JP6325858B2 - 薬効評価方法および画像処理装置 - Google Patents

Description

この発明は、培地内で培養された細胞に対する化学物質の薬効を評価する薬効評価方法および該評価に好適な画像処理装置に関するものである。

新たな医薬品を開発する創薬の技術分野では、特定の細胞、例えばがん細胞に対し薬効を示す薬剤を見出すためのスクリーニングが行われる。このスクリーニングでは、培養された細胞に薬剤候補となる化学物質を投与して細胞の変化を観察する（例えば、特許文献１参照）。従来の一般的なスクリーニング方法では、細胞の活動によって特定の生化学的反応を示す試薬が候補薬剤とともに添加され、生化学的反応により生成される物質や発光の量を計測することにより、細胞の活性度が判定される。このようなスクリーニング方法としては、例えばＡＴＰアッセイやＭＴＴアッセイなどが知られている。

このようなスクリーニング方法においては、試薬が高価であること、生化学的反応が現れるまでに比較的長時間を要すること、試薬が細胞の活動に影響を与えてしまい経時的な実験が行えないことなどの問題がある。

一方、観察対象となる細胞に影響を与えることなく観察を行う方法として、顕微鏡等を用いて細胞を撮像する技術も提案されている。例えば特許文献２に記載の技術では、培養液中の細胞の立体像を撮像するために、顕微光学系の焦点位置を深さ方向に多段階に変更しながらその都度撮像を行うことで、擬似的に細胞の三次元画像を得ている。

特開２０１１−０６２１６６号公報 国際公開第２００９／１０７３２１号

特許文献２に記載の撮像技術は、培養液が注入された容器の底面に付着した状態で培養（平面培養）された細胞を撮像するのに適している。一方、近年では、薬効評価の精度および効率の向上のために、立体的に培養された細胞集塊を用いてスクリーニングを行うことが求められるようになってきている。というのは、生体内での病変部位は多数の細胞が集まった立体的構造を有していることから、平面培養された細胞を用いた従来の薬効評価の結果が生体における薬効と一致しないことがあり、より生体に近い条件での評価が必要となってきているからである。

この目的のために、立体的に培養された細胞集塊が化学物質の投与によってどのように変化するかを簡便に観察することのできる技術の確立が望まれているが、上記従来技術を含めて、これまでこのような要求に応えることのできる技術は存在しなかった。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、化学物質が細胞集塊にどのような薬効を及ぼすかをより的確に評価することを可能とする技術を提供することを目的とする。

この発明の一の態様は、容器に担持された液体内の細胞集塊に投与された化学物質の薬効を評価する薬効評価方法であって、上記目的を達成するため、前記細胞集塊を、鉛直面と略一致する断面で断層撮像した断層画像を取得する工程と、前記断層画像に基づき、前記細胞集塊の特徴量を算出する工程と、前記特徴量の算出結果に基づいて、前記化学物質の薬効を判定する工程とを備えている。

このように構成された発明では、略鉛直方向の断面における細胞集塊の鉛直方向断面における断層画像から求められる細胞集塊の特徴量に基づき、化学物質の薬効が評価される。詳しくは後述するが、化学物質が細胞集塊に及ぼす作用についての本願発明者らの知見は以下の通りである。

活性の高い細胞からなる細胞集塊は、培養液のような液体内で比較的球形度の高い形状を示す。一方、投与された化学物質の薬効により細胞の死滅や活性度の低下が起きると、細胞集塊が収縮したり、その球形度が低下したりするなどの変化が現れる。本願発明者らの知見では、このような細胞集塊の崩壊に伴う形状の変化は細胞集塊の下部または下方に生じやすい。すなわち、細胞同士の結合が維持できなくなった細胞集塊は重力により下方へ向かって崩れてゆき、また死滅した細胞は集塊から遊離して落下する。

このことから、細胞集塊の上面を撮像するのではなく、側面、より好ましくは鉛直方向の断面の像を撮像し観察することが有効である。そこで、この発明では、鉛直面と略一致する断面で断層撮像した断層画像から細胞集塊の特徴量を求め、その結果に基づいて化学物質の薬効を評価する。こうすることで、化学物質の作用に伴う細胞集塊の形状の変化を確実に検出して、細胞集塊に対する当該化学物質の薬効の評価を的確に、また効率よく行うことが可能となる。

本発明は、断層画像に基づき細胞集塊から遊離して容器の底面に堆積した遊離細胞を検出する工程をさらに備え、特徴量の算出結果と遊離細胞の検出結果とに基づいて化学物質の薬効を判定するように構成されてもよい。上記したように、死滅した細胞は細胞集塊から離脱して容器の底に堆積するから、このような遊離細胞の存在は当該化学物質の薬効の有力な証拠となり得る。したがって、単に細胞集塊の形状のみに注目するのでなく、その周囲、特に容器底部に堆積した遊離細胞の有無や量を検出し評価を行うことで、その精度をより向上させることができる。

また本発明は、例えば、互いに異なる複数の断面について断層画像を取得するように構成されてもよい。細胞集塊の形状は完全な球体ではないから、このように複数の断層画像を用いて評価を行うことで、評価の精度をより向上させることが可能となる。

この場合において、例えば、複数の断層画像に基づく画像処理により、細胞集塊の表面の立体像を作成する工程がさらに設けられてもよい。多数の断層画像を収集することで、細胞集塊を擬似的に立体撮像することができる。断層画像から細胞集塊の立体像を作成しておけば、例えば細胞集塊の形状や表面状態を種々の視野方向から観察することが可能となる。これにより、特徴量の算出結果と合わせた総合的な評価が可能となって、評価精度の向上を図ることができる。

また、本発明で用いられる特徴量としては、例えば、細胞集塊の表面積、細胞集塊の体積、細胞集塊の表面の曲率および細胞集塊の表面の曲率半径の少なくとも１つを用いることが可能である。細胞集塊の表面積および体積からは、細胞集塊のサイズを知ることができる。また、細胞集塊の表面の曲率および曲率半径からは、細胞集塊の表面形状を知ることができる。これらはいずれも、細胞集塊が成長しているか衰弱しているかを判断するための情報として利用することができる。

特に、互いに異なる断面それぞれにおける細胞集塊の表面の曲率を特徴量として含むようにすれば、それらを比較することで、細胞集塊が球形を維持しているか、あるいは形状が崩れているかを判断することが可能となる。

また本発明は、例えば、所定の時間間隔をおいて複数回、細胞集塊の断層撮像を行い、各撮像で取得される断層画像から特徴量の経時変化を求め、その結果に基づいて化学物質の薬効を判定するように構成されてもよい。このように時間の経過に伴う細胞集塊の変化を調べることで、当該化学物質の薬効をより的確に判断することが可能となる。撮像対象物に対し非接触、非破壊で撮像を行うことができる断層撮像技術、例えば光干渉断層撮像技術が実用化されており、これを適用することで、細胞集塊に影響を及ぼすことなく撮像を行うことができる。そのため、細胞集塊の経時変化を観察することが可能である。

また、上記目的を達成するため、液体内の細胞集塊を鉛直面と略一致する断面で断層撮像した複数の断層画像を取得する画像取得手段と、前記複数の断層画像に基づき、前記細胞集塊の表面の立体像を作成する立体像作成手段と、前記複数の断層画像または前記立体像に基づき、前記細胞集塊の特徴量を算出する特徴量算出手段とを備える画像処理装置が本発明の実施に用いられてもよい。

細胞集塊の光学像を観察して薬効を確認する場合、これまでは二次元画像（例えば細胞集塊を上方から撮像した画像）を基に細胞集塊のサイズが計測されて成長または衰弱の有無が判断される程度であった。一方、上記の画像処理装置は、略鉛直方向を断面とする複数の断層画像から細胞集塊の立体像を作成し、さらに細胞集塊の特徴量を算出する機能を有する。そのため、前記した薬効評価方法を実施するのに極めて有効なものである。すなわち、細胞集塊の立体像が作成されることで、種々の視野方向からの細胞集塊の観察が可能となり、また細胞集塊の形状が特徴量の値により定量的に示される。したがって、細胞集塊の外観的特徴や特徴量に基づく総合的な薬効評価が可能となる。このように、上記の画像処理装置は、化学物質の薬効評価を行おうとする利用者に対し的確な情報を提供して、その作業を極めて効果的に支援することが可能である。

上記の画像処理装置は、例えば、特徴量算出手段は、立体像に基づき求められた、細胞集塊の表面に対応する近似曲面について特徴量を算出するように構成されてもよい。細胞集塊は多数の細胞の集まりであり、その表面には個々の細胞の表面に対応する不規則な凹凸が現れる。このような細かい凹凸は細胞集塊全体としての特徴を表すものではないから、より単純な曲面に近似して特徴量を求めることで、細胞集塊の形状的特徴をより的確に定量化することができる。

また上記の画像処理装置は、例えば、細胞集塊が含まれる液体を担持する容器を保持する保持手段をさらに備え、画像取得手段は、容器内の細胞集塊を断層撮像する撮像装置を有する構成であってもよい。断層画像は外部の撮像装置により撮像されたものであってもよいが、上記の画像処理装置が容器を保持する保持手段と撮像装置とを備えることにより、薬効評価という目的に最適な断層画像を取得することが可能となる。このような撮像が可能な撮像装置としては、前記したように、例えば光干渉断層撮像装置を用いることが可能である。

また上記の画像処理装置は、例えば、立体像を表示し、しかも、表示画像における細胞集塊に対する視野の方向を変更可能な表示手段を備える構成であってもよい。このような構成によれば、細胞集塊の外観的特徴に関する種々の情報を利用者に対して提供することができ、利用者は表示画像および算出された特徴量から、総合的な薬効評価を行うことが可能となる。

本発明の薬効評価方法では、化学物質の作用による細胞集塊の変化を確実に検出して、細胞集塊に対する当該化学物質の薬効の評価を的確にかつ効率よく行うことができる。また、本発明の実施に画像処理装置を適用すれば、このような薬効評価を行う者を極めて効果的に支援することができる。

本発明にかかる画像処理装置の一実施形態を示す図である。 この画像処理装置における撮像原理を説明する図である。 この画像処理装置の動作を示すフローチャートである。 断層画像および立体像の例を示す図である。 この実施形態における薬効評価方法を示すフローチャートである。 衰弱するスフェロイドの一例を示す図である。 衰弱するスフェロイドの他の例を示す図である。 スフェロイドの鉛直断面を模式的に示す図である。

図１は本発明にかかる画像処理装置の一実施形態を示す図である。この画像処理装置１は、本発明にかかる薬効評価方法を実施するために有益な情報を提供することが可能であり、この機能により、使用者による薬効評価方法の実施を極めて効果的に支援することができるものである。以下、この画像処理装置１の構成と、この装置を用いて行うことのできる本発明の薬効評価方法の一実施形態とについて、順に説明する。なお、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。

この画像処理装置１は、液体（例えば培養液）中で培養されたスフェロイド（細胞集塊）を断層撮像する。そして、これにより得られた断層画像を画像処理して、スフェロイドの立体像を作成するとともに、断層画像または立体像に基づいてスフェロイドの外観的特徴を定量的に示す特徴量の算出を行う。

画像処理装置１は、板状部材の上面に液体を担持可能な窪部（ウェル）Ｗが多数形成されたウェルプレート（マイクロプレートとも称される）ＷＰを、ウェルＷの開口面を上向きにして略水平姿勢に保持する保持部１０を備えている。ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには予め適宜の培養液が所定量注入されており、液中ではウェルＷの底面ＷｂにスフェロイドＳｐが培養されている。図１では一部のウェルＷにのみスフェロイドＳｐが記載されているが、各ウェルＷでスフェロイドＳｐが培養される。

保持部１０により保持されたウェルプレートＷＰの上方に、撮像ユニット２０が配置される。撮像ユニット２０は、撮像対象物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能なものであり、ここではその一例として、光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられるものとする。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像ユニット２０は、撮像対象物への照明光を発生する光源２１と、光源２１からの光を分割するビームスプリッタ２２と、対物レンズ２３と、基準ミラー２４と、光検出器２５と、これらを一体的に保持・収容する筐体２６とを備えている。

また、画像処理装置１はさらに、装置の動作を制御する制御ユニット３０と、撮像ユニット２０の可動部を駆動する走査駆動機構４０とを備えている。制御ユニット３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３１、Ａ／Ｄコンバータ３２、３Ｄ復元部３３、特徴量算出部３４、インターフェース（ＩＦ）部３５、画像メモリ３６およびメモリ３７を備えている。

ＣＰＵ３１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司り、ＣＰＵ３１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータはメモリ３７に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３２は、撮像ユニット２０の光検出器２５から受光光量に応じて出力される信号をデジタル画像データに変換する。３Ｄ復元部３３は、撮像ユニット２０により撮像された複数の断層画像の画像データに基づいて、撮像された細胞集塊の立体像（３Ｄ像）を作成する機能を有する。特徴量算出部３４は、撮像ユニット２０により撮像された１つまたは複数の断層画像、もしくは３Ｄ復元部３３により作成された立体像の画像データに基づき、細胞集塊の形態的特徴を定量的に示す特徴量を算出する機能を有する。撮像ユニット２０により撮像された断層画像の画像データおよび３Ｄ復元部３３により作成された立体像の画像データは、画像メモリ３６により適宜記憶保存される。

インターフェース部３５は画像処理装置１と外部との通信を担う。具体的には、インターフェース部３５は、外部機器と通信を行うための通信機能と、ユーザからの操作入力を受け付けたり各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能とを有する。この目的のために、インターフェース部３５には、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力デバイス３５１と、撮像ユニット２０により撮像された断層画像や３Ｄ復元部３３により作成された立体像、特徴量算出部３４により算出された特徴量の値など各種の処理結果を表示する例えば液晶ディスプレイからなる表示部３５２とが接続されている。

また、ＣＰＵ３１は走査駆動機構４０に制御指令を与え、これに応じて走査駆動機構４０は撮像ユニット２０に所定の走査移動を行わせる。次に説明するように、走査駆動機構４０により実行される撮像ユニット２０の走査移動と、光検出器２５による受光光量の検出との組み合わせにより、撮像対象物である細胞集塊の断層画像が取得される。

図２はこの画像処理装置における撮像原理を説明する図である。より具体的には、図２（ａ）は撮像ユニット２０における光路を示す図であり、図２（ｂ）はスフェロイドの断層撮像の様子を模式的に示す図である。なお、原理を理解しやすくするために、図２では、撮像ユニット２０の各構成のうち筐体２６および撮像光学系における一般的な対物レンズと同等である対物レンズ２３の記載を省いている。前記したように、撮像ユニット２０は光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置として機能するものである。

撮像ユニット２０では、例えばレーザダイオードまたは発光ダイオードなどの発光素子を有する光源２１から低コヒーレンス光ビームＬ１が出射される。光ビームＬ１はビームスプリッタ２２に入射し、破線矢印で示すように一部の光Ｌ２がウェルＷに向かい、一点鎖線矢印で示すように一部の光Ｌ３が基準ミラー２４に向かう。

ウェルＷに向かった光Ｌ２は、ウェルＷに担持された培養液内のスフェロイドＳｐに入射し、スフェロイドＳｐにより反射される。スフェロイドＳｐが光ビームＬ２に対する透過性を有するものでなければ光ビームＬ２はスフェロイドＳｐの表面で反射される。一方、スフェロイドＳｐが光ビームＬ２に対してある程度の透過性を有するものである場合、光ビームＬ２はスフェロイドＳｐ内まで進入してその内部の構造物により反射される。光ビームＬ２として例えば近赤外線を用いることで、入射光をスフェロイドＳｐ内部まで到達させることが可能である。

スフェロイドＳｐの表面もしくは内部で反射された光Ｌ４と、基準ミラー２４で反射された光Ｌ５とは、ビームスプリッタ２２を介して光検出器２５に入射する。このとき、スフェロイドＳｐでの反射による破線で示される光路の長さと、基準ミラー２４での反射による一点鎖線で示される光路の長さとが等しければ、光検出器２５に入射する２つの光の間で干渉が生じる。ここで、光源２１からの光のコヒーレンス長（可干渉距離）が十分短いとき、スフェロイドＳｐからの反射光のうち、その光路長が基準ミラー２４からの反射光の光路長に相当する深さ（Ｚ方向位置）の反射面からの反射光のみが、基準ミラー２４からの反射光と干渉する。

光検出器２５が干渉光を検出することで、スフェロイドＳｐのうち、基準ミラー２４の位置に対応する特定の深さの反射面からの反射光を選択的に検出することができる。矢印Ａ１で示すように、基準ミラー２４の位置を変化させることにより、スフェロイドＳｐの任意の深さからの反射光を検出することができる。これにウェルＷに入射する光Ｌ２のＸ方向への走査を組み合わせ、光検出器２５により干渉光を随時検出することで、Ｚ軸と平行な鉛直面のうち、ＸＺ平面と平行な面を断面とするスフェロイドＳｐの断層画像を撮像することができる。

矢印Ａ２で示すように、ウェルＷに対する撮像ユニット２０の相対位置をＹ方向に多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像を行うことで、図２（ｂ）に示すように、スフェロイドＳｐをＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像Ｉｔを得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、スフェロイドＳｐの立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。撮像ユニット２０における上記各部の走査移動は、ＣＰＵ３１から制御指令を受けた走査駆動機構４０の作動によって実現される。

図３はこの画像処理装置の動作を示すフローチャートである。最初に、撮像すべきスフェロイドＳｐが培養液とともに担持されたウェルプレートＷＰが、ユーザまたは搬送ロボットにより保持部１０にセットされる（ステップＳ１０１）。ＣＰＵ３１は、撮像ユニット２０および走査駆動機構４０を制御して、ウェルＷ内のスフェロイドＳｐの断層撮像を行う（ステップＳ１０２）。

より詳しくは、光ビームを走査することでスフェロイドＳｐに対する入射位置をＸ方向に変化させるとともに、基準ミラー２４の位置を変化させることで反射光を受光する受光面のＺ方向位置を変更しつつ光検出を行うことで、ＸＺ平面に平行な平面、つまりＹ方向に垂直な鉛直面を断面とするスフェロイドＳｐの断層画像を得る。そして、ウェルＷに対し撮像ユニット２０をＹ方向に移動させることで断面のＹ方向位置を変化させながら、当該断面におけるスフェロイドＳｐの断層画像を撮像する。これを繰り返すことで、Ｙ方向に互いに位置の異なる断面についての多数の断層画像が取得される。これらの画像データは画像メモリ３６に記憶保存される。

こうして得られた画像データに基づき、３Ｄ復元部３３が、スフェロイドＳｐの立体像に対応する３Ｄ画像データを作成する（ステップＳ１０３）。具体的には例えば、Ｙ方向に離散的に取得された断層画像データをＹ方向に補間することにより、３Ｄ画像データを求めることが可能である。断層画像データから３Ｄ画像データを作成する技術は既に実用化されているので詳しい説明を省略する。

図４は断層画像および立体像の例を示す図である。図４（ａ）に示すように、Ｙ方向に位置を変えながらＸＺ平面に平行な断面でスフェロイドＳｐを撮像した多数の断層画像（二次元画像）Ｉ２から、図４（ｂ）に示すように、スフェロイドＳｐの全体的外観を示す立体像（三次元画像）Ｉ３が作成される。図４（ａ）に例示する断層画像Ｉ２では、スフェロイドＳｐの表面、すなわちスフェロイドＳｐの内部と培養液との界面が明瞭に表れているほか、スフェロイドＳｐ内部の構造、具体的にはスフェロイドＳｐを構成する多数の細胞間の界面に対応する細かいテクスチャが見受けられる。一方、図４（ｂ）に示す立体像では、スフェロイドＳｐの表面の形状が明瞭に示される。

なお、図４（ａ）において画像下部に現れている弧状の白い筋はウェルＷの底面Ｗｂの像であり、使用されたウェルプレートＷＰにおいてウェルＷの底面Ｗｂが中央に向かって僅かに窪んだ形状となっていたため、このような弧状の像として現れている。図４（ｂ）の画像下部の白い平板状の像も同様である。これは後出の各図においても同様である。

このようにして断層画像から作成される３Ｄ画像データは、仮想的なＸＹＺ画素空間を構成する各画素の座標とその画素値とを対応付けたものである。このような３Ｄ画像データが作成されると、以後はこれを用いて種々の処理を行うことができる。例えば、スフェロイドＳｐを種々の視野方向から見た画像に対応する画像を画像処理によって作成し表示部３５２に表示させることで、ユーザはあたかもスフェロイドを目の前にして任意の方向から見ているかのような感覚でその外形や表面形状の観察を行うことができる。

図３に戻って、画像処理装置１の動作説明を続ける。図４（ｂ）に例示されるように、スフェロイドＳｐの表面には細胞の界面に相当する細かい凹凸がある。後述するように、本発明にかかる薬効評価方法ではスフェロイドＳｐの全体的な形状的特徴に基づいて判断がなされるので、スフェロイドＳｐの特徴を定量的に表すのにこのような細かい凹凸は却って誤差要因となり得る。そこで、スフェロイドＳｐの表面をより単純な、つまり凹凸の少ない曲面に近似した近似曲面を求める（ステップＳ１０４）。その算出方法としては種々の近似計算が考えられ、その一例については後に説明する。

求められた近似曲面はスフェロイドＳｐの包絡外形を表す曲面であり、スフェロイドＳｐを構成する個々の細胞の状態に関する情報は少ないが、スフェロイドＳｐ全体の形状的特徴をより明確に表すものである。この近似曲面を用いて、特徴量算出部３４が、スフェロイドＳｐの特徴を定量的に示す特徴量を算出する（ステップＳ１０５）。

後述する本発明の薬効評価方法では、薬剤候補となる化学物質を投与されたスフェロイドＳｐの形状がどのように変化するかによって、当該化学物質の薬効が評価される。特に、正常なスフェロイドが培養液中で球形に近い形状となる一方、化学物質によりダメージを受けたスフェロイドは収縮したり形状が崩れることから、このような変化を定量的に検出することができる特徴量が用いられる。例えば、スフェロイドの直径、体積およびその表面積、スフェロイド表面の曲率および曲率半径、ならびにスフェロイドの球形度などが、特徴量として算出される。近似曲面を用いてこれらの特徴量を求めることで、スフェロイドの表面状態に起因する算出誤差を低減することができる。

ここで、前記した近似曲面の算出方法の一例を説明する。ＸＹＺ画素空間における近似曲面を方程式ｚ＝ｆ（ｘ，ｙ）により表すこととし、この関数ｆを、３Ｄ画像データに基づき求めればよい。３Ｄ画像データから滑らかな曲面を求めるために最小二乗近似を行うこととし、ここでは簡便な例として平面近似、すなわち次式：
ｚ＝ａｘ＋ｂｙ＋ｃ … （式１）
を用いる。点列（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ，ｚ_ｉ）、ｉ＝１〜ｎ（ｎは自然数）があるとき、上記（式１）にｘ_ｉ、ｙ_ｉを代入して得られたｚの値とｚ_ｉとの差の二乗和が最小となるような定数ａ、ｂ、ｃの値を求める。具体的には、最小二乗和の式を定数ａ、ｂ、ｃそれぞれを変数として偏微分した式の値を０とした方程式を連立させて解けばよい。

行列式を用いた解法の一例を示す。（式１）にｘ_ｉ、ｙ_ｉを代入して得られるｚの値の集合をベクトルＺにより表すこととすると、ベクトルＺを次式により表すことができる。

ここで、次式を定義し、未知数ベクトルＸを求める。

係数行列Ｇは長方形行列であるため、演算が煩雑である。そこで、（式２）の両辺に転置行列^ｔＧを作用させると、
^ｔＧＺ＝^ｔＧＧ・Ｘ … （式４）
となり、未知数ベクトルＸは次式：
Ｘ＝（^ｔＧＧ）^-1・^ｔＧＺ … （式５）
と表すことができる。行列^ｔＧＧは正規行列であり、正方行列となっている。（式５）の右辺については、例えばガウスの掃出し法を用いて次のように解くことができる。

これらの結果から、未知数ベクトルＸが求められ、定数ａ、ｂ、ｃの値が求まる。これを（式１）に代入して、近似曲面の方程式が得られる。

以上は一次方程式による平面近似の場合であるが、より高次の方程式でも同様に考えることが可能である。

例えば二次方程式の場合、
ｚ＝ｆ（ｘ，ｙ）＝ａｘ²＋ｂｙ²＋ｃｘｙ＋ｄｘ＋ｅｙ＋ｆ … （式８）
とおき、６つの定数ａ〜ｆを未知数とし、（式２）の係数行列Ｇに代えて、値１，ｘ_ｉ,ｙ_ｉ，ｘ_ｉｙ_ｉ，ｘ_ｉ ²，ｙ_ｉ ²を１行の要素とするｎ行６列の係数行列を用いて方程式を立てる。

そして、上記と同様に転置行列を用いて６×６の正規行列を持つ方程式に変換し、未知数ａ〜ｆを求めればよい。

次に、求められた近似曲面上の任意の点Ｐにおける近似曲面の曲率の求め方を説明する。曲面の曲率は、ガウス曲率Ｋと平面曲率Ｈとの２つを用いて表すものとする。曲面の方程式ｚ＝ｆ（ｘ，ｙ）に対して、下記パラメータを設定する。

そうすると、ガウス曲率Ｋおよび平面曲率Ｈは下式により定義することができる。座標が画素単位で離散的に表される画素空間において曲率を求めるに際しては、（式９）における微分を画素ピッチでの差分に置き換えて数値計算を行うことが可能である。

次に、上記のように構成された画像処理装置１を用いた、化学物質の薬効評価方法について説明する。従来は、培養液中で二次元培養された標的細胞に薬剤候補である化学物質を投与し、細胞の生存能力（バイアビリティ）がどのように変化するかを観察することで、当該化学物質の薬効が評価されてきた。しかしながら、近年では、このようにして薬効が認められた化学物質が生体内では同様の薬効を示さないという例が生じてきている。その原因の１つは、標的細胞は生体内で多数が塊となって立体的な構造を有しているのに対し、薬効の確認が二次元培養された細胞で行われていることにあると考えられる。すなわち、二次元培養された細胞では投与された化学物質が多くの細胞に触れるため薬効が現れやすい一方、三次元的構造を有する細胞では塊の内部に位置する細胞には化学物質が届きにくく、薬効が出にくい。

このことから、培養液中で三次元培養された標的細胞の集塊を用いて薬剤候補である化学物質の薬効を評価する必要性が高まっている。しかしながら、このような三次元構造を有する細胞集塊、すなわち培養液中のスフェロイドの状態を仔細に観察することのできる技術が確立されておらず、的確かつ効率のよい評価を行うことができる環境はこれまで整っていなかった。上記した画像処理装置１はこのような観察に好適なものであり、これを利用することで、化学物質の薬効評価（スクリーニング）をより的確に、しかも効率よく行うことが可能となる。

図５はこの実施形態における薬効評価方法を示すフローチャートである。まず、ウェルプレートＷＰの各ウェルＷに適宜の培養液を注入し、その内部で標的となる細胞を培養してスフェロイドＳｐを成長させる（ステップＳ２０１）。そして、各ウェルＷに対して、評価対象である化学物質をそれぞれ所定量ずつ投与する（ステップＳ２０２）。

こうして化学物質が投与されたスフェロイドＳｐを、画像処理装置１により画像データ化する（ステップＳ２０３）。すなわち、断層画像の撮像と、それにより得られた画像データに基づく演算が、画像処理装置１によってなされる。撮像は、化学物質が投与されて所定時間経過後に１回のみ行われてもよいが、一定時間ごとに複数回撮像を行う、いわゆるタイムラプス撮像が行われてもよい。画像処理装置１によりスフェロイドＳｐの断層画像データ、立体像データおよび特徴量が求められると、これらの情報に基づき総合的に当該化学物質の薬効が評価される（ステップＳ２０４）。

薬効があればスフェロイドＳｐは衰弱し収縮する。したがって、時間をおいて撮像された画像の各々から算出された特徴量のうちスフェロイドＳｐの直径、表面積または体積が経時的に減少を示していれば、薬効があったものと判断することができる。これらの特徴量に有意な変化がない、または増加している場合には、薬効がないと判断することができる。なお、スフェロイドＳｐの体積については、ある断面方向におけるスフェロイドＳｐの断面積を断面方向と垂直方向に積分することにより算出可能であり、例えば撮像により得られた複数の断層画像から直接算出することも可能である。体積Ｖが求められると、次式：
Ｖ＝４πｒ³／３
の関係から、スフェロイドＳｐと同じ体積を有する球の半径ｒが算出できる。この値ｒを曲率半径としてもよく、その場合、曲率は（１／ｒ）により表される。

ただし、次に説明するように、これらの情報のみからではスフェロイドＳｐのバイアビリティを判断することが難しいケースもある。

図６は衰弱するスフェロイドの一例を示す図である。この図の画像例では、スフェロイドをその側方よりもやや上から見下ろす方向に視野方向が設定されている。図６（ａ）はバイアビリティの比較的高いスフェロイドの画像（立体像）であり、多数の細胞が集まって略球形をなしている。ただし画像の右下部分に崩壊の兆候が現れている。

一方、図６（ｂ）は衰弱して崩壊し始めたスフェロイドの画像であり、図６（ｃ）はさらに崩壊が進んだスフェロイドの画像である。これらの例では、細胞間の結合が弱まって球形が維持できなくなり、形状の不規則な集塊となっている。これらの場合、表面積や体積などの特徴量、あるいは上方からの観察だけでは図６（ａ）の状態との識別が難しいことがあるが、定性的には、種々の視野方向から立体像を観察することで形状の崩れを発見することは比較的容易である。また定量的には、スフェロイド表面の曲率や球形度などの特徴量の変化を見ることで、球形形状からの崩壊を検出することが可能である。

スフェロイドＳｐの表面（またはその近似曲面）が完全な球面とはならないことから、互いに異なる２以上の方向の断面から見た曲率を相互に比較することが、形状の崩れを検知するために有効である。細胞のバイアビリティが低下したスフェロイドＳｐでは重力の作用により下方、つまりウェルＷの底面に向かって落ち込むように崩れてゆく。したがって、スフェロイドＳｐを水平方向から見たときの表面の曲率が、特に大きく変化すると考えられる。このことから、水平方向に（すなわちＸＹ平面上で）見た曲率Ｒxyと、鉛直方向に（例えばＸＺ平面上で）見た曲率Ｒxzとの間に有意な差異があるとき、スフェロイドＳｐが崩壊している、つまり薬効が現れていると判断することができる。表示画像からこのことを確認する場合には、特に水平方向に近い方向からスフェロイドＳｐを観察することが有効である。

図７は衰弱するスフェロイドの他の例を示す図である。図７（ａ）は崩壊が始まった別のスフェロイドの立体像の例である。図７（ｂ）は図７（ａ）のＡ−Ａ矢視断面図であり、鉛直面を断面としてスフェロイドを水平方向から見たときの像に相当する。この例では、スフェロイドは球形に比較的近い形状を留めているが、ウェル底面Ｗｂに、スフェロイドの周囲を取り巻くように粒状の物体が分布している。

図７（ｃ）および図７（ｄ）はそれぞれ、図７（ｂ）のＢ−Ｂ矢視断面図、Ｃ−Ｃ矢視断面図であり、いずれもスフェロイドを水平断面で見た断面図である。ウェル底面Ｗｂから比較的離れた水平断面で見た図７（ｃ）では、スフェロイドの外周が比較的円形に近い形状となっている。これに対し、よりウェル底面Ｗｂに近い水平断面で見た図７（ｄ）では、中央部分で塊となったスフェロイド周囲の例えば白丸印で囲んだ位置に、形状不定で不鮮明な像が見受けられる。これもウェル底面Ｗｂに分布する粒状物の像である。なお図７（ｄ）において、スフェロイドから離れた位置でスフェロイドを囲むように広がる弧状の白い領域は、湾曲したウェル底面Ｗｂの一部が映り込んだものである。

これらの画像においてウェル底面Ｗｂに分布する粒状物は、スフェロイドから遊離して沈みウェルＷの底に堆積した遊離細胞またはその残滓（デブリ）である。化学物質が細胞のバイアビリティを低下させることで生じる現象としては、スフェロイドＳｐの表面付近の細胞がその位置に留まることができなくなって遊離するケースもある。遊離した細胞は活性度が低く、培養液の底に沈殿してウェル底面Ｗｂに堆積する。したがって、このような遊離細胞やデブリの有無および量は、薬効を指標する有効な情報として利用することができる。遊離細胞等の有無については、表示部３５２に表示される画像から目視観察により判断することができるほか、例えば図７（ｄ）に示すようにウェル底面Ｗｂに近い水平断面を示す画像から画像処理によって自動的に検出が行われるようにしてもよい。

これらの情報、すなわち、断層画像から再構成された立体像に基づく種々の視野方向からのスフェロイドの目視観察結果や、算出された各種の特徴量から総合的にスフェロイドの変化を検証することで、主観的判断に頼ったり細胞にダメージを与える従来のスクリーニング技術に比べて、より的確で効率的な薬効の評価を行うことが可能となる。したがって、各種化学物質のスクリーニングをより効率よく行うことができる。鉛直面と略一致する断面における断層画像を用いて評価に供することでその効果が顕著となる。その理由を以下に説明する。

図８はスフェロイドの鉛直断面を模式的に示す図である。図８（ａ）はバイアビリティの高いスフェロイドＳｐを示しており、その鉛直断面は略円形となる。同様に、このスフェロイドＳｐを上方から下向きに撮像した場合や、水平断面で断層撮像した場合でも、その外形は略円形となる。図８（ｂ）は部分的に崩壊したスフェロイドＳｐを示しており、崩壊に伴う形状変化はスフェロイドＳｐの下部において顕著に現れる。上方（Ｚ軸方向）からのまたは水平断面（ＸＹ平面）での観察では、スフェロイドの背後に隠れてこのような変化は発見されにくいが、鉛直断面での断層画像によれば、このようなスフェロイドＳｐの形状変化を容易に発見することが可能である。

図８（ｃ）は遊離細胞やデブリがウェル底面Ｗｂに沈殿したケースを示している。前記したように、投与された化学物質の薬効が現れている例として、スフェロイドＳｐからの遊離細胞Ｄが多く生じるケースがある。スフェロイドＳｐの形状を外部から観察するのみではこのような遊離細胞Ｄが見落とされるおそれがある。特に、上方からの二次元撮像画像では、スフェロイドＳｐを構成する細胞と、遊離した細胞Ｄとを判別することが困難である。

しかしながら、鉛直面での断層画像を取得する過程では、スフェロイドＳｐの周囲（特に下部）にスフェロイドＳｐとは分離した状態で沈殿する遊離細胞やデブリＤを画像に取り込むことができるので、このような見落としを回避することができる。特に、断層画像から立体像を再構成し、これを様々な方向から観察することができるようにすれば、単にスフェロイドＳｐのみならず、その周囲に分布する構造物を発見することが容易になる。

以上説明したように、この実施形態の画像処理装置１においては、撮像ユニット２０が本発明の「画像取得手段」として機能しており、３Ｄ復元部３３および特徴量算出部３４がそれぞれ本発明の「立体像作成手段」および「特徴量算出手段」として機能している。また、ウェルプレートＷＰが本発明の「容器」に相当し、保持部１０が本発明の「保持手段」として機能する一方、表示部３５２が本発明の「表示手段」として機能している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態で算出される各特徴量は、スフェロイドの形状的特徴を指標するものとして一部の例を示したものであり、これらの特徴量を用いることに限定されるものではない。すなわち、上記した特徴量の一部のみが用いられてもよく、また上記以外の特徴量が用いられてもよい。

また例えば、上記実施形態の制御ユニット３０では、ＣＰＵ３１、３Ｄ復元部３３および特徴量算出部３４がそれぞれ個別の機能ブロックとなっているが、例えば３Ｄ復元部３３および特徴量算出部３４が一体のＧＰＵ（Graphic Processing Unit）により構成されてもよく、またこれらの機能が単体のＣＰＵにより実現される構成であってもよい。

また例えば、上記実施形態では断層撮像を行う撮像ユニット２０として光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置が用いられているが、スフェロイドに対し非破壊で断層撮像を行うことのできる他の撮像原理による撮像装置、例えば共焦点顕微撮像装置を本発明の「画像取得手段」として用いてもよい。ただし、撮像をより短時間で完了することができるという点では、本実施形態のような光干渉断層撮像装置が有利である。

また例えば、上記実施形態では本発明の「画像取得手段」として撮像装置を用いているが、本発明にかかる画像処理装置は、それ自体が撮像機能を有することを必須とするものではない。すなわち、外部の撮像装置で撮像された断層画像データを受け入れて画像処理のみを行う態様であってもよい。この場合には、外部から画像データを受け付けるインターフェース部が本発明の「画像取得手段」として機能することになる。

この発明は、特定の細胞に対し薬効を有する化学物質を見出すスクリーニング技術に適用することができ、特に、細胞が立体的に集合した細胞集塊に対する薬効を的確に評価することができるので、生体内で有効に作用する薬剤の創薬に役立てることができる。

１ 画像処理装置
１０ 保持部（保持手段）
２０ 撮像ユニット（画像取得手段、光干渉撮像装置）
２１ 光源
２２ ビームスプリッタ
２４ 基準ミラー
２５ 光検出器
３０ 制御ユニット
３３ ３Ｄ復元部（立体像作成手段）
３４ 特徴量算出部（特徴量算出手段）
３５２ 表示部（表示手段）
Ｓｐ スフェロイド（細胞集塊）
Ｗ ウェル
ＷＰ ウェルプレート（容器）

Claims (7)

1. 容器に担持された液体内の細胞集塊に投与された化学物質の薬効を評価する薬効評価方法において、
   前記細胞集塊を、鉛直面と略一致する断面で断層撮像した断層画像を取得する工程と、
   前記断層画像に基づき、前記細胞集塊の特徴量を算出する工程と、
   前記特徴量の算出結果に基づいて、前記化学物質の薬効を判定する工程と
   を備える薬効評価方法。
2. 前記断層画像に基づき、前記細胞集塊から遊離して前記容器の底面に堆積した遊離細胞を検出する工程をさらに備え、
   前記特徴量の算出結果と前記遊離細胞の検出結果とに基づいて前記化学物質の薬効を判定する請求項１に記載の薬効評価方法。
3. 互いに異なる複数の断面について前記断層画像を取得する請求項１または２に記載の薬効評価方法。
4. 複数の前記断層画像に基づく画像処理により、前記細胞集塊の表面の立体像を作成する工程を備える請求項１ないし３のいずれかに記載の薬効評価方法。
5. 前記特徴量は、前記細胞集塊の表面積、前記細胞集塊の体積、前記細胞集塊の表面の曲率および前記細胞集塊の表面の曲率半径の少なくとも１つを含む請求項１ないし４のいずれかに記載の薬効評価方法。
6. 前記特徴量は、互いに異なる断面それぞれにおける前記細胞集塊の表面の曲率を含む請求項５に記載の薬効評価方法。
7. 所定の時間間隔をおいて複数回、前記細胞集塊の断層撮像を行い、各撮像で取得される前記断層画像から前記特徴量の経時変化を求め、その結果に基づいて前記化学物質の薬効を判定する請求項１ないし６のいずれかに記載の薬効評価方法。