JP6840419B2 - ハロモナス菌を用いたγーアミノ酪酸の製造方法。 - Google Patents

Description

本発明は、ハロモナス菌を用いたγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ、γ−ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）の製造方法に関する。

近年、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が課題となっている。

γーアミノ酪酸は高等動物では神経伝達物質、血圧降下剤、コレステロール低下などに効果があることが知られている。これは、微生物では、根粒菌の窒素固定などに関与している。酵母、乳酸菌、バシラス菌などではストレス耐性、酸素ダメージ除去、ｐＨ維持、浸透圧耐性などに関与している。例えば、乳酸菌などの微生物においては、図１に示すようなＧＡＢＡ回路という代謝システムが存在する。

ＧＡＢＡ回路では、ＴＣＡ回路に属するα―ケトグルタル酸を出発物質として、これからグルタミン酸デヒドロゲナーゼを触媒にしてグルタミン酸が生成され；これからグルタミン酸デカルボキシラーゼを触媒にしてγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ、γ−ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）が生成され；これかれγーアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを触媒にしてコハク酸セミアルデヒドが生成され；そして、これからコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを触媒にしてコハク酸が生成される。ＧＡＢＡ回路は、ＴＣＡ回路中のα―ケトグルタル酸からのコハク酸の生成を迂回するルートを有するために、ＧＡＢＡ−ｓｈｕｎｔ−ｐａｔｈｗｅｙとも呼ばれる。

このような微生物が有する回路を利用して、例えば乳酸菌を用いた発酵法によるγーアミノ酪酸の製造方法が試みられている（非特許文献１）。

ハロモナス属に属する菌体は、これを培養する際に用いる培地の塩濃度の高さ、ｐＨの高さに起因して、他の菌のコンタミネーションを生じにくい傾向を有するため、様々な物質の発酵生産に向いていることが知られている。例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）およびそのモノマー成分である３−ヒドロキシ酪酸の製造方法（特許文献１〜５）、乳酸および／または酢酸の製造方法（特許文献６）、ピルビン酸の製造方法（特許文献７）などが挙げられる。

これらの文献には、ハロモナス属に属する菌体を単に増殖させるための基本的な条件で培養するか、または培養条件、培地組成などを上記の条件から適宜変更することで、所望の物質を効率的に製造することができる発明が記載されている。

特願２０１１−０５０３３７号公報 特願２０１１−０８３２０４号公報 特願２００９−０７７６７８号公報 特願２０１３−０８１４０３号公報 国際公開２０１５／０７２４５６ 特開２０１０ー２７３５８２号公報 特開２０１５−２０４７６９号公報

漬物からγ‐アミノ酪酸（GABA）の高生産性乳酸菌の分離とその応用 生物工学会誌８５巻３号Ｐ１０９−１１４（2007）

上記非特許文献１に記載の方法は、原料としてグルタミン酸を用いる必要があるので、γーアミノ酪酸の製造方法として、コスト的に不利である。したがって、コスト的に有利なγーアミノ酪酸の製造方法の開発が求められている。すなわち、本発明は、安価で簡便に、γーアミノ酪酸の製造方法を提供することを課題とする。

斯かる課題を解決すべく、発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ハロモナス属に属する菌体の１種の菌体内の代謝解析により、斯かる菌体が上述のＧＡＢＡ回路を有していることが明らかとなった。

本発明はこのような知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す様々な態様の発明を包含する。
項１ 以下の工程（１）および（２）を含むγーアミノ酪酸またはその塩の製造方法；
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源および無機塩を含有する液体培地中で培養する工程（１）、
（２）工程（１）によって得られる培養液中から、γーアミノ酪酸またはその塩を回収する工程（２）。
項２ 前記工程（２）が、培養液を脱塩する工程を含む、上記項１に記載の製造方法。
項３ 前記好塩菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、上記項１または上記項２に記載の製造方法。
項４ γーアミノ酪酸またはその塩の製造用である、ハロモナス属に属する好塩菌。
項５ ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、上記項４に記載の好塩菌。
項６ γーアミノ酪酸またはその塩の製造のための、ハロモナス属に属する好塩菌の使用。
項７ 好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、上記項６に記載の使用。

本発明の製造方法によると、他の菌によるコンタミネーションを防止する特別な手段を取ることなく、γーアミノ酪酸の製造方法を提供することができる。

本発明の製造方法によると、安価で簡便なγーアミノ酪酸の製造方法を提供することができる。

ＧＡＢＡ回路を説明する図。 実施例に示すハロモナス菌の培養試験結果。 実施例に示すハロモナス菌の各種時間における培養後の菌体内の、リビトールに対するグルタミン酸の相対値を示す結果。 実施例に示すハロモナス菌の各種時間における培養後の菌体内の、リビトールに対するγーアミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）の相対値を示す結果。 実施例に示すハロモナス菌の各種時間における培養後の菌体内の、リビトールに対するコハク酸セミアルデヒドの相対値を示す結果。 実施例に示すハロモナス菌の各種時間における培養後の菌体内の、γーアミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）の絶対量を示す結果。

本発明のγーアミノ酪酸またはその塩の製造方法は、以下の工程（１）および（２）を含む。
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源および無機塩を含有する液体培地中で培養する工程（１）、
（２）工程（１）によって得られる培養液中から、γーアミノ酪酸またはその塩を回収する工程（２）。

工程（１）
＜Ａ：好塩菌＞
工程１において用いる好塩菌はハロモナス属に属する好塩菌である。このようなハロモナス属に属する好塩菌は、酸化的代謝と嫌気的代謝とを使い分けることができ、培地中の遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向を示す、いわゆる、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。

上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍ程度の範囲内の塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の範囲内の培地中において生育する。

このようなハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ４７
７０１５として登録されている。

また、上述のハロモナス属に属する好塩菌の生育特性などに鑑みて、工程１において用いることができる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ７００５９７）、ハロモナス・メリディアナ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｒｉｄｉａｎａ：ＮＢＲＣ１５６０８）なども挙げることができる。

さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア、およびハロモナス・メリディアナなども、工程１において用いるハロモナス属に属する好塩菌として採用できることが推定される。

なお、本発明で用いられるハロモナス属に属する好塩菌は、遺伝子導入または変異導入などが施されていない野生型株であることが好ましいが、人為的および偶発的を問わず、これらの導入が施されているものであってもよい。導入される遺伝子および／または変異は、本発明の製造方法において、γーアミノ酪酸またはその塩の生産効率などを向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。

例えば、上記のＧＡＢＡ回路において働く各種の酵素をコードする遺伝子などを遺伝子導入することが挙げられる。これらの遺伝子の当該菌体への導入方法は、一般的な方法を採用することができる。

＜Ｂ：培地＞
上記工程１において用いる培地は、無機塩とおよび有機炭素源を含有する液体培地である。このような培地のｐＨは特に限定されず、例えば、上記好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好しく、具体的にはｐＨ５〜１２程度の範囲内であることができる。より好ましくはｐＨ８〜１０程度である。本発明では、コンタミネーションを防止するための特別な手段を取ることは必須ではないが、アルカリ性の培地を用いれば、ハロモナス属に属する好塩菌以外の混入をより効果的に防止することができる。

工程１において用いる培地に配合する無機塩は特に限定されない。例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩；ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルトなどの金属塩などを採用することができる。

例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩を無機塩として採用する場合であれば、ＮａＣｌ、ＫＮＯ_３、ＫＮＯ_２、ＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４などを用いることができる。

これらの無機塩は、上記ハロモナス属に属する好塩菌にとって窒素源、リン源などとなるような化合物であることが好ましい。

窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、尿素などを用いればよく、特に限定はされない。例えばＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、尿素などの窒素含有化合物を用いることができる。好ましくは、硝酸塩、亜硝酸塩などである。

窒素源の使用量は、γーアミノ酪酸またはその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定することができる。具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として２５０ｍｇ程度以上、好ましくは１０００ｍｇ程度以上、より好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。

リン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩などを用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａ_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_３ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４４、ＫＨ_２ＰＯ_４などの化合物を用いることができる。

リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度の範囲内とすればよく、好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。

これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度の範囲内となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。

工程１において用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされない。例えば、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースなどの六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボースなどの五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオースなどの二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖アルコール；トリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸塩、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、クエン酸、αーケトグルタル酸、コハク酸、フマール酸、リンゴ酸、オキザロ酢酸、グルタミン酸などが挙げられる。

これらの有機炭素源は１種または２種以上を適宜組み合わせることで用いることができる。また、有機炭素源の使用量は特に限定はされず、通常は０．００５６〜０．１６６６Ｍ程度の範囲内となる濃度で用いればよく、好ましくは０．０２７８〜０．１３８９Ｍ程度、より好ましくは０．０５６〜０．１１１Ｍ程度である。

本発明の製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩
菌を好適に培養できるので、他の菌体の混入および増殖の恐れなどをほとんど排除できる。したがって、上述の培地に対して滅菌処理などを行わずに、簡便な設備で培養することも可能である。

＜Ｃ：培養方法＞
上記工程１における上記ハロモナス属に属する好塩菌の培養方法は、特に限定はされない。具体的な培養方法の１態様を以下に示す。

先ず、５ｍｌ程度の適当な培地に上記好塩菌を植菌し、通常は３０℃〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンターなどに入った上記＜Ｂ：培地＞において詳述した培地中に１００倍程度に希釈し本培養（これを、本明細書中、単に培養と称する場合がある。）する。

上記の本培養は、通常は２０℃〜４５℃程度の範囲内で設定することができる。好ましくは、３０℃〜４５℃程度、更に好ましくは３５℃〜４０℃程度、３６℃〜３８℃程度が最も好ましい。

本培養の方法としては、特に限定はされない、例えば、回分培養、半回分培養、流加培養、連続培養などの培養方法が挙げられる。特に本発明の方法では他の菌が混入、増殖などのする危険性が極めて低いので、長期の連続培養も採用可能である。このようにγーアミノ酪酸またはその塩を効率よく製造できる点で好ましい。

工程（２）
本発明の製造方法の工程２は、上記工程１によって得られた培養液から、γーアミノ酪酸またはその塩を回収する工程である。「培養液」とは、（１）培養後の培地の液、または（２）これと増殖した菌体とを含む液である。

工程２における回収の前に、上述の増殖した菌体を破砕する工程に供してもよい。増殖した菌体を破砕する場合には、公知の方法を採用すればよい。例えば、超音波破砕法、フレンチプレス法、乳鉢、ホモジナイザーを用いた粉砕法、またはガラスビーズなどの各種粉砕用ボールを用いた粉砕法を挙げることができる。

工程２における回収は、工程１によって得られる培養後の培地の液中にγーアミノ酪酸が存在している場合に限り、工程１の培養を停止して実施することもできる。培養液中のγーアミノ酪酸またはその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件などにより変わり得るものであり、これらの要素を考慮して適宜決定され得る。例えば、継時的に培養液を採取し、これをＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ、分析キットなどによる分析方法に供して、培養を停止するのに好ましい時期を決定することができる。

具体的な回収方法は特に限定はされない。たとえば遠心操作、濾過、膜分離などの固液分離の方法が挙げられる。さらに、固液分離の後に得られる液体画分を、公知の精製工程に供することも、工程２の回収に包含される。具体的な精製方法は特に限定はされない。例えば、脱塩工程、各種カラムを用いたクロマトグラフィーなどを挙げることができる。なお、脱塩の手段としては、上記カラムを採用することもできるし、この他にＥＤ法を採用することもできる。

すなわち、工程２の一態様として、工程１によって培養して得られた菌体を破砕することなく、斯かる菌体をそのまま脱塩処理に供する工程が挙げられる。これによって、γーアミノ酪酸またはその塩を簡便に製造することもできる。すなわち、本発明の一態様では、工程２は培養液を脱塩する工程を含む。また、本発明の別の一態様では、工程２は培養液を脱塩する工程からなる。このような方法で製造されたγーアミノ酪酸は、例えば、健康食品などの機能性食品にそのまま配合することができる。

なお、γーアミノ酪酸は、培養液中または菌体内に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウムなどのアルカリ金属；アルカリ土類金属などの陽イオンと反応した塩として回収されてもよい。

そして、上記の増殖した菌体内からは、特許文献１〜７などに記載の手法に従い、バイオポリマーであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、または３−ヒドロキシ酪酸などを回収することも可能である。

以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。 下記の試験例において用いるＳＯＴ改６培地は、下記の表１に示す組成を有する。本実施例では、３Ｌの発酵槽に張り込み培地（１．５Ｌ）として、下記のＳＯＴ改６培地に１０％（ｗ／ｗ）のグルコースおよび１．２％（ｗ／ｗ）の硝酸ナトリウムを加えた培地を用意した。次いで、前培養したハロモナス属に属する好塩菌ＫＭ−１株を張り込み培地に植菌し、好気培養を開始した。培養温度を３７℃に維持し、およびＤＯを培養開示時は１０％に設定し、および培養開始の２．５時間後から、５０％に上昇させた。また、撹拌羽根の回転数は２００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍの間に調整した。

培養開始の５時間後から、０．５ｍＬ／分の割合で、上記ＳＯＴ改６培地に６０％（ｗ／ｗ）のグルコースを添加した３００ｍＬの流加培地を加え、培養開始の１時間後から、０．１ｍＬ／分の割合で、上記ＳＯＴ改６培地に１７％（ｗ／ｗ）の硝酸ナトリウムを添加した１４８ｍＬの流加培地を加えた。なお、ｐＨは８．５となるように調整した。

培養開始から５時間後、８時間後、１２時間後、１４．５時間後、及び２７時間後に培養液をサンプリングした。分光光度計を用いてサンプリングした培養液の波長６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ）を測定し、およびグルコースセンサーによって培養液中のグルコース濃度を測定した。

サンプリングした培養液（各５００μＬ）は、１６，５００ｇで５分間遠心し、沈殿を蒸留水で洗浄して、再度遠心し、得られた菌体を液体窒素で凍結保存した。菌体を常温で溶かし、ここにジルコニアボールを２個入れ、次いでボールミルを用い、２０Ｈｚで５分間粉砕処理に供した。

処理物に、Ｍｉｘ ｓｏｌｖｅｎｔ（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ／ＣＨＣｌ_３＝５：２：２）の１０００μＬの混合液を加えて、ボルテックスミキサーで混合した。次いで、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した６０μＬのリビトール水溶液をここに加えて混合し、３７℃で３０分間、１２０００ｒｐｍで振とうさせた。

浸とう後のサンプルを、４℃で３分間、１６０００ｇの条件で遠心して、上清の８００μＬを新しい１．５ｍＬのエッペンチューブに移した。ここに４００μＬの蒸留水を加えて、４℃で３分間、１６０００ｇの条件で遠心して２相分離し、新しいエッペンチューブに上清の７００μＬを移した。これを、メタノールが無くなるまでＳｐｅｅｄｖａｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて室温で濃縮し、その後、凍結して、凍結乾燥器で水分が無くなるまで乾燥させた。

上記の凍結乾燥サンプルに、用事調製した１００μＬのＭｅｔｈｏｘｙａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｐｙｒｉｄｅｉｎｅ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて溶解させ、３０℃で９０分間、１２００ｒｐｍの条件で振とうして、サンプルのメトキシ化を行った。

メトキシ化を行った４０μＬのサンプルに、４０μＬのＭＳＴＦＡを添加して、３７℃で３０分間、１２００ｒｐｍで振とうして、サンプルのトリメチルシリル化を行った。反応終了後、１６０００ｒｐｍで５分間遠心して上清をＧＣ−ＭＳ（島津製作所）用バイアル瓶に全量を移して、２４時間以内にＧＣ−ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０Ｕｌｔｒａ 島津製作所）を用いてハロモナス属に属する好塩菌ＫＭ−１株の代謝物を分析した。上記の実験は３回行った。各種結果を図２〜６に示す。

図２は、培養過程における培地中のＯＤおよびグルコース濃度を示す。好気培養によって培地中のグルコースが減少し、培養開始から約２５時間には完全に消費された。また、ＯＤについては、最終的に（培養開始から２５時間程度で）１５０〜２００付近に到達した。

そして、図３〜５に示すように、ハロモナス属に属する好塩菌ＫＭ−１株の菌体内では、培養開始と共に、グルタミン酸、γーアミノ酪酸、およびコハク酸セミアルデヒトが代謝物として存在量が増加したことから、ハロモナス属に属する好塩菌ＫＭ−１株はＧＡＢＡ回路を有していることが明らかとなった。また、図６に示すように、γーアミノ酪酸は、培養開始から１４．５時間付近で、１５０ｍｇ／Ｌもの高い収量で生産されることが明らかとなった。

ハロモナス属に属する好塩菌ＫＭ−１株はＰＨＢの産生菌として知られる。今回の実験では、ＫＭ−１株におけるＰＨＢの蓄積を促す条件によって、γーアミノ酪酸も蓄積したことは、確認はされていないが、次のような事が考えられる。

ＰＨＢの蓄積にはＣ／Ｎ比において、窒素欠乏状態が必須となる。γーアミノ酪酸は、ＫＭ−１株においてＧＡＢＡ回路を介して窒素源であるＮＨ_３をトラップすることになるので、結果的に菌体内での窒素源の供給を抑制する作用を奏する。これによって、ＫＭ−１株におけるＰＨＢの蓄積の時期に、γーアミノ酪酸の生産量が増加することが示唆される。

Claims (2)

1. 以下の工程（１）および（２）を含むγーアミノ酪酸またはその塩の製造方法；
   （１）ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）を、有機炭素源および無機塩を含有する液体培地中で、３５℃〜４０℃にて培養する工程（１）、
   （２）工程（１）によって得られる培養液中から、γーアミノ酪酸またはその塩を回収する工程（２）。
2. 前記工程（２）が、培養液を脱塩する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。