JP5918779B2 - 置換１ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩 - Google Patents

Description

本発明は１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩、その製造方法、疾患の処置および／または予防のためのその使用ならびに疾患、特に心血管疾患および血液疾患および腎臓病の処置および／または予防および創傷治癒の促進のための医薬の調製へのその使用、に関する。

式（Ｉ）の化合物、１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール（エノール型；式（Ｉａ））または２−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾール−３−オン（ケト型；式（Ｉｂ））は特許文献１より公知である。

式（Ｉ）の化合物はＨＩＦ−プロリル−４−ヒドロキシラーゼの阻害剤として作用し、かつこの特異的な作用機序の結果として、非経口または経口投与の後、例えばエリスロポエチンのようなＨＩＦ標的遺伝子の生体内での誘導、およびそれにより引き起こされる生物的過程、例えば赤血球生成のような過程を誘発する。

国際公開第２００８／０６７８７１号

式（Ｉ）の化合物は吸湿性で、通常の環境条件（２０〜３５℃、大気圧）では、２０％を超える相対大気湿度下でさえ、約６重量％までの水分を取り込む。相対湿度３０％の大気湿度では６重量％の水分の取り込みはほとんど完全になされている。大気湿度が相対湿度３０％よりも下に下がった場合に、式（Ｉ）の化合物は含んでいる水分の一部を放出する。この水分の取り込みまたは放出により、この式（Ｉ）の化合物の取り扱い、例えば秤量操作、および式（Ｉ）の化合物を含む医薬およびその製造に用いる、均一で安定しておりかつ規定された形での化合物（Ｉ）の生成がさらに難しいものとなっている。特にこのことにより、式（Ｉ）の化合物を含む投与剤形、例えば錠剤、顆粒剤または飲用液剤の製造の間、技術面での消費が増えることになる。これは大気湿度を調節および制御する処置が式（Ｉ）の化合物の均一な濃度を維持するために必要なためである。

式（Ｉ）の化合物から、式（Ｉ）の化合物と比較して決定的な利点を持つナトリウム塩を製造することが可能であることが発見された。

本発明は式（ＩＩ）の化合物に相当する化合物、１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩を提供する。

本発明に関しては、１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩（式（ＩＩ）の化合物）は好ましくは結晶形で存在する。

本発明の式（ＩＩ）の化合物の使用により、大気湿度が変化する状況で、水分の取り込みまたは放出の点について式（Ｉ）の公知化合物と比較して著しく高い安定性が確実に達成される。１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩（式（ＩＩ）の化合物）は０．５重量％よりも少ない水分を含み、かつ吸湿性でなく、かつ通常の環境条件（２０〜３５℃、大気圧）下では相対湿度９０％までに大気湿度が上昇しても、その水分含量は最小限に、すなわち０．５重量％未満しか変化しない。技術的には、すなわち秤量操作の間および特に顆粒剤、飲用液剤または錠剤のような投与剤形において式（ＩＩ）の化合物の均一な濃度が保証されなければならない場合に、式（ＩＩ）の化合物は取り扱いがかなり容易である。さらに、式（ＩＩ）の化合物は式（Ｉ）の化合物と比べて水への溶解度が高い。

さらに本発明は本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造方法であって、式（Ｉ）の化合物

を溶媒中で水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液またはナトリウム塩と、適当であれば塩基を添加して反応させることを特徴とする方法を提供する。

好ましくは、式（Ｉ）の化合物を溶媒中で水酸化ナトリウム水溶液と、適当であれば塩基を添加して反応させることを特徴とする、本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造方法である。

特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物を、トリエチルアミンを添加して溶媒中で水酸化ナトリウム水溶液と反応させることを特徴とする、本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造方法である。

水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液またはナトリウム塩との反応は一般的に溶媒中で、好ましくは２０℃〜１２０℃の範囲の温度で、特に好ましくは４０℃〜７０℃の範囲の温度で、大気圧下で行われる。得られた懸濁液から、式（ＩＩ）の化合物を−２０℃〜８０℃の間の温度、好ましくは０℃〜２０℃の温度にて、大気圧下で濾過により分離し、その後乾燥させる。

該反応が塩基を添加して行われる場合、一般的にまず、式（Ｉ）の化合物を２０℃〜１２０℃の温度、好ましくは４０℃〜７０℃の温度にて、大気圧下で有機塩基を添加して溶媒に溶解し、次に水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液またはナトリウム塩を２０℃〜１２０℃、好ましくは４０℃〜７０℃の温度にて、大気圧下で添加することにより、式（ＩＩ）の化合物が沈殿する。得られた懸濁液から、式（ＩＩ）の化合物を−２０℃〜８０℃の温度、好ましくは０℃〜２０℃の温度にて、大気圧下で濾過により分離し、その後乾燥させる。

水酸化ナトリウムおよび水酸化ナトリウム水溶液およびナトリウム塩は式（Ｉ）の化合物に対して０．８〜２モル当量のモル比で使用される。好ましくは、水酸化ナトリウムおよび水酸化ナトリウム水溶液およびナトリウム塩は式（Ｉ）の化合物に対して、１．０〜１．４モル当量のモル比で用いられる。

適当なナトリウム塩は例えば有機酸の塩、例えば酢酸ナトリウムもしくはクエン酸ナトリウムのようなカルボン酸ナトリウム、または無機酸の塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムまたは塩化ナトリウムである。

適当な溶媒は低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノールまたはテトラヒドロフランまたはアセトニトリルまたはトルエンまたは１，４−ジオキサンまたは上述した溶媒の混合物または上述した溶媒の水との混合物である。好ましくは、メタノール、エタノール、２−プロパノール、テトラヒドロフランまたは上述した溶媒の水との混合物である。特に好ましくは、メタノールと水、またはエタノールと水を１：１〜５０：１（ｖ／ｖ）の比で混合したものであり、ことさらに好ましくは、メタノールと水を７：３〜３０：１（ｖ／ｖ）の比で混合したものである。

適当な有機塩基は第３アミン、例えばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンである。好ましくは、トリエチルアミンである。有機塩基は式（Ｉ）の化合物に対して０〜４モル当量の比で用いられる。好ましくは、有機塩基は式（Ｉ）の化合物に対して０．７〜１．５モル当量の比で用いられる。

本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造は以下の反応スキームで表されうる。
スキーム

式（ＩＩ）の化合物および式（Ｉ）の化合物のＩＲスペクトル。 式（ＩＩ）の化合物および式（Ｉ）の化合物のラマンスペクトル。 式（ＩＩ）の化合物および式（Ｉ）の化合物のＵＶ／ＶＩＳスペクトル。 式（ＩＩ）の化合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。 式（Ｉ）の化合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。 式（ＩＩ）の化合物の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。 式（Ｉ）の化合物の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。 式（ＩＩ）の化合物の質量スペクトル。 式（Ｉ）の化合物の質量スペクトル。 式（ＩＩ）の化合物のＸ線ディフラクトグラム。 式（Ｉ）の化合物のＸ線ディフラクトグラム。

本発明の式（ＩＩ）の化合物は予測不能で、有用な薬理作用のスペクトルを示す。それ故、該化合物はヒトおよび動物において疾患の処置および／または予防のための医薬として用いるのに適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はＨＩＦプロリル４−ヒドロキシラーゼの特異的な阻害剤として際立っている。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はその薬理学的な性質にもとづき、心血管疾患、特に心不全、冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、卒中、動脈硬化、本態性、肺性および悪性高血圧症ならびに末梢動脈閉塞症の処置および／または予防に用いられ得る。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに造血障害、例えば特発性貧血、腎性貧血および腫瘍（特に、化学療法により誘発される貧血）、感染症（特にＨＩＶ感染症）または例えば関節リウマチのような他の炎症性疾患にともなう貧血の処置および／または予防に適している。本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに失血の結果としての貧血、鉄欠乏性貧血、ビタミン欠乏性貧血（例えばビタミンＢ１２欠乏の結果または葉酸欠乏の結果としての貧血）、低形成性および再生不良性貧血または溶血性貧血の補助的処置、または鉄利用障害の結果としての貧血（鉄非利用性貧血）または他の内分泌障害（例えば甲状腺機能低下症）の結果としての貧血の補助的処置に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに、手術前に自己輸血用の血液を得るためにヘマトクリット値を増加させるのに適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに手術関連虚血状態および外科処置、特に、人工心肺装置を使った心臓への処置（例えばバイパス手術、心臓弁移植）、頸動脈への処置、大動脈への処置および頭蓋冠を開くもしくは貫通する器具を用いる処置の後の該虚血状態の継続症状の処置および／または予防に用いられ得る。本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに外科的介入処置の場合に、創傷治癒の促進および回復時間の短縮を目的とした一般的な処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに脳の急性および持続性の虚血状態の継続的な症状（例えば脳卒中、出生時仮死）の処置および予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらにがんの処置および／または予防、ならびにがんの処置の過程で、特に細胞増殖抑制剤、抗生物質および放射線での治療の後に生じる健康障害の処置および／または予防に用いられ得る。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はリューマチ型の疾患および他の自己免疫疾患として見なされる型の疾患の処置および／または予防、特にそれらの疾患の医薬を用いた処置の過程でおこる健康障害の処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに眼の疾患（例えば緑内障）、脳の疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、慢性疼痛）、慢性腎疾患、腎機能不全および急性腎不全の処置および／または予防、ならびに創傷治癒の促進に用いられ得る。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに、最悪の場合カヘキシーにいたる全身的な脱力、特に高齢になるほど程度が増大しておこるものの処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに性機能不全の処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに糖尿病およびその継続した症状、例えば糖尿病性の大血管症および細小血管症、糖尿病性の腎障害および神経障害の処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はさらに例えば心臓、肺および肝臓の線維性疾患の処置および／または予防に適している。

本発明の式（ＩＩ）の化合物は特に、未熟児における網膜症（未熟児網膜症）の予防および処置にもまた適している。

本発明はさらに疾患、特に上述した疾患の処置および／または予防のための本発明の式（ＩＩ）の化合物の使用を提供する。

本発明はさらに疾患、特に上述した疾患を処置および／または予防するための医薬を製剤するための本発明の式（ＩＩ）の化合物の使用を提供する。

本発明はさらに有効量の本発明の式（ＩＩ）の化合物を用いて疾患、特に上述した疾患を処置および／または予防する方法を提供する。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はそれ自体で、または必要であれば他の有効化合物との組み合わせで用いられ得る。本発明はさらに本発明の式（ＩＩ）の化合物およびさらに一つ以上の有効な化合物を含む医薬で、特に上述した疾患の処置および／または予防のための医薬を提供する。好ましい例として言及され得る組み合わせで適当な有効化合物は、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ベータ受容体遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、ＰＤＥ阻害剤、鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、利尿剤、アスピリン、鉄サプリメント、ビタミンＢ１２および葉酸サプリメント、スタチン、ジギタリス（ジゴキシン）誘導体、腫瘍化学療法剤および抗生物質である。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はＡＣＥ阻害剤、好ましい例としてはエナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、フォシノプリル、キノプリル、ペリンドプリルまたはトランドプリルと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はアンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、好ましい例としてはロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタンまたはエンブサルタンと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はベータ受容体遮断薬、好ましい例としては、プロプラノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ブプラノロール、メチ−プラノロール、ナドロール、メピンドロール、カラザロール、ソタロール、メトプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ビソプロロール、カルテオロール、エスモロール、ラベタロール、カルベジロール、アダプロロール、ランジオロール、ネビボロール、エパノロール、またはブシンドロールと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はカルシウムアンタゴニスト、好ましい例としては、ニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、好ましい例としては、ミルリノン、アムリノン、ピモベンダン、シロスタゾール、シルデナフィル、バルデナフィルまたはタダラフィルと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物は鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、好ましい例としては、スピロノラクトン、エプレレノン、カンレノンまたはカンレノン酸カリウムと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物は利尿剤、好ましい例としては、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、ベンドロフルメチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネタゾン、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、メタゾラミド、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、アミロライドまたはトリアムテレンと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物はスタチンのクラスのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、好ましい例としては、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチンまたはピタバスタチンと組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物は好ましい例としては、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンのような白金複合体、例えばシクロホスファミドおよびクロラムブシルのようなアルキル化剤、例えば５−フルオロウラシルおよびメトトレキサートのような代謝拮抗薬、例えばエトポシドおよびカンプトテシンのようなトポイソメラーゼ阻害剤、例えばドキソルビシンおよびダウノルビシンのような抗生物質、またはソラフェニブおよびスニチニブのようなキナーゼ阻害剤からなる群からの腫瘍化学療法剤と組み合わせて投与される。

本発明の好ましい態様においては、本発明の式（ＩＩ）の化合物は、好ましい例としてはペニシリン系、セファロスポリン系または例えばシプロフロキサシンおよびモキシフロキサシンのようなキノロン系からなる群からの抗生物質と組み合わせて投与される。

本発明はさらに本発明の式（ＩＩ）の化合物を、慣用的には一つ以上の不活性で、無毒で、薬学的に適した補助剤とともに含む医薬および上述した目的のためのその使用を提供する。

本発明の式（ＩＩ）の化合物は全身でおよび／または局所的に作用しうる。該化合物はこの目的のために適切な方法で、例えば経口で、非経口で、経肺で、経鼻で、舌下に、舌側に、頬側に、直腸に、皮膚に、経皮的に、結膜に、経耳にまたはインプラントもしくはステントとして投与されうる。

これらの投与経路のために本発明の式（ＩＩ）の化合物は適当な投与剤形で投与されうる。

先行技術に従って機能する投与剤形であり、本発明の式（ＩＩ）の化合物を急速におよび／または改良された方法で放出し、かつ本発明の化合物を結晶形でおよび／または非晶形でおよび／または溶解された形態で含む投与剤形は、経口投与、例えば、錠剤（無コートもしくはコーティングされた錠剤、例えば胃液に耐性があるか、または遅れて溶解するかまたは不溶性で本発明の化合物の放出を調節するコーティング）、口腔内で急速に分解する錠剤またはフィルム／オブラート、フィルム／凍結乾燥剤またはカプセル剤（例えば硬もしくは軟ゼラチンカプセル剤）、糖衣錠、顆粒剤、小丸薬、散剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤または液剤、に適している。

非経口投与は吸収段階を回避することによって（例えば静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内）、または吸収を含むことによって（例えば筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内）行われうる。非経口投与に適した投与剤形は、とりわけ液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤または滅菌散剤の剤形の注射および点滴製剤である。

その他の投与剤形には、例えば吸入医薬剤形（とりわけ吸入粉末吸引剤、ネブライザ）、点鼻薬、液剤もしくはスプレー剤、舌、舌下もしくは頬側投与用の錠剤、フィルム／オブラートもしくはカプセル剤、坐薬、耳もしくは眼の製剤、膣カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、振盪混合剤）、親油性懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮治療システム（例えばパッチ）、ミルク、ペースト、フォーム剤、散布用粉末剤、インプラントまたはステントが適している。

経口および非経口投与、特に経口および静脈内投与が好ましい。

本発明の式（ＩＩ）の化合物は上述された投与剤形に変換されうる。これは不活性で無毒の薬学的に適した補助剤と混合することにより、それ自体公知の方法により行うことができる。これらの補助剤はとりわけ担体物質（例えば微結晶性セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば液体ポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレイン酸）、結合剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えばアルブミン）、安定剤（例えばアスコルビン酸のような抗酸化剤）、着色剤（例えば酸化鉄のような無機色素）および香味料および／または臭気の矯正剤を含む。

一般的に、非経口投与の場合には約０．００１〜１mg／体重kg、好ましくは約０．０１〜０．５mg／体重kgの量を投与することが効果的な結果を達成するために有利であると考えられてきた。経口投与の場合には用量は約０．０１〜１００mg／体重kg、好ましくは約０．０１〜２０mg／体重kg、ことさらに好ましくは０．１〜１０mg／体重kgである。

それにもかかわらず特に体重、投与経路、有効化合物に対する個体の応答、製剤の性質および投与が行われる時点または間隔に依存して、上記の投与量を逸脱することが必要になり得る。それ故に上述の最小量よりも少ない量で十分に管理できる場合もあり得るが、一方では、上述の上限を超えなければならない場合もある。比較的大量に投与する場合には、これを一日の中で何回かの個々の投与量に分けるのが望ましいことがある。

以下の実施例は本発明を例証するものである。本発明は本実施例に限定されない。

以下の試験および実施例においてパーセントのデータは特に述べない限り重量パーセントであり、部は重量部である。溶媒比、希釈比および液体／液体溶液の濃度データは各場合において体積に関するものである。

Ａ．実施例
略語：

出発物質：
実施例１Ａ
２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸メチル
２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸エチル４５０gをメタノール３．５lに溶解し、トリエチルアミン３０gを添加し、該混合物を２２℃で１６時間撹拌した。その後、溶媒をすべて減圧下で留去した。これにより表題化合物４１０gを油として
得た。

実施例２Ａ
３−（ジメチルアミノ）−２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸メチル
ジメチルホルムアミドジメチルアセタール５２２gを２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）アクリル酸メチル４００gに添加し、該混合物を沸騰するまで加熱した。形成した低沸点の成分を留去した。４時間後、混合物を５５℃まで冷却し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／２−プロパノール１０５０ml（３：１ ｖ／ｖ）を計量して入れた。生じた懸濁液を２２℃まで冷却し、濾過した。濾過ケーキを繰り返しメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、減圧下、４０℃で乾燥させた。これにより表題化合物４９３gを固体として得た。

実施例３Ａ
１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール（エノール型；式（Ｉａ））または２−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾール−３−オン（ケト型；式（Ｉｂ））
トリフルオロ酢酸５．８４gを酢酸エチル２１０ml中の４−（６−ヒドラジノピリミジン−４−イル）モルホリン２０gおよび（２Ｅ／Ｚ）−３−（ジメチルアミノ）−２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）アクリル酸メチル２４．６gに添加し、該混合物を２４時間還流下で撹拌した。得られた懸濁液を０℃まで冷却し、濾過した。濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄し、高吸引濾過により濾去し、その後、水１６０mlに懸濁した。懸濁液を酢酸４．５mlを添加することにより約ｐＨ５に調整し、さらに１５分間撹拌し、濾過した。濾過ケーキを水５０mlで２回洗浄し、その後、減圧下、４０℃で乾燥させた。収量：表題化合物２６．０g（理論値の７９．４％）。

化合物４−（６−ヒドラジノピリミジン−４−イル）モルホリン（実施例Ｎｏ．１６Ａ）、２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）酢酸エチル（実施例Ｎｏ．３９Ａ）および３−（ジメチルアミノ）−２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）アクリル酸エチル（実施例Ｎｏ．３Ａ）の製造はすでにＷＯ２００８／０６７８７１に記載されている。

４−（６−ヒドラジノピリミジン−４−イル）モルホリンおよび３−（ジメチルアミノ）−２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）アクリル酸エチルからの化合物２−（６−モルホリン−４−イルピリミジン−４−イル）−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾール−３−オンの製造もまたＷＯ２００８／０６７８７１に記載されている（実施例Ｎｏ．７１）。

実施例：
実施例１
１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩（式（ＩＩ）の化合物）
実施例 １．１
実施例３Ａの化合物１０gをメタノール／水５０ml（９：１ ｖ／ｖ）中に懸濁した。撹拌しながら、４５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液３．４gを該懸濁液に添加し、さらにメタノール／水５０ml（９：１ ｖ／ｖ）を添加した。懸濁液を５０℃まで加温し、５０℃で２時間撹拌した。その後、該混合物を０℃まで冷却し、０℃でさらに１時間撹拌し、濾過した。得られた濾過ケーキをメタノール／水（９：１ ｖ／ｖ）で洗浄し、乾燥させた。収量：式（ＩＩ）の化合物１０．１g；Ｎａ６．８重量％。

実施例 １．２
実施例３Ａの化合物５gをエタノール／水６０ml（１：１ ｖ／ｖ）に懸濁し、４５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液１．４１gを２２℃で添加した。該懸濁液を５０℃で３日間および２０℃で２時間撹拌した。固体を濾去し、水１０mlで洗浄し、乾燥させた。収量：式（ＩＩ）の化合物４g。

実施例 １．３
実施例３Ａの化合物３０．２５gをメタノール／水１５０ml（９：１ ｖ／ｖ）に２２℃で懸濁した。トリエチルアミン１３．３mlを添加し、該混合物を６０℃まで加温した。１５分後、得られたほぼ透明な溶液を濾過し、フィルターをメタノール／水１０ml（９：１ ｖ／ｖ）で洗浄し、６０℃の集めた濾液に、４５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液１０．３gをゆっくりと添加した。得られた懸濁液に少量の式（ＩＩ）の化合物の結晶を添加し、混合物を６０℃で１時間懸濁し、その後、ゆっくりと０℃まで冷却して濾過した。濾過ケーキをメタノール／水１５ml（９：１ ｖ／ｖ）で洗浄し、４０℃、減圧下で乾燥させた。収量：式（ＩＩ）の化合物２５．１g。

実施例 １．４
実施例３Ａの化合物２５gをメタノール／水１５０ml（１：１ ｖ／ｖ）に懸濁し、トリエチルアミン１１mlを添加した。得られた溶液を６０℃まで加温し、４５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液８．５gを添加した。得られた懸濁液をゆっくりと２２℃まで冷却し、２２℃で２時間撹拌し、その後、０〜５℃で１時間撹拌した。濾過後、濾過ケーキをメタノール／水１５ml（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄し、４０℃、減圧下で乾燥させた。収量：式（ＩＩ）の化合物２６g。

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：
Perkin−ElmerのＤＳＣ７またはＰｙｒｉｓ−１示差走査熱量計およびＴＧＡ７熱重量分析器を用いてサーモグラムを得た。
ＤＳＣ７またはＰｙｒｉｓ−１示差走査熱量計；製造者：Perkin−Elmer； 加熱速度：２および２０K／分： パージガス：窒素； るつぼ：アルミニウムるつぼ（気密でない）；サンプル調製：なし。
ＴＧＡ７熱重量分析器； 製造者：Perkin−Elmer； 加熱速度：１０K／分； パージガス：窒素、２０−３０ml／分； るつぼ：開放白金るつぼ； サンプル調製：なし。
１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩（式（ＩＩ）の化合物）は３００℃をこえると融解せずに分解する。

蒸気吸着および蒸気脱着：
吸湿等温線はHiden Analyticalの動的水蒸気脱着測定装置ＩＧＡ Ｓｏｒｐを用いて記録した。計測温度は２５℃だった。サンプル調製は行わなかった。

溶解度データ：
方法：試験物質の飽和溶液を、水での懸濁液を２５℃で１６時間撹拌することにより調製した。次に、得られた懸濁液を濾過し、濾液の含有量をＨＰＬＣにより決定した。

ＩＲおよびＲａｍａｎ分光法：
式（ＩＩ）の化合物のＩＲおよびＲａｍａｎスペクトル測定のために、Bruker ＦＴ／ＩＲ−分光計ＩＦＳ ６６ｖおよびBruker ＦＴ／Ｒａｍａｎ分光計ＭｕｌｔｉＲＡＭを以下のパラメーターで用いた。

式（Ｉ）の化合物のＩＲおよびＲａｍａｎスペクトル測定のために、Bruker ＦＴ／ＩＲ−分光計Ｖｅｒｔｅｘ ８０ｖおよびBruker ＦＴ／Ｒａｍａｎ分光計ＭｕｌｔｉＲＡＭを以下のパラメーターで用いた。

ＵＶ／ＶＩＳ分光法：
ＵＶ／ＶＩＳスペクトルはPerkin Elmer分光器（Ｌａｍｂｄａ ４０Ｐ）で以下の条件またはパラメーターを用いて測定した：
キュベット：経路長 １cm；石英ガラス
波数範囲：２００−８００nm
スリット幅：１nm
サンプル調製：約１mg／１００ml アセトニトリル／水 １：１
バンド：２８５；２４９nm 式（ＩＩ）の化合物および ２８９．３；２４８．２nm 式（Ｉ）の化合物

核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法：
ＮＭＲスペクトルをBruker ＮＭＲ分光器（Advance）で以下の条件またはパラメーターで記録した：

それぞれのＮＭＲシグナルの割当を示した式（ＩＩ）および式（Ｉ）の化合物の構造式

質量分析：
質量分析を以下に記載した条件またはパラメーターを用いてWaters質量分析器（ＺＱ）で記録した：

元素分析：

Ｘ線回折法：
透過回折計PANalyticalのＸ｀Ｐｅｒｔ ＰＲＯとＰＩＸｃｅｌカウンター（マルチチャンネル）：

または
ＳＴＯＥ粉末回折系：

Ｂ．薬理活性評価
本発明の化合物の薬理学的性質は以下のアッセイで示されうる。
略語：
ＤＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地
ＦＣＳ ウシ胎仔血清
ＴＭＢ ３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン
Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン

１．ＨＩＦプロリル４−ヒドロキシラーゼ阻害剤の活性および選択性の決定のための試験管内試験
１．ａ）ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の阻害：
ヒドロキシル化されたＨＩＦは特異的にフォンヒッペル−リンダウ蛋白質−エロンギンＢ−エロンギンＣ複合体（ＶＢＣ複合体）に結合する。この相互作用はＨＩＦが保存されたプロリル基においてヒドロキシル化される場合にのみおこる。そのことはＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を生化学的に決定するための基礎である。試験は[Oehme F．，Jonghaus W．，Narouz−Ott L．，Huetter J．，Flamme I．，Anal．Biochem．330（1），74−80（2004）]に記載のように行う。

透明なNeutrAvidin ＨＢＣ（Pierce）コート９６穴マイクロタイタープレートをブロッカーカゼインとともに３０分間インキュベートする。その後プレートを毎回ウェルごとに洗浄緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００mM ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）ブロッカーカゼイン、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）２００μlで３回洗浄する。ビオチン−ＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬペプチド（Eurogentec、4102 Seraing、Belgium）を洗浄緩衝液１００μl中に４００nMの濃度で添加する。このペプチドはプロリルヒドロキシル化の基質としてはたらき、マイクロタイタープレートに結合する。６０分間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッカーカゼイン中１mMビオチンとともに３０分間インキュベートし、その後、再び３回洗浄する。

プロリルヒドロキシラーゼ反応をおこなうために、プレートに結合したペプチド基質をプロリルヒドロキシラーゼを含む細胞可溶化液とともに１〜６０分間インキュベートする。該反応は反応緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ_２、１μM−１mM ２−オキソグルタレート、１０μM ＦｅＳＯ_４、２mM アスコルベート）１００μl中、室温でおこる。反応混合物はさらに、試験されるプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤を様々な濃度で含む。試験物質は限定されるわけではないが、好ましくは、１nM〜１００μMの濃度で用いられる。反応はプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄することにより停止する。

プロリルヒドロキシル化の定量のために、結合緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１２０mM ＮａＣｌ）８０μl中の大腸菌由来のチオレドキシンおよびＶＢＣ複合体の両方を含む融合蛋白質を添加する。１５分後、ウサギポリクローナル抗チオレドキシン抗体の結合緩衝液中溶液１０μlを添加する。さらに３０分後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン抗体の結合緩衝液中溶液１０μlを添加する。室温で３０分間インキュベートした後、結合していないＶＢＣ複合体および抗体を取り除くためにプレートを３回洗浄する。結合しているＶＢＣ複合体の量を決定するために、プレートをＴＭＢとともに１５分間インキュベートする。呈色反応は１M硫酸１００μlを添加することによって終了する。結合したＶＢＣ複合体の量を４５０nmでの吸光度を測定することで決定する。それはペプチド基質中のヒドロキシル化されたプロリンの量に比例する。

別法として、ユーロピウム（Perkin Elmer）に結合したＶＢＣ複合体をプロリルヒドロキシル化の検出に用いることができる。この場合、結合したＶＢＣ複合体の量を時間に対する蛍光により決定する。[^３５Ｓ]−メチオニンで標識されたＶＢＣ複合体を使用することもまた可能である。このために、放射活性標識ＶＢＣ複合体は網状赤血球抽出液中での
試験管内転写−翻訳により調製されうる。

本発明の式（ＩＩ）の化合物はこの試験でＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性をＩＣ_５０値０．４７μM（ＥＧＬＮ２／ＰＨＤ１の平均値）もしくは０．１４μM（ＥＧＬＮ１／ＰＨＤ２の平均値）で阻害する。

１．ｂ）細胞性、機能性試験管内試験：
本発明の化合物の活性を組み換え細胞株を用いて定量化する。細胞は元々ヒト肺がん細胞株由来である（Ａ５４９、ATCC：American Type Culture Collection、Manassas、VA 20108、USA）。試験細胞株を、安定した方法でPhotinus pyralisルシフェラーゼ（以下、ルシフェラーゼとよぶ）のレポーター遺伝子を人工最小プロモーターの制御下で含むベクターで形質転換する。最小プロモーターはＴＡＴＡボックスの上流に２つ低酸素応答エレメントを含む[Oehme F．，Ellinghaus P．，Kolkhof P．，Smith T．J．，Ramakrishnan S．，Hutter J．，Schramm M．，Flamme I．，Biochem．Biophys．Res．Commun．296（2），343−9（2002）]。低酸素（例えば１％酸素存在下で２４時間培養）の影響下または非選択的ジオキシゲナーゼ阻害剤（例えば濃度１００μMのデスフェロキサミン、濃度１００μMの塩化コバルトまたは濃度１mMのＮ−オキサリルグリシンジエチルエステル）の作用下では、試験細胞株はルシフェラーゼを産生し、ルシフェラーゼは適当な生物発光試薬（例えばSteady−Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム、Promega Corporation、Madison、WI 53711、USA）および適当なルミノメーターを用いて検出および定量されうる。

試験方法：試験の前日に細胞を３８４または１，５３６穴マイクロタイタープレート中の、正確に計算された量の培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２mM グルタミン）に播種し、細胞インキュベーター（９６％大気湿度、５％ｖ／ｖ ＣＯ_２、３７℃）で保持する。試験当日は、試験物質を培地中に勾配濃度で添加する。陰性対照となるバッチ中の細胞には試験物質を何も添加しない。細胞の阻害剤への感受性を決定する陽性対照として、例えばデスフェロキサミンを最終濃度１００μMで添加する。試験物質をマイクロタイタープレートのウェルに移してから６〜２４時間後に、生じる光シグナルをルミノメーターで測定する。量／効果の関係を最大半量活性濃度（ＥＣ_５０値とよばれる）を決定する基準となる測定値を用いてプロットする。

本明細書に記載する試験では、本発明の式（ＩＩ）化合物は７μMのＥＣ_５０値をもつ。

１．ｃ）細胞性、機能性試験管内遺伝子発現調節試験：
試験物質処理後のヒト細胞株における特異的なｍＲＮＡの発現調節を調べるため、以下の細胞株を６または２４穴プレートで培養する：ヒト肝細胞腫細胞（ＨＵＨ、JCRB細胞バンク、日本）、ヒト胎性腎線維芽細胞（ＨＥＫ／２９３、ATCC、Manassas、VA 20108、USA）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ATCC、Manassas、VA 20108、USA）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Cambrex、East Rutherford、New Jersey 07073、USA）。試験物質を添加して２４時間後に、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、そこから全ＲＮＡを適当な方法（例えばTrizol（登録商標）試薬、Invitrogen GmbH、76131 Karlsruhe、Germany）を用いて得る。

典型的な分析実験のために、この方法で得た全ＲＮＡを１μgずつＤＮａｓｅＩで消化し、適当な逆転写酵素反応（ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ逆転写システム、Promega Corporation、Madison、WI 53711、USA）を用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に翻訳する。いずれの場合も、この方法で得られたバッチ中のｃＤＮＡの２．５％をポリメラーゼ連鎖反応に用いる。調べる遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シーケンス検出器（Applied Biosystems、Inc．）を用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応によって調べる[TaqMan−PCR；Heid C．A．，Stevens J．，Livak K．J．，Williams P．M．，Genome Res．6（10），986−94（1996）]。この実験で使用するプライマー−プローブの組み合わせはＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ソフトウェア（Applied Biosystems、Inc．）を用いて作る。具体的には、エリスロポエチン、カルボアンヒドラーゼＩＸ、乳酸デヒドロゲナーゼＡおよび血管内皮細胞増殖因子のｍＲＮＡを調べる。

２．心血管系内の作用検出のための生体内試験
２．ａ）遺伝子発現調節の生体内試験：
適当な溶媒に溶解した試験化合物をマウスまたはラットに胃管投与による経口投与、腹腔内投与または静脈内投与のいずれかにより投与する。典型的な用量は体重１kgおよび投与一回あたり０．１、０．５、１、５、１０、２０、５０、１００および３００mgの物質である。対照動物は溶媒のみを受ける。試験物質投与の４、８または２４時間後に、動物をイソフルランの過剰投与およびその後の頸部骨折により屠殺し、調べる器官を取り出す。器官の一部を液体窒素で瞬間凍結させる。器官部分から全ＲＮＡをＢ．１．ａ）に記載されたように得、これをｃＤＮＡに翻訳する。調べる遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シーケンス検出器を用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応により調べる[TaqMan−PCR；Heid C．A．，Stevens J．，Livak K．J．，Williams P．M．，Genome Res．6（10），986−94（1996）]。

本発明の物質は経口または非経口投与後にはプラシーボ対照と比較して腎臓においてエリスロポエチンｍＲＮＡの著しい濃度依存的な増加をもたらす。

２．ｂ）血清中のエリスロポエチンレベルの決定：
適当な溶媒中の試験物質をマウスまたはラットに腹腔内または経口のどちらかで一日に一度または二度投与する。典型的な用量は体重１kgおよび投与一回あたり０．１、０．５、１、５、１０、２０、５０、１００および３００mgの物質である。プラシーボ対照動物は溶媒のみを受ける。投与の前および最後の物質投与の４時間後に動物から短期麻酔下で後眼窩静脈叢または尾静脈から採血する。血液をリチウムヘパリンの添加により非凝固性にする。血漿を遠心分離により得る。血漿中のエリスロポエチンの含有量を製造者の指示にしたがい、エリスロポエチン−ＥＬＩＳＡ（Quantikine（登録商標）マウスＥｐｏイムノアッセイ、R&D Systems、Inc．，Minneapolis、USA）により決定する。測定値をマウスエリスロポエチン用に記録されている基準測定値を用いてpg／mlに変換する。

本発明の物質は経口および非経口投与の後、初期値およびプラシーボ対照と比較して血漿中のエリスロポエチンの著しい濃度依存的な増加をもたらす。

２．ｃ）末梢血の細胞組成の決定：
適当な溶媒中の試験物質をマウスまたはラットに腹腔内もしくは経口のどちらかで一日に一回または二回、数日間投与する。典型的な用量は例えば体重１kgおよび投与一回あたり０．１、０．５、１、５、１０、２０、５０、１００および３００mgの物質である。対照動物は溶媒のみを受ける。試験の最後に、短期麻酔下で動物の眼角の静脈叢または尾静脈から採血し、クエン酸ナトリウムの添加により非凝固にする。血液サンプルにおいて赤血球、白血球および血小板の濃度を適当な電子測定器により決定する。いずれの場合も、網状赤血球の濃度はこの目的に適当な染色液（KABE Labortechnik、Numbrecht）で染色した血液塗抹標本を用いて１０００の赤血球を顕微鏡スクリーニングすることで決定する。ヘマトクリット値の決定のため、ヘマトクリット管を用いて後眼窩静脈叢から採血し、この目的に適した遠心分離機で管の遠心分離を行ったあと、ヘマトクリット値を手動で読み取る。

本発明の物質は経口および非経口投与ののち、初期値およびプラシーボ対照と比較して、ヘマトクリット、赤血球数および網状赤血球の著しい濃度依存的な増加をもたらす。

Ｃ．医薬組成物の実施例
本発明の化合物は以下のように医薬製剤に変換されうる：
錠剤：
組成：
本発明の化合物１００mg、ラクトース（一水和物）５０mg、トウモロコシデンプン（天然）５０mg、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ２５）（BASF、Ludwigshafen、Germany）１０mgおよびステアリン酸マグネシウム２mg。
錠剤重量２１２mg、直径８mm、曲率半径１２mm。

製剤：
本発明の化合物、ラクトースおよびデンプンの混合物を５％濃度（ｗ／ｗ）のＰＶＰ水溶液で造粒する。乾燥後、顆粒をステアリン酸マグネシウムと５分間混合する。この混合物を慣用の打錠機で打錠する（錠剤の型については上記参照のこと）。打錠に推奨される値として、１５kNの押圧を使用する。

経口投与用懸濁液：
組成：
本発明の化合物１０００mg、エタノール（９６％）１０００mg、Rhodigel（登録商標）（FMC提供のキサンタンガム、Pennsylvania、USA）４００mgおよび水９９g。
経口用懸濁液１０mlは本発明の化合物の個々の用量１００mgに相当する。
製剤：
Rhodigelをエタノールに懸濁し、本発明の化合物を該懸濁液に添加する。撹拌しながら水を加える。混合物をRhodigelの膨張が終わるまで約６時間撹拌する。

経口投与用溶液：
組成：
本発明の化合物５００mg、ポリソルベート２．５gおよびポリエチレングリコール４００（９７g）。経口溶液２０gは本発明の化合物の個々の用量１００mgに相当する。
製剤：
本発明の化合物を、ポリエチレングリコールとポリソルベートの混合物に撹拌しながら懸濁する。撹拌操作を本発明の化合物の溶解が完了するまで続ける。

静脈注射用溶液：
本発明の化合物を生理学的に許容される溶媒（例えば等張食塩水、グルコース溶液５％および／またはＰＥＧ ４００溶液 ３０％）に飽和溶解度より低い濃度で溶解する。溶液を滅菌濾過し、無菌でパイロジェンを含まない注射容器に移す。

Claims (11)

1. 式（ＩＩ）の化合物
   

   

   に相当する、１−[６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４−イル]−４−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール＝ナトリウム塩。
2. 式（ＩＩ）の化合物が結晶形で存在することを特徴とする、請求項１の式（ＩＩ）の化合物。
3. 請求項１の式（ＩＩ）の化合物の製造方法であって、式（Ｉ）の化合物
   

   

   を溶媒中で水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液またはナトリウム塩と、適当であれば塩基を添加して反応させることを特徴とする製造方法。
4. 式（Ｉ）の化合物を溶媒中で水酸化ナトリウム水溶液と、適当であれば塩基を添加して反応させることを特徴とする請求項３の式（ＩＩ）化合物の製造方法。
5. 式（Ｉ）の化合物を溶媒中でトリエチルアミンを添加して水酸化ナトリウム水溶液と反応させることを特徴とする、請求項３の式（ＩＩ）化合物の製造方法。
6. 疾患の処置および／または予防のための請求項１または２に記載の化合物。
7. 疾患の処置および／または予防のための医薬を製剤するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
8. 心血管疾患、心不全、貧血、慢性腎疾患および腎不全を処置および／または予防するための医薬の調製のための請求項１または２に記載の化合物の使用。
9. 請求項１または２に記載の化合物を不活性で、無毒の薬学的に適切な補助剤と組み合わせて含む医薬。
10. 請求項１または２に記載の化合物をさらなる有効化合物と組み合わせて含む医薬。
11. 心血管疾患、心不全、貧血、慢性腎疾患および腎不全の処置および／または予防のための請求項９または１０に記載の医薬。

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