JP6330666B2 - 標的物質の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、標的物質の測定方法などに関する。

標的物質の測定は、臨床検査等の種々の検査のため、標的物質が測定されている。しかしながら、標的物質は、測定対象のサンプル中で、標的物質に対する結合性物質と結合していることがある。例えば、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ類（以下、単にビタミンＤと略称する）は血中で結合タンパク質（ＤＢＰ：ビタミンＤ結合タンパク質。Ｇｃグロブリンとも呼ばれる）と強固に結合していることが知られている。したがって、ビタミンＤを抗原抗体法で正確に測定するためには、ビタミンＤとＤＢＰの解離操作（前処理）が必要とされる。このような前処理としては、変性剤（例、酸、タンパク変性剤、界面活性剤、加水分解酵素）に加えて有機溶媒（例、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ）が使用されている（特許文献１〜７）。

国際公開第０３／１０４８２０号 国際公開第０７／０３９１９４号 国際公開第０２／０４６７４６号 国際公開第０４／０６３７０４号 国際公開第０８／０９２９１７号 国際公開第０２／０５７７９５号 国際公開第０７／１４０９６２号

本発明は、標的物質の測定方法を提供する。

本発明者らは、鋭意検討したところ、炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤で標的物質含有サンプルを処理することにより、標的物質を正確に測定できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、標的物質の測定方法：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔２〕炭化水素鎖が、１０個以上の炭素原子数を有する直鎖の炭化水素基である、〔１〕の方法。
〔３〕親水性部分が、スルホネート基、カルボキシレート基、またはアンモニウム基である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記界面活性剤が、デシル硫酸、ドデシル硫酸またはこれらの塩である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕チオール基含有還元剤でサンプルを処理することをさらに含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕チオール基含有還元剤が、ジチオエリトリトール、システイン、２−メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールからなる群より選ばれる、〔５〕の方法。
〔７〕サンプルの処理が混合のみによって行われる、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕以下を含む方法である、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法：
１’）前記界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理すること；ならびに
２’）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔９〕以下を含む方法である、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法：
１’’）前記界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること；
２’’）前記１’’）で処理されたサンプルを希釈液で処理すること；ならびに
３’’）前記２’’）で処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔１０〕サンプルがヒト由来のサンプルである、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕サンプルが血液関連サンプルである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕標的物質がサンプル中で標的物質に対する結合性物質と結合している、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕標的物質が低分子物質である〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕低分子物質がビタミンである、〔１３〕の方法。
〔１５〕ビタミンがビタミンＤである、〔１４〕の方法。
〔１６〕以下を含む、標的物質の測定用キット：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤；ならびに
２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。

本発明の方法は、標的物質の測定に有用である。本発明によれば、迅速かつ簡便に標的物質を測定できる。
本発明のキットは、例えば、本発明の方法の簡便な実施に有用である。

図１は、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法により得られた測定値と、有機溶媒（アセトニトリル）を用いるタンパク質除去法により得られた測定値との高い相関性（Ｒ^２＝０．９９８１）を示す図である。 図２は、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法により得られた測定値と、Ｄｉａｓｏｒｉｎ ＲＩＡ法による測定値との相関性（Ｒ^２＝０．９４２５）を示す図である。

（１．標的物質の測定方法）
本発明は、サンプル中の標的物質の測定方法を提供する。

本発明の方法は、以下を含む：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。

（Ａ−１．工程１）
先ず、炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルが処理される。以下、必要に応じて、「炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤」を、「主要界面活性剤」と略記することがある。

本発明の方法で用いられるサンプルは、標的物質を含有する、または含有すると疑われるサンプルである。標的物質としては、例えば、低分子物質、タンパク質、糖、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。用語「低分子物質（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」とは、分子量１，５００未満の化合物をいう。低分子物質は、天然物質または合成物質である。低分子物質の分子量は、１，２００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満または３００未満であってもよい。低分子物質の分子量はまた、５０以上、１００以上、１５０以上または２００以上であってもよい。低分子物質としては、例えば、リガンド、ホルモン、脂質、脂肪酸、ビタミン、オピオイド、神経伝達物質（例、カテコールアミン）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、およびオリゴペプチド、あるいは医薬、毒物、および代謝産物が挙げられる。ホルモンとしては、例えば、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ペプチドホルモンが挙げられる。

一実施形態では、低分子物質は、ビタミンであってもよい。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋが挙げられる。好ましくは、ビタミンは、脂溶性ビタミン（例、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）であり、より好ましくは、以下に示すようなビタミンＤである。低分子物質はまた、ビタミンの代謝産物であってもよい。ビタミンの代謝産物としては、例えば、上述したようなビタミンにヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体（例、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体）が挙げられる。低分子物質はさらに、ビタミン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「ビタミン」は、特に指定されないかぎり、ビタミン、およびビタミンに類似する薬物、ならびにそれらの代謝産物を包括的に含むものとする。例えば、用語「ビタミンＤ」は、特に指定されないかぎり、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３、およびビタミンＤ２およびビタミンＤ３に類似する薬物、ならびにそれらの代謝産物を包括的に含むものとする。

別の実施形態では、低分子物質は、ステロイド化合物であってもよい。ステロイド化合物とは、ステロイド骨格を有する化合物をいう。ステロイド化合物としては、ステロイドホルモン、およびステロイド骨格を保持するその誘導体（例、タンパク質同化ステロイド、抗男性ホルモン剤および抗卵胞ホルモン剤等の合成ステロイド）が挙げられる。ステロイドホルモンとしては、例えば、男性ホルモン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、コルチコイド（例、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド）が挙げられるが、卵胞ホルモンが好ましい。卵胞ホルモンとしては、例えば、エストロン、エストラジオール、エストリオールが挙げられる。低分子物質はまた、ステロイド化合物の代謝産物であってもよい。ステロイド化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなステロイド化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体が挙げられる。抱合体としては、例えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体（例、エストラジオールの３位もしくは１７位のいずれかのヒドロキシル基、または３位および１７位の双方のヒドロキシル基に硫酸基が抱合された化合物）、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、ステロイド化合物類似治療用薬物（例、エストラムスチン）またはその代謝産物（例、エストロムスチン）であってもよい。

さらに別の実施形態では、低分子物質は、アミノ酸化合物であってもよい。アミノ酸化合物とは、アミノ基およびカルボキシル基を有する化合物をいう。アミノ酸化合物としては、例えば、α−アミノ酸（例、グリシン、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、シトルリン）、β−アミノ酸（例、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例、γ-アミノ酪酸）、ならびに、アミノ基およびカルボキシル基を保持するそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸化合物は、Ｌ体またはＤ体であってもよい。低分子物質はまた、アミノ酸化合物の代謝産物であってもよい。アミノ酸化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなアミノ酸化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、アミノ酸化合物類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。

アミノ酸化合物は、チロシンから生合成されるチロシン誘導体であってもよい。チロシン誘導体としては、甲状腺ホルモン（例、トリヨードチロニン、チロキシン）が挙げられる。チロシン誘導体はまた、甲状腺ホルモンの代謝産物であってもよい。甲状腺ホルモンの代謝産物としては、例えば、甲状腺ホルモンにヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、甲状腺ホルモン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。

サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物、菌類、魚類であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよいが、血液関連サンプルが好ましい。環境サンプルとしては、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。

本発明の方法で用いられるサンプルは、好ましくは、標的物質およびそれに対する結合能を有する分子の複合体を含むサンプルである。本発明の方法は、サンプル中に標的物質に対する強い結合能を有する分子（例、タンパク質）が存在していた場合であっても、標的物質を正確に測定できるという利点を有する。例えば、ビタミンＤは、ヒト血清中に存在するＤＢＰと強固に結合することが知られており、その解離定数はＫｄ＝５×１０^−８であることが報告されているが（特許文献４を参照）、本発明の方法によれば、このような強い結合能を有するタンパク質がサンプル中に存在する場合であっても、サンプル中の標的物質を正確に測定することができる。したがって、標的物質に対する結合能を有する分子がサンプル中に存在する場合であっても、本発明の方法によれば、標的物質を正確に測定することができると考えられる。具体的には、標的物質（例、ビタミンＤ等のビタミン）およびそれに対する結合能を有する分子の複合体を含むサンプルとしては、例えば、血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）が挙げられる。

本発明の方法では、サンプルは、主要界面活性剤により処理される前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌が挙げられる。

主要界面活性剤により処理されるべきサンプルの容量は、標的物質の測定が可能な限り特に限定されないが、例えば０．１〜１０００μｌ、好ましくは０．５〜１００μｌ、より好ましくは１〜５０μｌである。

主要界面活性剤において、疎水性部分は、炭化水素鎖から構成される。炭化水素鎖は、直鎖または分岐鎖の炭化水素基であり、炭化水素鎖中の炭素原子数は通常８〜６０個である。主要界面活性剤は、少なくとも１つのこのような炭化水素鎖を有していればよい。炭化水素鎖中の炭素原子数は、好ましくは１０個以上である。炭化水素鎖中の炭素原子数はまた、合成または入手の容易の観点から、４０個以下が好ましく、３０個以下がより好ましく、２０個以下がさらにより好ましい。炭化水素鎖中の炭素原子数は、特に好ましくは１０または１１個である。
直鎖の炭化水素基としては、直鎖の飽和炭化水素基であるアルキル基、ならびに直鎖の不飽和炭化水素基（例、アルケニル基およびアルキニル基）が挙げられる。炭素原子数８〜６０個のアルキル基としては、例えば、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシルが挙げられる。炭素原子数８〜６０個の直鎖の不飽和炭化水素基としては、例えば、上述したアルキル基において、１〜４個（好ましくは１または２個）の不飽和結合（二重結合または三重結合）部分を含むものが挙げられる。
分岐鎖の炭化水素基としては、例えば、上述した直鎖の飽和または不飽和炭化水素基上の水素原子が、１〜４個（好ましくは１または２個）の炭素原子数１〜１０の炭化水素基で置換されたものが挙げられる。炭素原子数１〜１０の炭化水素基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、ナフタレニルが挙げられる。
疎水性部分を構成する炭化水素鎖は、好ましくは、直鎖の飽和炭化水素基であり、より好ましくは、１０または１１個の炭素原子数を有する直鎖の飽和炭化水素基である。

主要界面活性剤において、親水性部分としては、例えば、アニオン性親水性部分およびカチオン性親水性部分が挙げられる。炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤は、１または２種以上の親水性部分を有していてもよく、アニオン性親水性部分およびカチオン性親水性部分の双方を有していてもよい。アニオン性親水性部分としては、例えば、スルホネート基（−ＳＯ_３ ⁻）、カルボキシレート基（−ＣＯＯ⁻）、およびホスホネート基（−ＰＯＯ_２ ⁻）が挙げられる。カチオン性親水性部分としては、例えば、アンモニウム基（Ｎ^＋）、およびホスホニウム基（Ｐ^＋）が挙げられる。親水性部分は、好ましくは、スルホネート基（−ＳＯ_３ ⁻）、カルボキシレート基（−ＣＯＯ⁻）、アンモニウム基（Ｎ^＋）、またはホスホニウム基（Ｐ^＋）であり、より好ましくは、スルホネート基（−ＳＯ_３ ⁻）、カルボキシレート基（−ＣＯＯ⁻）、またはアンモニウム基（Ｎ^＋）であり、さらにより好ましくは、スルホネート基（−ＳＯ_３ ⁻）、またはカルボキシレート基（−ＣＯＯ⁻）であり、特に好ましくは、スルホネート基（−ＳＯ_３ ⁻）である。

主要界面活性剤は、炭化水素鎖から構成される疎水性部分および親水性部分に加えて、他の部分（例えば、疎水性部分と親水性部分との間）を含んでいてもよい。このような他の部分としては、例えば、環状基（例、シクロアルキル基、フェニル基等のアリール基、複素環基）、および非環状基（例、アミノ基、オキシ基、オキソ基、カルボニル基、カルボニルアミノ基、カルボニルオキシ基）が挙げられる。

主要界面活性剤は、塩の形態であっても、なくてもよい。本明細書中で用いられる用語「塩」は、任意の塩であり、例えば、無機塩、有機塩および分子内塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、金属塩、ハロゲン化物塩、酸付加塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、アルカリ金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム）の塩、アルカリ土類金属（例、マグネシウム、カルシウム）の塩が挙げられる。ハロゲン化物塩におけるハロゲンとしては、例えば、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素が挙げられる。無機塩である酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸との塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩、ならびにシュウ酸等の有機酸との塩が挙げられる。

具体的には、主要界面活性剤としては、例えば、ヘキシル硫酸、オクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラドデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸、ドデシルホスホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸、およびドデカノイルサルコシン酸、ならびにそれらの塩が挙げられる。

サンプルの処理は、１種または複数（例、２または３種）の主要界面活性剤を用いて行われてもよい。主要界面活性剤の濃度は、ビタミンＤの測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）％（ｗ／ｖ）であってもよい。
具体的には、主要界面活性剤によりサンプルを処理する場合におけるこのような界面活性剤の濃度は、後述するような反応液を用いる方法によりサンプルを処理する場合、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。このような場合、主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の界面活性剤を用いる場合、各界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。
また、主要界面活性剤によりサンプルを処理する場合における主要界面活性剤の濃度は、後述するような前処理液を用いる方法によりサンプルを処理する場合には、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。このような場合、主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の界面活性剤を用いる場合、各界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。
反応液において、より低濃度での主要界面活性剤の使用が意図される場合、好ましくは、ドデシル硫酸またはその塩を、主要界面活性剤として使用してもよい。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、低濃度で強い効果を示すことが確認されている（表５、７を参照）。このような低濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、より好ましくは０．０６％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、さらにより好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）未満の濃度である。

一実施形態では、サンプルの処理は、主要界面活性剤に加えて、還元剤を併用して行われてもよい。したがって、本発明の方法は、還元剤でサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。主要界面活性剤および還元剤によるサンプルの処理は、同時または別々に行うことができるが、好ましくは同時に行われる。このような還元剤としては、任意の還元剤を用いることができるが、チオール基含有還元剤が好ましい。チオール基含有還元剤としては、例えば、ジチオエリトリトール、システイン、２−メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールが挙げられる。還元剤の濃度は、標的物質の測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば０．０１〜１０００ｍＭであってもよい。
具体的には、還元剤によりサンプルを処理する場合における還元剤の濃度は、後述するような反応液を用いる方法によりサンプルを処理する場合、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．０１〜１００ｍＭであってもよい。このような場合、還元剤の濃度は、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であってもよい。還元剤の濃度はまた、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは１０ｍＭ以下であってもよい。複数の還元剤を用いる場合、各還元剤の濃度もまた、上記のとおりである。
また、還元剤によりサンプルを処理する場合における還元剤の濃度は、後述するような前処理液を用いる方法によりサンプルを処理する場合には、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．１〜１００ｍＭであってもよい。このような場合、還元剤の濃度は、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であってもよい。還元剤の濃度はまた、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは２０ｍＭ以下であってもよい。複数の還元剤を用いる場合、各還元剤の濃度もまた、上記のとおりである。

別の実施形態では、サンプルの処理は、主要界面活性剤、または主要界面活性剤および還元剤の組合せに加えて、主要界面活性剤と異なる別の変性剤を併用して行われてもよい。したがって、本発明の方法は、別の変性剤でサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。主要界面活性剤、還元剤および別の変性剤によるサンプルの処理は、同時または別々に行うことができるが、好ましくは同時に行われる。このような変性剤としては、例えば、界面活性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、カオトロピック剤が挙げられる。変性剤は、１種であってもよいが、複数（例、２または３種）であってもよい。このような変性剤は、変性作用のために有効な濃度で用いられてもよいが、変性作用以外の作用を期待して、変性作用以外の作用に有効な濃度で用いられてもよい。

主要界面活性剤と異なる別の変性剤として、ステロイド骨格を有する界面活性剤を用いてもよい。ステロイド骨格を有する界面活性剤は、ステロイド骨格を、独立した環状構造（即ち、他の環と縮合していないステロイド骨格）として有する化合物、またはその塩である。ステロイド骨格を有する界面活性剤において、その５位の立体構造はαであってもβであってもよい。ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度は、標的物質の測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば０．００５％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）である。

ステロイド骨格を有する界面活性剤は、疎水性部分としてのステロイド骨格、および親水性部分を有する化合物またはその塩であり得る。ステロイド骨格を有する界面活性剤の親水性部分としては、例えば、アニオン性部分〔例、スルホネート（−ＳＯ_３ ⁻）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、およびホスホネート（−ＰＯＯ_２ ⁻）〕、カチオン性部分（例、１〜４個の炭化水素基で置換されていてもよい４級アンモニウムおよび４級ホスホニウム）、非イオン性親水性部分（例、複数のエーテル）およびそれらを有する基（例、このような親水性部分を有する炭化水素基）が挙げられる。したがって、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、親水性部分の種類に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤であり得る。上述した炭化水素基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル（ラウリル）、テトラデシル（ミリスチル）、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、およびナフタレニルが挙げられる。炭化水素基は、好ましくは、炭素原子数１〜１０の炭化水素基であり、より好ましくは炭素原子数１〜６のアルキル基である。

ステロイド骨格は、親水性部分の他に、１〜６個（好ましくは１、２、３または４個）の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、ステロイド骨格の性質（例、疎水性）を大きく損なうものでない限り特に限定されないが、例えば、炭素原子数１〜１０の炭化水素基、ヒドロキシル基、炭素原子数１〜１０の炭化水素基で置換されたヒドロキシル基（例、アルキルオキシ基）、炭素原子数１〜１０の炭化水素基−カルボニル−オキシ基（例、アルキル−カルボニル−オキシ基）、オキソ基、ホルミル基、炭素原子数１〜１０の炭化水素基−オキシ−カルボニル基（例、アルキルオキシ−カルボニル基）、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、およびシアノが挙げられる。

好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、胆汁酸またはその誘導体あるいはそれらの塩である。胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、5α-シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロコール酸が挙げられる。胆汁酸の誘導体としては、例えば、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡＰ、およびｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。

より好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有していてもよい。７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤としては、例えば、ヒドロキシル基以外の基（例、ヒドロキシル基を除く上述した置換基）を７位に有するステロイド骨格を有する界面活性剤、および７位に置換基を有しない（換言すれば、７位の炭素原子が水素原子と結合している）ステロイド骨格を有する界面活性剤が挙げられる。特に好ましくは、７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤は、７位に置換基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤である。７位に置換基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、５α−シプリノール、およびそれらの塩が挙げられる。

サンプルの処理はまた、他の物質の存在下で行われてもよい。このような物質としては、例えば、標的物質に対する親和性物質、アルブミン（例、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）、ゼラチン、およびスキムミルクが挙げられる。

標的物質に対する親和性物質とは、標的物質に結合する能力を有する物質をいい、例えば、標的物質に対する抗体、アプタマーが挙げられる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体はさらに、ファージディスプレイ等の分子生物学的手法により、および／または既存のタンパク質モチーフを利用してタンパク質工学的手法により作製された抗体様分子（例、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ）であってもよい。

サンプルの処理は、例えば、（ａ）サンプルを、上述したような成分を含む水溶液（例、緩衝液）と混合して混合液を調製すること、および（ｂ）混合液をインキュベートすることを含む。

緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液（例、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、トリス緩衝生理食塩水）、リン酸緩衝液（例、リン酸緩衝生理食塩水）、炭酸緩衝液（例、炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液）、ＧＯＯＤ緩衝液（例、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）が挙げられる。サンプルの処理は、中性条件下あるいは酸性またはアルカリ性条件下で行うことができるが、好ましくは中性条件下で行われる。したがって、サンプルの処理において採用されるｐＨ値は、例えば４．０〜９．５、好ましくは５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。サンプルの処理におけるｐＨ値の調整は、緩衝液、酸性物質およびアルカリ性物質を利用して行うことができる。

サンプルの処理（例、上記（ａ）（ｂ）の工程）の温度は、主要界面活性剤等の成分がその作用を発揮するのに適切である限り特に限定されないが、例えば１５〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃である。（ａ）における混合液の調製に要する時間は、通常、３０秒以下であり、好ましくは２０秒以下であり、より好ましくは１５秒以下であり、さらにより好ましくは１０秒以下である。（ｂ）におけるインキュベート時間は、例えば６０分以下、好ましくは３０分以下、より好ましくは１０分以下である。測定のための処理時間の短縮の観点から、インキュベート時間は、さらにより好ましくは５分以下であり、特に好ましくは３分以下、２分以下、１分以下、５０秒以下、４０秒以下、３０秒以下、２０秒以下、１５秒以下、１０秒以下または５秒以下であってもよい。したがって、測定のための処理時間の短縮の観点から、サンプルの処理時間（例、上記（ａ）（ｂ）の合計時間）は、３分以下、２分以下、１分以下、５０秒以下、４０秒以下、３０秒以下または１５秒以下であってもよい。

サンプルの処理はまた、混合のみによって行われてもよい。サンプルの処理が「混合のみ」によって行われるとは、サンプルの処理が上記（ａ）によって行われ、上記（ｂ）が行われないこと（即ち、インキュベーションが不要であること）を意味する。迅速かつ簡便な測定という観点からは、サンプルの処理を混合のみによって行ってもよい。

（Ａ−１−１．反応液の使用）
好ましい実施形態では、上記工程１）は、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理することにより行うことができる。

反応液は、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む。反応液はまた、還元剤を含んでいてもよい。反応液はさらに、主要界面活性剤と異なる別の変性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、およびカオトロピック剤、ならびにステロイド骨格を有する界面活性剤等の他の成分を１種または複数（例、２または３種以上）含んでいてもよい。

反応液中の主要界面活性剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の主要界面活性剤を用いる場合、各主要界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。反応液中の還元剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭである。

反応液中の主要界面活性剤の濃度、および含まれる場合、還元剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、反応液とサンプルとの混合液において上述したような濃度（主要界面活性剤および／または還元剤でサンプルを処理する場合における主要界面活性剤および／または還元剤の濃度）を達成できるような濃度である。したがって、反応液中の主要界面活性剤および／または還元剤の濃度は、サンプルおよび反応液の容量に基づいて、上述したような濃度を達成するように適宜設定できる。

反応液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。反応液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、反応液のｐＨ値は、例えば４．０〜９．５、好ましくは５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。

反応液の容量は、サンプルの容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルの容量に対して、例えば１〜３００倍、好ましくは１〜１５０倍、より好ましくは１〜５０倍である。

反応液によるサンプルの処理は、反応液中に含まれる主要界面活性剤等の成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、反応液によるサンプルの処理は、上述したようなサンプルの処理と同様にして行うことができ、（ａ１）サンプルを反応液と混合して混合液を調製すること、および（ｂ１）混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ１）および（ｂ１）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。

（Ａ−１−２．前処理液および希釈液の使用）
別の好ましい実施形態では、上記工程１）は、ｉ）主要界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること、およびｉｉ）前処理液で処理されたサンプルを希釈液で処理することにより行うことができる。

（工程ｉ）
前処理液は、主要界面活性剤を含む。前処理液はまた、還元剤を含んでいてもよい。前処理液はさらに、主要界面活性剤と異なる別の変性剤を含んでいてもよい。別の変性剤としては、例えば、ステロイド骨格を有する界面活性剤、ならびにステロイド骨格を有する界面活性剤と異なる別の界面活性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、およびカオトロピック剤が挙げられる。前処理液に含まれる主要界面活性剤および別の変性剤は、それぞれ、１種であってもよいが、複数（例、２または３種以上）であってもよい。前処理液は、希釈液に含まれる別の変性剤と同種の１または２個以上（例、１〜３個）の変性剤（例、ステロイド骨格を有する界面活性剤および別の界面活性剤）を含んでいてもよい。前処理液はまた、上述したような他の成分を含んでいてもよい。

前処理液中の主要界面活性剤の濃度、および含まれる場合、還元剤の濃度は、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、前処理液とサンプルとの混合液において上述したような濃度（主要界面活性剤および／または還元剤でサンプルを処理する場合における主要界面活性剤および／または還元剤の濃度）を達成できるような濃度である。したがって、前処理液中の主要界面活性剤および／または還元剤の濃度は、サンプルおよび前処理液の容量に基づいて、上述したような濃度を達成するように適宜設定できる。

前処理液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。前処理液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、前処理液のｐＨ値は、例えば４．０〜９．５、好ましくは５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。

前処理液の容量は、サンプルの容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルの容量に対して、例えば０．５〜１００倍、好ましくは１〜１０倍、より好ましくは１〜５倍である。

前処理液によるサンプルの処理は、前処理液中に含まれる成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、前処理液によるサンプルの処理は、上述したようなサンプルの処理と同様にして行うことができ、（ａ２−１）サンプルを前処理液と混合して第１混合液を調製すること、および（ｂ２−１）第１混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ２−１）および（ｂ２−１）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。前処理液によるサンプルの処理はまた、上述したように混合のみによって行われてもよい。

（工程ｉｉ）
希釈液は、例えば、上述した成分（例、ステロイド骨格を有する界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カオトロピック剤、および還元剤）を１種または複数（例、２または３種以上）含んでいてもよい。希釈液はまた、上述したような他の成分（例、ビタミンＤに対する親和性物質、アルブミン）を含んでいてもよい。

希釈液における上述した成分の濃度は、前処理液、希釈液およびサンプルの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されず、適宜設定できる。

希釈液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。希釈液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、希釈液のｐＨ値は、例えば４．０〜９．５、好ましくは５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。

希釈液の容量は、サンプルおよび前処理液の容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルおよび前処理液の総容量よりも多い容量において用いられ得る。具体的には、希釈液の容量は、サンプルおよび前処理液の総容量に対して、例えば１〜２０倍、好ましくは１〜１０倍、より好ましくは１〜５倍である。

希釈液によるサンプルの処理は、希釈液中に含まれる成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、希釈液によるサンプルの処理は、前処理液によるサンプルの処理と同様にして行うことができる。具体的には、希釈液によるサンプルの処理は、（ａ２−２）前処理液で処理されたサンプルを希釈液と混合して第２混合液を調製すること、および（ｂ２−２）第２混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ２−２）および（ｂ２−２）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。

（Ａ−２．工程２）
上述したとおり処理されたサンプルにおいて、標的物質が検出される。標的物質の検出は、定性的または定量的に行われる。本工程では、上述した親和性物質が用いられる場合、親和性物質を処理されたサンプルに添加することを含んでいてもよい。

標的物質の検出は、任意の方法により行うことができ、例えば、標的物質に対する親和性物質を利用して行うことができる。標的物質の検出はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、磁性粒子法、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ラテックス凝集法が挙げられる。標的物質の検出を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。

標的物質に対する親和性物質として抗体が用いられる場合、２次抗体がさらに用いられてもよい。２次抗体としては、標的物質に対する抗体（１次抗体）の１次抗体部分に対する抗体であってもよく、標的物質および１次抗体の複合体に対する抗体であってもよい。２次抗体等の抗体は、検出用物質に連結されていてもよい。検出用物質としては、例えば、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）が挙げられる。２次抗体等の抗体は、抗体は、支持体に固定されていてもよい。支持体としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）、デバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。

（Ｂ．標的物質の測定用キット）
本発明はまた、標的物質の測定用キットを提供する。

本発明のキットは、以下を含む：
１）主要界面活性剤；ならびに
２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。
本発明のキットはまた、還元剤を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、ステロイド骨格を有する界面活性剤等の変性剤を含んでいてもよい。標的物質に対する親和性物質が１次抗体である場合、本発明のキットは、２次抗体をさらに含んでいてもよい。

好ましい実施形態では、本発明のキットは、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液を含む。反応液は、還元剤をさらに含んでいてもよい。

別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、以下を含む：
１）主要界面活性剤を含む前処理液（還元剤をさらに含んでいてもよい）；
２）希釈液；ならびに
３）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。

本発明のキットに含まれる上述の構成成分の詳細（例、有効成分および濃度、好ましい例）は、本発明の方法において上述したとおりである。反応液ならびに前処理液および希釈液は、本発明の方法において上述した成分および／または物質をさらに含んでいてもよい。標的物質標品は、所定の濃度（単一または複数）の標的物質を含む水溶液または標的物質の粉末であり、コントロールとして有用である。

本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。デバイスの構造としては、例えば、１）サンプルと主要界面活性剤とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、標的物質に対する親和性物質と接触させて、標的物質を検出するための第２区域を備えるデバイス；２）サンプル、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を混合して、標的物質を検出するための区域を備えるデバイス；ならびに３）サンプルと上記構成成分（例、反応液、ならびに前処理液および希釈液）との混合を可能にする流路、および標的物質を検出するための区域を備えるデバイスが挙げられる。

以下、本発明の実施例を記載するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。

以下の実施例では、標的物質としてのビタミンＤを測定する免疫学的方法として、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３（以下、必要に応じて、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３を包括して２５ＯＨビタミンＤと略記する）を認識する１次抗体を用いた。したがって、以下の実施例で測定された値は、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３の総量に対応し得る。

実施例１：アニオン性界面活性剤および還元剤による２５ＯＨビタミンＤ測定法の検討
ヒト血清を、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および還元剤（ＤＴＴ）で処理し、次いで、免疫学的方法によりヒト血清中の２５ＯＨビタミンＤを測定した。

方法は、以下のとおり行った。
１）同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に、１％、０．３０％、０．１％または０％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ＋８ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭまたは０ｍＭ ＤＴＴ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ〕を４０μｌ加えて、血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．８％、０．２４％、０．０８％または０％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ；６．４ｍＭ、４ｍＭ、１．６ｍＭまたは０ｍＭ ＤＴＴ；０．０８％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ。
２）第１混合液を、室温（２５℃。以下同様）にて１０分間インキュベートした。
３）インキュベートした第１混合液に、希釈液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ〕を１５０μｌ加えて、第１混合液と希釈液との第２混合液（２００μｌ）を調製した。第２混合液中のデオキシコール酸ナトリウム塩の濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）であった。
４）第２混合液７５μｌと抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合磁性粒子液７５μｌを混合した。
５）上記４）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
６）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
７）洗浄液を除いた磁性粒子に、ＭＥＳ緩衝液で懸濁したアルカリホスファターゼ標識抗体（２５ＯＨビタミンＤ−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の免疫複合体に対する抗体）を加えた。
８）上記７）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
９）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
１０）洗浄液を除いた磁性粒子に、発光基質 （ＡＭＰＰＤ）液を加えた。
１１）上記１０）で得られた溶液を、３７℃にて５分間インキュベートした。
１２）発光カウントを、ラベルリーダー（ＡＲＶＯ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。

結果は、以下の表１に示すとおりであった。なお、表１では、ＳＤＳおよびＤＴＴを含まない前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを１（コントロール）とし、各種条件下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。

その結果、ＳＤＳ ０．３％（ｗ／ｖ）を含む前処理液を加えた条件では、未処理条件の１０倍以上のカウントが得られた（表１）。また、ＤＴＴを５ｍＭ以上を含む前処理液を加えた条件では、なにも加えなかった条件の２０倍近くのカウントが得られた（表１）。したがって、２５ＯＨビタミンＤを含むサンプルの処理において、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いることで、２５ＯＨビタミンＤの測定感度を向上できること、ならびにアニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および還元剤（ＤＴＴ）を併用することで、２５ＯＨビタミンＤの測定感度をさらに向上できることが示された。

実施例２：ビタミンＤ結合タンパクを変性させるのに有効な還元剤の検討
ヒト血清を、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および種々の還元剤で処理し、次いで、免疫学的方法によりヒト血清中の２５ＯＨビタミンＤを測定した。

方法は、以下のとおりに行った。
１）同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に０．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋５ｍＭ 各還元剤＋０．１％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ〕を４０μｌ加えて、血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．２４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ；４ｍＭ 各還元剤；０．０８％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ。
２）以降の操作は、実施例１の上記２）〜１２）と同じ方法により行った。

結果は、以下の表２に示すとおりであった。なお、表３では、還元剤を含まない前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを１（コントロール）とし、還元剤としてＤＴＥ（ジチオエリトリトール）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ−２−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｌ−システイン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを、コントロールに対する割合（％）で表示した。

表２に示されるように、チオール基（−ＳＨ）含有還元剤（例、ＤＴＥ、Ｌ−Ｃｙｓ、２−ＭＥＡ、ＤＴＴ）を用いた場合、シグナル強度（発光カウント）が向上した。特に、２−ＭＥＡで高い効果が確認された。

実施例３：アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による処理時間の検討
２５ＯＨビタミンＤの高感度測定に必要とされる、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による処理時間について検討した。

方法は、以下のとおりに行った。
１同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液（ＰＢＳに０．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋５ｍＭ ２−ＭＥＡ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ）を４０μｌ加えて、攪拌による混合により血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．２４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ；４ｍＭ ２−ＭＥＡ；０．０８％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ。攪拌による混合に要した時間は、約３秒であった。
２）第１混合液を、室温（２５℃）にてインキュベートした（１０分、５分または１分）。また、攪拌による混合のみにより調製された第１混合液を、インキュベートすることなく、次の操作に供した（インキュベート時間：０分）。
３）以降の操作は、実施例１の３）〜１２）と同じ方法により行った。

結果は、以下の表３に示すとおりであった。なお、表３では、上記工程２）に関して、１０分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントを１００％（コントロール）とし、０分、１分および５分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントを、コントロールに対するパーセントで表示した。

その結果、上記工程２）に関して、混合のみ（インキュベート時間：０分）の条件下で測定された発光カウントは、１０分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントとほぼ同じであった。このことは、上記工程２）のインキュベート操作は必ずしも必要でなく、血清と前処理液とを軽く攪拌するだけで、ビタミンＤが、ＤＢＰから解離することを示す。したがって、本発明の方法により、標的物質の測定に要する時間が短縮できることが示された。

参考例１：既存製品を用いた前処理に要する時間
既存製品では、血清サンプルの前処理に必要とされる時間は、その使用説明書によれば、以下のとおりである。既存製品として、ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡ（ＤｉａＳｏｒｉｎ社製）、ＤｉａＳｏｒｉｎ−Ｌｉａｉｓｏｎ（ＤｉａＳｏｒｉｎ社製）

実施例４：本発明の方法と有機溶媒を用いる既存の方法との比較（Ｉ）
アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いる本発明の方法による標的物質の測定精度を検証するため、本発明の方法による標的物質の測定値と、有機溶媒を用いる既存の方法により得られた測定値との相関係数を比較した。

４−１）本発明の方法による測定
方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、ヒト血清５サンプルを用いた。
１）ヒト血清３．７５μｌに、反応液（ＰＢＳに約０．０３％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ＋約０．５ｍＭ ２−ＭＥＡ＋約０．０４％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液）１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ；約０．５ｍＭ ２−ＭＥＡ；約０．０４％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム；約０．０４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ。
２）混合液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
３）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
４）洗浄液を除いた磁性粒子に、ＭＥＳ緩衝液中に懸濁したアルカリホスファターゼ標識抗体（２５ＯＨビタミンＤ−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体免疫複合体に対する抗体）を加えた。
５）上記４）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間のインキュベートした。
６）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
７）洗浄液を除いた磁性粒子に、発光基質（ＡＭＰＰＤ）液を加えた。
８）磁性粒子および発光基質を含む溶液を、３７℃にて５分間インキュベートした。
９）発光カウントを、ラベルリーダー（ＡＲＶＯ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。

４−２）有機溶媒を用いる既存の方法による測定
既存の方法としては、有機溶媒（アセトニトリル）によるタンパク質除去法を用いた。方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、上記４−１）と同じヒト血清５サンプルを用いた。
ａ）ヒト血清２５μｌに、７５μｌのアセトニトリルを加えた。
ｂ）血清とアセトにトリルの混合液を、６０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。
ｃ）上清５０μｌを回収し、希釈液（ＭＥＳ緩衝液：０．１％ ＢＳＡ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）を２００μｌ加えた。
ｄ）上記ｃ）で得られた溶液７５μｌと抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合磁性粒子液を７５μｌ混合した。
ｅ）以降の操作は、上記４−１）の２）〜９）と同じ方法により行った。

４−３）結果
本発明の方法による測定値は、有機溶媒（アセトニトリル）を用いるタンパク質除去法による測定値との相関性が高かった（図１、Ｒ^２＝０．９９８１）。したがって、本発明の方法は、ビタミンＤの測定に有用であると考えられる。

実施例５：本発明の方法と既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡ）との比較（ＩＩ）
アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いる本発明の方法による標的物質の測定精度をさらに検証するため、本発明の方法による標的物質の測定値と、既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡ）により得られた測定値との相関係数を比較した。

５−１）本発明の方法による測定
方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、ヒト血清１３サンプルを用いた。
１）ヒト血清３．７５μｌに、反応液（ＰＢＳに０．０３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋０．５ｍＭ ２−ＭＥＡ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ＋０．０３８％ＢＳＡ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液）１４６．２５μｌを加えた。
２）以降の操作は、実施例４−１）の２）〜９）と同じ方法により行った。

５−２）既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡ）による測定
既存の方法としては、後述するとおり、ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡを用いた。ＤｉａＳｏｒｉｎ−ＲＩＡは、市販のキット（２５−ＨｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ １２５Ｉ ＲＩＡ Ｋｉｔ，ＤｉａＳｏｒｉｎ製）を用いて行った。方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、上記５−１）と同じヒト血清１３サンプルを用いた。
Ｉ）前処理操作
ａ）ガラス試験管を準備する。
ｂ）アセトニトリルを各試験管に５００μｌずつ分注する。
ｃ）キャリブレーター、コントロール、またはサンプル（血清など）を５０μｌずつ加える。
ｄ）サンプル溶液を１０秒間攪拌する。
ｅ）サンプル溶液を、室温にて１２００ｇで１０分間遠心分離する。
ｆ）上清をサンプルとして用いる。

ＩＩ）測定操作
ａ）上記サンプル ２５μｌ、Ｉ^１２５ ２５ＯＨビタミンＤ（ＤｉａＳｏｒｉｎ製） ５０μｌおよび抗２５ＯＨビタミンＤ抗体液 １ｍｌを混合する。
ｂ）混合液を、室温にて９０分インキュベートする。
ｃ）インキュベートした混合液に、ロバ由来抗ヤギ抗体を５００μｌ加える。
ｄ）得られた溶液を、室温にて２５分インキュベートする。
ｅ）インキュベートした溶液に、ＮＳＢ／添加緩衝液を５００μｌ加える。
ｆ）得られた溶液を、室温にて１８００ｇで２０分間遠心分離する。
ｇ）遠心分離した溶液から完全に上清を除く。
ｈ）ガンマシンチレーションカウンターを用いて測定を行う。

５−３）結果
アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法による測定値は、Ｄｉａｓｏｒｉｎ ＲＩＡ法による測定値との相関性が高かった（図２、Ｒ^２＝０．９４２５）。したがって、本発明の方法は、ビタミンＤの測定に有用であると考えられる。

実施例６：ＳＤＳ類似界面活性剤によるビタミンＤの測定
次いで、ＳＤＳ類似界面活性剤によるビタミンＤの測定について検討した。

方法は、以下のとおりに行った。
１）５０ｎｇ／ｍｌ強化ウマ血清３．７５μｌに、反応液〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に、０．０３％（ｗ／ｖ）または０．１％（ｗ／ｖ） 下記界面活性剤＋０．０３８％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０３８％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液〕１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ）または約０．１％（ｗ／ｖ） 下記界面活性剤；約０．０４％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム；および約０．０４％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ。
２）以降の操作は、実施例４−１）の２）〜９）と同じ方法により行った。

結果は、以下の表５に示すとおりであった。なお、表５では、上記工程１）に関して、界面活性剤の非存在下で測定された発光カウントを１００（コントロール）とし、各種界面活性剤の存在下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。

その結果、１０以上の炭素原子数を有する炭化水素鎖を含むＳＤＳ類似界面活性剤で高い効果が認められた。特に、デシル硫酸ナトリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム塩を用いたときに高い効果が認められた。親水性部分を構成する硫黄原子がリン原子である場合、効果が認められなかった。以上のことから、界面活性剤の親水性部分および疎水性部分のどちらもビタミンＤの測定に重要であることが考えられた。

実施例７：炭化水素鎖を有する界面活性剤によるビタミンＤの測定
次いで、炭化水素鎖を有する界面活性剤によるビタミンＤの測定について検討した。

具体的には、方法は、以下のとおりであった。
１）１００ｎｇ／ｍｌ強化ウマ血清３．７５μｌに、反応液〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）、０．０３％（ｗ／ｖ）または０．１％（ｗ／ｖ） 下記の界面活性剤、０．０３８％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．０３８％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液〕１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ）または約０．１％（ｗ／ｖ） 下記界面活性剤；約０．０４％（ｗ／ｖ） デオキシコール酸ナトリウム；および約０．０４％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ。
２）以降の操作は、実施例４−１）の２）〜９）と同じ方法により行った。

結果は、以下の表６に示すとおりであった。なお、表６では、上記工程（１）に関して、界面活性剤の非存在下で測定された発光カウントを１００（コントロール）とし、界面活性剤の存在下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。

その結果、これらの界面活性剤で効果が認められた。特に、ＳＤＳは、低濃度で高い効果を示した。

本発明の方法およびキットは、標的物質の測定に有用である。

Claims (14)

1. 以下を含む、ビタミンＤの測定方法：
   １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
   ２）処理されたサンプルにおいてビタミンＤを検出すること。
2. 炭化水素鎖が、１０個以上の炭素原子数を有する直鎖の炭化水素基である、請求項１記載の方法。
3. 親水性部分が、スルホネート基、カルボキシレート基、またはアンモニウム基である、請求項１または２記載の方法。
4. 前記界面活性剤が、デシル硫酸、ドデシル硫酸またはこれらの塩である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. チオール基含有還元剤でサンプルを処理することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
6. チオール基含有還元剤が、ジチオエリトリトール、システイン、２−メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールからなる群より選ばれる、請求項５記載の方法。
7. サンプルの処理が混合のみによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
8. 以下を含む方法である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法：
   １’）前記界面活性剤およびビタミンＤに対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理すること；ならびに
   ２’）処理されたサンプルにおいてビタミンＤを検出すること。
9. 以下を含む方法である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法：
   １’’）前記界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること；
   ２’’）前記１’’）で処理されたサンプルを希釈液で処理すること；ならびに
   ３’’）前記２’’）で処理されたサンプルにおいてビタミンＤを検出すること。
10. サンプルがヒト由来のサンプルである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
11. サンプルが血液関連サンプルである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
12. ビタミンＤがサンプル中でビタミンＤ結合タンパク質と結合している、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. 以下を含む、ビタミンＤの測定用キット：
    １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤；ならびに
    ２）ビタミンＤに対する親和性物質および／またはビタミンＤ標品。
14. チオール基含有還元剤をさらに含む、請求項１３記載のキット。

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