JP6281887B2 - ハロモナス菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ハロモナス菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。

近年、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が課題となっている。

３−ヒドロキシ酪酸（以下、本明細書において３−ＨＢと呼ぶことがある。）は、人間では肝臓でアセチルＣｏＡから作られ、血中グルコース濃度が少ない時に脳のエネルギー源として使われること、また、腸内細菌の血中への転移を抑制することから、輸液、目薬等として、また、生分解性プラスチックの原料としての利用が検討されている（特許文献１、２）。

３−ヒドロキシ酪酸の製造方法として、斯かる化合物がポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、本明細書においてＰＨＢと呼ぶことがある。）のモノマーであることから、例えばＰＨＢを各種菌体で製造した後、別途調整したリパーゼ等でＰＨＢを分解し、そのモノマーである３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（特許文献３）、突然変異体を用い、８．７ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献１）、遺伝子組換え手法を用い１２ｇ／Ｌの収量にて３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献２）等が知られている。

本発明者らは、微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討する中で、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一の混入する菌として生育することを認めた。当該好塩菌そのものは、通常はｐＨ５〜１２程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等の混入が極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のＰＨＢを蓄積していること明らかにした（特許文献４）。

その後、検討を進める中で、ハロモナス属に属する好塩菌が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、微好気条件に移行するとことでＰＨＢのモノマーである３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌産生することを見いだした。（特許文献５）

３−ヒドロキシ酪酸は、母乳に著量含まれていることが知られており、低グルコース濃度となった場合に脂肪酸などから誘導されることが知られている。そして、３−ヒドロキシ酪酸の代謝速度は比較的早いことが知られており、３−ヒドロキシ酪酸のメチルエステルは、健康食品等、中でもアスリートに適したサプリメントとして有用であると期待されている。

このように、３−ヒドロキシ酪酸は、そのままでも又は上述のようなエステル体として、他にもこれを構成ユニットとするポリマーとしても非常に有用な化学品原料である。

特開平７−６１９２４号公報 特開２００５−３０６８１５号広報 特開２０１０−１６８５９５号公報 国際公開第２００９／０４１５３１号パンフレット 特開２０１３−０８１４０３

Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０２，Ｉｓｓｕｅ １２，Ｊｕｎｅ ２０１１，Ｐａｇｅｓ ６７６６−６７６８ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｕ．Ｕｇｗｕ，Ｙｕｔａｋａ Ｔｏｋｉｗａ ａｎｄ Ｔｏｓｈｉｏ Ｉｃｈｉｂａ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）７６：８１１−８１８ Ｑｉａｎ Ｌｉｕ，Ｓｈａｏ−Ｐｉｎｇ Ｏｕｙａｎｇ，Ａｈｌｅｕｍ Ｃｈｕｎｇ，Ｑｉｏｎｇ Ｗｕ ａｎｄ Ｇｕｏ−Ｑｉａｎｇ Ｃｈｅｎ Ｍｏｎｔｅｉｌ−Ｒｉｖｅｒａ Ｆら．２００７ Ｊｕｎ ２２；１１５４（１−２）：３４−４１ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ

培養条件を好気条件から微好気条件に変更することを特徴とする発明が開示される特許文献５では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法が開示され、１５％グルコースを含む培地を使用した際に２０ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌産生させた実施例が示されている。

斯かる方法によると、培養液から３−ヒドロキシ酪酸を簡便に回収できる利点を有するものの、２０ｇ／Ｌ程度の産生量では工業的に十分な製造方法が提供さるとは言い難い。

従って、菌体内に蓄積したＰＨＢのより多くを分解させ、更に高効率に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液中に分泌産生させることが求められる。

以上、本発明はハロモナス属に属する好塩菌を用いて３−ヒドロキシ酪酸及びその塩を製造する方法であって、該菌体内に蓄積されたＰＨＢを分解し、３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に高効率に分泌産生させ、培養液から３−ヒドロキシ酪酸を回収する手段を導き出す事を目的とする。

本発明者は、上述のような背景のもとで鋭意研究を進めた結果、ハロモナス属に属する好塩菌体内にＰＨＢを著量蓄積させる段階において、培地中に有機炭素源に加えて、窒素、金属塩、ホウ酸塩等を添加して好気培養を行い、その後、培養条件を微好気条件に変更し、菌体内でＰＨＢが著量蓄積したＰＨＢを分解し、３−ヒドロキシ酪酸を菌体外の培養液中に分泌産生させることによって、菌体内に蓄積されたＰＨＢが分解し、３−ヒドロキシ酪酸が培養液中に著量分泌されることを見いだした。

また、特定の窒素源を用いることによって３−ヒドロキシ酪酸の生産量を向上させ得ることを見出した。

更に、微好気培養前に、窒素源、金属塩、ホウ酸塩等を添加すること、培養液の容量を減少させること、及びｐＨを特定の範囲に調整及び／又は維持するで、より高濃度に３−ヒドロキシ酪酸を分泌生産させ得ることも見いだした。

本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。

〔項１〕下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。

〔項２〕無機塩に、尿素が含有される、上記項１に記載の製造方法
〔項３〕工程２における培養条件を好気培養から微好気培養に変更する時期が、菌体中のＰＨＢ蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部以上となる時期である、上記項１又は項２に記載の製造方法。

〔項４〕工程２の前に、培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程を含む、上記項１〜項３の何れか１項に記載の製造方法。

〔項５〕窒素源が、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、及び尿素からなる群より選択される少なくとも１つである、上記項４に記載の製造方法。

〔項６〕金属塩が、亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩からなる群より選択される少なくとも１つである、上記項４又は項５に記載の製造方法。

〔項７〕培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期が、菌体中のＰＨＢ蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部以上となる時期である、上記項４〜項６の何れか１項に記載の製造方法。

〔項８〕工程２の前に、培養液の容量を減少させる工程を含む、上記項１〜項７の何れか１項に記載の製造方法。

〔項９〕工程２の後に、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持する工程を含む、上記項１〜項８の何れか１項に記載の製造方法。

〔項１０〕培養液のｐＨを７．５以上に調整及び／又は維持する、上記項９に記載の製造方法。

〔項１１〕培養液のｐＨの調整及び／又は維持を、水酸化物、炭酸塩、及び炭酸水素塩からなる群より選択される少なくとも１種を用いて行う、上記項９又は項１０に記載の製造方法。

〔項１２〕前記好塩菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、上記項１〜項１１の何れか１項に記載の製造方法。

本発明に係る製造方法は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を、培地中に著量産生することができる。

本発明に係る製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養する工程が含まれるが、斯かる好塩菌の培養は、他の細菌の混入が起こりにくい環境で培養することが可能であり、非滅菌培地及び／又は非滅菌環境下での培養が可能である、更に、供気条件の変更も容易であることから優れた製造方法である。

本発明に係る製造方法にて用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液、生ごみ等の発酵で得られる有機酸等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。

本発明に係る製造方法では、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液中に生産させることが可能である。よって、培養液中から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む画分を簡便に回収することが可能であり、精製工程を行ったとしても、簡易な精製方法が適用できるため、優れた製造方法である。

この点に関して、本発明に係る製造方法では、ハロモナス属に属する好塩菌体の溶菌を伴わない条件にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩をその培養液中から回収することができるので、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を精製する際に、溶菌に伴う核酸、タンパク質、糖質、脂質等といった夾雑分子を除去するための精製工程が非常に簡便になるといった効果を有する。

特に、本発明に係る方法によると、３−ヒドロキシ酪酸を回収する際の培養液がアルカリ性になっており、３−ヒドロキシ酪酸が塩を形成しにくい環境であるため、３−ヒドロキシ酪酸の回収に有効である。

本発明に係る製造方法によって得られる３−ヒドロキシ酪酸又はその塩は、医療用の輸液等に添加したり、そのまま重合してプラスチックとするだけでなく、化粧品、医薬品、機能性食品、光学活性を持った素材、化成品原料等として有用である。

実施例の製造例１に示す方法によって得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース及び培養開始から２４時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに培養開始から２４時間後及び３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の◇（白ダイヤモンド）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、ＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース及び培養開始から２４時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに培養開始から２４時間後及び３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の◇（白ダイヤモンド）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、菌体量（縦軸：ＯＤ_６００と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース及び培養開始から２４時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに培養開始から２４時間後及び３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の◇（白ダイヤモンド）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、菌体中に蓄積されたＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（％）：ＰＨＢ（ｇ）／菌体乾燥重量（ｇ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース及び培養開始から２４時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに培養開始から２４時間後及び３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の◇（白ダイヤモンド）は、ＳＯＴ改５培地に２０％グルコース並びに養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。 実施例の製造例２に示す方法によって得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコースグルコース並びに培養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコース、培養開始から２４時間後及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウム、並びに培養開始から３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウム及び金属塩含有添加物を添加した際の結果を示す。 実施例の製造例２に示す方法によって得られた、ＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコースグルコース並びに培養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコース、培養開始から２４時間後及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウム、並びに培養開始から３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウム及び金属塩含有添加物を添加した際の結果を示す。 実施例の製造例２に示す方法によって得られた、菌体量（縦軸：ＯＤ_６００と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコースグルコース並びに培養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコース、培養開始から２４時間後及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウム、並びに培養開始から３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウム及び金属塩含有添加物を添加した際の結果を示す。 実施例の製造例２に示す方法によって得られた、菌体中に蓄積されたＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（％）：ＰＨＢ（ｇ）／菌体乾燥重量（ｇ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコースグルコース並びに培養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地に合計２５％グルコース、培養開始から２４時間後及び４８時間後に窒素源である硝酸ナトリウム、並びに培養開始から３６時間後に窒素源である硝酸ナトリウム及び金属塩含有添加物を添加した際の結果を示す。 実施例の製造例３に示すＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加し、１Ｌスケールのファーメンターを用いて、好気的な培養の後、６０時間目に微好気条件に変更し、水酸化ナトリウム若しくは炭酸ナトリウムでｐＨ調整を行った場合、及びコントロールとしてｐＨ調整を行わなかった場合によって得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、微好気培養時に、ｐＨ調整を行わなかった場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、微好気培養時に、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、微好気培養時に、炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。 実施例の製造例３に示す方法によって得られた、ＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、微好気培養時に、ｐＨ調整を行わなかった場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、微好気培養時に、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、微好気培養時に、炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、菌体量（縦軸：ＯＤ_６００と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、微好気培養時に、ｐＨ調整を行わなかった場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、微好気培養時に、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、微好気培養時に、炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、菌体中に蓄積されたＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（％）：ＰＨＢ（ｇ）／菌体乾燥重量（ｇ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、微好気培養時に、ｐＨ調整を行わなかった場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、微好気培養時に、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、微好気培養時に、炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した場合の結果を示す。 実施例の製造例４に示すＳＯＴ改５培地に２０％グルコースを添加し、１Ｌスケールのファーメンターを用いて、好気的な培養６０時間の後、遠心分離処理により、培養液を１／２容量、１／４容量、比較として１／１容量に濃縮し、微好気条件に変更し、炭酸ナトリウムでｐＨ調整を行った場合によって得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、比較として、１／１容量、そのまま、微好気培養に移行した場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、１／２容量に濃縮し、微好気培養に移行した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、１／４容量に濃縮し、微好気培養に移行した場合の結果を示す。 実施例の製造例４に示す方法によって得られた、ＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、比較として、１／１容量、そのまま、微好気培養に移行した場合の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、１／２容量に濃縮し、微好気培養に移行した場合の結果を示す。グラフ中の■（黒四角）は、１／４容量に濃縮し、微好気培養に移行した場合の結果を示す。 実施例の製造例５に示す、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に１２％グルコースを添加し、それぞれ異なる濃度の窒素源を添加して培養して得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１２．５ｇ／Ｌ硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１５．０ｇ／Ｌ硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の○（白丸）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、８．７５ｇ／Ｌ尿素を添加した際の結果を示す。グラフ中の△（白三角）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１０．５ｇ／Ｌ尿素を添加した際の結果を示す。 実施例の製造例５に示す、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に１２％グルコースを添加し、それぞれ異なる濃度の窒素源を添加して培養して得られた、菌体中に蓄積されたＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／菌体乾燥重量（ｇ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。グラフ中の●（黒丸）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１２．５ｇ／Ｌ硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。グラフ中の▲（黒三角）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１５．０ｇ／Ｌ硝酸ナトリウムを添加した際の結果を示す。 グラフ中の○（白丸）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、８．７５ｇ／Ｌ尿素を添加した際の結果を示す。グラフ中の△（白三角）は、ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）に、１０．５ｇ／Ｌ尿素を添加した際の結果を示す。

本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法は、下記の工程（１）〜（３）を含む（本明細書においてこれを第１の態様と呼ぶことがある）。

（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。

本発明に係る製造方法によって製造される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩とは、生体内にて通常の光学活性を持った化合物であり、Ｄ体である。

また、３−ヒドロキシ酪酸の塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオン及び／又は菌体内に存在する陽イオンによって形成される塩であり、特に限定はされないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、アンモニウム塩、リチウム塩、銀塩、水銀塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、ニッケル塩、スズ塩、鉛塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられる。

工程１について
本発明に係る製造方法の工程１は、ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程である。

＜Ａ：好塩菌＞
本発明に係る製造方法の工程１にて用いる好塩菌は、下記の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
（ｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ｉｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、微好気条件下で３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培養液に分泌産生することを特徴とする好塩菌。

なお、「無機塩」及び「有機炭素源」については、＜培地＞の欄にて後述するが、無機塩には尿素が含まれていることが好ましい。また、「微好気条件」については、下記工程２の＜培養方法＞の欄にて詳述する。

このようなハロモナス属に属する好塩菌は、酸化的代謝も嫌気的代謝も使い分けることができ、遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向となる、所謂、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。

上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。

上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ４７７０１５として登録されている。

また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ７００５９７）等も挙げることができる。

さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。

なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＨＢの発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＢの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液にて生産する機能を増大させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生量を増大させる遺伝子；ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。

＜Ｂ：培地＞
工程１にて用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８〜１２の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された３−ヒドロキシ酪酸がクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。

工程１にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。

例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３等を用いればよい。

これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。

窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、尿素等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、尿素等の化合物を用いればよい。これらの中でも尿素が特に好ましい。

以上、工程１にて用いる培地に含有される無機塩には、尿素が含まれることが好ましい。

窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。

なお、窒素源として尿素を用いる場合には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり、２００ｍｇ以上とすればよいが、より好ましくは４００〜７００ｍｇ程度とすることにより、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩をより高効率に産生させることも可能である。

リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＫ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４等の化合物を用いればよい。

リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。

これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。

工程１にて用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えばトリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。

本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。従って、上述の培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくともよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。

＜Ｃ：培養方法＞
工程１における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程１における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされない。

具体的には、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。

本培養は通常２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜３７℃程度で行うことが好ましい。この際の攪拌速度は通常は１５０〜２５０ｒｐｍ程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培養液表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る気体を吹き込む方法を採用してもよい。

工程１では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以上とすればよく、５ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。

工程１での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮して長期の連続培養も可能である。そして、培養環境も特に限定はされず、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。

工程２について
本発明に係る製造方法の工程２は、工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程である。

工程２において、培養条件を微好気条件に変更する際には、工程１にて培養したハロモナス属に属する好塩菌を回収し、これを新たな培地に変更して、且つ微好気条件下で培養してもよく、培地を変更せずにそのまま培養条件を微好気条件に変更しても、工程１にて得られた培養液に新たな培地を追加して、培養してもよい。

工程１の好気培養を終了し、工程２の微好気培養に培養条件を変更する時期は、工程１及び工程２にて得られるハロモナス属に属する好塩菌体内に蓄積されるＰＨＢの量が最大となる時期が好ましい。

ここで、最大となる時期とは必ずしも一点の時期に限定されることは無く、具体的には、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の蓄積量が、培養液１Ｌ当たり３０ｇ程度以上となる時期、菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部程度以上となる時期等を目安にすることができる。

具体的なハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量は、下記の実施例に示す方法を採用して測定する。

＜Ｄ：培養方法＞
工程２における微好気培養とは、培地中又は培養環境を完全に嫌気条件下にするのではなく、積極的に酸素の通気を行わない方法で培養することである。

このような微好気条件での培養方法は、特に限定はされないが、例えば培地表面が空気に触れる状態で、攪拌速度を１００ｒｐｍ以下、望ましくは５０ｒｐｍ以下にて培養する方法が挙げられる。なお、撹拌を完全に止めてしまうと、速やかに消費されている溶存酸素の供給を停止することから、工程３において好ましくない。

微好気培養時の、培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以下とすればよい。ここで、培養液中に溶存する酸素が全く存在せず、酸素供給も行われない条件とすれば、ハロモナス属に属する好塩菌がすみやかに溶菌するので、工程３において好ましくない。

工程２において、工程１によって得られるＰＨＢを菌体内に著量蓄積したハロモナス属に属する好塩菌を微好気培養することによって、当該好塩菌は死滅すること無く培養することができる。

なお、当該好塩菌の死滅を確認するには、当該菌体の死滅に基づく菌体から培養液に溶出するＤＮＡの有無を判断すればよく、例えば、当該好塩菌の培養液上清を分光光度計で測定することにより、ＤＮＡに基づく２６０ｎｍ付近に吸光の顕著なピークが存在しないことによって確認すればよい。

即ち、工程２では上述のような培養液中におけるＤＮＡ量となるような条件にてハロモナス属に属する好塩菌を培養すればよく、このような培養液中におけるＤＮＡ量となる培養条件を、本発明における微好気条件を満たすことの、ひとつの目安とすることができる。

工程２における培養時間は、培地に用いる無機塩、有機炭素源等の使用条件等により異なるが、後述するような所望の量の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が回収できるのに十分な時間の培養時間とすればよく、特に限定はされないが、上述のように微好気培養に変更した後に、培養液中に放出されるハロモナス属に属する好塩菌の溶菌に伴う核酸、タンパク質等を除去する精製工程を簡便にすること、すなわち、培養液中のＤＮＡ濃度や、当該培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の濃度等に鑑みて、適宜決定すればよい。

なお、工程２にて培養条件を微好気環境とすることによって培養液のｐＨは通常は８．７程度から７．５程度にまで変化し、更にｐＨは下がる傾向となる。

「培養液中に３−ヒドロキシ酪酸を生産させる」とは、前途の工程までに培養して得られるハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培養液中に３−ヒドロキシ酪酸を分泌させることを意味し、本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における最終工程（回収工程）の前に設けられる過程である。

工程３について
本発明に係る製造方法の工程３は、工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程である。

ここで、回収とは工程２で得られる培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在している時に上述の工程３の培養を停止し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む培養液と、上記好塩菌体を分離すればよい。

具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記工程１〜３によって得られるハロモナス属に属する好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離手段を用いて培養液と前記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。

培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれたまま培養をし続けて、特に培養条件が好気的になればなるほど、ハロモナス属に属する好塩菌体から
培養液中に分泌された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用される傾向となり、培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が減少し、最終的には培養液からこれらが消失してしまう。

従って、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、培養液１Ｌ当たり４０ｇ以上存在しているときに、上記培養を停止することが好ましい。すなわち本発明の方法によると、上記培養液中に、培養液１Ｌ当たり２０ｇ程度以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させることができる。

培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培養液を採取し、これをキャピラリー電気泳動等の分析方法を供して、培養を停止する時間を決定することもできる。

また、３−ヒドロキシ酪酸は酸性を示す化合物であることから、培養液のｐＨを継時的にモニタリングしながら、培養の際の培地のｐＨの低下を基準にして、３−ヒドロキシ酪酸の存在を確認してもよい。

なお、回収される３−ヒドロキシ酪酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属；アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３−ヒドロキシ酪酸を製造するには、回収した培養液を塩析等の常法に供すればよい。

また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。また、回収した培養液に低級アルコール類を添加し、エステル化反応を経て、３−ヒドロキシ酪酸エステルとして蒸留等で精製することも可能である。

〔第二の態様〕
本発明に係る３−ヒロドキシ酪酸又はその塩の製造方法には、上記の第１の態様に対して、培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程を含む第二の態様も包含する。

このような態様として、例えば、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む製造方法が挙げられる。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａの培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ、
（Ｃ）工程Ｂの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｃ、及び
（Ｄ）工程Ｃで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程Ｄ。

工程Ａは上記の第１の態様における工程１と同様とすることができ、工程Ｃは上記の第１の態様における工程２と同様とすることができ、そして工程Ｄは上記第１の態様における工程３と同様とすることができる。

培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程（工程Ｂ）について、窒素源のみを添加してもよいし、更に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加してもよい。窒素源並びに金属塩及び／又はホウ酸塩の添加時期は、同一であっても異なっていてもよく、特に限定はされないが、異なる場合は窒素源の添加の後に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加することが好ましい。

なお、金属塩及びホウ酸塩を添加する際の添加時期は、同一であっても、異なっていてもよく、特に限定はされない。

窒素源は、上記工程１において詳述した通りとすればよい。

金属塩は、特に限定はされないが、例えば亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩等が挙げられる。これらの金属塩は適宜組み合わせて添加すればよく、特に限定はされないが、少なくともモリブデン塩を含む組み合わせとすることが好ましい。

具体的にはモリブデン塩、亜鉛塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩を含む金属塩；モリブデン塩、銅塩を含む金属塩；モリブデン塩、亜鉛塩を含む金属塩；モリブデン塩、マンガン塩を含む金属塩；モリブデン塩、コバルト塩を含む金属塩等の組み合わせが挙げられる。

ホウ酸塩は、特に限定はされないが例えばホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）、メタホウ酸（ＨＢＯ_２）_ｎ、過ホウ酸（ＨＢＯ_３）、次ホウ酸（Ｈ_４Ｂ_２Ｏ_４）、ボロン酸（Ｈ_３ＢＯ_２）、ボリン酸（Ｈ_３ＢＯ）等が挙げられる。

工程３における、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は、特に限定はされないが、例えば培養液のＯＤ６００の値が５０以上となる時期にすればよい。ＯＤ６００の測定方法は、市販の分光光度計を用いて測定する。

窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は、特に限定はされないが、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部以上となる時期、培養液１Ｌ当たり２５ｇ以上となる時期等が挙げられる。

具体的なハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量は、下記の実施例に示す方法を採用して測定する。

窒素源の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して、硝酸ナトリウムとして０．１〜０．５重量部程度とすればよい。

金属塩の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．０２〜０．２５０重量部程度とすればよい。

ホウ酸塩の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．１４３〜０．２８６重量部程度とすればよい。

なお、上記金属塩及びホウ酸塩の添加量の合計は、１００重量部の培地に対して通常は０．０２〜０．２８６重量部程度とすればよい。

窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される、少なくとも１つを添加する回数は、特に限定はされないが、通常は１〜５回程度とすればよい。複数回添加する場合、上述の培養条件下であれば、３〜２４時間の間隔を空ければよい。

窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加した後、引き続いて行う工程（例えば、上記工程Ｃ）までの所定の時間は、上記工程１に示す培養条件と同様の培養条件にて培養を行えばよい。

〔第三の態様〕
本発明に係る３−ヒロドキシ酪酸又はその塩の製造方法には、上記の第１の態様に対して、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持する工程を含む第三の態様も包含する。

このような態様として、例えば、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む製造方法が挙げられる。
（ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程ａ、
（ｂ）工程ａの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更する工程ｂ、
（ｃ）工程ｂの後、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程ｃ、及び
（ｄ）工程ｃで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程ｄ。

上記ａは上記の第１の態様における工程１と同様とすることができ、上記工程ｂは上記の第１の態様における工程２と同様とすることができ、そして上記工程ｄは上記の第１の態様における工程３と同様とすることができる。

上記工程２にて説明したように、培養条件を好機培養から微好気培養に変更することによって、培地のｐＨは下がる傾向となる。この様な培養液のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置又はこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。

培養液のｐＨ７．０以上に調整及び／又は維持する工程（工程ｃ）について、用語「調整及び維持」とは、上述のようなｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨを特定の範囲に保つことを意味する。

工程ｃにて調整及び維持するｐＨは好ましくは７．５以上、より好ましくは８．０以上、さらに好ましくは８．５以上である。特にｐＨが８．５〜９．４程度であればハロモナス属に属する好塩菌体中に蓄積されたＰＨＢのうちの９０％程度以上が分解して、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸が著量分泌されることが期待される。

ハロモナス属に属する好塩菌は、通常は中程度の高塩濃度且つアルカリ条件下で培養することが可能であるため、夾雑菌の混入・繁殖（コンタミネーション）が少ない。しかしながら、一部乳酸菌には、中程度の高塩濃度且つｐＨ８．４以下の環境下において増殖可能な菌も存在し、このような菌が本発明の培養系にコンタミネーションすると、ハロモナス属に属する好塩菌が分泌した３ーヒドロキシ酪酸又はその塩を乳酸発酵の基質として消費してしまい、更には培養液のｐＨの一段の低下を生じさせる恐れがある。

このため、培地を滅菌せず及び／又は非滅菌環境下でハロモナス属に属する好塩菌を培養して、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造するためには、工程ｃにおける培地のｐＨの調整及び維持をｐＨ８．５程度以上とすることが好ましい。

ｐＨ調整剤としては、特に限定はされないが、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が挙げられる。より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素マグネシウム等が挙げられ、中でも弱アルカリ性を示すものが好ましく、炭酸水素ナトリウムが最も好ましい。

なお、第三の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

〔第四の態様〕
なお、本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法には、上述の第二の態様に対しても、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持する工程が含まれていてもよく、例えば、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む製造方法が挙げられる（本明細書においてこれを第四の態様とする。）。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａの培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ、
（Ｃ）工程Ｂの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養する工程Ｃ、
（Ｄ）培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｄ及び
（Ｅ）工程Ｄで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程Ｅ。

第四の態様における工程Ｄは上記第三の態様における工程における工程ｃと同様とすることができ、工程Ｅは上記第三の態様における工程ｄと同様とすることができる。

なお、第四の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

また、第四の態様の発明であれば、通常は培地１Ｌあたり、４０ｇ程度以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を得ることができる。

〔第五の態様〕
本発明に係る３−ヒロドキシ酪酸の製造方法には、上記の第一の態様に対して、培養液の培養液の容量を減少させる工程を含む第五の態様も包含する。

このような態様として、例えば、以下の工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含む製造方法が挙げられる。
（Ｉ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ｉ、
（ＩＩ）工程Ｉで得られる培養液の培養液の容量を減少させる工程ＩＩ、
（ＩＩＩ）工程ＩＩの培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程ＩＩＩ、及び
（ＩＶ）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程ＩＶ。

上記Ｉは上記の第一の態様における工程１と同様とすることができ、上記工程ＩＩＩは上記の第一の態様における工程２と同様とすることができ、そして上記工程ＩＶは上記の第一の態様における工程３と同様とすることができる。

培養液の培養液の容量を減少させる工程（工程ＩＩ）とは、具体的には、上記工程Ｉの培養物を、培養液（液体画分）と培養されたハロモナス属に属する好塩菌体（固体画分）を分離し、一部の液体画分を除去してから固体画分を再懸濁し、その後培養を再開する手段が挙げられる。

その他の手段としては、固体画分を分離した後に、上記工程Ｉにて用いる培地を新たに調製した、上記液体画分の容量よりも少ない量の培地を用いて、分離した固体画分を再懸濁し、その後培養を再開すればよい。

培養液と培養されたハロモナス属に属する好塩菌体を分離する手段は、特に限定はされないが、例えば遠心分離、濾過、静置等の固液分離手段を採用すればよい。

なお、第五の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

〔第六の態様〕
なお、上述の第二の態様に対しても、培養液の培養液の容量を減少させる工程を含んでいてもよく、例えば、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む製造方法が挙げられる（本明細書においてこれを第六の態様とする。）。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａの培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ
（Ｃ）工程Ｂで得られる培養液の培養液の容量を減少させる工程Ｃ、
（Ｄ）工程Ｃの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｄ、及び
（Ｅ）工程Ｄで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程Ｅ。

なお、第六の態様における工程Ｃは上記第五の態様における工程ＩＩＩと同様とすることができ、工程Ｄは上記第二の態様における工程Ｃと同様とすることができ、そして工程Ｅは上記第二の態様における工程Ｄと同様とすることができる。

第六の態様における工程Ｃにおいて、具体的に培養液の容量を減少する手段として、上記第五の態様における工程ＩＩＩで説明したように、固体画分を分離した後に、第六の態様における工程Ａにて用いる培地に第六の態様における工程Ｂにて添加する窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つが含有されるように新たに調製した、液体画分の容量よりも少ない量の培地を用いて、分離した固体画分を再懸濁し、その後培養を再開すればよい。

なお、第六の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

〔第七の態様〕
また、上述の第三の態様に対しても、培養液の培養液の容量を減少させる工程を含んでいてもよく、例えば、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を含む製造方法が挙げられる（本明細書においてこれを第７の態様とする。）。
（ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程ａ、
（ｂ）培養液の容量を減少させる工程ｂ
（ｃ）工程ｂの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更する工程ｃ、
（ｄ）工程ｃの後、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程ｄ
（ｅ）工程ｄで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程ｅ。

なお、第七の工程における工程ｂは上記の第五の態様における工程ＩＩと同様とすることができ、工程ｃは上記の第三の態様における工程ｂと同様とすることができ、工程ｄは上記の第三の態様における工程ｃと同様とすることができ、そして工程ｅは上記の第三の態様における工程ｄと同様とすることができる。

また、第七の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

〔第八の態様〕
さらに、上述の第四の態様に対しても、培養液の培養液の容量を減少させる工程を含んでいてもよく、例えば、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む製造方法が挙げられる（本明細書においてこれを第八の態様とする。）。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａの培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ、
（Ｃ）培養液の容量を減少させる工程Ｃ
（Ｄ）工程Ｃの後、培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養する工程Ｄ、
（Ｅ）工程Ｄの後、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｅ及び
（Ｆ）工程Ｅで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程Ｆ。

なお、第八の工程における工程Ｃは上記の第五の態様における工程ＩＩと同様とすることができ、工程Ｄは上記の第四の態様における工程Ｃと同様とすることができ、工程Ｅは上記の第四の態様における工程Ｄと同様とすることができ、そして工程Ｆは上記の第四の態様における工程Ｅと同様とすることができる。

培養液の容量を減少させる程度は、特に限定はされないが、例えば培養液中における培養されたハロモナス属に属する好塩菌体の濃度が、培養液の容量を減少させる前と比較して２倍程度となるようにすれば、得られる３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の収量がおおよそ１００ｇ／Ｌを超えることが期待される。また、４倍となるようにすれば、収量が２５０ｇ／Ｌを超えることが期待される。

なお、第八の態様の発明であっても、培地に含有させる窒素源として尿素を用いることが好ましい。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。

本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造する方法について具体的に詳述する。

表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ_３及びＮａ_２ＣＯ_３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ_３を５倍に、リン源のＫ_２ＨＰＯ_４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。

培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源として、それぞれ培地中での終濃度が２０％もしくは２５％となるグルコースを使用した。

＜３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定＞
本実施例における培養液にて生産される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定は、非特許文献３に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用した以下の方法にて行った。

培養液を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ％のＨ_２ＳＯ_４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱し、３−ヒドロキシ酪酸またはその塩をすべて３−ヒドロキシ酪酸メチルに変換した。

その後、室温まで冷却し、次いでクロロホルム０．５０ｍｌ及び蒸留水０．２５ｍｌを加えて激しく攪拌した後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取した。そして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中の３−ヒドロキシ酪酸の量を測定した。

一方で、３−ヒドロキシ酪酸の標品を上清乾燥物と同様の処理等を行い、これを基準として培地１Ｌ当たりの３−ヒドロキシ酪酸蓄積率（３−ヒドロキシ酪酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。また、「Ｆ−キット Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸」（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）のキットでは、Ｄ体のみが検出される。このキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分泌された３−ヒドロキシ酪酸はほぼＤ体であることが確認された。

＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
本実施例における菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量の測定は、非特許文献１に記載の手法を適宜採用した以下に示す方法で行った。

上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１〜３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ_２ＳＯ_４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で３時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、０．５０ｍｌのクロロホルム及び０．２５ｍｌの蒸留水を加えて激しく攪拌した。

その後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取した。そして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中のＰＨＢの量を測定した。

一方で、ＰＨＢの標品を乾燥菌体と同様の処理等を行い、これを基準として乾燥菌体当たりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。

＜ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養＞
ハロモナス属に属する好塩菌（ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地に炭素源として上述のグルコースではなく、１ｗ／ｖ％グルコースを加えて、３７℃で１晩振盪培養した。

＜ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等＞
製造例１
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌずつ回収して、上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の量を測定した。

有機炭素源は２０重量％のグルコースとなるように培地に添加した。

培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、６０時間目に撹拌速度を５０ｒｐｍと、微好気条件に変更した。培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。

さらに、窒素源として、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを添加し、培養開始から２４時間目に２．５ｇ／Ｌを加えたもの、２４時間目、３６時間目それぞれに、２．５ｇ／Ｌ、２４時間目、３６時間目、４８時間目それぞれに、２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウム加えたもの、加えなかったものを比較した。結果を図１〜４に示す。

図１に示す結果から、硝酸ナトリウムの添加を行わず、単に６０時間目に好気条件から微好気条件に移動した場合には、３−ヒドロキシ酪酸の分泌が見られなかった。

一方で、２４時間目に硝酸ナトリウムを加えた場合、７２時間目に培養上清中に３−ヒドロキシ酪酸の分泌が見られた。そして、２４時間目及び３６時間目に窒素源を添加した場合、並びに２４時間目、３６時間目、及び４８時間目において硝酸ナトリウムの添加を行った場合は更に多くの３−ヒドロキシ酪酸の分泌が見られた。

以上の結果から、単に培養条件を好気培養から微好気培養に条件を変更するだけでは培養上清中に十分な３−ヒドロキシ酪酸を産生させることはできず、好気培養中の適当な時期に硝酸ナトリウム等の適当な窒素源を添加する必要があることが明らかとなった。

製造例２
上述の製造例１におけるグルコースの量として、培養開始時に培養開始時に２０％重量分を培地に添加し、更に培養開始から２４時間目に更に５重量％分を追加した。

また、窒素源である硝酸ナトリウムの添加（添加量：２．５ｇ／Ｌ）を培養開始から２４時間後、３６時間後、及び４８時間目とした。

さらに、３６時間目に、金属塩としてＡ５＋Ｃｏ溶液を、上記表１に示す量の１／１００量を加えた場合と、これを加えなかった場合とで比較した。他の条件は、上述の製造例１と同様である。結果を図５〜８に示す。

図５に示す結果から、グルコースの総量を２５重量％とした場合であっても、これを２０重量％とした製造例１と同様に、培養開始から７２時間目に培養上清中に著量の３−ヒドロキシ酪酸の分泌が見られた。

さらに、３６時間目に金属塩を添加した場合は、これを添加しなかった場合よりも多くの３−ヒドロキシ酪酸を培養上清中に分泌産生させることができることが明らかとなった。

製造例３
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．５ｍｌを、２００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌ（２０％グルコースを含む）に混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる好気的な培養条件で３６時間振盪培養し、これを種菌とした。

１Ｌスケールのファーメンターに対して、５００ｍＬのＳＯＴ改５培地（２０％グルコースを含む）を仕込み、３３℃、ＤＯ３０％となるように調整し、先ほどの種菌５ｍＬ（１％相当）を植菌して、培養を開始した。その後、２４時間目にＤＯを１０％に減じた。さらに、窒素源として、培養当初には、１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムが含まれるがこれに加えて、培養開始から２４時間目、３６時間目、及び４８時間目のそれぞれに、２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウム加えた。

加えて、６０時間目に、空気の供給を停止し、攪拌のみでＤＯ０．５％以下に調整した。その後、３−ヒドロキシ酪酸の分泌生産に伴って、ｐＨが低下してくるが、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムでｐＨ８．５に調整したもの、調整しなかったものについて比較した。結果を図９〜１２に示す。

これらの結果から、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムそれぞれでｐＨを８．５に調整した場合は、調整しない場合に比べて、ＰＨＢの分解が早く、また著しい（１２時間程度で８０％程度分解する）。それに伴って、３−ヒドロキシ酪酸の分泌が行われ、微好気条件での培地のｐＨ調整が、ＰＨＢの分解、３−ヒドロキシ酪酸を培養上清中に分泌産生に顕著に関与することが明らかになった。

製造例４
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．５ｍｌを、２００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌ（２０％グルコースを含む）に混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる好気的な培養条件で３６時間振盪培養し、これを種菌とした。

１Ｌスケールのファーメンターに対して、５００ｍＬのＳＯＴ改５培地（２０％グルコースを含む）を仕込み、３３℃、ＤＯ３０％となるように調整し、先ほどの種菌５ｍＬ（１％相当）を植菌して、培養を開始した。その後、２４時間目にＤＯを１０％に減じた。さらに、窒素源として、培養当初には、１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムが含まれるがこれに加えて、培養開始から２４時間目、３６時間目、及び４８時間目のそれぞれに、２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウム加えた。

加えて、６０時間目に、遠心分離により、菌体と培地上清を分離し、培地成分中のハロモナス属に属する好塩菌体の濃度を、遠心分離前と比較してそれぞれ２倍、４倍、及び等倍となるよう、培地上清を除いた後、再度菌体を懸濁した。次いで、再度ファーメンターに設置し、空気の供給を停止し、攪拌のみでＤＯ０．５％以下に調整した。その後、３−ヒドロキシ酪酸の分泌生産に伴って、ｐＨが低下してくるが、炭酸ナトリウムでｐＨ８．５に調整し比較した。結果を図１３〜１４に示す。

これらの結果から、通常は生成物の濃度が上昇すると、生成物阻害により生成反応が抑制されるが、本実施例の場合には、１／１濃縮、１／２濃縮、１／４濃縮それぞれで、３−ヒドロキシ酪酸の濃度が、それぞれ、４５ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌに達した。菌体を高濃度に濃縮しても、ＰＨＢの分解、３−ヒドロキシ酪酸を培養上清中に分泌産生が行われることが明らかになった。

製造例５
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、２００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地（窒素源を除く）２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これに、窒素源として、硝酸ナトリウムを１２．５ｇ／L、１５．０ｇ／L、または尿素８．７５ｇ／L、１０．５ｇ／Lをそれぞれ添加し、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌずつ回収して、上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の量を測定した。

有機炭素源は１２重量％のグルコースとなるように培地に添加した。

培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、４８時間目に撹拌速度を５０ｒｐｍと、微好気条件に変更した。培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。それぞれの結果を図１５、１６に示す。

図１５、１６に示す結果から、硝酸ナトリウムの場合、塩濃度の関係から、１５ｇ／Ｌ以上の添加は難しい。また、尿素の場合は、窒素等量は２倍になるため、硝酸ナトリウムより、低濃度で生育が可能であり、また４８時間目以降に、微好気条件に移行した場合、ＰＨＢの分解、３−ヒドロキシ酪酸の分泌が速やかに行われ、尿素を窒素源として利用することが有効であることが明らかになった。

Claims (10)

1. 下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法であって、後記する工程２の前に、培養液の容量を減少させる工程を含む、製造方法：
   （１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
   （２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記菌体を培養し、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
   （３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
2. 工程２における培養条件を好気培養から微好気培養に変更する時期が、菌体中のＰＨＢ蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部以上となる時期である、請求項１に記載の製造方法。
3. 工程２の前に、培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 窒素源が、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、及び尿素からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の製造方法。
5. 金属塩が、亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 培養液中に窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期が、菌体中のＰＨＢ蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり７０重量部以上となる時期である、請求項３〜５の何れか１項に記載の製造方法。
7. 工程２の後に、培養液のｐＨを７以上に調整及び／又は維持する工程を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の製造方法。
8. 培養液のｐＨを７．５以上に調整及び／又は維持する、請求項７に記載の製造方法。
9. 培養液のｐＨの調整及び／又は維持を、水酸化物、炭酸塩、及び炭酸水素塩からなる群より選択される少なくとも１種を用いて行う、請求項７又は８に記載の製造方法。
10. 前記好塩菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、請求項１〜９の何れか１項に記載の製造方法。

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