JP6325666B2 - ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体 - Google Patents

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発明の詳細な説明

本発明は、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄の複合体に関する。具体的には、本発明は、鉄欠乏症の治療又は予防における使用のための、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む組成物に関する。本発明の一態様は、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む強化食品である。本発明のさらなる態様は、食品を鉄で強化するための方法、及び食品を鉄で強化するための、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の使用である。

世界中の何十億もの人が「隠れた飢餓」又は微量栄養素欠乏に苦しんでいる。彼らは口にする食料から、健康で生産的な生活を送るために必要な微量栄養素を十分に摂取していない。微量栄養素はビタミン及びミネラル（ビタミンＡ、亜鉛、及び鉄）であり、健康のために絶対に欠かせない。微量栄養素欠乏は、ＩＱを低下させ、子供の発育不全及び失明の原因となり、子供及び大人の両方の、疾患への抵抗力を低下させ、また、出産中の、母親及び乳児の両方のリスクを増加させることがある。鉄欠乏症は、世界で最も一般的で広範にわたる栄養障害である［Ｊ．Ｕｍｂｒｅｉｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ７８，２２５（２００５）］。発展途上国の数多くの子供及び女性に影響を及ぼすと共に、鉄欠乏症は、先進工業国でも大変広く行き渡っている唯一の栄養素欠乏症である。比較的裕福な国では、人は菜食等、鉄摂取の低下の原因となり得る食事を自主的に選択することがある。乳児及び小さな子供は、成長しているために一層多くの鉄を必要とし、それ故、不適切な食事では鉄欠乏症を引き起こす場合がある。妊婦は、成長する胎児が多量の鉄を必要とするため鉄欠乏症になるおそれがある。

体内に貯蔵された鉄が枯渇すると、貧血を起こす。貧血は蒼白、衰弱、及び疲労の原因となる。通常の食事では鉄の２０％未満が体内に吸収される。したがって、鉄欠乏症の大半の人は通常、１日１回又は２回、鉄補給食品を口から摂取する必要がある。鉄は、硫酸第一鉄、並びにグルコネート、デキストラン、カルボニルイオン、及び他の塩類との複合体等の種々の薬理学的形態を用いて、経口経路により補充することができる。場合により、吸収を良好にするためにアスコルビン酸が添加される。硫酸第一鉄及びクエン酸第一鉄等の多くの鉄塩は不快な味を有する。いくつかの食物の成分（植物繊維及びフィチン酸塩等）は遊離鉄と複合体を形成し、鉄の吸収を低下させるため、患者は多くの場合、空腹の状態で補助食品の形で鉄を摂取するよう勧められる。しかし、空腹の状態で鉄補給食品を摂取することは消化不良及び便秘の原因となる場合がある。鉄欠乏症を治療及び予防するために使用可能な鉄のさらなる形態、特に、当たり障りのない味を有し、かつ食物と組み合わせた際に効果が持続する鉄の形態を見出すことが望ましい。

世界保健機関（ＷＨＯ）は、その生物学的利用能の高さから、鉄強化剤の中でも硫酸第一鉄を第一候補とすべきことを推奨した［Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｆｏｏｄ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２００６］。しかし、硫酸第一鉄で強化したある種の食品では好ましくない感覚刺激が発生する可能性があり、硫酸第一鉄と比較して生物学的利用能が低くなることに引き換えても、その食品マトリックス中で化学反応性が低い他の鉄の形態を選択することが必要となっている。例えば、鉄は酸化反応を加速させて食品の風味を悪くする場合があり、また、鉄は変色をもたらす場合がある。遊離の可溶性鉄は着色化合物と食品中で複合体を形成し、変色の原因となる。本問題は通常、長期間の保存後、食品の調理時、又は熱を用いて食品を滅菌した場合に生じる。食品は、滅菌して長い貯蔵寿命を提供し、又は病人若しくは幼児等の敏感なグループにより安全に消費される必要がある。鉄で食品を強化する際の変色の問題は、果実を含有する食品組成物で特に明らかである。多くの果実の色は、鉄の存在下にて変色し得るアントシアニン等の化合物に由来する。鉄はアントシアニン分子と複合体を形成する。これは、アントシアニンにより吸収される光の波長の変化の原因となり（深色移動）、望ましくない変色をもたらす。果実は元来、有益な食物栄養素を豊富に提供するため、食品にさらなる栄養価を付与するのに優れた主成分である。したがって、望ましくない変色を示さない鉄強化食品、例えば果実を含有する食品を提供する必要性がある。

欧州特許第１０１１３４４号は、フマル酸第一鉄及び硫酸第一鉄等の鉄の供給源で強化された、チョコレート風味の飲料混合物及び他の食用混合物について記載しているが、フルーツジュースを含む水性液体で飲料混合物を再構成した際に、望ましくない灰色への変色が見られない。灰色の発色問題は、クエン酸又はリンゴ酸等の食用酸を飲料混合物中で緩衝剤として含め、再構成されたチョコレート飲料のｐＨを約６．５以下とすることにより解決される。ｐＨを酸性に調節することは、必ずしも製品の所望の味に適合するわけではない。また、ｐＨを調節することは一般に飲料に最も適しており、着色成分は、一般に連続水相に溶解又は分散しているため、添加した酸の影響を受けることができる。非飲料の食品組成物に関しては、望ましくない色の着色の原因となるすべての成分が、添加した酸の影響を受けるようにすることは困難な場合がある。

国際特許第９７／１５２０１号は、色が安定した鉄強化果実味の乾燥飲料混合物を開示しており、ここでは、鉄を固形脂肪内に封入した硫酸第二鉄として、又はアミノ酸とキレート化した鉄として添加している。しかし、固形脂肪を食品中に添加することは必ずしも望ましいとは限らず、また、アミノ酸とキレート化した鉄は他の多くの鉄化合物よりも高価である。

欧州特許第１０４０７６６号は、酢酸、グルコン酸及び乳酸から選択される少なくとも１種の酸味料と共に、鉄及びラクトフェリンを含む鉄補強飲料について記載している。この成分の組み合わせは鉄の不快味を避けることが見出された。

国際特許第２００５／０５１０８８号は鉄含有母乳強化剤について記載しており、ここでは乳の抗菌性が大きくは阻害されない。これは、可溶性の非結合鉄をほとんど又は全く有しないことによって達成された。ラクトフェリンの添加は可溶性の非結合鉄画分を減少させるのに有用であることが見出された。

不快味なしで鉄欠乏症を治療及び予防するために使用可能であり、かつ食品と組み合わせた際に望ましくない変色を引き起こさない、さらなる鉄の形態を見出す必要性が依然として存在する。特に、硫酸第一鉄よりも食品マトリックス中で化学的活性が低いが、類似の又は改善された生物学的利用能を有する鉄の形態を提供する必要性がある。加えて、良好な生物学的利用能を有し、天然源の成分による変色に対して安定化された鉄を提供する、改善された又は代替の強化食品を提供する必要性がある。

本発明の目的は、現況技術を改良し、改善された解決策を提供して上記の不都合の少なくともいくつかを克服する、又は少なくとも有用な代替物を提供することである。本明細書内の先行技術文献を参照することはいずれも、そのような先行技術が周知であるか、又は当分野で共通の一般的な認識の一部を形成しているということを認めたものであるとみなされるべきではない。本明細書中で使用する場合、単語「含む」、「含んでいる」、及び類似の単語は、限定的に又はすべてという意味で解釈されるべきではない。換言すれば、それらは「〜を含むが、それらに限定されない」ことを意味することが意図されている。

本発明の目的は独立請求項の主題によって達成される。従属請求項はさらに本発明の着想を発展させる。

したがって、本発明は、第１の態様において、鉄欠乏症の治療又は予防における使用のための、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む組成物を提供する。第２の態様において、本発明は、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む強化食品を提供する。本発明のさらなる態様は、食品を鉄で強化するための方法、及び食品を鉄で強化するための、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の使用に関する。

ラクトトランスフェリンとしても知られているラクトフェリンは８０ｋＤａの球状糖タンパク質である。ラクトフェリンは母乳中で約１５００ｍｇ／Ｌ、牛乳中で約１５０ｍｇ／Ｌ存在し、涙及び唾液等の、多くの粘膜分泌物中にも見出され得る。ラクトフェリンは体の自然免疫系の一部であり、抗菌、抗ウイルス、抗真菌、抗腫瘍及び抗炎症活性を含む多数の生物活性を有する。オステオポンチンは、３６ｋＤａの、アニオン性で大部分が非構造性であるリン酸化糖タンパク質である。オステオポンチンは母乳中で約１５０ｍｇ／Ｌ、牛乳中で約１５ｍｇ／Ｌ存在する。

ラクトフェリン（ＬＦ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）は、１、２又は３個のＬＦ分子が単一のＯＰＮ分子に結合することによる複雑なメカニズムにより相互作用することが示されている［Ａ．Ｐ．Ｙａｍｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４６，２３９５（２００９）］。

驚くべきことに、本発明者らは、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は食品等の物質と組み合わせた際に、良好な色安定性を有するバイオアクセシブルな鉄供給源を提供したことを見出した。例えば、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で強化したイチゴ及びバナナヨーグルトは、ＮａＦｅＥＤＴＡ、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４）又はラクトフェリン−鉄複合体を用いて同一の量の鉄で強化したヨーグルトと比較して加熱処理後の変色をさほど示さなかった。硫酸第一鉄は生物学的利用能の高い鉄供給源を提供することが知られているため、本発明者らは、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で強化したヨーグルト中の鉄のバイオアクセシビリティが、同量の鉄の硫酸第一鉄で強化したヨーグルトと類似しているか又はそれよりむしろ高いことを見出して驚いた。

図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化／Ｃａｃｏ−２細胞により測定された鉄のバイオアクセシビリティを示す。フェリチン量（ｎｇ／ｍｇタンパク質）±ＳＥＭ又はＳｔｄｅｖ（ｎ＝９）を、鉄の量が１００μｇ／ｇの異なる鉄含有化合物で強化されたＪｏｇｏｌｉｎｏサンプルに対してプロットする。対照＝未強化；Ａ＝ＦｅＳＯ_４；Ｂ＝ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄；Ｃ＝ラクトフェリン−鉄；及びＤ＝ＮａＦｅＥＤＴＡ。

したがって、本発明は、部分的には、鉄欠乏症の治療又は予防における使用のための、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む組成物に関する。少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の量は、鉄欠乏症の治療又は予防のための有効量の鉄を提供する。２ｇ／ｋｇの量は、母乳に見出されるラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の量のほぼ２倍である。母乳では、ＬＦは重量でＯＰＮの１０倍を超える。ＬＦの質量を８０ｋＤａ、ＯＰＮの質量を３６ｋＤａとする［Ａ．Ｐ．Ｙａｍｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４６，２３９５（２００９）］と、ＬＦの分子はＯＰＮの分子よりも４．５倍多い。Ｙａｍｎｉｕｋらは、ＬＦ−ＯＰＮ−鉄複合体中ではＬＦ：ＯＰＮの最大モル比が３：１であることを示した。したがって、ＯＰＮがすべてＬＦと複合体を形成し、母乳にＯＰＮが１５０ｍｇ／ｋｇの量で存在すると、母乳では最大１．１５ｇ／ｋｇのＬＦ−ＯＰＮ−鉄複合体が存在する。

本発明の組成物は、少なくとも４ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体、例えば少なくとも８ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含み得る。本発明の組成物は、少なくとも６００ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む組成物、例えば、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を６０％、及びドライバインダー等の他の物質を４０％含有する圧縮錠のように、大部分がラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体であり得る。鉄欠乏症の治療又は予防における使用のための組成物はラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体からなるものであり得る。例えば、粉末のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は対象者に経口投与され得る。

ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体では、ラクトフェリンはオステオポンチンに例えば静電相互作用により結合する。複合体中に存在する鉄はラクトフェリン及び／又はオステオポンチンに結合し得る。鉄はＦｅ^２＋又はＦｅ^３＋イオンとして存在し得る。複合体におけるＬＦ：ＯＰＮの比はその調製に応じて変化し得、例えば、結合して複合体を形成するＬＦ及びＯＰＮの量によって変化し得る。Ｙａｍｎｉｕｋらにより示されるように、各複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比はモル基準で３：１、２：１又は１：１であり得、これは重量では約６．６：１、４．４：１及び２．２：１である。分子レベルでの異なる比の組み合わせのため、全バルク比において中間値を取り得る。本発明で使用される複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比は、重量で６．６：１〜２．２：１、例えば重量で４．４：１〜２．２：１、さらなる例では重量で３：１〜２．２：１であり得る。複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比は重量で約２．２：１であり得る。複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比はラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体における全バルク比を意味する。

異なる哺乳類の種における乳のラクトフェリン及びオステオポンチンの量は異なるものの、ＬＦ：ＯＰＮ比は基本的に同じであり、重量で約１０：１である。鉄欠乏症の治療又は予防にて使用するには、ラクトフェリンのオステオポンチンに対する比率が低いことが有利である。ラクトフェリンに対するオステオポンチンの相対量が増加するとＬＦ：ＯＰＮ比が低下する。オステオポンチンは骨再形成及び免疫系の機能の両方に重要な役割を果たすため、所与の複合体の重量に対して多くの量のオステオポンチンを提供することができることは有利である。オステオポンチンの量が最も多い複合体はモル比１：１の複合体である［Ａ．Ｐ．Ｙａｍｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４６，２３９５（２００９）］。モル比１：１の複合体の形成を促進するには、オステオポンチンを、オステオポンチンがモル過剰となる量でラクトフェリンと組み合わせるのが有利であり得る。例えば、同重量のオステオポンチン及びラクトフェリンを組み合わせ、モル比約１：２．２のＬＦ：ＯＰＮを提供し、過剰のオステオポンチンがラクトフェリンに結合せずに残った状態で確実にモル比１：１の複合体が形成されるようにし得る。

本発明は、任意の供給源から得られるラクトフェリン及びオステオポンチンに関する。ラクトフェリン及び／又はオステオポンチンは、例えばミルク又は乳清、例えば牛乳又は乳清から得られる。牛乳又は乳清からラクトフェリン又はオステオポンチンを得ることは、さらに精製することなく食品組成物中で使用され得る食品グレード材料から得られる天然成分を提供するという利点を有する。

一実施形態において、本発明の組成物は経口又は経腸投与するためのものである。ヒト及び動物のほとんどは注射を受けることを嫌うため、注射なしで投与可能な組成物を有することは有利である。本発明の組成物は栄養補助食品であり得る。食品補助剤又は健康補助食品としても知られている栄養補助食品は食事を補い、人の食事で欠く場合があるか又は十分量を摂取しない場合があるビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸又はアミノ酸等の栄養素を提供することを目的とした調製物である。組成物は、例えば病院で経腸投与可能な液体栄養配合物であり得る。

一実施形態において、組成物は早産児又は低出生体重児に投与するためのものである。早産児は、３７週未満の妊娠で生まれた乳児である。低出生体重児は、２．５ｋｇ未満の出生時体重を有する乳児である。早産児及び低出生体重児は、健全な正期産新生児よりも体内の貯蔵鉄をかなり早く枯渇させてしまうおそれがある。鉄の補充を受ける乳児は、補充を受けていない乳児と比較して鉄の貯蔵が改善され、鉄欠乏性貧血の進展がより低リスクとなった［Ｒ．Ｊ．Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ａｎｄ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ，Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｏｎｌｉｎｅ）３，ｐｐ．ＣＤ００５０９５］。

一実施形態において、組成物は妊娠中又は授乳中の女性に投与するためのものである。女性が妊娠中に鉄欠乏症が進展することは極めて一般的である。血液量が約３５％増加し、胎児、胎盤及び他の母体組織が成長することによって、第２及び第３の３半期には鉄の必要量が３倍に増加する。多くの妊婦には、特に妊娠２０週目以降は鉄栄養補助食品が必要であるが、補充は母体の鉄状態に応じて個別に取り扱わなければならない。授乳中の女性もまた、例えば、出産の結果の失血のため、又は第３の３半期の間に母胎から成長中の子に移った多量の鉄のため、鉄不足となる場合がある。この時期に母体の食事が鉄不足であれば、鉄欠乏症を経験するであろう。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む強化食品を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の形態で添加された鉄は、遊離の可溶性鉄に関係する質の問題、例えば変色を引き起こすことなく、食品材料を強化するために使用され得ることを見出した。強化食品は、１つ又は複数の栄養素の含有量が食品中で増加した食品である。特定の国の食品ラベル表示法では、用語「補強」及び「強化」の間には区別がつけられている。用語「補強」とは、食品中に一度存在していたが、加工中に除去されたか又は減少した補助栄養素を添加することを意味する。本明細書において、用語「強化食品」は、場合によっては、栄養素が補強されたものと記述される食品を含み、その場合、栄養素含有量の増加は、加工中に失われる栄養素を補充することを目的としている。

本発明の強化食品は、重量で６．６：１〜２．２：１、例えば重量で４．４：１〜２．２：１、さらなる例では重量で３：１〜２．２：１の、複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比を有し得る。強化食品は、重量で約２．２：１の、複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比を有し得る。

本発明の強化食品は、乳製品；料理用製品；乳児用食品；妊婦又は出産後間もない母親用の食品、飲料；ビスケット、ケーキ若しくはペーストリー製品；デザート；栄養配合物又はペット食品であり得る。乳製品は、例えば、牛乳系粉末、アイスクリーム、チーズ、発酵乳、及びヨーグルトであり得る。ヨーグルトは良好なカルシウム供給源であり、強靱な骨の形成及び維持に役立つ。ヨーグルトは、マグネシウム及び亜鉛等の他の有益なミネラルで強化されてもよい。しかし、ヨーグルトを鉄で強化すると、果実ヨーグルト等で見出され得るように、ヨーグルトが発色団化合物を含有する場合に問題を呈する。例えば、ブルーベリー中のアントシアニンにより着色されるブルーベリーヨーグルトは鉄の添加後に変色するが、これは、アントシアニンが深色移動するためである。料理用製品は通常、台所に用意又は使用される食品組成物である。本発明の強化食品であり得る料理用製品としては、スープ、ソース、ブイヨン、液体調味料、及び調理した食事が挙げられる。遊離の溶解鉄により、これらの製品中で望ましくない変色が引き起こされ、また、脂肪などの成分が、異臭をもたらす酸化を一層受けやすくなる場合がある。本発明のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で製品を強化することは、これらの望ましくない影響を防止又は低減する。

本発明の強化食品は、乳児用食品、妊婦又は出産後間もない母親用の食品であり得る。本発明の範囲において、乳児は１２ヶ月以下の年齢の子供である。乳児用食品は、乳児の完全又は部分栄養を目的とした食品であり得る。出産後間もない母親とは、先の６ヶ月以内に出産をした、又は授乳をしている人である。乳児、妊婦及び出産後間もない母親は、食事で生物学的利用能のある鉄の摂取が不十分となる特段のリスクがあるため、本発明の強化食品が、不快な金属味を有しない、又は望ましくない変色等の不安定さを示さない食品において、鉄の良好な生物学的利用能を提供することができることは有利である。

強化食品は栄養配合物であり得る。これは、例えば、投与される対象者の唯一の栄養供給源として十分な種類と量の多量栄養素（タンパク質、脂肪、及び炭水化物）及び微量栄養素を提供する完全栄養配合物であり得る。栄養配合物は、部分栄養を提供し、対象者の現在の食事の栄養補助食品としての役割を果たすものであってもよい。栄養配合物は、鉄欠乏症に罹患した場合にすぐに必要となり得る栄養素を体に提供する。

本発明の強化食品はペット食品であり得る。ネコ、イヌ等のペットは鉄欠乏症に罹患することがあるため、鉄強化された食品の利益を受け得る。

本発明の強化食品は、食品の貯蔵寿命における変色に対して耐性を示し得る。例えば、製造時及び推奨保存条件下での貯蔵寿命の終わりにおける鉄強化食品のＣＩＥＬＡＢ ΔＥａｂ^＊色差は３．５未満、例えば２未満であり得る。貯蔵寿命は、食品、飲料、及び他の多くの腐敗性の物品を貯蔵でき、特定の割合の物品の規定の品質が、想定される（又は特定の）流通、貯蔵及び陳列条件下で許容可能であり続ける期間の、推奨される長さである。通常、「賞味期限」（ＢＢＤ）は、推奨保存条件と共に、密封した腐敗性食品に印刷される。そのようなＢＢＤが示される場合、貯蔵寿命は製造とＢＢＤとの間の期間である。ＢＢＤが示されない場合、貯蔵寿命は、関連する製品タイプに関して通常の同等の期間である。

本発明の強化食品は、製品の熱処理中の変色に対して耐性を示し得る。例えば、１０５℃での２分の熱処理の後、ΔＥａｂ^＊として測定される強化食品の変色は３．５未満、例えば２未満であり得る。そのような熱処理は、長い貯蔵寿命を有すること又は乳児等の敏感なグループにより消費されることが意図されたパッケージ化された食品に対しては典型的なものである。

ＣＩＥ １９７６ Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊（以下ＣＩＥＬＡＢ）のカラースケールは、国際照明委員会（ＣＩＥ）により提案された色測定の１つの方法である［ＣＩＥ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＩＥ １５．２−１９８６，ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐｒｉｎｔ １９９６］。ＣＩＥＬＡＢ色空間は、量Ｌ^＊、ａ^＊、ｂ^＊を直交座標にプロットすることによって作成される。物体のＬ^＊座標は、０（黒）から１００（完全な白）のスケールで測定した明度の強さである。ａ^＊及びｂ^＊座標は特定の数値限界を有しない。パラメータａ^＊は純粋な緑（マイナスａ^＊）から純粋な赤（プラスａ^＊）に伸び、ｂ^＊は純粋な青（マイナスｂ^＊）から純粋な黄（プラスｂ^＊）に伸びる。

ＣＩＥＬＡＢ色空間では、色差は、２つのサンプルのＬ^＊、ａ^＊及びｂ^＊の値の差を考慮した単一の値として計算され得る。色差ΔＥａｂ^＊は下記のように計算される。

本発明のさらなる態様は、食品を鉄で強化するための方法であって、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄（該ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄は水溶液中に存在する。）を組み合わせることによってラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を形成するステップと、食品を調製するステップと、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を食品に添加するステップと、を含む方法である。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を形成するための成分は任意の順序で組み合わせ得る。鉄は、溶解した複合体、例えばラクトフェリン及び／又はオステオポンチンとの複合体の形態で溶液中に存在し得る。ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄を組み合わせることは、ラクトフェリン及びオステオポンチンの水溶液を調製し、次いでこれを水溶液中の鉄と組み合わせることによって実施され得る。ラクトフェリンは、通常、それと複合体を形成した鉄と共に供給される。（鉄と複合体を形成した）このラクトフェリンは、水溶液中でオステオポンチンと組み合わされてラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を形成し得る。そして、さらなる鉄の溶液を添加してラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体中の鉄の量を増加させてもよい。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は、既に鉄と複合体を形成したラクトフェリンの水溶液を取り、それを、既に鉄と複合体を形成したオステオポンチンの水溶液と組み合わせることによって形成させてもよい。

ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄は、本発明の方法において、重量で８：１〜１：８のラクトフェリンとオステオポンチンの比で組み合わされ得る。上述のように、３：１、２：１、及び１：１の結合化学量論モル比でラクトフェリンがオステオポンチンと複合体を形成するために、本方法にて組み合わせられるラクトフェリンとオステオポンチンの比は得られる複合体における比と同じでなくてもよい。用語「〜の比で組み合わせる」とは、記載された比で成分を混合することを意味し得る。多量のオステオポンチンを含む複合体を最大限に形成させるために、オステオポンチンと組み合わされるラクトフェリンの量を制限することが望ましい場合がある。例えば、重量で５：１〜１：５のラクトフェリンとオステオポンチンの比で、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄が本発明の方法において組み合わされ得る。別の例では、重量で３：１〜１：３のラクトフェリンとオステオポンチンの比で、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄が本発明の方法において組み合わされ得る。最も多くの量のオステオポンチンを含む複合体（モル比１：１の複合体）を形成するために、モル過剰のオステオポンチンをラクトフェリンと組み合わせるのが望ましい場合がある。例えば、重量で２：１〜１：２のラクトフェリンとオステオポンチンの比で、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄が本発明の方法において組み合わされ得る。

食品に添加されるラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は水溶液の形態であり得る。複合体は粉末として食品に添加され得る。本発明の方法は、さらに、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を乾燥させて粉末を形成するステップを含み得る。例えば、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は食品に添加する前に乾燥され得る。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を乾燥させて粉末を形成する技術は、当該技術分野において周知のもののいずれかである。例えば、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は、遠心分離及び／又は濾過により水溶液から分離し、次いで凍結乾燥により乾燥させて粉末にしてもよい。あるいは、任意選択でマルトデキストリン等の担体と共に、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の水溶液をスプレードライしてもよい。

本発明のさらなる態様は、食品を鉄で強化するための、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の使用であって、複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で６．６：１〜２．２：１、例えば重量で４．４：１〜２．２：１、さらなる例では重量で３：１〜２．２：１である使用である。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体からの鉄のバイオアクセシビリティが良好であるため、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で食品を強化することは有益である。さらなる利点は、可溶性鉄の他の多くの供給源とは異なり、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は熱処理又は保管中に著しい変色をもたらさないことである。

果実を含有する食品は、鉄で強化される際に変色を特に起こしやすい。それ故、果実含有食品を強化するために本発明のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を使用し得ることは特に有利である。果実は天然の状態でビタミンＣを含有し、このビタミンは鉄の吸収を助ける。本発明による果実含有食品は、果実を食品中に少なくとも１ｗｔ％の量で、例えば少なくとも２ｗｔ％の量で、さらなる例では少なくとも５ｗｔ％の量で含み得る。果実の最大量はほぼ１００ｗｔ％であり得、例えば、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体０．０１５％で強化されたフルーツピューレは、他の成分がない場合、果実を９９．９８５ｗｔ％含有する。ドライフルーツ又はフルーツパウダー等の果実加工品に関しては、１ｗｔ％は新鮮な相当果実の１重量％を意味する。果実は、例えば、新鮮な果実、新鮮な果実を切り分けたもの、フルーツパウダー、ドライフルーツ、又はフルーツピューレの形態であり得る。果実は、ポリフェノール等の食物抗酸化物質と共にビタミン、ミネラル等の有益な食物栄養素を提供する。これらの強力な栄養学的資質により、果実を含有する食品組成物は（例えば鉄による）さらなる強化のための好適なビヒクルとなる。また、果実は食品組成物に魅力的な質感及び色を加えることができる。果実は、イチゴ、ラズベリー、ブルーベリー、ブラックベリー、アンズ、西洋ナシ、バナナ、マルメロ、クコ、及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。

本発明のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体は食品を強化するために使用され得、食品はフルーツピューレ又はフルーツヨーグルトであり得る。フルーツピューレ及びフルーツヨーグルトをビタミン及びミネラルで強化することができることは有益である。フルーツピューレ及びフルーツヨーグルトは乳児及び幼児にとって好適な食品であり、フルーツピューレは一般に６〜７ヶ月の年齢から、また、フルーツヨーグルトは８〜１２ヶ月の年齢から乳児の食事に取り入れられる。乳児及び幼児にとっては、鉄が豊富な食品を含むバランスのよい食事を取ることが重要である。しかし、フルーツピューレ及びフルーツヨーグルトを鉄で強化することによって、これらが望ましくない変色を起こしやすくなる場合がある。それ故、本発明に従うラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の使用によって、変色を予防又は低減しつつフルーツピューレ及びフルーツヨーグルトを鉄で強化することが可能になるのは有利である。

当業者は、本明細書にて開示した本発明のあらゆる特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の製品のために記載された特徴は本発明の方法と組み合わせてよく、逆もまた同様である。さらに、本発明の異なる実施形態のために記載された特徴を組み合わせてもよい。周知の同等物が特定の特徴に存在する場合、そのような同等物は、本明細書で具体的に表されるかのように組み込まれる。本発明のさらなる利点及び特徴は図及び非限定例から明らかである。

図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化／Ｃａｃｏ−２細胞により測定された鉄のバイオアクセシビリティを示す。フェリチン量（ｎｇ／ｍｇタンパク質）±ＳＥＭ又はＳｔｄｅｖ（ｎ＝９）を、鉄の量が１００μｇ／ｇの異なる鉄含有化合物で強化されたＪｏｇｏｌｉｎｏサンプルに対してプロットする。対照＝未強化；Ａ＝ＦｅＳＯ_４；Ｂ＝ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄；Ｃ＝ラクトフェリン−鉄；及びＤ＝ＮａＦｅＥＤＴＡ。

実施例１（オステオポンチンの割合が高いラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の調製）：
５００ｍｇのラクトフェリン（Ａｒｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ）を５ｍＬのミリポア水に溶解させ、５００ｍｇのオステオポンチン（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ ＯＰＮ−１０，Ａｒｌａ）を別の５ｍＬのミリポア水に溶解させた。２つの溶液を１５ｍＬチューブ内で組み合わせて振盪し、１５分間静置した。０．３１９２ｇのＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（メルク社）を秤量して１５ｍＬチューブに入れ、１０ｍＬのミリポア水を添加して十分混合することによって、鉄の溶液を調製した。２００μＬの鉄溶液（１２８０μｇ Ｆｅ）をラクトフェリン及びオステオポンチンの混合物に添加し、１５分間静置した。

２つのアミコンウルトラ１５限界濾過チューブを挿入フィルターあり及びなしで計量した。ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄の混合物を分割し、２つのアミコンウルトラ１５限界濾過チューブの各々に５ｍＬをピペットで移した。すべての液体がフィルターを通過するまで、チューブを４０００ｇで３時間遠心した。各フィルターを取り除いて２〜３ｍＬのミリポア水ですすぎ、回収したタンパク質を５０ｍＬザルスタットチューブにピペットで移した。フィルターなしのアミコンチューブを計量し、濾液の重量を確定した。濾液を冷蔵庫に保存した。回収した複合体を凍結乾燥した。約８５０ｍｇの粉末を得た。

凍結乾燥した複合体のＦｅ含有量を、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により決定した。Ｆｅ含有量は１．４２５ｍｇ Ｆｅ／ｇ粉末であった。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の存在は、ＨＰＬＣ−ＩＣＰＭＳ（高性能液体クロマトグラフィー／高周波誘導結合プラズマ質量分析）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより確認した。

ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄を、重量で１：１のラクトフェリンとオステオポンチンの比で組み合わせた。これは１：２．２２のモル比である。オステオポンチンが過剰であることによって、ラクトフェリンとオステオポンチンのモル比が１：１のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体が確実に形成される。これは、複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で２．２：１である複合体である。したがって、凍結乾燥した粉末は、重量で７２．５％のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含有する。

実施例２（ラクトフェリンの割合が高いラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の調製）：
５ｍＬのミリポア水に溶解させた１０００ｍｇのラクトフェリンを、５ｍＬのミリポア水に溶解させた１００ｍｇのオステオポンチンと組み合わせたことを除いて、実施例１の手順を繰り返した。約９３５ｍｇの粉末を得た。Ｆｅ含有量は約１．５ｍｇ Ｆｅ／ｇ粉末であった。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の存在は、ＨＰＬＣ−ＩＣＰＭＳを使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより確認した。

実施例２では、ラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄を、重量で１０：１のラクトフェリンとオステオポンチンの比で組み合わせた。これは４．５：１のモル比である。ラクトフェリンが過剰であることによって、ラクトフェリンとオステオポンチンのモル比が３：１のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体が確実に形成される。これは、複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で６．６：１である複合体である。したがって、凍結乾燥した粉末は、重量で７６％のラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含有する。

実施例３（鉄強化イチゴ−バナナヨーグルト）：
バナナピュレ−を１５％、イチゴピュレ−を１０％含有する市販のヨーグルト、Ｎｅｓｔｌｅ Ｊｏｇｏｌｉｎｏ（商標）イチゴ／バナナヨーグルトを、下の表に報告されるように種々の鉄含有材料を５ｋｇのヨーグルトに添加することによって鉄強化した。量は、ヨーグルト１００ｇ当たり約０．８ｍｇの鉄が提供されるように選択した。そのような量の鉄を含むヨーグルトを１００ｇ摂取すれば、乳児に推奨される鉄の１日量の１５％が提供される［Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００６／１２５／ＥＣ］。

硫酸第一鉄及びＥＤＴＡ鉄ナトリウムはＤｒ Ｐａｕｌ Ｌｏｈｍａｎｎ（商標）から入手した。ラクトフェリンはＡｒｍｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｅｓから入手した。

ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体（試験Ｂ）については、実施例１の粉末をヨーグルト５ｋｇ当たり２８ｇの量でヨーグルトに添加した。得られたヨーグルト組成物は、キログラム当たり４ｇのＬＦ−ＯＰＮ−Ｆｅ複合体に相当するキログラム当たり５．６ｇの粉末を含んでいた。

ヨーグルトを１０５℃で２分間、低温殺菌した。Ｘ−Ｒｉｔｅ ＣｏｌｏｒＥｙｅ ７０００Ａ色差計を使用して１×１ｃｍのポリスチレンキュベット内で色測定を行った。色差計は、Ｄ６５光源、１０°の観測角に設定し、かつ正反射成分が含まれるように設定した。鉄塩非含有ヨーグルトと鉄強化ヨーグルトとの色差を各鉄塩について測定し、ＣＩＥＬＡＢカラースケールを用いてΔＥａｂ^＊として表した。

ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で強化したヨーグルトは、低温殺菌の際に示した変色が最小であった。

実施例４（鉄強化イチゴ−バナナヨーグルトの鉄のバイオアクセシビリティ）：
種々の鉄含有化合物で強化したヨーグルトにおける鉄のバイオアクセシビリティを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化を組み合わせたＣａｃｏ−２細胞を用いて測定した［Ｒ．Ｐ．Ｇｌａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６４（５），９２５−９２８．（１９９９）］。すべてのヨーグルトにおける鉄の量は１００μｇ／ｇであった。

要約すると、まず、ヨーグルトをｐＨ＝２、３７℃で１時間、ペプシンで模擬胃内消化させた。本工程に続き、ｐＨ＝７、３７℃で２時間、パンクレアチン及び胆汁で模擬腸内消化させた。この第２の工程は、Ｃａｃｏ−２単層膜の存在下、透析膜上で行われた。消化工程の間、鉄は食品マトリックスから放出される。次いで、可溶化Ｆｅは拡散して細胞に取り込まれることができる。こうして、細胞内Ｆｅ濃度の上昇に応答してＣａｃｏ−２はフェリチンを形成する。それ故、フェリチンの形成は、細胞によるＦｅの取り込みの指標として定量化される。フェリチンは、消化の２４時間後に、採取したＣａｃｏ−２細胞内でＥＬＩＳＡにより測定される。結果は、Ｃａｃｏ−２細胞の総タンパク質含有量で標準化され、ｎｇフェリチン／ｍｇタンパク質として表される。結果のロバスト性を確保するために、同じバッチの細胞を３連で使用して別々の日に３つの実験を行った。同じ処理から収集したデータをプールした。酵素及び緩衝液をブランクとして使用する。Ｆｅ １００μｇ／ｇで強化したＮａＦｅＥＤＴＡを内部標準及び陽性対照（Ｄ）として使用した。ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体で強化したヨーグルト（Ｂ）は、ＦｅＳＯ_４で強化したヨーグルト（Ａ）と類似したバイオアクセシビリティを有することが判明した。図１を参照のこと。

Claims (14)

1. 鉄欠乏症の治療又は予防における使用のための、少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む組成物。
2. 前記複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で６．６：１〜２．２：１である、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. 経口又は経腸投与するための、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
4. 早産児又は低出生体重児に投与するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
5. 妊娠中又は授乳中の女性に投与するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
6. 少なくとも２ｇ／ｋｇのラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を含む強化食品。
7. 前記複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で６．６：１〜２．２：１である、請求項６に記載の強化食品。
8. 前記食品が、乳製品；料理用製品；乳児用食品；妊婦又は出産後間もない母親用の食品、飲料；ビスケット、ケーキ若しくはペーストリー製品；デザート；栄養配合物、又はペット食品である、請求項６又は７に記載の強化食品。
9. １０５℃での２分の熱処理の後、ΔＥａｂ^＊として測定される強化食品の変色が３．５未満である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の強化食品。
10. 食品を鉄で強化するための方法であって、水溶液中に存在するラクトフェリン、オステオポンチン及び鉄を組み合わせることによってラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を形成するステップと、食品を調製するステップと、前記ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を前記食品に添加するステップと、を含み、前記複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で４．４：１〜２．２：１である、方法。
11. 前記ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体を乾燥させて粉末を形成するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 食品を鉄で強化するための、ラクトフェリン−オステオポンチン−鉄複合体の使用であって、前記複合体におけるラクトフェリンとオステオポンチンの比が重量で４．４：１〜２．２：１である使用。
13. 前記食品が果実を含む、請求項１２に記載の使用。
14. 前記食品がフルーツピューレ又はフルーツヨーグルトである、請求項１２又は１３に記載の使用。