JP6426397B2

JP6426397B2 - Biomass-degrading bacteria from the digestive tract of Akate crab

Info

Publication number: JP6426397B2
Application number: JP2014164345A
Authority: JP
Inventors: 克英三宅; 清治柳井
Original assignee: Ishikawa Prefectural University
Current assignee: Ishikawa Prefectural University
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2018-11-21
Anticipated expiration: 2034-08-12
Also published as: JP2016039786A

Description

本発明は、アカテガニ消化管由来バイオマス分解細菌群に関し、リグニン分解能を有する好気性微生物を含んでなるリグニン分解剤に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a group of biomass-degrading bacteria derived from the digestive tract of Akate crab, and to a lignin-decomposing agent comprising an aerobic microorganism having lignin-degrading ability.

植物バイオマス資源が、持続的に利用可能な燃料の製造原料、あるいは高性能セルロース製造原料として、注目されている。しかし、植物バイオマス資源は、難分解性のリグニンが多量に含まれていることが、その応用の妨げになっている。そこで、このリグニンを分解可能な酵素源や生物製剤が求められていた。また、このようなリグニン分解手段は、環境汚染難分解性物質の分解、がれき処理、コンポスト効率化等においても有用となる。 Plant biomass resources are attracting attention as raw materials for sustainable use of fuels or raw materials for producing high-performance cellulose. However, plant biomass resources are hampered by their high application of persistent lignin. Therefore, an enzyme source and a biologic capable of degrading this lignin have been desired. In addition, such a lignin decomposition means is useful also in the decomposition of substances difficult to be decomposed into environmental pollution, the treatment of debris, and the improvement of compost efficiency.

担子菌である白色腐朽菌が、自然界におけるリグニン分解を主として担っていることから、リグニン分解手段の探索のために、主に研究されてきた（非特許文献１、非特許文献２）。しかし、生物製剤として用いるには生育が遅いという欠点がある。 Since white rot fungus, which is a basidiomycete, is mainly responsible for lignin degradation in the natural world, it has been mainly studied for the search for lignin degradation means (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). However, there is a disadvantage that the growth is slow when used as a biologic.

ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ２００９；５（６）：５７８−５９５International Journal of Biological Sciences 2009; 5 (6): 578-595 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２），１５８，５８−６８Microbiology (2012), 158, 58-68

したがって、本発明の目的は、リグニン分解能を有する新規な微生物製剤を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a novel microorganism preparation having lignin degradation.

本発明者は、鋭意探索研究を進めた結果、北陸地方の海辺林における生態学的な観察から、森林に生息するアカテガニ等の甲殻類が、落ち葉や木片を食料とする草食性であって、森林と海を往復する習性から海辺林−水域の物質循環や沿岸の水産資源維持を担うほどの大量のバイオマス処理を行っているという洞察を得た。そして、このようなバイオマス処理を行うだけの強いバイオマス分解能力を持っていると予想して、この草食性甲殻類の消化管に対してスクリーニングを行ったところ、強いリグニン分解能を有する好気性微生物を単離して、本発明に到達した。 As a result of intensive investigations, the inventor of the present invention has found that crustaceans such as red crest crabs that inhabit the forest are herbivores which feed on fallen leaves and pieces of wood, as a result of ecological observation in seaside forests of the Hokuriku region. From the habit of going back and forth between the forest and the sea, we obtained the insight that we are carrying out a large amount of biomass processing that is responsible for material circulation in the seaside forest-water area and maintenance of coastal fishery resources. Then, when it was predicted that the herbivorous crustacean digestive tract had strong biomass decomposition ability to perform such biomass processing, aerobic microorganisms having strong lignin degradation ability were screened. It isolated and arrived at the present invention.

したがって、本発明は、次の（１）以下を含む。
（１）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されたリグニン分解能を有する好気性微生物を含んでなる、リグニン分解剤：
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物、
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物。
（２）リグニン分解能を有する好気性微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（１）に記載のリグニン分解剤：
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）、
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）。
（３）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物を含んでなる、セルロース分解剤。
（４）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、リグニン分解能を有する好気性微生物：
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物、
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物。
（５）
リグニン分解能を有する好気性微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（４）に記載の微生物：
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）、
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）。
（６）
（１）〜（２）のいずれかに記載のリグニン分解剤を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、リグニンの分解方法。
（７）
（３）に記載のセルロース分解剤を、セルロースを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、セルロースの分解方法。
（８）
草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、
分離された微生物をリグニン分解能検出系で培養する工程、
を含む、草食性甲殻類の消化管からリグニン分解能を有する好気性微生物を製造する方法。
（９）
草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、
分離された微生物をセルロース分解能検出系で培養する工程、
を含む、草食性甲殻類の消化管からセルロース分解能を有する好気性微生物を製造する方法。 Therefore, the present invention includes the following (1):
(1)
A lignin degrading agent comprising an aerobic microorganism having lignin degradation ability selected from the group consisting of (a) and (b) below:
(A) A microorganism belonging to Bacillus licheniformis, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) A microorganism belonging to Staphylococcus siroli, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 2.
(2) The lignin degrading agent according to (1), wherein the aerobic microorganism having lignin degradation is a microorganism selected from the group consisting of (c) and (d) below:
(C) Bacillus licheniformis LB1 strain (NITE P-01886),
(D) Staphylococcus Ciuli LB11 strain (NITE P-01888).
(3)
A cellulolytic agent comprising the microorganism according to any one of (1) to (2).
(4)
Aerobic microorganisms with lignin degradation, selected from the group consisting of (a) and (b) below:
(A) A microorganism belonging to Bacillus licheniformis, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) A microorganism belonging to Staphylococcus siroli, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 2.
(5)
The microorganism according to (4), wherein the aerobic microorganism having lignin degradation is a microorganism selected from the group consisting of the following (c) and (d):
(C) Bacillus licheniformis LB1 strain (NITE P-01886),
(D) Staphylococcus Ciuli LB11 strain (NITE P-01888).
(6)
A method for degrading lignin, comprising the step of culturing the lignin degrading agent according to any one of (1) and (2) in the presence of a biomass resource containing lignin.
(7)
A method for decomposing cellulose, comprising the step of culturing the cellulolytic agent according to (3) in the presence of a biomass resource comprising cellulose.
(8)
Separating microorganisms from the digestive tract of herbivorous crustaceans,
Culturing the separated microorganism in a lignin degradation detection system,
A method of producing an aerobic microorganism having lignin degradation ability from the digestive tract of herbivorous crustaceans, comprising:
(9)
Separating microorganisms from the digestive tract of herbivorous crustaceans,
Culturing the separated microorganism with a cellulose resolution detection system,
A method for producing an aerobic microorganism having cellulose degradability from the digestive tract of herbivorous crustaceans, comprising:

さらに、本発明は、次の（１１）以下を含む。
（１１）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物の、リグニン分解のための使用（ｕｓｅ）。
（１２）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物の、セルロース分解のための使用（ｕｓｅ）。 Furthermore, the present invention includes the following (11):
(11)
Use of the microorganism according to any one of (1) to (2) for lignin degradation.
(12)
Use for the cellulose decomposition of the microorganisms in any one of (1)-(2).

本発明によれば、植物バイオマス資源に含まれる難分解性のリグニンを容易に分解して、植物バイオマス資源を、持続的に利用可能な燃料の製造原料、あるいは高性能セルロース製造原料として利用できる。また、難分解性のリグニンを分解することによって、環境汚染難分解性物質の分解処理、がれき処理、コンポスト効率化等を、効率よく行うことができる。 According to the present invention, it is possible to easily decompose persistent lignin contained in plant biomass resources, and to use plant biomass resources as a raw material for the sustainable use of fuel or as a raw material for producing high-performance cellulose. In addition, decomposition of the difficultly disintegrating lignin can efficiently carry out decomposition treatment, debris treatment, compost efficiency, etc.

図１は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。FIG. 1 is a photograph showing halo formation on CMC-congo-Red plates. 図２は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。FIG. 2 is a photograph showing halo formation on CMC-congo-Red plates. 図３は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。FIG. 3 is a photograph of the TLC (thin layer chromatography) results showing that CMC has degraded to glucose. 図４は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。FIG. 4 is a photograph of the TLC (thin layer chromatography) results showing that CMC has degraded to glucose. 図５は、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成を示す写真である。FIG. 5 is a photograph showing halo formation on RBBR plates. 図６は、培養によるリグニン吸光度の減少を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the decrease in lignin absorbance due to culture. 図７は、ＬＢ１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。FIG. 7 is a photograph showing lignin discoloration by culture of LB1 strain. 図８は、ＬＢ１１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。FIG. 8 is a photograph showing lignin decolorization by culture of the LB11 strain. 図９は、ＬＢ１株の培養によるリグニンプレートでのハロ形成を示す写真である。FIG. 9 is a photograph showing halo formation on lignin plates by culture of LB1 strain.

具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［本発明の好気性微生物］
本発明の好気性微生物は、次の（ａ）及び（ｂ）の微生物にある。
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物 The present invention will be described in detail by way of specific embodiments. The present invention is not limited to the specific embodiments described below.
[Aerobic microorganism of the present invention]
The aerobic microorganisms of the present invention are the following microorganisms (a) and (b).
(A) A microorganism belonging to Bacillus licheniformis, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 1 (b) A microorganism belonging to Staphylococcus syriuli, wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 2

上記微生物は、好ましくは、次の（ｃ）及び（ｄ）の微生物にある。
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８） The above-mentioned microorganisms are preferably the following (c) and (d) microorganisms.
(C) Bacillus licheniformis LB1 strain (NITE P-01886)
(D) Staphylococcus shiri LB11 strain (NITE P-01888)

［ＬＢ１株］
ＬＢ１株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列（１４１２塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、９９％の相同性があったことから、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属すると同定された。このバチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＬＢ１Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８８６として、２０１４年６月２４日に寄託されている。 [LB1 stock]
In the LB1 strain, the 16S rRNA gene sequence has the base sequence (1412 bases) of SEQ ID NO: 1. The homology search of the 16S rRNA gene sequence identified it as belonging to Bacillus licheniformis because it had 99% homology. This Bacillus licheniformis LB1 strain (LB1 Bacillus) is listed as Accession No. NITE P-01886 at the Patent Microorganisms Depositary, National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology Evaluation, 2-5-8, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. , Deposited on June 24, 2014.

［ＬＢ１１株］
ＬＢ１１株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列（１４２５塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、１００％の相同性があったことから、スタフィロコッカスシウリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｉｕｒｉ）に属すると同定された。このスタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＬＢ１１Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８８８として、２０１４年６月２４日に寄託されている。 [LB11 shares]
In the LB11 strain, the 16S rRNA gene sequence has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (1425 bases). A homology search of 16S rRNA gene sequences identified it as belonging to Staphylococcus sciuri because of 100% homology. The Staphylococcal siuli LB11 strain (LB11 Staphylococcus) is available under the Accession No. NITE P-, to the Patent Microorganisms Depositary, Product Evaluation Technology Foundation Organization, National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology Evaluation, 2-5-8 It has been deposited on June 24, 2014, as 01888.

［リグニン分解剤］
上記微生物は、リグニン分解能を有し、リグニン分解剤として好適に使用できる。このリグニン分解剤は、好気的条件下で容易に使用できる生物製剤であり、担子菌である白色腐朽菌よりも生育が早く、子実体を形成することもなく、溶液中に分散させて使用する事もでき、取り扱いが容易である。 [Lignin decomposition agent]
The above-mentioned microorganism has lignin degradability and can be suitably used as a lignin decomposing agent. This lignin decomposing agent is a biological preparation that can be easily used under aerobic conditions, is faster in growth than the basidiomycete white rot fungus, and is dispersed in a solution without forming a fruiting body. It is also easy to handle.

［セルロース分解剤］
上記微生物は、セルロース分解能を有し、セルロース分解剤として好適に使用できる。このセルロース分解剤は、好気的条件下で容易に使用できる生物製剤であり、担子菌である白色腐朽菌よりも生育が早く、子実体を形成することもなく、溶液中に分散させて使用する事もでき、取り扱いが容易である。また、リグニン分解能とセルロース分解能を同時に有する生物製剤は、植物バイオマス資源を効率よく分解できる点で有利である。 [Cellulose decomposing agent]
The above-mentioned microorganism has cellulose degradability and can be suitably used as a cellulose decomposing agent. This cellulolytic agent is a biological preparation that can be easily used under aerobic conditions, and is faster in growth than the basidiomycete white rot fungus, and is dispersed in a solution without forming fruiting bodies. It is also easy to handle. In addition, a biologic having lignin and cellulose degradability simultaneously is advantageous in that plant biomass resources can be efficiently degraded.

［リグニン分解能を有する好気性微生物のスクリーニング］
本発明の好気性微生物は、草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、分離された微生物をリグニン分解能検出系で培養する工程、を含む方法によって、草食性甲殻類の消化管からスクリーニングして取得することができる。 [Screening of aerobic microorganisms with lignin degradation]
The aerobic microorganism of the present invention is screened from the digestive tract of herbivorous crustaceans by a method comprising the steps of: separating the microorganism from the digestive tract of herbivorous crustaceans; and culturing the separated microorganisms with a lignin degradation detection system. Can be obtained.

［セルロース分解能を有する好気性微生物のスクリーニング］
本発明の好気性微生物は、草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、分離された微生物をセルロース分解能検出系で培養する工程、を含む方法によって、草食性甲殻類の消化管からスクリーニングして取得することができる。 [Screening of aerobic microorganisms with cellulose degradability]
The aerobic microorganism of the present invention is screened from the digestive tract of herbivorous crustaceans by a method comprising the steps of: separating the microorganism from the digestive tract of herbivorous crustaceans; and culturing the separated microorganisms with a cellulose decomposable detection system. Can be obtained.

［草食性甲殻類の消化管］
草食性甲殻類の消化管がスクリーニング源として好適であることは、本発明者による北陸地方の海辺林における生態学的な観察と物質循環の洞察から、導かれたものである。好ましい草食性甲殻類としては、例えば、アカテガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓｈａｅｍａｔｏｃｈｅｉｒ）、クロベンケイガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓｄｅｈａａｎｉ）、ベンケイガニ（Ｓｅｓａｒｍｏｐｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）等をあげることができる。 [Gastrointestine of herbivorous crustaceans]
The suitability of the digestive tract of herbivorous crustaceans as a screening source is derived from the present inventors' insights on ecological observation and material circulation in the seaside forest of Hokuriku region. As preferable herbivorous crustaceans, for example, red-necked crab (Chiromantes haematocheir), black-necked crab (Chiromantes dehaani), brown-backed crab (Sesarmops intermedium) and the like can be mentioned.

［リグニン分解能のスクリーニング］
リグニン分解能検出系は、例えば、実施例において後述する、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成による検出系、液体培地中でのリグニン吸光度の減少による検出系、リグニンプレートでのハロ形成による検出系を、好適に使用することができる。あるいは、公知のリグニン分解能検出系を使用することできる。 [Screening of lignin degradation]
For example, a detection system by halo formation in an RBBR plate, a detection system by reduction of lignin absorbance in a liquid medium, and a detection system by halo formation in a lignin plate, which will be described later in Examples It can be used. Alternatively, known lignin degradation detection systems can be used.

［セルロース分解能のスクリーニング］
セルロース分解能検出系は、例えば、実施例において後述する、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成による検出系、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）によるＣＭＣからのグルコース生成検出による検出系を、好適に使用することができる。あるいは、公知のセルロース分解能検出系を使用することできる。 [Cellulose resolution screening]
The cellulose resolution detection system suitably uses, for example, a detection system by halo formation on a CMC-congo-Red plate, a detection system by glucose generation detection from CMC by TLC (thin layer chromatography) described later in the examples. can do. Alternatively, known cellulose resolution detection systems can be used.

以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［アカテガニ由来消化管細菌の単離］
石川県加賀市で採取したアカテガニを解剖し、口腔近傍の消化管から細菌を回収した。アカテガニはオスバン消毒液で表面を殺菌し、解剖した。消化管は１×ＰＢＳ（表１）で縣濁し、ＬＢ培地（表２）にプレーティングした。アカテガニから１５株の細菌群を得た。 The present invention will be described in detail by way of the following examples. The present invention is not limited to the examples illustrated below.
[Isolation of digestive tract bacteria from Akategani]
The cuttlefishes collected in Kaga City, Ishikawa Prefecture were dissected and bacteria were recovered from the digestive tract near the oral cavity. Akategani disinfected the surface with Osban disinfectant and dissected. The digestive tract was suspended with 1 × PBS (Table 1) and plated on LB medium (Table 2). 15 strains of bacteria were obtained from Akategani.

［菌の同定］
アカテガニから得られた細菌を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子によって同定した。
ユニバーサルプライマーである１６ＳｒＲＮＡの２７ｆと１４９２ｒ（表３）を用いてＰＣＲ増幅し、電気泳動を行って１．５ｋｂｐに出たバンドを切り出した後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）でリボソームＲＮＡ遺伝子を回収した。そのＲＮＡ遺伝子をシーケンスし、得られた塩基配列をインターネットのＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）のデータベースで検索して相同性を検討した。 [Identification of bacteria]
Bacteria obtained from Akate crabs were identified by the 16S rRNA gene.
After PCR amplification using 27f and 1492r (Table 3) which are universal primers, electrophoresis was carried out to cut out a 1.5 kbp band, ribosomal RNA gene was recovered by MagExtractor (TOYOBO). The RNA gene was sequenced, and the obtained nucleotide sequence was searched on the database of NCBI (US Biotechnological Information Center) on the Internet to examine homology.

一般に、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の相同性が９７％以上であれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種である可能性が高いとされる。９８．７％以上の種がいない場合、新種であろうとされる。相同性と属や種の帰属とは異なるが、本明細書では、一般的な基準に従って、相同性が９８％以上であれば当該の菌（種）に属し、それ未満では異なる菌（種）の属するとした。 Generally, if the homology of the nucleotide sequence of 16S rRNA is 97% or more, there is an affinity relation, and if it is 99% or more, it is considered that the possibility of being homologous is high. If there is no 98.7% or more of the species, it is considered to be a new species. Although different from homology and attribution of genus or species, in the present specification, according to a general standard, if the homology is 98% or more, it belongs to the relevant fungus (species), and if it is less than it, the different fungi (species) It belongs to.

この結果、得られたアカテガニ由来消化管細菌のうち、ＬＢ１株は、９９％の相同性を有することから、バチルスリケニフォルミスに属すること、ＬＢ１１株は、１００％の相同性を有することから、スタフィロコッカスシウリに属することがわかった。配列番号１（１４１２塩基）は、ＬＢ１株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。配列番号２（１４２５塩基）は、ＬＢ１１株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。 As a result, LB1 strain has 99% homology among the obtained guttella-derived gut bacteria, and belongs to Bacillus licheniformis, and LB11 strain has 100% homology; It turned out that it belongs to coccus siuli. SEQ ID NO: 1 (base 1412) is the base sequence of 16S rRNA of LB1 strain. SEQ ID NO: 2 (1425 bases) is the base sequence of 16S rRNA of LB11 strain.

［セルロース分解菌のスクリーニング］
アカテガニ由来消化管細菌に対して、セルロース分解活性を有しているか否かのスクリーニングを行った。スクリーニング法はＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法を用いた。ＣＭＣにｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ（赤色色素）が結合して一様に赤色を示しているプレートにおいて、ＣＭＣが分解されるとｃｏｎｄｏ−Ｒｅｄは遊離して流れてゆき、ＣＭＣが分解された箇所は脱色する（ハロを形成する）。このような原理のＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法によって、プレート上で菌のコロニーの周りのハロの形成を指標として、ＣＭＣ分解活性（セルロース分解活性）菌の一次スクリーニングを行った。 [Screening of cellulolytic bacteria]
Screening was conducted to determine whether or not it has cellulolytic activity with respect to digestive tract bacteria derived from Akate crab. The screening method used CMC-congo-Red method. In a plate showing congo-Red (red dye) bound to CMC and showing uniform red color, when CMC is degraded, condo-Red liberates and flows, and the site where CMC is degraded is decolored (Forms a halo). By the CMC-congo-Red method of such principle, primary screening of CMC decomposition activity (cellulolytic activity) bacteria was performed using the formation of halo around the colony of the fungus as an index on the plate.

ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法を使用して、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレート（表４）を作成し、アカテガニ由来消化管細菌を植菌し、３７℃で培養した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、ハロを形成し、セルロース分解活性を有することがわかった。図１及び図２は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。 Using the CMC-congo-Red method, CMC-congo-Red plates (Table 4) were prepared, inoculated with gut-derived gut bacteria, and cultured at 37 ° C. As a result, it was found that the LB1 strain (Bacillus licheniformis LB1 strain) and the LB11 strain (Staphylococcus siuli LB11 strain) form halo and have cellulolytic activity. 1 and 2 are photographs showing halo formation on CMC-congo-Red plates.

［ＴＬＣによるセルラーゼ活性の解析］
試験管中のＬＢ培地５ｍｌに菌を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍ、Ｏ／Ｎで振とう培養した。培養液を４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上清と菌体に分けた。次に菌体の方に１×ＰＢＳを２ｍｌ加えた。よく混濁した後、オートチューンシリーズ高強度超音波プロセッサー（マイクロテック・ニチオン）を用いて１．５ｍｉｎの超音波破砕処理（ＡＭＰＬＩＴＵＤＥ３０％，ＰＵＬＳＥＲ１：１）し、４℃、１００００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し上清を回収した。 [Analysis of cellulase activity by TLC]
The fungus was inoculated into 5 ml of LB medium in a test tube, and cultured with shaking at 37 ° C., 150 rpm, O / N. The culture solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to divide it into supernatant and cells. Next, 2 ml of 1 × PBS was added to the cells. After clouding well, sonicate (AMPLITUDE 30%, PULSER 1: 1) for 1.5 min using an Autotune series high-intensity ultrasonic processor (Microtech Nichion) and centrifuge at 4 ° C, 10000 rpm for 15 minutes It separated and the supernatant was collected.

酵素液４８μｌと１０ｍｇ／ｍｌＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム、和光純薬工業株式会社カタログ番号０３９−０１３３５）溶液２μｌをよく混ぜた後、３７℃、Ｏ／Ｎで反応させた。試料をシリカゲルプレートに２０μｌスポットして風乾し、展開用容器に展開溶媒を入れ，展開用容器を密閉し展開を行った。目安として１ｍｇ／ｍｌＣＭＣ、セロビオース、グルコースを８μｌずつスポットした。
展開溶媒：２−プロパノール：酢酸：水＝４：１：１
展開後は５％硫酸エタノール溶液を吹きかけ、ホットプレートで熱した。 After thoroughly mixing 48 μl of the enzyme solution and 2 μl of a solution of 10 mg / ml CMC (carboxymethylcellulose sodium, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Catalog No. 039-01335), the mixture was reacted at 37 ° C., O / N. The sample was spotted at 20 μl on a silica gel plate, air-dried, the developing solvent was put in a developing container, and the developing container was sealed and developed. As a standard, 8 μl of 1 mg / ml CMC, cellobiose and glucose were spotted.
Developing solvent: 2-propanol: acetic acid: water = 4: 1: 1
After development, a 5% ethanol solution of sulfuric acid was sprayed and heated on a hot plate.

その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、いずれも、上清由来の酵素液でＣＭＣがグルコースまで分解されていた。このことから、セルラーゼが菌体の外に分泌されていると考えられる。また、グルコースまで分解されたことから、エンドグルカナーゼ・エキソセロビオヒドロラーゼ・β−Ｄ−グルコシダーゼ等の複数のセルラーゼを発現し分泌していると考えられる。図３及び図４は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。 As a result, in each of the LB1 strain (Bacillus licheniformis LB1 strain) and the LB11 strain (Staphylococcus siurii LB11 strain), CMC was degraded to glucose by the enzyme solution derived from the supernatant. From this, it is considered that cellulase is secreted out of the cell. Moreover, since it was decomposed | disassembled to glucose, it is thought that several cellulases, such as endoglucanase, exocellobiohydrolase, (beta) -D-glucosidase, are expressed and secreted. Figures 3 and 4 are photographs of the TLC (thin layer chromatography) results showing that CMC has degraded to glucose.

［リグニン分解菌のスクリーニング］
アカテガニ由来消化管細菌に対して、リグニン分解活性を有しているか否かのスクリーニングを行った。スクリーニング法はＲＢＢＲ（ＲｅｍａｚｏｌＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ）法を用いた。ＲＢＢＲはリグニン類似構造をもつ青色色素である。ＲＢＢＲが分解されると脱色するため、プレート上でコロニーのまわりでのハロの形成を指標としてスクリーニングを行った。 [Screening of lignin degrading bacteria]
Screening was conducted to determine whether or not the digestive tract bacteria derived from Akategani have lignin degrading activity. The screening method used RBBR (Remazol Brilliant Blue R) method. RBBR is a blue pigment having a lignin-like structure. In order to decolorize when RBBR is degraded, screening was performed on the plate using formation of halo around colonies as an index.

ＬＢ培地にＲＢＢＲ（シグマ社製、商品名ＲｅｍａｚｏｌＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲカタログ番号Ｒ８００１−２５Ｇ）を０．０６％添加し、プレートを作成し、アカテガニ由来消化管細菌を植菌し、３７℃で培養した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）は、ハロを形成し、リグニン分解活性を有することがわかった。図５は、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成を示す写真である。 To the LB medium, 0.06% of RBBR (manufactured by Sigma, trade name: Remazol Brilliant Blue R Catalog No. R8001-25G) was added to prepare a plate, and Akategani-derived digestive tract bacteria were inoculated and cultured at 37 ° C. As a result, it was found that LB1 strain (Bacillus licheniformis LB1 strain) forms halo and has lignin degrading activity. FIG. 5 is a photograph showing halo formation on RBBR plates.

［高分子リグニン分解活性の測定］
ＬＢ培地にリグニン（リグニン、関東化学株式会社カタログ番号２４１０４−３２）０．０５％を添加して、濾過滅菌を行った。試験管に濾過滅菌後の培地を２ｍｌ入れ、ＬＢ１，２，５，９，１３の菌を１５μｌ植菌した。２４時間振とう培養後、遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、２０分）を行い、上清を回収し、４８０ｎｍの吸光度を測定した。 [Measurement of high molecular weight lignin degradation activity]
Filter sterilization was carried out by adding 0.05% of lignin (lignin, Kanto Chemical Co., Ltd. catalog number 24104-32) to LB medium. 2 ml of the culture medium after filter sterilization was put in a test tube, and 15 μl of LB1, 2, 5, 9, 13 was inoculated. After shaking culture for 24 hours, centrifugation (4 ° C., 10000 rpm, 20 minutes) was performed, the supernatant was recovered, and the absorbance at 480 nm was measured.

その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、４８０ｎｍのリグニンの吸光度が、それぞれ約２３％、及び約６８％減少し、高分子のリグニンを分解する活性を有していることがわかった。これらの吸光度の減少は顕著であり、目視観察によってもリグニンの褐色の脱色が確認できた。図６は、培養によるリグニン吸光度の減少を示すグラフである。図６の縦軸は、４８０ｎｍでの吸光度（ＡＵ）を示す。図７及び図８は、ＬＢ１株及びＬＢ１１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。 As a result, LB1 strain (Bacillus licheniformis LB1 strain) and LB11 strain (Staphylococcus siurii LB11 strain) decrease the absorbance of lignin at 480 nm by about 23% and about 68%, respectively, and degrade the polymeric lignin Was found to have the following activity. The decrease in absorbance was remarkable, and the brown color of lignin could be confirmed also by visual observation. FIG. 6 is a graph showing the decrease in lignin absorbance due to culture. The vertical axis in FIG. 6 indicates the absorbance (AU) at 480 nm. FIG. 7 and FIG. 8 are photographs showing lignin decolorization by culture of strains LB1 and LB11.

［リグニンプレートによる高分子リグニン分解活性の測定］
次の表５の組成のリグニンプレートを作製し、アカテガニ由来消化管細菌をその上に植菌して３７℃で１−２日培養してハロの形成を観察した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）は、ハロを形成し、高分子リグニン分解活性を有することがわかった。図９は、ＬＢ１株の培養によるリグニンプレートのハロ形成を示す写真である。 [Measurement of polymer lignin degradation activity by lignin plate]
A lignin plate having the composition shown in Table 5 below was prepared, and Akagegani-derived gut bacteria were inoculated thereon and cultured for 1 to 2 days at 37 ° C. to observe formation of halo. As a result, it was found that LB1 strain (Bacillus licheniformis LB1 strain) forms halo and has high molecular weight lignin degrading activity. FIG. 9 is a photograph showing halo formation of lignin plates by culture of LB1 strain.

本発明はリグニン分解能を有する新規微生物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。 The present invention provides novel microorganisms having lignin degradation. The present invention is an industrially useful invention.

Claims

A lignin cellulose decomposing agent comprising an aerobic microorganism having lignin decomposition and cellulose decomposition , which is selected from the group consisting of (a) and (b) below:
(A) Bacillus licheniformis LB1 strain (NITE P-01886) , wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) Staphylococcus siroli LB11 strain (NITE P-01888) , wherein the 16S rRNA gene sequence has the base sequence of SEQ ID NO: 2 ;

A method for degrading lignin, comprising the step of culturing the lignin and cellulose decomposing agent according to claim 1 in the presence of a biomass resource containing lignin.

A method of decomposing cellulose, comprising the step of culturing the lignin / cellulose decomposing agent according to claim 1 in the presence of a biomass resource containing cellulose.