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JP5898693B2 - 分析方法における電気化学的分析のための新規なフェロセン標識およびそれらの使用 - Google Patents
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分析方法における電気化学的分析のための新規なフェロセン標識およびそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、電気化学的検出法に関する。更に特に、本発明は、電気化学的分析、電気化学的検出法で用いる電気化学的活性標識、及びそれらの使用に関する。
特定の生体分子の検出は、人生における多くの面で重要な役割を果たす。例えば、医療分野において、微生物若しくはウイルス性の病原菌又は生体分子を検出することへの常に存在する要求がある。高感度分析（又はアッセイ）が不可欠な他の分野は、食品及び飲料産業を含む。
ＷＯ０３／０７４７３１号は、核酸のプローブ方法を開示している。核酸溶液を、電気化学的活性マーカーを有するオリゴヌレクオチドプローブと接触させる。プローブを、核酸溶液中に存在し得る任意の相補的なターゲット配列と少なくとも部分的にハイブリダイズさせる。核酸プローブの酵素的分解後に、マーカーに関する情報を電気化学的に求める。本発明の方法で使用する化合物もまた開示されている。
ＷＯ２００５／０５６５７号は、プロテアーゼ活性の検出方法を開示しており、該方法において、試料溶液を、電気化学的活性マーカーを有するプロテアーゼ基質と接触させ、試料中に存在し得る任意のプロテアーゼがプロテアーゼ基質を分解できる条件を用意し、電気化学的活性マーカーに関する情報を電気化学的に求める。本発明の方法で用いる特定の新規な化合物もまた開示されている。
本発明が解決しようとする課題
例えば、核酸（単離形態又はより大きい分子の形態において、例えば、天然又は合成のオリゴヌレクオチド）、又はアミノ酸（単離形態又はより大きい分子の形態において、例えば、天然又は合成のペプチド）のような低濃度の生物学的基質又はインジケーターの存在の検出を可能にする標識を開発することへの継続的な要求がある。とりわけ、異なる酸化電位を有する新規な標識、従って、利用可能な分析範囲を拡大し、多重反応を発生させる領域を広げることへの継続的な要求がある。
本発明は、電気化学的分析において一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及びＲは、リンカー基である。]
で示される化合物の標識としての使用を提供する。
本発明に用いられる化合物は、電気化学的分析で用いるのに効果的な標識であることが見出されている。とりわけ、化合物を、標識した（又は標識化した）基質を製造するように用いてよい。標識され得る基質として興味深い分子は、限定されないが、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物及び任意のそれらの分子の誘導体を含む。本発明の化合物を用いて標識され得る他の基質は、ラテックス/常磁性のミクロ粒子及びナノ粒子を含む。一般式Ｉで示される標識付与化合物、及び該標識付与化合物から誘導可能な標識を有する標識された分子は、電気化学的方法に潜在的に有益であり、それらの電気化学的特性を、標識又はそれらの環境について情報を得るように用いることができる。例えば、本発明の化合物は、ＷＯ０３／０７４７３１号に記載されている方法における使用又はＷＯ２００５／０５６５７号に記載されている方法における使用として見出され得る。
本発明に用いられる化合物において、Ｘが、必要に応じて酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；Ｙが、必要に応じて酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；Ｚが、必要に応じて酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ８アルキレンを表すことが好ましい。Ｘは、好ましくは、ｘが１〜６、好ましくは、１〜４、特に１又は２である−（ＣＨ２）ｘ−であり；又は酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン、例えば、−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、又は−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）３−である。Ｙは、好ましくは、ｙが１〜６、好ましくは、１〜４、特に１又は２である−（ＣＨ２）ｙ−であり；又は酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン、例えば、−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、又は−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）３−である。好ましくは、Ｘ及びＹは同じである。好ましくは、Ｆｃ及びＦｃ’は同じであり、Ｘ及びＹは同じである。好ましくは、Ｚは、ｚが１〜８、好ましくは、１〜６、特に２〜６である−（ＣＨ２）ｚ−であり；又は必要に応じて酸素によって中断されているＣ１〜Ｃ８アルキレン、例えば、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、又は−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−である。１つの好ましい実施形態では、Ｘは、ｘが１又は２である−（ＣＨ２）ｘ−であり；又はＹが、ｙが１又は２である−（ＣＨ２）ｙ−であり；及びＺが、ｚが１〜８である−（ＣＨ２）ｚ−である。Ｘ及びＹが−ＮＲ５−により中断されているアルキレン鎖を表し、Ｒ５は、好ましくは、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル、更に好ましくは水素を表す。
１つの好ましい実施形態では、本発明は、一般式ＩＩ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；ｘは、１又は２であり；ｙは、１又は２であり；ｚは、１〜８であり；及びＲは、リンカー基である。]
で示される化合物の電気化学的標識としての使用を提供する。好ましくは、ｘ及びｙは、それぞれ１に等しい。
一般式Ｉ又は一般式ＩＩで示される化合物におけるフェロセニル残基は、以下に更に開示されているように、置換されていないフェロセニルであってよく又は１若しくは両方が、置換されてよい。フェロセニル残基が同じであることは好ましく、従って、Ｆｃが１以上の置換基により置換されており、Ｆｃ’が同じ位置に同じ置換基を有することが好ましい。
反対のことが内容から明らかである場合を除いて、用語「基質」は、自然に生じた基質と合成基質の両方を含むように、本明細書の残り全体で用いられる。合成基質は、自然に生じた基質の合成類似体を含む。基質は、単一のヌクレオチドと単一のアミノ酸を含む。例えば、酵素などの基質の開裂に依存する分析の場合に、単一のアミノ酸は、基質としてみなされてよい。なぜなら、それは、プロテアーゼ酵素によって開裂し得る内部の化学結合を有していないけれども、このような化学結合は、マーカーの結合によって形成され得るからである。
本発明は、本発明に係る化合物を用いて化学物質（ケミカルエンティティ）を検出する方法を提供する。本発明に係る電気化学的分析における使用は、例えば、電気化学的に標識された基質を検出するための分析においてでよい。電気化学的分析は、例えば、電気化学的に標識された基質の量を求めるための分析であってよい。分析は、好都合的には、標識された基質の量を検出又は求めるためであってよく、標識された基質は、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ミクロ粒子及びナノ粒子から選択される。所定の好ましい実施形態では、分析は、標識された基質の量を検出又は求めるためであり、標識された基質は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドから選択される。別の好都合な実施形態では、分析は、標識された基質の量を検出又は求めるためであり、標識された基質は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から選択される。
基質に結合する目的で、標識は、官能基（又は官能性付与基）を加えることによって官能化されてよい。従って、本発明は、基質への結合を促進するのに適した官能基に結合した本発明の化合物から誘導可能な残基を有する官能性誘導体を更に提供する。
本発明は、また、電気化学的分析で用いるために標識残基を有する官能性標識化合物を製造する方法を提供し、該方法が、一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及びＲは、酸素原子を有するリンカー基である。]
で示される化合物を官能性化合物と反応させて、一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａは、一般式Ｉａ
Figure 0005898693
（ここで、Ｆｃ、Ｆｃ’、Ｘ、Ｙ及びＺは、一般式Ｉを参照して上記のとおりである。）
を表し、Ｆは、官能基、特に、標識化残基の基質への結合のために基質と反応させるための官能基を表し；及びＬは、リンカー残基を表す。]
で示される官能性標識化合物を得ることを有する。リンカー残基Ｌは、概して、リンカー基Ｒから誘導可能なリンカー残基である。例えば、ＲがＯＨ基であり、又はＯＨ基を有する場合に、Ｌは、通常−Ｏ−を表す又は有する。
更に、本発明は、基質を製造する方法を提供し、標識された基質を製造するように、一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａ、Ｆ及びＬは上記の通りである。]
で示される化合物を基質と反応させることを有する。
更に、本発明は、基質の製造において用いるための官能性標識化合物を提供し、官能性標識化合物は一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａ、Ｆ及びＬは上記の通りである。]
を有する。
本発明は、また、電気化学的分析で用いるための標識化基質であって、一般式ＩＩＩａ：
Ａ−Ｌ−Ｆ’−[Ｓ] ＩＩＩａ
[式中、Ａは、一般式Ｉａ：
Figure 0005898693
（ここで、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）
を表し、Ｌ〜Ｆ’は、リンカー残基を表し；[Ｓ]は、基質を表す。]
で示される標識化基質を提供する。リンカー残基−Ｌ−Ｆ’−は、一般に、一般式ＩＩＩの残基−Ｌ−Ｆ−から誘導可能である残基である。
本発明は、本発明に係る基質を用いた分析を更に提供する。
電気化学的検出の適用は、蛍光検出に比べて多くの利点を有する。電気化学的検出は、非常に高レベルの感度の可能性を有しており、蛍光よりも広範囲なリニアダイナミックレンジを示す。試料が光学的に透明である必要はない。また、バックグラウンドの汚染物質からの干渉も少ない（多くの生物学的試料は自家蛍光（自発蛍光）する）。
電気化学的活性マーカーが、基質に結合するかどうか及び基質の性質に依存して異なる電気化学的特性を示すという観察に、電気化学的検出は基づく。例えば、アミノ酸に結合した電気化学的標識の場合に、示される特性は、アミノ酸の同定に依存するだけでなく、アミノ酸残基がペプチド又はタンパク質に組み込まれているかどうか及び全てのそのようなペプチド又はタンパク質の長さにも依存する。適切な環境下において、アミノ酸残基に結合したマーカーの電気化学的活性は、検出可能な程度で変化して、単一又は非常に少ないアミノ酸残基の結合の以下の損失をもたらし得る。
電気化学的活性マーカーが結合した分子の寸法及び特性は、電気化学的マーカーの観察可能な特性に影響を及ぼす。それは、例えば、拡散によりマーカーの移動速度に又は電界に応じてその移動速度に影響を及ぼすことによって起こり得る。
マーカーの電気化学的活性は、また、それが結合している分子の存在から得られる立体効果により影響を受け得る。例えば、立体障害は、マーカーが電極に接近して電子を受容又は供与するのを防ぐ可能性がある。
そして、マーカーがペプチドに結合した場合に、ペプチドの二次構造（一次配列により大部分が求められるように）は、マーカーの物理的性質に影響を及ぼし得る。例えば、ペプチドの構造が電気化学的活性マーカーを立体的に阻害するようにマーカーがペプチドのアミノ酸残基に結合する場合に、ボルタンメトリーにより観察可能な信号が減少し得る。ペプチドの分解（消化）は、二次構造要素を破壊又は除去（解放）して、マーカーに対するペプチド構造の影響を減少又は無効に（又は根絶）できる。従って、ペプチドの分解は、マーカー部位により生じる電気化学的信号の変化（通常、増加）をもたらす。微分パルスボルタンメトリー実験において、特定の適用電圧におけるファラデー電流応答は、ペプチドの分解により増加し得る。
類似的に、マーカーがヌクレオチドと結合した場合に、電気化学的特性は、ヌクレオチドがオリゴヌレクオチドに組み込まれているかどうかによって、そのオリゴヌレクオチドの長さに対して及びオリゴヌレクオチドの配列に対して（特に結合場所付近で）影響を受け得る。
電気化学的活性マーカーに関する情報は、ボルタンメトリー又はアンペロメトリー法によって得られる。微分パルスボルタンメトリーはとりわけ適切である。必要に応じて、寸法、電荷又は疎水性などの１以上の特性に基づいて分子を排除するのを選択的に可能にする膜によって覆われる１以上の電極を用いた電気化学的検出工程を行ってよい。それは、溶液中の荷電種などから生じるバックグラウンドノイズ電流を排除するのを支援し得る。
本発明の１つの実施形態では、電気化学的分析に用いる一般式Ｉで示される化合物は、Ｎ，Ｎ−ジ−(フェロセニルアルキル)アミノアルコールであり、アミノアルコール残基は、２〜１０の炭素原子、好ましくは、２〜８の炭素原子、特に、３〜６の炭素原子を有利に有する。好ましくは、アルコール残基は、１以上のヘテロ原子及び／又は１以上の基により必要に応じて中断されており置換されていない又は置換されている直鎖アルコール残基である。ヘテロ原子の例示は、例えば、酸素、硫黄又は窒素である。存在してよい基は、限定されないが、ヘテロシクロアルキルを含むシクロアルキル、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−及び−ＮＨ−並びに−ＮＲ１−[式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルである。]
を含む。置換基は、存在する場合に、例えば、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドから選択される１以上の基により必要に応じて置換されてよいＣ１−Ｃ４アルキル;Ｃ１−Ｃ４アルケニル;ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドにより置換されているＣ１−Ｃ４アルケニル;アリール;又はヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドにより置換されているアリールであってよい。
好ましくは、ジフェロセニルアルキル基のアルキレン残基は、１〜４の炭素原子、好ましくは、１又は２の炭素原子を有する。好ましくは、アルキレン残基は、両方のフェロセニルアルキル基が同じである。従って、好ましくは、ジフェロセニルアルキル基は、ジフェロセニルメチル又はジフェロセニルエチルであり、フェロセニル残基は、それぞれの場合に、独立して、置換されてなくてよい又は１以上の置換基により置換されてよい。
一般式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩで示される化合物、及び一般式Ｉａの標識残基を有する本発明で用いられる化合物（標識化合物、官能性標識化合物及び標識された基質を含む）において、２つのフェロセニル残基Ｆｃ及びＦｃ’は、それぞれ、好ましくは独立して、置換されていない及び置換されているフェロセニル残基から選択される。１つの実施形態では、一般式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩで示される化合物及び一般式Ｉａの標識残基における２つのフェロセニル残基は、それぞれ、置換されていないフェロセニルである。他の実施形態では、１又はそれぞれのフェロセニル残基の１又は両方のペンタジエニル環は、１以上の置換基によって置換されてよく、その性質及び位置は、所望の様式で、フェロセン残基の酸化還元特性に影響を与えるように選択される。フェロセニル残基のペンタジエニル環は、標識の電気化学的感度を実質的に低下させない任意の環置換基により、付加的に又は代わりに、置換されてよい。１つの実施形態では、少なくとも１つ及び好ましくは両方のフェロセニル残基は、ハロ；ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドにより置換されている１以上の基により必要に応じて置換されてよいＣ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ４アルケニル；ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドにより置換されているＣ１−Ｃ４アルケニル；アリール；ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドにより置換されているアリールから選択された１以上の置換基を有する置換されたフェロセニル残基である。好ましい置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、例えば、メチル又はエチル；ＮＨ２、ＮＨＲ２、ＮＲ３Ｒ４により置換されるＣ１−Ｃ４アルキルを含み、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、直鎖又は分岐状Ｃ１〜Ｃ４アルキル；例えば、ブロモ又はフルオロなどのハロ；例えば、ビニルなどのＣ１〜Ｃ４アルケニルからそれぞれ独立して選択される。
例えば、本発明の１つの実施形態では、フェロセニル残基が分子の残りと結合した位置に隣接した環位置において、各々のフェロセニル残基は単一の置換基を有する。その実施形態の例示として、化合物ビス((２−(ジメチルアミノ)フェロセニル)メチル)−６−アミノヘキサノールがある。別の実施形態では、両方のフェロセニル残基は置換されていない。その実施形態の例示として、化合物Ｎ，Ｎ−ジ(フェロセニルメチル)−６−アミノヘキサノールがある。更なる例示的なフェロセニル残基は、１’-メチルフェロセニル;２-メチルフェロセニル;１’-ビニルフェロセニル;１’-ブロモフェロセニル;及び２,３,４,５−テトラメチル−１’，２’，３’，４’，５’−ペンタメチルフェロセニルを有する。
フェロセニル残基が同じであることが好ましい。それは、より強い信号を与えると考えられる。
残基Ｚは、置換されてなくてよく又は置換されてよい。置換基は、存在する場合に、例えば、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、アミノ及び置換されていない又は置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルケニル又はアリールから選択される１以上の置換基であってよく；各々の場合において任意の置換基は、制限されないが、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル又はアミドを含む。残基Ｚは、必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを含むシクロアルキル、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−及び−ＮＨ−及び−ＮＲ１−（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルである）から選択される１又は必要に応じて１以上の原子又は残基により中断されてよい。残基Ｚ内で中断として含み得るシクロアルキル残基の例示として、５〜７環原子、特に、６環原子を有するシクロアルキル環、例えば、シクロヘキシル、ピペリジニル、モルホリニルなどがある。
好ましくは同じである残基Ｘ及びＹは、１〜６、好ましくは、１〜４の炭素原子、特に、１又は２の炭素原子、より特に、１つの炭素原子の鎖長さを有利に有する。残基Ｘ及びＹは、それぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−、例えば、−ＮＨ−により必要に応じて中断されるアルキレン鎖を表してよい。好ましい残基Ｘ及びＹは、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−及び−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−を含む。
基質への結合は、任意の適切な結合によるもの、典型的には、基質側鎖への結合によるものであってよい。一般式Ｉで示される化合物におけるリンカー基Ｒは、直接的な又は本明細書に記載されるような官能基を用いた基質への結合を達成するのに適した任意の基であってよい。Ｒは、好ましくは、ヒドロキシル基若しくは保護されているヒドロキシル基、又はヒドロキシル基若しくは保護されているヒドロキシル基を有する基である。しかしながら、使用中に化合物が結合する基質を考慮して、任意の他の適切なリンカー基Ｒが選択され得るということを理解されたい。タンパク質、ペプチド若しくはアミノ酸側鎖又はタンパク質、ペプチド若しくはアミノ酸末端残基の誘導体化のための様々な合成法が発展してきた。例えば、タンパク質におけるリジン残基は、スクシンイミドエステルとの反応により誘導体化されてよい。他のアミノ酸残基における誘導体化のために、他の既知の合成法を用いてよい。例えば、マレイミド剤は、システイン残基を誘導体化するように用いてよい。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、タンパク質若しくはペプチドのアミノ末端若しくは側鎖アミノ基、又はアミノ酸のアミノ残基を誘導体化するように用いてよい。
ヌクレオチドに適した誘導体化法もまた既知であり、例えば、ホスホラミダイト残基を用いる。
上記の誘導体化法は、他の方法を用いてよいけれども、本発明の化合物を基質に結合するのに用いられ得る方法で説明される。
本発明に従って標識された基質は、官能性標識化合物を得るように必要に応じて官能化した後に、基質、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド）、ヌクレオシド、糖分、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物及び任意のそれらの分子の誘導体から選択される基質と、本発明に係る化合物との反応により調製されてよい。
好ましい実施形態では、基質は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチドは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン又はウリジンから選択されてよい。ヌクレオチドのリボース又はデオキシリボース基に結合した基によって、例えば、２’、３’又は５’位に、例えば、酸素又は窒素原子によって、好ましくは、ヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチドを標識に結合する。最も好ましくは、ヌクレオチドは、３’又は５’位に、例えば、５’位に、結合する。他の位置における結合もまた可能である。
ヌクレオチドの場合に、本発明の標識を結合する１つの好都合な方法は、ホスホラミダイトを用いた官能化によるものである。オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト基への結合は、オリゴヌクレオチド合成において幅広く行われており、従って、ホスホラミダイトにより官能化された標識のオリゴヌクレオチドに結合するための方法及び条件は、既知であり、当業者にとって当然のことである。更に、それは、標準オリゴ製造方法の使用を有利に可能にする。
本発明に係る分析で用いるためのオリゴヌクレオチドは、有利に、２〜５０のヌクレオチド、更に好ましくは、２〜４０のヌクレオチド、特に、１５〜３５のヌクレオチド、特別に好ましくは、１８〜３０のヌクレオチドを有するヌクレオチドである。いくつかの用途では、更に短いオリゴヌクレオチド、例えば、２〜１４のヌクレオチド、更に好ましくは、２〜１０のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが有益であり得る。
例えば、システイン、リジンを用いてタンパク質に結合することは、場合によっては、適切な緩衝溶液において室温でタンパク質とフェロセニル標識を一緒に培養することによって達成できる。標識がシステイン又はリジンに有利に結合しているが基質配列が適切な位置にシステイン又はリジンを有さない配列は、必要に応じて、１以上のシステイン又はリジン残基を追加的な残基として又は別の残基のための置換基として追加するように変えられてよい。タンパク質に結合するための代替的な方法は、標識のビオチン化及び商業用ストレプトアビジン化タンパク質（逆の場合も同じ）の使用を含んでよい。例として、基質を、任意の標準技術により、例えば、市販のビオチン化キットの使用によりビオチン化してよい。ビオチン化基質は、例えば、抗体（商業的及び幅広く利用可能な）などのストレプトアビジン又はアビジン共役化合物に結合する。
しかしながら、適切な標識する官能基の使用により、類似の標識が、多くの位置の選択された１つに基質と結合してよいことは当業者にとって明らかである。
一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａ〜Ｌは、好ましくは、一般式Ｉで示される化合物から誘導される残基であり、Ｆは官能基である]
で示された官能性標識化合物。
一般式ＩＩＩで示される好適な官能性標識化合物は、一般式ＩＩＩｂ：
Ａ−Ｏ−Ｆ ＩＩＩｂ
[式中、Ａ−Ｏは、好ましくは、一般式Ｉのリンカー基Ｒがヒドロキシル又はヒドロキシル含有基であり又は保護されているヒドロキシル基である場合に、ヒドロキシ水素原子又は保護基の損失によって、一般式Ｉで示される化合物から誘導される残基であり、Ｆは官能基である。]
で示される化合物を含む。
一般式ＩＩＩ及び一般式ＩＩＩｂにおける官能基Ｆとして有する本発明の標識とともに使用可能な適切な官能基は、限定されないが、スクシンイミドエステル基、ホスホラミダイト基、マレイミド基、ビオチン及びアジド基を含んでよい。しかしながら、標識すべき基質への標識化合物の結合を容易にする任意の官能基を用いてよいことを理解されたい。
本発明は、また、試料中の核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）の検出方法を提供し、該方法は、核酸を増幅する（例えば、ＰＣＲ又は他の核酸増幅技術による）任意の工程、続いて、プローブとアンプリコンの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、相補的な核酸プローブとアンプリコンを接触させる工程、次いで、ハイブリダイズされている又はハイブリダイズされていないプローブを選択的に低下する（例えば、一本又は二本鎖の特定ヌクレアーゼの使用により）工程を有し、前記プローブを、本発明の電気化学的活性化合物により標識化し、当該方法は、プローブを標識化する化合物の電気化学的活性を測定する工程を有し、前記電気化学的活性は、プローブの分解程度に定量的に又は定性的に依存する。
本発明は、本発明の電気化学的活性化合物により抗体又は誘導体（例えば、分析においてターゲット抗原に結合してよい）を検出する方法も提供し、本発明は、化合物の電気化学的活性を測定する工程を有する。
本発明は、患っている病気を診断又は監視する方法も提供し、本発明は、患っている組織又は体液の前記病気に伴うプロテアーゼ又はプロテアーゼ阻害剤の検出において本発明の方法を使用することを含む。
本発明は、患っている病気を診断又は維持する方法も提供し、本発明は、患っている組織又は体液の前記病気に伴うペプチド又はタンパク質を検出するように本発明の方法を使用することを含む。
本発明は、患っている病気を診断又は監視する方法も提供し、本発明は、患っている組織又は体液の前記病気に伴うヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ阻害剤の検出において本発明の方法を使用することを含む。
更に、本発明は、患っている病気を検出するために本発明の方法の使用を提供する。
本発明は、また、病原菌又は他の望ましくない有機物、例えば、食品損傷有機物を検出する方法を提供し、本発明は、本発明の方法を使用することを含む。
更に、本発明は、電気化学的測定法におけるＮ，Ｎ−ジ(フェロセニルアルキル)グリシン誘導体、例えば、Ｎ，Ｎ−ジ(フェロセニルアルキル)グリシンアミド誘導体の電気化学的標識としての使用を提供する。
本発明は、必要に応じて、例えば、試料容器、電気化学的検出のための電極を有するコンテナ、分析又は標準および制御における使用のための酵素などの他の分析要素と組み合わせて、本発明の標識された基質を有する分析も提供する。前記分析は、本発明の１以上の異なる標識された基質を有してよい。その場合に、異なる標識された基質の存在は、それらを、異なる電気化学的特性を有する本発明の電気化学的標識により標識することによって異なって検出することができ（例えば、異なる酸化電位）、従って、分析を多重（例えば、二重）分析にでき、異なる基質は、同じ試料容器内に存在する場合に識別（区別）できる。
本発明は、付加的な実施形態において一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されているフェロセニル残基であり、Ｆｃ’は、置換されているフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じ又は異なってよく；Ｘは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、必要に応じて、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ５−によって中断され、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを示し；
Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、必要に応じて、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ５−によって中断され、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを示し；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって、必要に応じて置換されてよく及び／又は必要に応じて中断されてよく、ここで、Ｒ１は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し、Ｒはリンカー基である。]
で示される化合物を提供する。
その実施形態では、各々のフェロセニル残基が、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、ハロアルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基によって置換されることが好ましい。
更に付加的な実施形態において、本発明は、一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃ及びＦｃ’は、それぞれ置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、必要に応じて、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ５−によって中断され、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを示す。
Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、必要に応じて、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ５−によって中断され、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを示す。
Ｚは、Ｃ６〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、又は１以上の置換基により置換されている又は−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−若しくは−ＮＲ１−から選択される基により中断されているＣ６〜Ｃ１２アルキレンであり（ここで、Ｒ１は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）、Ｒはリンカー基である。]
で示される化合物を提供する。
更なる付加的な実施形態において、Ｘが、ｘが１〜６である−（ＣＨ２）Ｘ−を表し、Ｙが、ｙが１〜６である−（ＣＨ２）ｙ−を表すことが好ましい。
前記付加的な実施形態及び更なる追加的な実施形態では、Ｚは、酸素によって必要に応じて中断されているＣ６〜Ｃ８アルキレンを好ましくは表す。好ましくは、リンカー基Ｒは、官能基の又は基質の適合基と反応して化合物を前記官能基又は前記基質に結合できる基を有し、例えば、Ｒは、ヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、又はヒドロキシ又は保護されているヒドロキシ基を有する残基であってよい。
表１は、以下に、一般式ＩＶａ、Ｖａ、ＶＩａ、ＶＩＩａ及びＶＩＩＩａにおいて、本発明に係る所定の好ましい化合物を示しており、本発明に係る電気化学的分析において標識として用いることができ、及び本発明に係る官能性標識化合物及び標識された基質を調製するように用いることができる。表１は、また、一般式ＩＶｂ、Ｖｂ、ＶＩｂ、ＶＩＩｂ及びＶＩＩＩｂにおいて、本発明に係る例示的な対応官能性標識化合物を示す。表１における式では、各々のフェロセニルは、同じ又は異なってよい１より多い置換基Ｒを、任意の環位に（環位置に）有してよい（立体障害の濃度がそれに対して低減することについて、考慮することを除いて）。フェロセニル基の１つに１以上の置換基がある場合に、他のフェロセニル基は、同じ位置に同じ置換基を有するものと理解されたい。
Figure 0005898693
Figure 0005898693
Figure 0005898693
表１の一般式ＩＶａ、Ｖａ、ＶＩａ、ＶＩＩａ及びＶＩＩＩａ並びにそれらの官能性対応物（均等物）において、１以上の環置換基Ｒ１１又はＲ１３が、各々のフェロセニルの隣接したペンタジエニル環（即ち、分子の残りに直接結合している環）に存在する場合に、好ましくは、その結合に隣接した環位に前記環置換基がある。１以上の環置換基Ｒ１１、Ｒ１３が、それぞれの隣接したペンタジエニル環に存在する場合に、それらの置換基は、互いに任意の位置であってよい。１以上の環置換基Ｒ１０、Ｒ１２又はＲ１４が、各々のフェロセニルの各々の末端ペンタジエニル環（即ち、分子の残りにフェロセニルを繋いでいる結合から離れている環）に存在する場合に、それらの置換基は互いに任意の位置であってよい。表１における一般式ＩＶａ、Ｖａ、ＶＩａ、ＶＩＩａ及びＶＩＩＩａ並びにそれらの官能性対応物において、隣接又は末端の環に環置換基が示されているが、各々のフェロセニルの両方のペンタジエニル環が、１以上の置換基を有することも可能である。
特別に好ましい実施形態では、化合物は、Ｎ，Ｎ−ジ(フェロセニルメチル)−６−アミノヘキサノール（以下に標識Ａとして実施例で言及される）である。本発明に従って用いることができる他の好ましい標識は、２−((ジフェロセニルメチル)アミノ)−１−(４−(ヒドロキシメチル)ピペリジン−１−yl)エタノン;及びＮ，Ｎ−ジ−(フェロセニルメチル)−２−アミノエトキシ) エタノールを有し、１又は各々のフェロセニル残基は、置換されてなくてよく、又は１以上の置換基によって置換されてよい。フェロセニル残基が両方とも置換されていない化合物Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノールは、優れた電気化学的特性を有することが見出されている。本明細書における実施例で説明するように、その化合物において各々のフェロセニル残基における１以上の置換基の組み込み（各々のフェロセニルにおける置換基が同じである）をは、修飾電気化学特性を有する化合物を得るように用いることができ、適切な置換基選択によって１組の化合物を用意し、そこから２以上を多重反応の目的で選択することができる。
優れた電気化学的特性を有することが見出されている本発明に係る例示的な所定の化合物が表２に示される：
Figure 0005898693
図１は、本明細書に記載される微分パルスボルタンメトリー測定に用いる電気化学的セルの概略図である。 図２は、以下の実施例１で製造されるような標識Ａの微分パルスボルタモグラムである。 図３は、以下の実施例２で製造されるような標識Ｂの微分パルスボルタモグラムである。 図４は、以下の実施例３で製造されるような標識Ｃの微分パルスボルタモグラムである。 図５は、以下の実施例５（ａ）に従うChlamydia陽性試料及び陰性試料の両方のボルタメトリックスキャンを示す。 図６は、以下の実施例５（ａ）に記載されるような標識Ａ電気化学的標識により合成されるモノヌクレオチド及びジヌクレチオドの質量分析法である。 図７は、実施例５（ａ）の分析生成物の質量分析法である。 図８は、以下の実施例５（ｂ）に記載されるように、Chlamydiaターゲットを、濃度範囲においてＰＣＲ反応に直接加え、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する場合に行う電流測定を示す棒グラフである。 図９は、以下の実施例５（ｃ）に記載されるように、Chlamydiaターゲットを、ＤＮＡ抽出プロセスに加え、抽出プロセスからの生産物を、ＰＣＲを用いて増幅して、次いで、標識Ａにより標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出した場合における濃度範囲でのピーク電流を示す棒グラフである。 図１０は、ノロウィルスのための標識Ａプローブを用いた電気化学的検出と、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースのｑＰＣＲ分析との比較を示す。 図１１は、Streptococcus equiのための標識Ａプローブを用いた電気化学的検出と、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースのｑＰＣＲ分析との間の比較を示す。 図１２ａは、市販のａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧに結合した標識Ａを用いたボルタメトリックスキャンである。 図１２ｂは、市販のａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧに結合した標識Ａを用いて時間間隔を置いて行われるボルタメトリックスキャンを示す。 図１３ａは、様々な濃度における実施例８に従うミクロ粒子のボルタメトリックスキャンを示す。 図１４は、以下の実施例９で製造されるような標識Ｄの微分パルスボルタモグラムである。
図１を参照すると、本発明に記載されるサイクリックボルタンメトリー実験に用いるのに適した電気化学的セル１が概略的に示される。セルは、容器２を有し、１００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液であるバックグラウンド電解質溶液３を有する。溶液３に浸されたのは、プリント（印刷）した炭素作用電極５、プリントした炭素カウンター電極６、及び銀／銀の塩化物参照電極７であり、全て銀コネクタを有する。試料は、作用電極の表面上に広げられ、ボルタンメトリーは、銀コネクタをポテンショメーター上における適切な鉛に接続することによって行われる。説明することによって、試料は、以下のように準備されてよい：フェロセニル標識前駆体（２ｎｇ）は、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解する。１０μＬの一定分量が、この溶液から取り出され、従って、緩衝液（５００μＬ）中で更に蒸留される。次いで、一定分量（２０μＬ）を、電気化学的スキャンを行うようにスクリーン印刷電極に適用する。
以下の実施例は本発明を説明する。
材料及び方法−標識の合成及び分析
フェロセンカルボン酸は、シグマ−アルドリッチから得た。フェロセンカルボアルデヒドは、シグマ−アルドリッチから得た。
６−アミノヘキサノールは、シグマ−アルドリッチから得た。
グリシンは、シグマ−アルドリッチから得た。
N,N-ジイソプロピルエチルアミンは、シグマ−アルドリッチから得た。
２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイトは、シグマ−アルドリッチから得た。
濃度１ｍｇ／ｍＬにおけるパパイン溶液は、シグマ−アルドリッチから得た。
Ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ及びビオチン化したｇｏａｔ ＩｇＧは、シグマから得た。
ＰＣＲ法は、ＰＴＣ−１００又はＰＴＣ−２００Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて行い、又はＰｅｑＬａｂのフラットベッドサーモサイクラーのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ストレプトアビジン）コーティング・マイクロタイタ−ウェルは、Ｓｉｇｍａ Ｓｃｒｅｅｎ（商標登録）の高密度ウェルであった。
材料及び方法−電気化学的検出
電極は、インクベースであり、ポリマー基質（例えば、Ｍｙｌａｒ）上にスクリーン印刷され、続いて、ＧＭ Ｎａｍｅプレート（ワシントン州シアトル）により熱硬化製造される。
実施例１
Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノールの合成（標識Ａ）
Figure 0005898693
乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）におけるフェロセンカルボアルデヒド（２．１ｇ、９．８１ｍｍｏｌ）及び６−アミノヘキサン−１−オール（０．５ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）を、オーブンで乾燥したフラスコに加えた。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２．３ｇ、１０．９０ｍｍｏｌ）を、溶液に分割添加した。反応を一晩中放置した。反応は、エチルアセテート（４０ｍＬ）内で起こり、ＮａＣＯ３（飽和；２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）及びＭｉｌｌｉＱ水（２０ｍＬ）で、有機層を洗浄した。次いで、有機分画を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を真空中で除去した。次いで、粗生成物は、９：１の溶液Ｂ：溶液Ａ（溶液Ａ：エチルアセテート９５％ＴＥＡ５％、溶液Ｂ：石油エーテル４０−６０ ９５％、ＴＥＡ５％）を用いて、純粋な生成物（ダークオレンジ固体）を生じるように、並べられる（columned）。８５％の収率 1H NMR (300MHz, CDC13)δ4.18 (2H, s, Cp), 4.17 (2H, s, Cp), 4.13 (15H, s, Cp), 3.66 (4H, t, J = 6.25Hz, CH2), 3.48 (2H, s, CH2), 2.20 (2H, t, J = 6, CH2), 1.59 - 1.31 (6H, m, CH2). 13CNMR (75.5 Hz, CDC13) δ 77.83, 77.40, 76.98, 70.58, 68.88, 63.36, 53.02, 52.17, 33.10, 27.43, 25.88. HRMS (ESI) C28H33N1O1Fe2(m/z)としての計算値：519.1430；実測値:519.1438
化合物標識Ａの電気化学は、図２のボルタモグラムに示される。
生成物標識は、０．２７５Ｖの酸化還元電位を有することが分かった。
実施例２
ジ−((ジメチルアミノ)メチルフェロセニルメチル)−６−アミノヘキサノールの合成(標識Ｂ)
Figure 0005898693
（ａ）ジメチルアミノ)メチルフェロセンカルボアルデヒド (ジアミノメチル)メチルフェロセンの合成（１ｇ、５ｍｍｏｌ）はＥｔ２Ｏに溶解し、ｎ−ブチルリチウム（２．５１ｍＬ、６．２５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えて、反応混合物を１６時間室温で攪拌した。
１６時間後、反応混合物を、ＤＭＦ（０．４ｍＬ、６．２５ｍｍｏｌ）によりクエンチし、再び、４時間室温で攪拌した。次いで、水（１５ｍＬ）を反応に加えた。次いで、有機層を、エーテルにより抽出した（２ｘ２５ｍＬ）。組み合わせた有機層を、硫酸マグネシウムにより乾燥し、濾過し、溶媒を、７２％の収率で生成物（ダークレッド／ブラウンの油）を利用するように真空下で除去した。
1H NMR (300MHz, CDC13) δ 9.81 (1H, s, CHO), 4.21 (2H, s, Cp), 4.14 (5H, s, Cp), 3.64 (2H, s, CH2), 2.08 (6H, s, NMe2) 13CNMR (75.5 Hz, CDC13) δ 193.2, 86.7, 83.4, 77.8, 77.5, 77.0, 76.62, 75.8, 71.8, 70.3, 70.2, 70.0, 68.4, 68.0, 59.2, 56.6, 44.8, 44.7. HRMS (ESI) C14H18N1O1Fe1(m/z)として計算値：272.0737;実測値:272.0731。
Ref: Biot, C, Glorian, G., Maciejewski, L. A., Brocard, J. S., Domarle, O., Blampain, G., Millet, P., Georges, A. J., Abessolo, H., Dive, D., Lebibi, J. J. Med. Chem. 1997, 40, 3715- 3718.
（ｂ）標識Ｂの合成
標識Ｂ
（ジメチルアミノ)メチルフェロセンカルボアルデヒド（１．１ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解した。次いで、６−アミノヘキサン−１−オール（０．２５ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１．３ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。溶液を、一晩中室温で、窒素下で攪拌した。次いで、エチルアセテート（２０ｍｌ）及び１ＮのＮａＯＨ（飽和；２０ｍＬ）を加え、続いて、有機層を、ＮａＣＯ３（２５ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）及びＭｉｌｌｉＱフィルター処理水（２５ｍＬ）により抽出し、次いで、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、及び真空中で溶媒を除去し、オレンジ油を得た（０．９５、７５％）。
1H NMR (300MHz, CDC13) δ 4.18 (2H, s, Cp), 4.17 (2H, s, Cp), 4.13 (15H, s, Cp), 3.66 (4H, t, J = 6.25Hz, CH2), 3.48 (2H, s, CH2), 2.20 (2H, t, J = 6, CH2), 2.17 (12H, s, CH3) 1.59 - 1.31 (6H, m, CH2). HRMS (ESI) C34H49N301Fe2 (m/z)として計算値:627.3012;実測値:627.3126。
生成化合物の電気化学は、図３のボルタモグラムに示される。生成物標識Ｂは、０．３８Ｖの酸化還元電位を有することが分かった。
実施例３
2-((ジフェロセニルメチル)アミノ)−１−(４−ヒドロキシメチル)ピペリジン-l-yl)エタノンの合成（標識Ｃ）
（ａ）Ｎ，Ｎ−(ジフェロセニルメチル)グリシンの合成
Figure 0005898693
フェロセンカルボアルデヒド（２．１ｇ）を、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）を有する丸底のフラスコに加えた。グリシン（０．５ｇ）を溶液に加え、反応をＮ２下で攪拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２．３ｇ）を、攪拌溶液に分割添加した。反応を一晩中攪拌した。溶液は、エチルアセテート（４０ｍＬ）と１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）の間で分割した。有機分画を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（飽和；２０ｍＬ）、ブライン（４０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）により洗浄した。有機分画を、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、溶媒を除去した。次いで、粗生成物を並べた（溶媒Ａ：石油エーテル４０−６０：ＴＥＡ ９５：５、溶媒Ｂ：エチルアセテート：ＴＥＡ ９５：５）。生成物はダークオレンジ固体（８０％）であった。1H NMR (250 MHz, CDC13) δ 4.099 (1H, s, CpH), 4.052 (1H, s, CpH), 4.022 (7H, s, FcCpH), 3.549 (4H, t, J = 6.75, 2 x CH2), 3.348 (2H, s, CH2), 1.979 (1H, s, OH). 13CNMR (75.5Hz, CDC13) δ 171.5, 78.0, 77.5, 77.1, 68.9, 67.4, 61.1. HRMS (ESI) C24H25N1O2Fe2 (m/z)として 計算値: 477.3974;実測値:477.4213。
（ｂ）ジフェロセニルグリシンから標識Ｃの合成
Figure 0005898693
Ｎ２下において０℃で乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）内で上記３（ａ）で得られるジ−フェロセニルグリシン誘導体の攪拌溶液に、乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）における塩化オキサリル（０．８７ｍＬ）を、均圧滴下漏斗を用いて滴下して加えた。反応は室温まで上昇し、２時間攪拌した。次いで、溶媒を除去し、酸塩化物生成物を乾燥ＤＣＭ（７５ｍＬ）内に加えた。乾燥ＤＣＭ（７５ｍＬ）内の６−アミノヘキサン−１−オール（０．５６ｇ）を０℃Ｎ２下で滴下漏斗を用いて滴下して加えた。続いて、室温まで上昇しながら反応を２時間に亘って攪拌した。次いで、溶液をＮａＨＣＯ３（飽和；１００ｍＬ）及び１．０ＭのＨＣＬ（１００ｍＬ）で洗浄した。有機分画をＭｇＳＯ４上で乾燥し、次いで、溶媒を除去し、生成物を得た（８５％）。オレンジ／イエロー固体。1H NMR (250MHz, CDC13) δ 4.11 (12H, s, FcCp), 3.65 (4H, t, J = 6.0Hz, CH2), 3.55 (2H, s, CH2), 1.48 - 1.18 (5h, m, CH2). 13CNMR (75.5Hz, CDC13) δ 173.32, 77.80, 77.39, 76.90, 62.10, 38.85, 35.45, 32.02, 30.67, 26.75, 25.54, 25.44. m/z: 576.
生成化合物標識Ｃの電気化学は、以下の表３及び図４のボルタモグラムに示される。
Figure 0005898693
実施例４
ホスホラミダイト官能基を結合するための一般的な合成法
Figure 0005898693
上記の反応式において出発材料として示されるフェロセニル誘導体を説明し、上記の実施例１〜３又は以下の実施例９〜１３で製造される全ての化合物のモル当量で置換されてよい。
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(０．４ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）内でフェロセン誘導体（２．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えた。２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．２ｍｌ、３．１５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、得られる混合物を１５分間攪拌した。MilliQフィルター処理水（２００ｍＬ）を加え、溶液を更に３０分間攪拌した。エチルアセテート−トリエチルアミン（１：１、２５ｍＬ）を加え、沈殿物を形成した。混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）及びMilliQフィルター処理水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機分画をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。次いで、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより浄化した（石油エーテル:エチルアセテート ９：１）。
フェロセニル出発材料として標識Ｃによる上記の方法を用いて、以下に記載した特徴データを有する式（ＩＸ）のホスホラミダイト官能性化合物を得た。
Figure 0005898693

1H NMR (500MHZ, CDC13) 6 4.23 (2H, s, Cp), 4.18 (2H, s, Cp), 4.13 (15H, s, Cp), 3.90- 3.82 (2H, m, CH2), 3.71-3.54 (4H, m, CH2), 3.44 (4H, s, CH2), 2.64 (2H, t, J = 6, CH2), 2.35 (2H, t, J = 6.5, CH2), 1.69 - 1.35 (85H, m, CH2, CH), 1.23 (12H, t, J = 7, CH3). 31PNMR (DEC) (202.5Hz, CDC13) δ 147.23. HRMS (ESI) C39H53N4O3Fe2P1 (m/z)として計算値: 768.0973;実測値:768.1254。
実施例５
オリゴヌクレオチドプローブと結合した標識Ａの使用
オリゴヌクレオチドの合成を、標準オリゴヌクレオチド固相合成技術を用いて行い、ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドストランド（鎖）の５’末端に段階的に加えた。オリゴヌクレオチド鎖へのそれぞれの添加は、デ−ブロッキング、カップリング、キャッピング及び酸化工程である４つの反応を有する。オリゴヌクレオチド配列が所望の長さに完成すると、電気化学的標識を、ホスホラミダイト結合を用いて加えた。
方法
５’及び３’ターゲット特定プライマー及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）工程を用いた標準ＰＣＲ法により、ターゲット配列をChlamydia trachomatisターゲットから増幅した。ＰＣＲ条件を以下の表１に要約した。ＰＣＲ反応が完了したときに、５’と３’のプライマーの間におけるターゲット上の位置の中間の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（５’末端において電気化学的標識Ａにより標識した）を、ＰＣＲ反応生成物に加えて、アンプリコン上のそのターゲットに対してアニールした。Ｔ７エキソヌクレアーゼ（二重鎖の核酸のために特定されている）を管に加え、それがｄｓＲＮＡを分解するのを可能するように培養した。プローブを、ＰＣＲアンプリコンに対してアニール（結合）する程度まで、Ｔ７エキソヌクレアーゼによって分解した。次いで、電気化学的検出を行い、標識Ａにより標識された分解生成物ヌクレオチドのために、０．２Ｖの特徴的な酸化還元電位におけるピークを示した。
Figure 0005898693
UNGプロトコール:
37℃ x 10分
94℃ x 10分
PCRプロトコール:
94℃ x 30 秒
58℃ x 45 秒
72℃ x 60秒
繰り返し工程 x 39 サイクル (合計で40サイクル)
72℃ x 7 分
結果
図５は、Chlamydia trachomatisの陽性試料（強いピーク）及び陰性試料（ピークの欠如）の両方のための既知の（標識の特定の）酸化還元電位におけるピーク高さを電流として示す。
図６は、標識Ａ電気化学的標識と合成したモノヌクレオチド及びジヌクレオチドの質量分析法を示す。図７は、分析生成物の質量分析法であり、標識Ａ電気化学的標識に連結されているモノヌクレオチドに対する正確な相関関係を示し、電気化学的残基は、分析で検出した。
図８は、Chlamydiaターゲットを、濃度範囲においてＰＣＲ反応に直接加えた実験の結果を示す。これは、ＰＣＲを用いて増幅し、次いで、標識Ａのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出した。
図９は、濃度範囲のChlamydiaターゲットをＤＮＡ抽出プロセスに加え（即ち、ＰＣＲに直接加えない）て、抽出プロセスからの生産物を、ＰＣＲを用いて増幅し、次いで、標識Ａにより標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出した実験の結果を示す。
実施例６
ｑＰＣＲに対する性能の比較
ａ）図１０は、ノロウィルスのための、標識Ａプローブを用いた電気化学的検出とＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースのｑＰＣＲ分析との間の比較を示す。材料及びプロトコールは以下のとおりである：
Ｂｉｏｌｉｎｅ ＳｅｎｓｉＭｉｘ ｄＵ
Ｂｉｏｌｉｎｅ １Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
0.3μＭ フォワードプライマー
0.3μＭ リバースプライマー
0.5Ｕ UNG

UNG プロトコール:
37 ℃ x 10 分
60 ℃ x 2 分

qPCR プロトコール:
95 ℃ x 10 分(taq活性化工程)
95 ℃ x 15 分
45 ℃ x 10 分
72 ℃ x 10 分(SYBR取得)
繰り返し最終３工程 x 39 サイクル (合計で40 サイクル)
1 ℃ずつ増加における47 ℃ - 95 ℃（特定でない増幅のためにチェックするように溶融されるエンドポイント）
Ｃｔ値の十進法の逆数は、ｑＰＣＲ結果が化学的結果に対する直接の比較を与えるように用いられる。
データは、電気化学的分析が２００アトグラムであるための検出の制限を示す。ｑＰＣＲ分析のための検出の制限は、２〜２０フェトグラムとの間として示される。このレベルより低くにおいて、Ｃｔ値は、４０サイクル・カットオフよりも大きく、４０のＣｔ値の逆数として水平線により示される。ｑＰＣＲ陰性試料は、しきい値よりも上に上昇しなかった。これは、標識Ａを用いた電気化学的分析の好都合な感度を示す。
ｂ）図１１は、Streptococcus equiのための、標識Ａプローブを用いた電気化学的検出とＳＹＢＲＧｒｅｅｎベースのｑＰＣＲ分析との間の比較を示す。電気化学的分析とｑＰＣＲ分析の両方が、この実験で試験される最低ＤＮＡ濃度（２０フェトグラム）に下がって検出することができるということを、データが示す。２０フェトグラムにおける電気化学的検出のための信号：ノイズ比は、この実験で４：１であった。２０フェトグラムは、S. equiＤＮＡの８遺伝子複製と等しい。
実施例７
タンパク質と直接結合した標識Ａ
ａ）図１２ａは、活性ＮＨＳエステル(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、市販のａｎｔｉ−ｇｏａｔ ｌｇＧの第１級アミンに直接結合している標識Ａを用いたボルタメトリックスキャンである。
以下の一般的な反応式は、ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ｌｇＧにおいてリジン残基などの遊離アミンへの標識の結合を説明する。
Figure 0005898693
市販のビオチン化ｇｏａｔ ｌｇＧを、ストレプトアビジンコーティング・ミクロタイタ−のウェル上に固定化した。次いで、標識Ａのａｎｔｉ−ｇｏａｔ ｌｇＧを、固定化したｇｏａｔ ｌｇＧを有するウェル内で培養し、次いで、これを、洗浄により除去した。パパイン溶液を、ウェルに加えて培養し、二次抗体の分解を可能にし、電気化学的に解読（判断）される得られた溶液を有した。この実験の制御は同じ方法を用いたが、最後の培養を、パパインなしに緩衝液のみ内で行った。
図１２ａは、標識Ａのための既知の酸化電位における電気化学的信号が、パパインが存在する場合に発するがパパインの欠如下では存在しないということを示す。これは、標識Ａがこの分析における抗体に直接結合されており、この抗体を分解して電気化学的標識を発する場合にのみ信号が観察されるということを示す。
ｂ）図１２ｂのデータは、パパイン分解の時間的経過実験が示されることを除いて、上記の実施例７ａ）と同じモデルの分析を用いる。この実験において、制御（又はコントロール）は、固定化されたｇｏａｔ ｌｇＧ抗体を有さないウェルに加えられた標識Ａ二次抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ｌｇＧ）であった。
実施例８
ミクロ粒子と結合した標識Ａ
ビオチン分子を標識Ａと結合した。自動化オリゴヌクレオチド・シンセサイザーで又は標準的な研究室条件を用いて、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによるフェロセニルホスホラミダイト標識の反応により、ビオチン化を行うことができる。常磁性のトレプトアビジン粒子を、３回（ホスフェート緩衝液）洗浄し、ビオチン化標識と混合し、混合しながら室温で１時間培養した。粒子を２回（ホスフェート緩衝液）洗浄し、１回（ＰＣＲ緩衝液）洗浄した。それらを、仕上緩衝液（ＰＣＲ緩衝液）で再懸濁した。各々の洗浄工程の後に、上澄液（上清）を、電気化学的信号用に試験し、上澄液が、遊離した（又は自由な）電気化学的標識の表示を示さなくなるまで、必要に応じて洗浄を繰り返した。
観察した電気化学的信号が、磁石粒子と結合した標識Ａに起因したことを確認するように、これらの粒子を、濃度範囲において分析した。これは、緩衝液量の範囲において粒子の磁気的捕獲と再懸濁を伴った。結果を図１３に示す。
実施例９
(Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−２−アミノエトキシ)エタノール(標識Ｄ)の合成
Figure 0005898693
乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）内におけるフェロセンカルボアルデヒド（２．１ｇ、９．８１ｍｍｏｌ）と(アミノエトキシ)エタノール(０．５ｇ、４．２７ｍｍｏｌ)をオーブンで乾燥したフラスコに加えた。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２．３ｇ、１０．９０ｍｍｏｌ）を溶液に分割添加した。反応を一晩中放置した。反応物をエチルアセテート（４０ｍＬ）内に加え、有機層を、ＮａＣＯ３（飽和；２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）及びMilliQ水（２０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機分画を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を真空中で除去した。次いで、粗生成物を、純粋な生成物標識Ｄ（ダークオレンジ固体）を生じるように、９：１の溶液Ｂ：溶液Ａ（溶液Ａ：エチルアセテート９５％ ＴＥＡ ５％、溶液Ｂ：石油エーテル ４０−６０ ９５％、ＴＥＡ ５％）を用いて、並べた。
85% 収率；1H NMR (300MHz, CDC13) δ 4.18 (2H, s, Cp), 4.17 (2H, s, Cp), 4.13 (15H, s, Cp), 3.66 (4H, t, J = 6.25Hz, CH2), 3.48 (2H, s, CH2), 2.20 (2H, t, J = 6, CH2). 13CNMR (75.5 Hz, CDC13) δ 77.83, 77.40, 76.98, 70.58, 68.88, 63.36, 53.02, 52.17, 33.10, 27.43, 25.88. HRMS (ESI) C26H33N102Fe2 （m/z）として計算値501.1430 実測値 501.1438。
標識Ｄの電気化学は、以下の表及び図１４のボルタモグラムに示される。
Figure 0005898693
実施例１０
ジ−フェロセニルグリシンアミノアルコールの合成
Ｎ，Ｎ−２(ジフェロセニルメチルアミノ)アセチル−６−アミノヘキサノールは、Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−２−（（ジフェロセニルメチル）アミノ）−アセトアミド（標識Ｅ）とも呼ばれる。
Figure 0005898693
乾燥ＤＣＭ内（２ｍＬ）における塩化オキサリル（０．８７ｍＬ）を、０℃Ｎ２下で乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）においてジフェロセニルグリシン（実施例３ａに記載されるように得られる）の攪拌溶液に、均圧漏斗を用いて滴下して加えた。反応は室温まで暖まり、2時間攪拌した。次いで、溶媒を除去し、酸塩化物生成物を、乾燥ＤＣＭ内（７５ｍＬ）に加えた。乾燥ＤＣＭ（７５ｍＬ）内の６−アミノヘキサン−１−オール（０．５６ｇ）を、０℃Ｎ２下で滴下漏斗を用いて、滴下して加えた。室温まで温めながら反応を２時間攪拌した。次いで、反応を、ＮａＨＣＯ３（飽和；１００ｍＬ）と１．０ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）により洗浄した。有機分画をＭｇＳＯ４上で乾燥し、次いで、溶媒を、生成物標識Ｅ（８５％）を得るように除去した。オレンジ／黄色固体。lH NMR (250MHz, CDC13) δ 4.11 (12H, s, FcCp), 3.55 (4H, t, J = 6.0Hz, CH2), 3.31 (2H, s, CH2), 1.48 - 1.18 (12h, m, CH2). 13CNMR (75.5Hz, CDC13) δ 173.32, 77.80, 77.39, 76.90, 62.10, 38.85, 35.45, 32.02, 30.67, 26.75, 25.54, 25.44. HRMS (ESI) C24H25N102Fe2 (m/z)として計算値: 576.0988 実測値 576.1264.
標識Ｅの電気化学は、以下の表のデータに説明される。
Figure 0005898693
実施例１１
６−(ビス((１’-ビニルフェロセニル)１-メチルフェロセニル)アミノ)ヘキサン-l−オール
Figure 0005898693
１’−ビニルフェロセンカルボアルデヒド（１２２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｃｍ３）内に溶解し、６−アミノヘキサン−l−オール (２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ) 及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(２０５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ)で連続して処理した。溶液を室温で一晩攪拌した。この時間の後に、反応を、１０ｃｍ３の飽和したＮａＨＣＯ３を添加することによりクエンチした。有機層を分離し、次いで、液層は、エチルアセテート（３ｘ１０３ｃｍ）により再び抽出した。組み合わされた有機抽出物を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、フィルター処理（又は濾過）し、赤い固体を与えるように真空中で濃縮した。生成物をシリカクロマトグラフィーにより浄化し、１：１（エチルアセテート：ヘキサン）の１％水酸化アンモニアを溶出し、オレンジ油７２ｍｇとして、５０％収率で所望の生成物を与えた。
1H NMR (500 Mhz; CDC13) δH 6.38 (2H, dd, J 17.6, 10.7 =CH), 5.30 (2H, dd, J 10.7, 1.5, =CH2), 5.03 (2H, dd, J 10.7, 1.5, = CH2), 4.25 (4H, t, J 1.8, CpH), 4.15 (4H, t, J 1.8, CpH), 4.07 (8H, s, CpH), 3.59 (2H, t, J 6.6, OCH2), 3.32 (4H, s, 2 x FCCH2), 2.23, (2H, app t, J 7.4, NCH2), 1.49 - 1.55 (2H, m, CH2), 1.33-1.39 (2H, m, CH2), 1.22-1.33 (4H, m, CH2); 13CNMR (125 Mhz; CDC13) 5C 134.3, 111.3, 83.7, 83.6, 71.4, 69.2, 69.0, 67.2, 62.8, 52.1, 32.7, 27.1, 25.5; HRMS, m/z (ESI) 566.1825 (1.8%, [M+H] , C32H39Fe2NOは566.1808を要求する); 電極電位: 298mV.
実施例１２
６−（ビス((l'-ブロモフェロセニル)l−メチルフェロセニル)アミノ）ヘキサン−１−オール
Figure 0005898693
１’−ブロモフェロセンカルボアルデヒド（８５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ内（３ｃｍ３）内で溶解し、６−アミノヘキサン−１−オール（２５ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(５９．３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ)で連続して処理した。溶液は、室温で一晩中攪拌した。この時間の後に、反応を、５ｃｍ３の飽和ＮａＨＣＯ３の添加によりクエンチした。有機層を分離し、次いで、液層は、エチルアセテート（３ｘ１０３ｃｍ）を用いて再び抽出した。組み合わされた有機抽出物は、硫酸マグネシウム上で乾燥し、フィルター処理し、次いで、真空中で濃縮し、赤い固体を与えた。生成物は、シリカクロマトグラフィーにより浄化し、１：１（エチルアセテート：ヘキサン）の１％水酸化アンモニアを溶出し、黄色油１７ｍｇとして、１７％収率で所望の生成物を与えた。
1H NMR (500 Mhz; CDC13) δH 4.32, (4H, t, J 1.8, FcH), 4.21 (8H, s, FcH), 4.05 (4H, t, J 1.8, FcH), 3.63 (2H, t, J6.5, OCH2), 3.46 (4H, s, FCCH2N), 2.31 (2H, t, J7.1, NCH2), 1.45-1.58 (4H, m, CH2), 1.27-1.36 (4H, m, CH2); 13CNMR (125 Mhz; CDCl3) δC 78.4, 72.9, 70.8, 70.5, 68.6, 67.9, 63.1, 62.8, 52.1, 33.0, 27.3, 26.0; HRMS, m/z (ESI) 669.7929 (2.7%, [M+H] , C28H34Fe2Br2NOは、669.9705を要求する); 電極電位: 437mV.
実施例１３
６− (ビス((2-メチルフェロセニル)メチル)アミノ)ヘキサン-l−オール
Figure 0005898693
メチルフェロセンカルボアルデヒド（１ｇ、５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ内で溶解した（３０ｃｍ３）。６−アミノヘキサン−１−オール（０．２５ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１．３ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。溶液を、一晩中室温で窒素下で攪拌した。エチルアセテート（２０ｃｍ３）及び１ＭのＮａＯＨ（２０ｃｍ３）を加え、有機層は、飽和したＮａＨＣＯ３（２５ｃｍ３）、ブライン（２５ｃｍ３）及びＭｉｌｌｉＱフィルター処理水（２５ｃｍ３）で抽出し、次いで、硫酸マグネシウム上で乾燥し、及び真空中で溶媒を除去し、オレンジ油を得た。粗生成物を、純粋な生成物（オレンジ油）を生じる（０．９５、６５％）ように、９：１の溶液Ｂ：溶液Ａ（溶液Ａ：エチルアセテート９５％ ＴＥＡ５％、溶液Ｂ：石油エーテル４０−６０ ９５％、ＴＥＡ５％）を用いて、並べられる。
1H NMR (300MHz; CDCl3) δH 4.18 (2H, s, CpH), 4.17 (2H, s, CpH), 4.13 (15H, s, CpH), 3.66 (4H, t, J 6.25, CH2), 3.48 (2H, s, CH2), , 2.36 (3H, s, CH3), 2.20 (2H, t, J 6.1, CH2), 1.59-1.31 (6H, m, CH2). 13CNMR (75.5 Hz; CDCl3) δC 77.8, 77.4, 76.9, 70.5, 68.9, 63.3, 53.0, 52.1, 33.1 , 27.4, 25.8, 12.4; HRMS, m/z (ESI) 539.8156 (10%, [M+H] , C30H47N1O1Fe2は、539.8232を要求する); 電極電位: 330mV.
Figure 0005898693
上記の表におけるデータは、フェロセニル残基に対する置換基の含有及びその置換基の選択が、電極電位に影響を与えるようにどのようにして用いてよいかを示す。これは、化合物の電気化学的検出を、様々な異なる条件下で行うことを可能にし、例えば、最適測定電位を選択する、又は存在してよい不純物との干渉により測定感度が妥協できる条件を避ける。更に、異なる電極電位による標識の使用は、多重反応の発展を可能にし、１より多くの測定を同じ試料で行ってよい。
本発明の開示内容は、以下の態様を含み得る。
［態様１］
電気化学的分析における一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
Ｒは、リンカー基である。]
で示される化合物の標識としての使用。
［態様２］
Ｘが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；
Ｙが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；
Ｚが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ８アルキレンを表す、上記の［態様１］に記載の使用。
［態様３］
Ｘが、ｘが１又は２である−（ＣＨ ２ ） ｘ −であり；
Ｙが、ｙが１又は２である−（ＣＨ ２ ） ｙ −であり；
Ｚが、ｚが１〜８である−（ＣＨ ２ ） ｚ −である、上記の［態様１］に記載の使用。
［態様４］
Ｆｃ及びＦｃ’が同じであり、Ｘ及びＹが同じである、上記の［態様１］〜［態様３］のいずれか１項に記載の使用。
［態様５］
分析が、電気化学的に標識されている基質を検出する分析である、上記の［態様１］〜［態様４］のいずれか１項に記載の使用。
［態様６］
分析が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドから選択される生物学的基質を検出する分析である、上記の［態様１］〜［態様５］のいずれか１項に記載の使用。
［態様７］
分析が、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から選択される生物学的基質を検出する分析である、上記の［態様１］〜［態様６］のいずれか１項に記載の使用。
［態様８］
電気化学的分析で用いるために標識残基を含む官能性標識付与化合物を製造する方法であって、該方法が、一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
Ｒは、酸素原子を含むリンカー基である。]
で示される化合物を官能性化合物と反応させて、一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａは、一般式Ｉａ：
Figure 0005898693
（ここで、Ｆｃ、Ｆｃ’、Ｘ、Ｙ及びＺは、上記のとおりである。）
を表し、
Ｆは、官能基を表し；及び
Ｌは、リンカー基を表す。]
で示される官能性標識付与化合物を得ることを含む、官能性標識付与化合物の製造方法。
［態様９］
標識化基質の製造方法であって、該方法が、一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａ、Ｆ及びＬは、上記の［態様８］に規定したとおりである。]
で示される化合物を基質と反応させて標識化基質を製造することを含む、標識化基質の製造方法。
［態様１０］
アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ミクロ粒子及びナノ粒子から基質を選択する、上記の［態様９］に記載の方法。
［態様１１］
基質が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドから選択した生物学的基質である、上記の［態様９］又は［態様１０］に記載の方法。
［態様１２］
基質が、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から選択した生物学的基質である、上記の［態様９］又は［態様１０］に記載の方法。
［態様１３］
上記の［態様９］〜［態様１２］のいずれか１項に記載の方法で用いるための官能性標識付与化合物であって、一般式ＩＩＩ：
Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
[式中、Ａは、一般式Ｉａ：
Figure 0005898693
（ここで、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）
で示される標識付与残基を表し、
Ｌは、リンカー基を表し；
Ｆは、標識付与残基を基質に結合するために、基質と反応する官能基を表す。]
を有する、官能性標識付与化合物。
［態様１４］
Ｆが、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ミクロ粒子及びナノ粒子から選択される基質と反応する官能基を表す、上記の［態様１３］に記載の官能性標識付与化合物。
［態様１５］
官能基Ｆが、スクシンイミジルエステル基、ホスホラミダイト基、マレイミド基、ビオチン基及びアジド基から選択される、上記の［態様９］〜［態様１４］のいずれか１項に記載の官能性標識付与化合物。
［態様１６］
官能基が、ホスホラミダイト基である、又はホスホラミダイト基から誘導可能である、上記の［態様９］〜［態様１５］のいずれか１項に記載の官能性標識付与化合物。
［態様１７］
電気化学的分析で用いるための標識化基質であって、一般式ＩＩＩａ：
Ａ−Ｌ−Ｆ’−[Ｓ] ＩＩＩａ
[式中、Ａは、一般式Ｉａ：
Figure 0005898693
（ここで、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）
を表し、
Ｌ−Ｆ’は、リンカー基を表し；
[Ｓ]は、基質を表す。]
である標識化基質。
［態様１８］
基質が、生物学的分子、ミクロ粒子及びナノ粒子から選択される、上記の［態様１７］に記載の標識化基質。
［態様１９］
基質が、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び炭水化物から選択される生物学的分子である、上記の［態様１７］又は［態様１８］に記載の標識化基質。
［態様２０］
基質が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドから選択される、上記の［態様１７］又は［態様１８］に記載の標識化基質。
［態様２１］
基質が、オリゴヌクレオチドである、又はオリゴヌクレオチドを含む、上記の［態様１７］〜［態様２０］のいずれか１項に記載の標識化基質。
［態様２２］
基質が、アミノ酸、糖類、ペプチド、タンパク質から選択される、上記の［態様１７］〜［態様１９］のいずれか１項に記載の標識化基質。
［態様２３］
分析ターゲットの存在を決定するための分析キットであって、上記の［態様１７］〜［態様２２］のいずれか１項に記載の標識化基質を含む、分析キット。
［態様２４］
一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃは、置換されているフェロセニル残基であり、
Ｆｃ’は、置換されているフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
Ｒは、リンカー基である。]
で示される化合物。
［態様２５］
各々のフェロセニル残基が、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ハロアルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基により置換されている、上記の［態様２４］に記載の化合物。
［態様２６］
一般式Ｉ：
Figure 0005898693
[式中、Ｆｃ及びＦｃ’は、それぞれ、置換されていないフェロセニル残基であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ ５ −によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ ５ は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
Ｚは、Ｃ６〜Ｃ１２アルキレン鎖、又は１以上の置換基により置換されている及び／又は−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ １ −、−ＮＲ １ ＣＯ−又は−ＮＲ １ −から選択される基によって中断されているＣ１〜Ｃ１２アルキレンであり、ここで、Ｒ １ は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
Ｒは、リンカー基である。]
で示される化合物。
［態様２７］
Ｘが、ｘが１〜６である−（ＣＨ ２ ） ｘ −であり；
Ｙが、ｙが１〜６である−（ＣＨ ２ ） ｙ −である、上記の［態様２４］〜［態様２６］のいずれか１項に記載の化合物。
［態様２８］
Ｚが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ６〜Ｃ８アルキレンを表す、上記の［態様２４］〜［態様２７］のいずれか１項に記載の化合物。
［態様２９］
リンカー基Ｒが、化合物を官能基又は基質に結合させるように、官能基の又は基質の適合基と反応できる基を含む、上記の［態様２４］〜［態様２８］のいずれか１項に記載の化合物。
［態様３０］
表２から選択される化合物。
［態様３１］
Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノール又はその類似体であって、その両方のフェロセニル基が、１以上の置換基により置換されている、Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノール又はその類似体。
［態様３２］
Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノールから又はその類似体から誘導される標識付与残基を含む標識化基質であって、両方のフェロセニル残基が、１以上の置換基により置換されている、標識化基質。
［態様３３］
核酸の検出方法であって、該方法が、プローブとアンプリコンの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、相補的な核酸プローブと核酸を接触させ、次いで、ハイブリダイズされている又はハイブリダイズされていないプローブを選択的に分解する工程を行うことを含み、
プローブを、上記の［態様２４］〜［態様３２］のいずれか１項に記載の化合物により標識し、該方法が、プローブを標識する化合物の電気化学的活性を測定する工程を含み、前記電気化学的活性が、プローブの分解程度に定量的に又は定性的に依存する、核酸の検出方法。
［態様３４］
上記の［態様２４］〜［態様３２］のいずれか１項に記載の化合物により標識されているアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の検出方法であって、化合物の電気化学的活性を測定する工程を含む、検出方法。

Claims (34)

  1. 電気化学的分析における一般式Ｉ：
    Figure 0005898693
    [式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
    Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
    Ｒは、リンカー基である。]
    で示される化合物の標識としての使用。
  2. Ｘが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；
    Ｙが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレンを表し；
    Ｚが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ８アルキレンを表す、請求項１に記載の使用。
  3. Ｘが、ｘが１又は２である−（ＣＨ２）ｘ−であり；
    Ｙが、ｙが１又は２である−（ＣＨ２）ｙ−であり；
    Ｚが、ｚが１〜８である−（ＣＨ２）ｚ−である、請求項１に記載の使用。
  4. Ｆｃ及びＦｃ’が同じであり、Ｘ及びＹが同じである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
  5. 分析が、電気化学的に標識されている基質を検出する分析である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
  6. 分析が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドから選択される生物学的基質を検出する分析である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
  7. 分析が、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から選択される生物学的基質を検出する分析である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
  8. 電気化学的分析で用いるために標識残基を含む官能性標識付与化合物を製造する方法であって、該方法が、一般式Ｉ：
    Figure 0005898693
    [式中、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
    Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
    Ｒは、酸素原子を含むリンカー基である。]
    で示される化合物を官能性化合物と反応させて、一般式ＩＩＩ：
    Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
    [式中、Ａは、一般式Ｉａ：
    Figure 0005898693
    （ここで、Ｆｃ、Ｆｃ’、Ｘ、Ｙ及びＺは、上記のとおりである。）
    を表し、
    Ｆは、官能基を表し；及び
    Ｌは、リンカー基を表す。]
    で示される官能性標識付与化合物を得ることを含む、官能性標識付与化合物の製造方法。
  9. 標識化基質の製造方法であって、該方法が、一般式ＩＩＩ：
    Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
    [式中、Ａ、Ｆ及びＬは、請求項８に規定したとおりである。]
    で示される化合物を基質と反応させて標識化基質を製造することを含む、標識化基質の製造方法。
  10. アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ミクロ粒子及びナノ粒子から前記基質を選択する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記基質が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドから選択した生物学的基質である、請求項９に記載の方法。
  12. 前記基質が、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質から選択した生物学的基質である、請求項９に記載の方法。
  13. 請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法で用いるための官能性標識付与化合物であって、一般式ＩＩＩ：
    Ａ−Ｌ−Ｆ ＩＩＩ
    [式中、Ａは、一般式Ｉａ：
    Figure 0005898693
    （ここで、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
    Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）
    で示される標識付与残基を表し、
    Ｌは、リンカー基を表し；
    Ｆは、標識付与残基を基質に結合するために、基質と反応する官能基を表す。]
    を有する、官能性標識付与化合物。
  14. Ｆが、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ミクロ粒子及びナノ粒子から選択される基質と反応する官能基を表す、請求項１３に記載の官能性標識付与化合物。
  15. 官能基Ｆが、スクシンイミジルエステル基、ホスホラミダイト基、マレイミド基、ビオチン基及びアジド基から選択される、請求項１３または１４に記載の官能性標識付与化合物。
  16. 官能基が、ホスホラミダイト基である、又はホスホラミダイト基から誘導可能である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の官能性標識付与化合物。
  17. 電気化学的分析で用いるための標識化基質であって、一般式ＩＩＩａ：
    Ａ−Ｌ−Ｆ’−[Ｓ] ＩＩＩａ
    [式中、Ａは、一般式Ｉａ：
    Figure 0005898693
    （ここで、Ｆｃは、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、
    Ｆｃ’は、置換されている又は置換されていないフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表す。）
    を表し、
    Ｌ−Ｆ’は、リンカー基を表し；
    [Ｓ]は、基質を表す。]
    である標識化基質。
  18. 基質が、生物学的分子、ミクロ粒子及びナノ粒子から選択される、請求項１７に記載の標識化基質。
  19. 基質が、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び炭水化物から選択される生物学的分子である、請求項１７又は１８に記載の標識化基質。
  20. 基質が、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドから選択される、請求項１７又は１８に記載の標識化基質。
  21. 基質が、オリゴヌクレオチドである、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の標識化基質。
  22. 基質が、アミノ酸、糖類、ペプチド、タンパク質から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の標識化基質。
  23. 分析ターゲットの存在を決定するための分析キットであって、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の標識化基質を含む、分析キット。
  24. 一般式Ｉ：
    Figure 0005898693
    [式中、Ｆｃは、置換されているフェロセニル残基であり、
    Ｆｃ’は、置換されているフェロセニル残基であり、Ｆｃと同じであってよく又は異なってよく；
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−によって必要に応じて置換されてよい及び／又は必要に応じて中断されてよいＣ１〜Ｃ１２アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
    Ｒは、リンカー基である。]
    で示される化合物。
  25. 各々のフェロセニル残基が、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ハロアルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基により置換されている、請求項２４に記載の化合物。
  26. 一般式Ｉ：
    Figure 0005898693
    [式中、Ｆｃ及びＦｃ’は、それぞれ、置換されていないフェロセニル残基であり、
    Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ５−によって必要に応じて中断されているＣ１〜Ｃ６アルキレン鎖であり、ここで、Ｒ５は、水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルを表し；
    Ｚは、Ｃ６〜Ｃ１２アルキレン鎖、又は１以上の置換基により置換されている及び／又は−Ｏ−、−Ｓ−、シクロアルキル、−ＣＯＮＲ１−、−ＮＲ１ＣＯ−又は−ＮＲ１−から選択される基によって中断されているＣ１〜Ｃ１２アルキレンであり、ここで、Ｒ１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルを表し；及び
    Ｒは、リンカー基である。]
    で示される化合物。
  27. Ｘが、ｘが１〜６である−（ＣＨ２）ｘ−であり；
    Ｙが、ｙが１〜６である−（ＣＨ２）ｙ−である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
  28. Ｚが、酸素によって必要に応じて中断されているＣ６〜Ｃ８アルキレンを表す、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
  29. リンカー基Ｒが、化合物を官能基又は基質に結合させるように、官能基の又は基質の適合基と反応できる基を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
  30. Figure 0005898693
    から選択される化合物。
  31. Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノール又はその類似体であって、その両方のフェロセニル基が、１以上の置換基により置換されている、Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノール又はその類似体。
  32. Ｎ，Ｎ−ジフェロセニルメチル−６−アミノヘキサノールから又はその類似体から誘導される標識付与残基を含む標識化基質であって、両方のフェロセニル残基が、１以上の置換基により置換されている、標識化基質。
  33. 核酸の検出方法であって、該方法が、プローブとアンプリコンの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、相補的な核酸プローブと核酸を接触させ、次いで、ハイブリダイズされている又はハイブリダイズされていないプローブを選択的に分解する工程を行うことを含み、
    プローブを、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の化合物により標識し、該方法が、プローブを標識する化合物の電気化学的活性を測定する工程を含み、前記電気化学的活性が、プローブの分解程度に定量的に又は定性的に依存する、核酸の検出方法。
  34. 請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の化合物により標識されているアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の検出方法であって、化合物の電気化学的活性を測定する工程を含む、検出方法。
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