後、マイクロタイターウェルからの上清を除去してヒアルロン酸を検定する。その後、細胞層を、ＰＢＳ中に取り上げ、超音波処理によって切り離し、０．１ＭのＮａＯＨに溶解させた。次に、ビシンコニン酸＋硫酸銅混合物を添加し、プレートを暗闇にした湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）内に置いた。３０分の培養後、吸光度を５５０ｎｍで測定した（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ社）。

並行して、０μｇ〜１００μｇ／ウェルの濃度範囲に亘るＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌの貯蔵液（Ｐ−０９１４）を用いて、標準曲線を準備した。

この標準曲線を用いて、ウェルにおいて測定された光学密度を、ＮＨＫ細胞の１ウェル当たりのμｇ単位のタンパク質に変換した。

７．４．結果の発現
セルによって放出されるヒアルロン酸の量を、各ウェルおよび各処理条件について、μｇ単位のタンパク質として表される細胞含有物に対して測定した。したがって、最終結果を、タンパク質１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ単位のヒアルロン酸として表した。

テスト製品と同じ濃度で処理されたウェルについて平均値を計算した。この平均を、コントロールウェルの平均と比較した（ステューデントのｔ検定−平均の比較−ｐ＜０．０５^＊ならば９５％の有意差、および、ｐ＜０．０１^＊＊ならば９９％の有意差）。

テスト製品により誘発される刺激率を、コントロールおよび処理したものの条件の平均値と比較することによって決定した。

刺激率（％）＝（処理したもの−コントロール）／コントロール
結果を表１および表２に示す（略称：ＮＡＧ６Ｐ：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート）。

^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
表１：２４時間後にケラチノサイトによって産生されたヒアルロン酸

^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表２：４８時間後にケラチノサイトによって産生されたヒアルロン酸
結論：
正常なヒトケラチノサイトにＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートを添加することにより、２４時間の処理後、これら皮膚細胞によるヒアルロン酸産生が用量に依存して刺激された。４８時間の時点で刺激が確認され、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによって処理されていない細胞に比べて、ヒアルロン酸産生が＋２８２％さらに増進した。

したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、皮膚細胞によるヒアルロン酸産生の優れた刺激物質である。したがって、ＮＡＧ６Ｐは、皺および細かい皺の形成を制限するため、または、その減衰を促進するため、ならびに、（ヒアルロン酸の高い保水能力により）皮膚の水分補給を促進および維持するために、皮膚の表皮性細胞外基質の更新性を刺激することについて関心が持たれている。

実施例２：ビタミンＡプロピオナートとの相乗効果でＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートによって処理されるヒトケラチノサイトによるヒアルロン酸産生の刺激。

実施例１において説明した条件下で、ビタミンＡプロピオナートをＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートと組み合わせて使用して実験を行った。ビタミンＡプロピオナートを、ＤＭＳＯ中に溶解させた。

ビタミンＡプロピオナート＋／−ＮＡＧ６Ｐのテストについて、コントロールの代わりにＤＭＳＯコントロール（実際に存在するＤＭＳＯの量に対応する１：１０，０００の希釈）に対して刺激率を表した。

結果を、表３および表４に示す（略称：ＮＡＧ６Ｐ：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート）。

^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０−９９％での有意な結果
表３：２４時間後にケラチノサイトによって産生されたヒアルロン酸

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理において存在するＤＭＳＯの量に対応する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊検定ステューデント：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊検定ステューデント：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表４：４８時間後にケラチノサイトによって産生されたヒアルロン酸
結論：
注目すべきことに、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートをビタミンＡプロピオナートと組み合わせることによって、ケラチノサイトによるヒアルロン酸産生の相乗的刺激が２４時間目から起きる、ということが観察された。より注目すべきことには、前記効果は、個別にテストした各化合物の効果の合計よりも大きかった（両化合物を含む場合の２４時間目のヒアルロン酸レベルの上昇は＋９９％であったのに対し、ビタミンＡプロピオナートだけを含む場合、およびＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートだけを含む場合はそれぞれ、＋３４％、および＋３５％であった）。

この相乗効果は、４８時間後に確定され、増進した。この時点で、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせは、ケラチノサイトによるヒアルロン酸産生における＋３３０％の増加を誘発したのに対し、ビタミンＡプロピオナートだけの場合、およびＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートだけの場合はそれぞれ、＋１０５％、および＋１３５％であった。

したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡ誘導体との組み合わせは、皮膚細胞によるヒアルロン酸産生を刺激することについてのＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの有効性を向上させる。したがって、ビタミンＡプロピオナートと相乗的に作用するＮＡＧ６Ｐは、皺および細かい皺の形成を制限するため、または、その減衰を促進するため、ならびに皮膚の水分補給を（ヒアルロン酸の高い保水力により）促進および維持するために、皮膚の表皮性細胞外基質の更新性を刺激することについて関心が持たれている。

実施例３：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートだけを介した、または、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせた、正常ヒト線維芽細胞によるヒアルロン酸産生の（ケラチノサイトによって仲介される）間接刺激（Ｎ−アセチルグルコサミンとの比較）。

１．テストの原則
正常ヒト皮膚線維芽細を、培養して融合細胞にした。この細胞を、テスト製品の存在下であらかじめ成長させた正常ヒトケラチノサイトの上清によって４８時間に亘って処理した。ヒアルロン酸を含む線維芽細胞上清を収集し、直ぐに検定した。ヒアルロン酸を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートによって定量化した。タンパク質含有量をマイクロタイタープレートの各ウェルについて測定した。

２．テストした製品
＊１０ｍＭまたは５ｍＭの濃度のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）またはＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート（ＮＡＧ６Ｐ）を、４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

＊ビタミンＡプロピオナート１μＭを、４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

＊ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせを、４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

＊ＮＡＧ６Ｐ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせを、４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

３．細胞の調製
正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）の原始培養株を、美容整形手術により皮膚標本から分離された細胞より取得した。

ＮＨＫを、２４−ウェルプレートにおける特定のＫＳＦＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、１３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。このプレートを、湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）中に２４時間置いた。

正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）の原始培養株を、美容整形手術により皮膚標本から分離された細胞より取得した。

ＮＨＦを、２４−ウェルプレートにおける、０．５％のＦＣＳが捕捉されたＥ−１９９培養液（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、９０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。このプレートを、湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）中に２４時間置いた。

２種類の細胞、すなわち、ＮＨＫおよびＮＨＦを４８時間開けて塗布した。

４．細胞の処理
各濃度の異なる製品（ＫＳＦＭ培地中に希釈された、６００μｌ）を、４８時間に亘ってＮＨＫ細胞に接触させた。未処理の細胞をコントロール条件として使用した。２つのプレートを使用して、一方ではＮＡＧ、およびＮＡＧ＋ビタミンＡプロピオナートを、他方ではＮＡＧ６Ｐ、およびＮＡＧ６Ｐ＋ビタミンＡプロピオナートを別々にテストした。

各処理条件を、３つのウェルのＮＨＫ細胞において評価した。

４８時間後、ＮＨＫ細胞の上清（３００μｌ／ウェル）の一部を取り出し、ＮＨＦ細胞の上清（３００μｌのＥ−１９９／ウェル-ＦＣＳを含まない新鮮培地）にウェルそれぞれに移植した。

これにより、最終的な容積は６００μｌ／ウェル（５０：５０の割合のＫＳＦＭ／Ｅ−１９９培地）となり、これは、ＮＨＦ細胞上に４８時間に亘って残った。

５．ヒアルロン酸検定
４８時間の処理後、ＮＨＦ細胞の上清を回収し、遠心分離した。

ヒアルロン酸を、実施例１において説明したような細胞上清において検定した。

この検定を、各ウェルについて重複して行った。

６．結果の発現
各標本において測定した光学密度（ＯＤ）を、グラフにプロットした（キットにおける具体的な標準曲線）。ヒアルロン酸濃度を、ｎｇ／ｍｌの単位で表す。

７．タンパク質合成
これは、上清の細胞ペレットにおけるタンパク質含有量を測定することを含む。なお、この上清の細胞ペレットについて、ヒアルロン酸が検定される。

この検定を実施例１に記載のように行い、結果を１ウェル当たりのμｇ単位のタンパク質として表した。

セルによって放出されたヒアルロン酸の量を、各ウェルおよび各処理条件について、μｇ単位のタンパク質として表される細胞含有物に対して測定した。したがって、最終的な結果を、タンパク質１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ単位のヒアルロン酸として表した。

同じ濃度のテスト製品で処理されたウェルについて、平均値を計算した。この平均を、コントロールウェルの平均と比較した（ステューデントのｔ検定−平均値の比較−ｐ＜０．０５^＊ならば９５％の有意差、ｐ＜０．０１^＊＊ならば９９％の有意差）。

テスト製品により誘発される刺激率を、コントロールおよび処理したものの条件と比較することにより決定した。

刺激率（％）＝（処理したもの−コントロール）／コントロール
ビタミンＡプロピオナート＋／−ＮＡＧまたはＮＡＧ６Ｐ（移植後）の条件について、コントロールの代わりにＤＭＳＯコントロール（実際に存在するＤＭＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈）に対して刺激率を表した。

結果を表５および表６に示す。結果は、３つのウェルの平均に対応している。

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理において存在するＤＭＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表５：４８時間後に線維芽細胞によって産生されたヒアルロン酸−ＮＡＧだけの効果、または、ビタミンＡプロピオナートとの組み合わせでの効果

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理において存在するＭＤＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ６Ｐ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表６：４８時間後に線維芽細胞により産生されたヒアルロン酸−ＮＡＧ６Ｐだけの効果、または、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせた効果
結論：
ケラチノサイトを、ＮＡＧだけが存在する環境下で、または、ビタミンＡプロピオナートだけが存在する環境下で４８時間に亘って培養し、細胞上清を線維芽細胞に移植した後、該線維芽細胞によるヒアルロン酸合成の低減が観察された（この低減は、１０ｍＭのＮＡＧで顕著であった）。ＮＡＧとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせで行った同じ実験は、ケラチノサイト培養上清によって処理した線維芽細胞によるヒアルロン酸産生が、弱い１５％の刺激になった。

驚くべきことに、同じ条件下でケラチノサイトをＮＡＧ６Ｐのみ、または、ビタミンＡプロピオナートのみと共に培養し、これらの細胞の上清を線維芽細胞に移植した後、これら線維芽細胞によるヒアルロン酸産生のわずかな刺激が見られた。ＮＡＧ６ＰとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせによって実施された同じ実験は、ケラチノサイト培養上清によって処理された線維芽細胞によるヒアルロン酸産生における大きな４２％の上昇を示した。

効果の無かったＮ−アセチルグルコサミンとは異なり、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせられたＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、真皮細胞によりケラチノサイトの中間物を介してヒアルロン酸産生を刺激することができた。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせは、真皮中に天然に存在する細胞におけるヒアルロン酸産生を刺激する。

したがって、ビタミンＡプロピオナートと相乗的に作用するＮＡＧ６Ｐは、皺および細かい皺の形成を制限するため、または、それらの減衰を促進するため、ならびに皮膚深部における水分補給を（ヒアルロン酸の高い保水力により）促進および維持するために、皮膚の真皮細胞外基質の更新性を刺激することについて関心が持たれている。

実施例４：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートだけによる、または、ビタミンＡプロピオナートとの組み合わせによる、正常ヒト線維芽細胞によるプロコラーゲン１産生の（ケラチノサイトにより仲介された）間接的刺激（Ｎ−アセチルグルコサミンとの比較）。

１．原則
この実験は、実施例３において説明した方法に従って実施された。プロコラーゲン１を含む線維芽細胞上清を収集し、ＥＩＡマイクロタイタープレートを用いてプロコラーゲン１を直ぐに検定した。

２．プロコラーゲン１検定
４８時間の処理後、ＮＨＦ細胞上清を収集し、遠心分離した。

プロコラーゲン１を、細胞上清において、プロコラーゲンタイプ１Ｃ−ペプチドＥＩＡキット（ＭＫ１０１、Ｔａｋａｒａ社）に記載の方法によって検定した。これは、４５０ｎｍでの分光光度的検出によるＥＩＡ検定である（Ｓａｆｉｒｅ、Ｔｅｃａｎ社）。

重複検出を２つのウェルについて実施したのに対し、第３ウェルは１回だけ検定した。

３．結果の発現
各標本において測定された光学密度（ＯＤ）を、グラフにプロットした（キットにおける具体的な標準曲線）。プロコラーゲン１濃度をｎｇ／ｍｌで表した。

実施例３のように、タンパク質含有量を、プロコラーゲン１の検定の対象である上清の細胞ペレットにおいて測定した。

したがって、最終的結果を、タンパク質１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ単位のプロコラーゲン１として表した。

平均値を同じ濃度のテスト製品で処理されたウェルについて計算した。この平均を、コントロールウェルの平均と比較した（ステューデントのｔ検定−平均の比較、ｐ＜０．０５^＊ならば９５％の有意差、ｐ＜０．０１^＊＊ならば９９％の有意差）。

テスト製品によって生じる刺激率を、コントロールおよび処理したものの条件の平均値を比較することにより決定した。

刺激率（％）＝（処理したもの−コントロール）／コントロール
ビタミンＡプロピオナート＋／−ＮＡＧまたはＮＡＧ６Ｐ（移植後）の条件について、コントロールの代わりにＤＭＳＯコントロール（実際に存在するＤＭＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈）に対して刺激率を表した。

結果を、表７および表８に示す。結果は、３つのウェルの平均に相当している。

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理において存在するＤＭＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表７：４８時間後に線維芽細胞により産生されるプロコラーゲン１−ＮＡＧだけの場合の効果、または、ビタミンＡプロピオナートとの組み合わせた場合の効果

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理において存在するＤＭＳＯの量に相当する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表８：４８時間後に線維芽細胞により産生されるプロコラーゲン１−ＮＡＧ６Ｐだけの場合の効果、または、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせた場合の効果
結論：
ＮＡＧだけ、または、ビタミンＡプロピオナートだけが存在する環境下で４８時間に亘ってケラチノサイトを培養し、細胞上清を線維芽細胞に移植した後、線維芽細胞によるプロコラーゲン１合成の低減が観察された（この低減は、１０ｍＭのＮＡＧにおいて顕著であった）。ＮＡＧとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせを用いて行った同じ実験により、プロコラーゲン１産生はこれら線維芽細胞により低減されると考えられた。

驚くべきことに、同じ条件下で、ケラチノサイトをビタミンＡプロピオナートと組み合わせたＮＡＧ６Ｐと共に培養し、これら細胞の上清を線維芽細胞に移植することにより、線維芽細胞によるプロコラーゲン１合成の刺激が見られた。ＮＡＧ６ＰをビタミンＡプロピオナートと組み合わせることにより得られたこの刺激作用は、別々にテストした各化合物の効果の合計よりも大きかった。

効果の無かったＮ−アセチルグルコサミンとは異なり、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせられたＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、真皮細胞によるプロコラーゲン１産生を、ケラチノサイトの中間物を介して刺激することができた。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせは、天然には真皮に存在する細胞中のプロコラーゲン１産生を刺激する。

したがって、ＮＡＧ６Ｐは、ケラチノサイトを介して、線維芽細胞によるプロコラーゲン１産生をビタミンＡプロピオナートとの相乗効果で誘発することができ、したがって、この組み合わせは、皺および細かい皺の形成を制限するため、または、これらの減衰を促進するため、ならびに、皮膚深部における水分補給を（ヒアルロン酸の高い保水力により）促進および保持するために、皮膚の細胞外基質の更新性を刺激することについて関心が持たれている。

実施例５：Ｎ−アセチルグルコサミンだけによる、または、ビタミンＡプロピオナートとの組み合わせによる、正常ヒト線維芽細胞増殖の（ケラチノサイトにより仲介された）間接的刺激
この実験は、ヒトケラチノサイトから移植された上清による処理の４８時間後に正常ヒト線維芽細胞（真皮原始培養株）の増殖を評価した。

「細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ」テストは、ルミネッセンス検出前のＤＮＡ合成中のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを測定することにより細胞増殖を定量化する。これは、放射線を使わない鋭敏法である（［Ｈ^３］チミジン取り込みの代替）。

１．原則
細胞を処理の存在下に特定の時間置いた（インキュベータは３７℃、５％ＣＯ_２）。その後、ピリミジン類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、細胞を最低２時間に亘ってさらに培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。この間に、チミジンの代わりにＢｒｄＵが増殖細胞のＤＮＡに取り込まれた。

培養液を除去し、その後、細胞を固定し、ＤＮＡが同時に変性した（抗体接触性）。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）抗体を添加した。この抗体は、新規合成ＤＮＡにおいてＢｒｄＵに結合する。その後、この免疫複合体を、ルミノール基質を添加することにより、発光を測定することで検出する（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ社）。

２．テスト製品
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート（ＮＡＧ６Ｐ）を、１０ｍＭおよび５ｍＭの濃度で４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を正常ヒト線維芽細胞に移植した。

ビタミンＡプロピオナートを、１μＭの濃度で４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

ＮＡＧ６Ｐ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせを、４８時間に亘って正常ヒトケラチノサイトに塗布し、その後、上清を、正常ヒト線維芽細胞に移植した。

３．細胞の調製
正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）の原始培養株を、美容整形手術により皮膚標本から分離された細胞から取得した。

ＮＨＫを、２４−ウェルプレートにおける特定のＫＳＦＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、１３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。このプレートを、湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）中に２４時間置いた。

正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）の原始培養株を、美容整形手術により皮膚標本から分離された細胞から取得した。

ＮＨＦを、９６−ウェルＯｐｔｉｌｕｘホワイトプレート（ＢＤファルコン３５３９４７）におけるＥ−１９９培養液（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。このプレートを、湿潤インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）に２４時間置いた。

２種類の細胞−ＮＨＫおよびＮＨＦ−を４８時間空けて塗布した。

４．細胞の処理
各濃度の異なる製品（ＫＳＦＭ培養液中に希釈された、６００μｌ）を、４８時間に亘ってＮＨＫ細胞と接触させた。コントロール細胞は、未処理で残された。各処理条件を、３つのウェルのＮＨＫ細胞において評価した。

４８時間後、ＮＨＫ細胞上清の一部を除去した。ＮＨＫプレート（２４ウェル）上のウェルから上清の各サンプル（２回１００μｌ）を、１ウェル当たり１００μｌのＥ−１９９培地を既に含んでいるＮＨＦプレートの２つのウェルに移植した。これにより、４８時間に亘ってＮＨＦ細胞に残る最終的な容積が２００μｌ／ウェル（ＫＳＦＭ／Ｅ−１９９培地は５０：５０の比率）となった。

５．増殖の測定
細胞増殖を「細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ」キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社Ｎｏ．１１６６９９１５００１）に記載の方法によって定量化した。これは、ルミネッセンス検出による免疫学的検定である（Ｇeｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ社）。

６．結果の発現
同じ処理条件による６つのウェルの輝度値（ＲＬＵ／ｓ）の平均を決定した。これらの平均を、６つのコントロールウェルについての平均と比較した（ステューデントのｔ検定−平均の比較−ｐ＜０．０５^＊ならば９５％の有意差、および、ｐ＜０．０１^＊＊ならば９９％の有意差）。

処理された細胞の増殖を、コントロール（未処理細胞−１００％）に対する割合として表した（ＯＤ処理されたもの／ＯＤコントロール×１００）。

ビタミンＡプロピオナート＋／−ＮＡＧ６Ｐ（移植後）という条件について、増殖率を、コントロールの代わりにＤＭＳＯコントロール（実際に存在するＤＭＳＯの量に対応する１：１０，０００の希釈）に対して相対的に表した。

以下の表９に示す結果は、６つのＮＨＫ上清が移植された６つのウェルの平均に対応している。

^ａＤＭＳＯコントロール：ビタミンＡプロピオナートによる処理に存在するＤＭＳＯの量に対応する１：１０，０００の希釈、および、ＮＡＧ１０ｍＭ＋ビタミンＡプロピオナート１μＭの組み合わせ。
^＊ステューデント検定：ｐ＜０．０５−９５％での有意な結果
^＊＊ステューデント検定：ｐ＜０．０１−９９％での有意な結果
表９：４８時間後の線維芽細胞増殖−ＮＡＧ６Ｐだけの効果、または、ビタミンＡプロピオナートと組み合わせた効果
結論：
ＮＡＧ６Ｐのみの存在下で４８時間に亘ってケラチノサイトを培養し、これらの細胞の上清を線維芽細胞に移植した後、驚くべきことに、線維芽細胞増殖が著しく増加したことが観察された。さらに驚くべきことに、この増加は、ケラチノサイトプレインキュベーションにおいて使用されるＮＡＧ６Ｐの濃度に無関係であり、線維芽細胞増殖に直接作用し得るのはＮＡＧ６Ｐではないだろうということを示す。したがって、ＮＡＧ６Ｐは、ケラチノサイトの反応を誘発するということが非常に確実であり、ケラチノサイトは、この化合物の効果の下に、１つまたは複数の分子（おそらく、サイズの異なるヒアルロン酸）をその上清に分泌し、この１つまたは複数の分子により線維芽細胞増殖が活性化される。

注目すべきことに、ＮＡＧ６ＰとビタミンＡプロピオナートとの組み合わせは、別々にテストした両製品よりも線維芽細胞増殖をより一層刺激した。

したがって、ＮＡＧ６Ｐは、単独で、または、ビタミンＡプロピオナートとの相乗効果で、ケラチノサイトの中間体を介して、線維芽細胞増殖を誘発することができ、皮膚細胞更新性を刺激することについて関心が持たれている。

実施例６：ヒト皮膚におけるＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの効果のテスト
この研究では、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの効果を生きているヒト皮膚において評価し、レチノール（０．０２％〜０．０５％）を含む市販の「ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙ」クリームの効果と比較した。特に、以下のパラメータを評価した：
マッソントリクローム染色による染色後の一般的な皮膚形態、
アルシアンブルー染色後の酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量、
該受容体の免疫標識後のヒアルロン酸ＣＤ４４受容体の発現量。

１．テストした製品
テストした製品：１％（Ｐ１）、０．１％（Ｐ２）、および０．０１％（Ｐ３）の濃度（ｗ／ｖ）のＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート（ＮＡＧ６Ｐ）
２．生体モデル
３３個の組織片（直径約１０ｍｍ）を、腹壁形成術を受ける３６歳の白色人種の女性（Ｐ７１２ＡＢ３６）から採取した。これらの組織片を、３つの組織片からなる１１グループに分け、特別な皮膚組織片生存培地中に置いた。

３．処理
ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームを、０日目（Ｄ０）、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、６日目（Ｄ６）および８日目（Ｄ８）に、組織片に対して１ｃｍ²当たり１ｍｇ塗布した。

０日目、２日目、３日目、６日目および８日目において、３０μｌの生成物Ｐ１、Ｐ２およびＰ３が組織片上に置いた濾紙ディスクに堆積した。

コントロールには何の処理も行わなかった。

４．標本
０日目に、グループＣ０の３つの組織片をサンプリングし、２つに切った。一方の半片を一般的ブアン液中に固定し、他方の半片を−８０℃で保管した。

６日目および１０日目（Ｄ１０）に、各グループから３つの組織片をサンプリングし、同様に処理した。

５．組織像
一般的ブアン溶液中に４８時間固定した後、標本を乾燥させ、Ｌｅｉｃａ １０２０自動組織処理機を用いてパラフィン中に含浸させた。その後、ＬｅｉｃａＥＧ１１６０包埋ステーションを用いて操作手順ＭＯ−Ｈ−１５３に従って包埋した。５μｍの薄片をＬｅｉｃａ ＲＭ２１２５ Ｍｉｎｏｔ型マイクロトームを用いて操作手順ＭＯ−Ｈ−１７３に従って調製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）の組織学的硝子顕微鏡スライド上に搭載した。

５．１ 全体的な形態
マッソントリクローム、ゴールドナー変型によって染色したパラフィン薄片を操作手順ＭＯ−Ｈ−１５７に従って全体的な形態を調査した。

５．２ 酸ＧＡＧの可視化
酸ＧＡＧを、アルシアンブルー染色により可視化した。酸ＧＡＧは、乳頭状の真皮全体に存在していた。

このゾーンにおいて、検査対象のＧＡＧは青色に染色され、酸ＧＡＧに対応する。

染色強度を、画像解析によって定量化した。

５．３ ＣＤ４４免疫標識
ＦＩＴＣによるビオチン／ストレプトアビジン増殖システムによって室温で１時間培養されたマウスの抗−ＣＤ４４モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＭＨＣＤ４４００）を１：１００の希釈で用いて、凍結した薄片のＣＤ４４受容体を標識化した。核を、ヨウ化プロピジウムによって対比染色した。

結果
全体的な形態
０日目：
組織片の角質層は、中程度に肥厚し、わずかに層状になり、その表面および底部において完全に角質化された。表皮は、５〜６の細胞層を良好な形態で有していた。真皮・表皮接合部は、中程度の起伏を有していた。乳頭状の真皮は、非常に濃密な網状組織を形成する相当厚いコラーゲン線維を良好な細胞充実性で有していた。

１０日目（図２参照）：
コントロール組織片の表皮および真皮の構造は、わずかに変化し、角質層の底部における著しい角質化と軽度の不全角化とを伴った。基底層は、軽度の海綿状態を示した。

ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙ基準クリームの塗布は、顕著な表皮肥厚を伴う非常に明確なレチノイン型の反応につながった（５〜６細胞層／１９〜２０）。乳頭状の真皮は濃密であった。

組織片に対するＮＡＧ６Ｐの塗布により、表皮形態がかなり修正された。特に、０．０１％のＮＡＧ６Ｐ（生成物Ｐ３）を塗布することにより、全体的な形態が変化し、真皮・表皮接合部が明らかに再構成／強化された。乳頭状の真皮は、かなり濃密であった。

酸ＧＡＧの可視化／定量化
視覚分析
０日目：
酸ＧＡＧは、乳頭状の真皮全体において中程度であり、線維芽細胞おいて鮮明に見られた。

６日目（図３参照）：
未処理の組織片上に、Ｃ０の場合よりもわずかに多い程度でＧＡＧが発現した。

ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームによって、ＧＡＧは、中程度になり、真皮・表皮接合部（ＤＥＪ）に沿った部分、および、乳頭状の真皮の残りの部分においては、かなり濃密であった。

ＮＡＧ６Ｐによって、ＧＡＧは、ＤＥＪに沿っては中程度になり、乳頭状の真皮全体に容量に依存して存在していた。つまり、酸ＧＡＧは、ＮＡＧ６Ｐが０．０１％の場合よりもＮＡＧ６Ｐが１％の場合のほうが濃密であった。

１０日目：
未処理の組織片上において、ＧＡＧは、６日目に見られたのと同様であった。

基準ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームによって、ＧＡＧは、真皮・表皮接合部（ＤＥＪ）に沿った部分、および、乳頭状の真皮の残りの部分において顕著に且つ相当に濃密になった。

ＮＡＧ６Ｐによって、６日目に見られた効果を確定した。つまり、酸ＧＡＧは、ＤＥＪに沿って、および、乳頭状の真皮全体に、容量に応じて中程度に存在していた。つまり、酸ＧＡＧは、ＮＡＧ６Ｐが０．０１％の場合よりもＮＡＧ６Ｐが１％の場合のほうが濃密であった。

定量分析
酸ＧＡＧを画像解析により定量化した。結果を以下の表１０に分析面積の割合として表す。

表１1：酸ＧＡＧが乳頭状の真皮に占める面積の割合
ヒアルロン酸ＣＤ４４受容体の発現
０日目：
ＣＤ４４発現は、組織片において明らかであり、非常に規則的であった。

表皮において、ＣＤ４４は、顆粒層までの全ての生きている層における膜および細胞周囲の場所において、ほぼ点状であった。乳頭状の真皮において、ＣＤ４４は、線維芽細胞および細繊維上において非常に顕著であった。

６日目：
未処理の組織片中では、ＣＤ４４発現は、表皮および乳頭状の真皮の双方において低減した。

ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームによって処理したグループにおいて、ＣＤ４４は、中程度に過剰発現した。

ＣＤ４４は、１％および０．１％のＮＡＧ６Ｐによって処理したグループにおいて軽度に過剰発現した。この過剰発現は、０．０１％のＮＡＧ６Ｐでは非常に軽度であった。

１０日目（図４参照）：
未処理の組織片中において、ＣＤ４４は、特に、表皮基底層および乳頭状の真皮において、わずかに過剰発現した。

ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームによって処理したグループにおいて、ＣＤ４４は、中程度に過剰発現した。

この過剰発現は、０．０１％のＮＡＧ６Ｐでは、表皮および乳頭状の真皮の双方において非常に明瞭であった。

結論
この研究は、注目すべきことに、ヒト皮膚に対するＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートの塗布が、以下のような複数の現象を誘発するということを示した。

・ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームとは対照的に、表皮肥厚を伴わずに、真皮・表皮接合部の明らかな強化を伴う皮膚−表皮構造の可視的再構成；
・ＲｅｔｉｎＯｘ＋Ｄａｙクリームの場合にように真皮・表皮接合部だけではなく、乳頭状の真皮全体に良好に分散した酸ＧＡＧ（ひいては、皮膚における主要な酸ＧＡＧである主にヒアルロン酸）含有量の増加；
・ヒアルロン酸合成活性および皮膚細胞の活性化を示す、ヒアルロン酸ＣＤ４４受容体のレベルの上昇。

特に、この化合物は単独で、市販のレチノールクリームと同程度に、または、それ以上に有効であった（例えば、市販のクリームとは異なり、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、表皮肥厚を引き起こさない）。

したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートは、皮膚において
・皮膚の３次元支持マトリックスの構成要素であるＧＡＧの合成を刺激することにより皮膚を再緊張させる、
・真皮・表皮接合部を改善することにより表皮と真皮との間の栄養素交換を増進する、
・真皮・表皮接合部を改善し、ＧＡＧ合成を刺激することにより皮膚を滑らかにして張りを持たせる、
・ＣＤ４４受容体を刺激することにより、皮膚再生を促す
といった複数の現象を刺激することについて関心が持たれている。

実施例７：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート（ＮＡＧ６Ｐ）を含む皮膚ケア組成物の例
６．１．成熟した皮膚用の再生クリーム
Ａ−水相
グリセリン ２．０％
ヘキシレングリコール ３．０％
キサンタンガム ０．５％
保存料 充分量
カルボマー ０．３５％
ＮＡＧ６Ｐ ０．１％
水 充分量１００％
Ｂ−油相
スクアラン １５％
セチルアルコール ２％
アラキルアルコール／ベヘニルアルコール／アラキジルグルコシド １％
グリセロールステアラート ５％
水 １．５％
ＮａＯＨ ０．３５％
保存料＋香料 充分量
６．２．保湿および柔軟化エマルジョン
Ａ−油相
セテアレス−２ ３．５％
セテアレス−２１ ２〜４％
麦芽油 ３％
シクロメチコン ７％
パルミチン酸オクチル ８％
Ｂ−水相
水 充分量１００％
グリセリン ７．０％
ヘキシレングリコール ３．０％
ＮＡＧ６Ｐ ０．１％
保存料 充分量
Ｃ−４０℃未満の温度でエマルジョンに添加される成分
ナトリウムヒアルロン酸塩 ０．１％
水 ５％
トコフェロール ０．０５％
ビタミンＡパルミタート ０．１％
リン脂質 ０．５％
セラミド３ ０．１％
ポリアクリルアミド＆Ｃ_{１４−１３}イソパラフィン＆ラウレス−７ ２〜３．５％
６．３．紫外線により老化した皮膚のためのサンクリーム
Ａ−油相
モノステアリン酸グリセロール ２％
ＰＥＧ−１００ステアラート ３％
Ｃ１２−Ｃ１５息香酸アルキル １０％
ジメチコン ５％
酢酸トコフェロール １％
オクチル−トリアゾン（ＵｖｉｎｕｌＴ１５０） １．５％
ブチルメトキシジベンゾイルメタン（Ｅｕｓｏｌｅｘ９０２０） ２．０％
セトステアリルアルコール １％
Ｂ−水相
水 充分量１００％
保存料 ０．６％
グリセリン ７％
ヘキシレングリコール ３．０％
カルボマー ０．５％
テトラナトリウムＥＤＴＡ ０．２％
ＮＡＧ６Ｐ ０．１％
ナトリウムヒアルロン酸塩ＨＭＷ ０．１％
水 ５％
ＮａＯＨ ０．５％
保存料＋香料 充分量
６．４．皺取りクリーム、注射後＜＜充填剤＞＞
Ａ−油相
スクアラン ５％
セチルアルコール ２％
ジメチコン ５％
パルミチン酸オクチル ５％
Ｂ−水相
ブチレングリコール ０．５〜４％
水 充分量１００％
ＮＡＧ６Ｐ ０．１％
グリセリン ２．０％
ヘキシレングリコール ３．０％
キサンタンガム ０．５％
保存料 充分量
Ｃ−４０℃未満の温度でエマルジョンに添加される成分
酢酸トコフェロール ０．１〜１％
ピリドキシン ０．０１〜０．０５％
ビタミンＡパルミタート ０．０１〜１％
ｄ−パンテノール ０．１〜１％
クエン酸 ０．１〜０．５％
グルコン酸亜鉛 ０．１〜１％
クエン酸三ナトリウム １〜２．５％
水 ５％
６．５．成熟した皮膚用の化粧落しローション
ポリソルベート２０ １．０％
カプリリル／カプリルグルコシド（ＯｒａｍｉｘＣＧ１１０） ２．０％
ＮＡＧ６Ｐ ０．１％
ＰＥＧ−７ヤシ脂肪酸グリセリル ０．５％
ヘキシレングリコール ４〜５％
ｄ−パンテノール ０．１％
マンニトール ０．０２％
保存料 充分量
水 充分量１００％

Claims (15)

1. Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは化粧品的に許容可能なその塩を含む化粧品組成物の、
   乾燥皮膚を処置するため、もしくは、皮膚および付属肢の老化を処置または防止するため、皺を処置または防止するため、
   皮膚の弾力性および／または色調を向上するため、
   皮膚を引き締めるため、ならびに／または、
   ヒアルロナンおよび／またはコラーゲンの合成を増進するための美容的使用（医療行為を除く）。
2. 深い皺および／または細かい皺を処置又は防止するための請求項１に記載の使用。
3. ビタミンＡ群の化合物をさらに含む、請求項１に記載の使用。
4. 前記ビタミンＡ群の化合物は、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３に記載の使用。
5. レチノール、その塩、またはそのエステルをさらに含む、請求項１に記載の使用。
6. 前記組成物は、局所的投与で用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節疾患、軟骨欠失に関係する疾患、滑液浸出の治療において使用するため、炎症反応を調節するため、または関節内補充療法のための、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファートまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、医薬的または獣医学的な組成物。
8. Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、化粧品的に許容可能なその塩と、 ビタミンＡ群の化合物とを含む、化粧品組成物。
9. 前記ビタミンＡ群の化合物は、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される、請求項８に記載の化粧品組成物。
10. Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスファート、または、薬学的に許容可能なその塩と、 ビタミンＡ群の化合物とを含む、医薬的または獣医学的な組成物。
11. 前記ビタミンＡ群の化合物は、レチノール、レチナールまたはレチンアルデヒド（シスまたはトランス）、レチノイン酸、イソトレチノイン、アダパレン、トレチノイン、これらの塩および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬的または獣医学的な組成物。
12. レチノール、その塩、またはそのエステルを含む、請求項８または１０に記載の組成物。
13. 乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節疾患、軟骨欠失に関係する疾患、および滑液浸出の治療において使用するため、炎症反応を調節するため、または関節内補充療法のための、請求項１０に記載の組成物。
14. 局所的投与、経口投与、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、および／または微量注入法のために用いられる、請求項７、１０、１１及び１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 請求項１０に記載の組成物を含む装置であって、表皮内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、微量注入法、および／もしくは関節内注射、または、局所的投与のために用いられる装置。