JP6426397B2

JP6426397B2 - アカテガニ消化管由来バイオマス分解細菌群

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Publication number: JP6426397B2
Application number: JP2014164345A
Authority: JP
Inventors: 克英三宅; 清治柳井
Original assignee: Ishikawa Prefectural University
Current assignee: Ishikawa Prefectural University
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2018-11-21
Anticipated expiration: 2034-08-12
Also published as: JP2016039786A

Description

本発明は、アカテガニ消化管由来バイオマス分解細菌群に関し、リグニン分解能を有する好気性微生物を含んでなるリグニン分解剤に関する。

植物バイオマス資源が、持続的に利用可能な燃料の製造原料、あるいは高性能セルロース製造原料として、注目されている。しかし、植物バイオマス資源は、難分解性のリグニンが多量に含まれていることが、その応用の妨げになっている。そこで、このリグニンを分解可能な酵素源や生物製剤が求められていた。また、このようなリグニン分解手段は、環境汚染難分解性物質の分解、がれき処理、コンポスト効率化等においても有用となる。

担子菌である白色腐朽菌が、自然界におけるリグニン分解を主として担っていることから、リグニン分解手段の探索のために、主に研究されてきた（非特許文献１、非特許文献２）。しかし、生物製剤として用いるには生育が遅いという欠点がある。

ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ２００９；５（６）：５７８−５９５Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２），１５８，５８−６８

したがって、本発明の目的は、リグニン分解能を有する新規な微生物製剤を提供することにある。

本発明者は、鋭意探索研究を進めた結果、北陸地方の海辺林における生態学的な観察から、森林に生息するアカテガニ等の甲殻類が、落ち葉や木片を食料とする草食性であって、森林と海を往復する習性から海辺林−水域の物質循環や沿岸の水産資源維持を担うほどの大量のバイオマス処理を行っているという洞察を得た。そして、このようなバイオマス処理を行うだけの強いバイオマス分解能力を持っていると予想して、この草食性甲殻類の消化管に対してスクリーニングを行ったところ、強いリグニン分解能を有する好気性微生物を単離して、本発明に到達した。

したがって、本発明は、次の（１）以下を含む。
（１）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されたリグニン分解能を有する好気性微生物を含んでなる、リグニン分解剤：
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物、
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物。
（２）リグニン分解能を有する好気性微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（１）に記載のリグニン分解剤：
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）、
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）。
（３）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物を含んでなる、セルロース分解剤。
（４）
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、リグニン分解能を有する好気性微生物：
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物、
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物。
（５）
リグニン分解能を有する好気性微生物が、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択された微生物である、（４）に記載の微生物：
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）、
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）。
（６）
（１）〜（２）のいずれかに記載のリグニン分解剤を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、リグニンの分解方法。
（７）
（３）に記載のセルロース分解剤を、セルロースを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、セルロースの分解方法。
（８）
草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、
分離された微生物をリグニン分解能検出系で培養する工程、
を含む、草食性甲殻類の消化管からリグニン分解能を有する好気性微生物を製造する方法。
（９）
草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、
分離された微生物をセルロース分解能検出系で培養する工程、
を含む、草食性甲殻類の消化管からセルロース分解能を有する好気性微生物を製造する方法。

さらに、本発明は、次の（１１）以下を含む。
（１１）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物の、リグニン分解のための使用（ｕｓｅ）。
（１２）
（１）〜（２）のいずれかに記載の微生物の、セルロース分解のための使用（ｕｓｅ）。

本発明によれば、植物バイオマス資源に含まれる難分解性のリグニンを容易に分解して、植物バイオマス資源を、持続的に利用可能な燃料の製造原料、あるいは高性能セルロース製造原料として利用できる。また、難分解性のリグニンを分解することによって、環境汚染難分解性物質の分解処理、がれき処理、コンポスト効率化等を、効率よく行うことができる。

図１は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。図２は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。図３は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。図４は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。図５は、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成を示す写真である。図６は、培養によるリグニン吸光度の減少を示すグラフである。図７は、ＬＢ１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。図８は、ＬＢ１１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。図９は、ＬＢ１株の培養によるリグニンプレートでのハロ形成を示す写真である。

具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［本発明の好気性微生物］
本発明の好気性微生物は、次の（ａ）及び（ｂ）の微生物にある。
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスに属する微生物
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリに属する微生物

上記微生物は、好ましくは、次の（ｃ）及び（ｄ）の微生物にある。
（ｃ）バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）
（ｄ）スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）

［ＬＢ１株］
ＬＢ１株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列（１４１２塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、９９％の相同性があったことから、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属すると同定された。このバチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＬＢ１Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８８６として、２０１４年６月２４日に寄託されている。

［ＬＢ１１株］
ＬＢ１１株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列（１４２５塩基）を有する。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性検索で、１００％の相同性があったことから、スタフィロコッカスシウリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｉｕｒｉ）に属すると同定された。このスタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＬＢ１１Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８８８として、２０１４年６月２４日に寄託されている。

［リグニン分解剤］
上記微生物は、リグニン分解能を有し、リグニン分解剤として好適に使用できる。このリグニン分解剤は、好気的条件下で容易に使用できる生物製剤であり、担子菌である白色腐朽菌よりも生育が早く、子実体を形成することもなく、溶液中に分散させて使用する事もでき、取り扱いが容易である。

［セルロース分解剤］
上記微生物は、セルロース分解能を有し、セルロース分解剤として好適に使用できる。このセルロース分解剤は、好気的条件下で容易に使用できる生物製剤であり、担子菌である白色腐朽菌よりも生育が早く、子実体を形成することもなく、溶液中に分散させて使用する事もでき、取り扱いが容易である。また、リグニン分解能とセルロース分解能を同時に有する生物製剤は、植物バイオマス資源を効率よく分解できる点で有利である。

［リグニン分解能を有する好気性微生物のスクリーニング］
本発明の好気性微生物は、草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、分離された微生物をリグニン分解能検出系で培養する工程、を含む方法によって、草食性甲殻類の消化管からスクリーニングして取得することができる。

［セルロース分解能を有する好気性微生物のスクリーニング］
本発明の好気性微生物は、草食性甲殻類の消化管から微生物を分離する工程、分離された微生物をセルロース分解能検出系で培養する工程、を含む方法によって、草食性甲殻類の消化管からスクリーニングして取得することができる。

［草食性甲殻類の消化管］
草食性甲殻類の消化管がスクリーニング源として好適であることは、本発明者による北陸地方の海辺林における生態学的な観察と物質循環の洞察から、導かれたものである。好ましい草食性甲殻類としては、例えば、アカテガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓｈａｅｍａｔｏｃｈｅｉｒ）、クロベンケイガニ（Ｃｈｉｒｏｍａｎｔｅｓｄｅｈａａｎｉ）、ベンケイガニ（Ｓｅｓａｒｍｏｐｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）等をあげることができる。

［リグニン分解能のスクリーニング］
リグニン分解能検出系は、例えば、実施例において後述する、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成による検出系、液体培地中でのリグニン吸光度の減少による検出系、リグニンプレートでのハロ形成による検出系を、好適に使用することができる。あるいは、公知のリグニン分解能検出系を使用することできる。

［セルロース分解能のスクリーニング］
セルロース分解能検出系は、例えば、実施例において後述する、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成による検出系、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）によるＣＭＣからのグルコース生成検出による検出系を、好適に使用することができる。あるいは、公知のセルロース分解能検出系を使用することできる。

以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［アカテガニ由来消化管細菌の単離］
石川県加賀市で採取したアカテガニを解剖し、口腔近傍の消化管から細菌を回収した。アカテガニはオスバン消毒液で表面を殺菌し、解剖した。消化管は１×ＰＢＳ（表１）で縣濁し、ＬＢ培地（表２）にプレーティングした。アカテガニから１５株の細菌群を得た。

［菌の同定］
アカテガニから得られた細菌を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子によって同定した。
ユニバーサルプライマーである１６ＳｒＲＮＡの２７ｆと１４９２ｒ（表３）を用いてＰＣＲ増幅し、電気泳動を行って１．５ｋｂｐに出たバンドを切り出した後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）でリボソームＲＮＡ遺伝子を回収した。そのＲＮＡ遺伝子をシーケンスし、得られた塩基配列をインターネットのＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）のデータベースで検索して相同性を検討した。

一般に、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の相同性が９７％以上であれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種である可能性が高いとされる。９８．７％以上の種がいない場合、新種であろうとされる。相同性と属や種の帰属とは異なるが、本明細書では、一般的な基準に従って、相同性が９８％以上であれば当該の菌（種）に属し、それ未満では異なる菌（種）の属するとした。

この結果、得られたアカテガニ由来消化管細菌のうち、ＬＢ１株は、９９％の相同性を有することから、バチルスリケニフォルミスに属すること、ＬＢ１１株は、１００％の相同性を有することから、スタフィロコッカスシウリに属することがわかった。配列番号１（１４１２塩基）は、ＬＢ１株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。配列番号２（１４２５塩基）は、ＬＢ１１株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列である。

［セルロース分解菌のスクリーニング］
アカテガニ由来消化管細菌に対して、セルロース分解活性を有しているか否かのスクリーニングを行った。スクリーニング法はＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法を用いた。ＣＭＣにｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ（赤色色素）が結合して一様に赤色を示しているプレートにおいて、ＣＭＣが分解されるとｃｏｎｄｏ−Ｒｅｄは遊離して流れてゆき、ＣＭＣが分解された箇所は脱色する（ハロを形成する）。このような原理のＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法によって、プレート上で菌のコロニーの周りのハロの形成を指標として、ＣＭＣ分解活性（セルロース分解活性）菌の一次スクリーニングを行った。

ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄ法を使用して、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレート（表４）を作成し、アカテガニ由来消化管細菌を植菌し、３７℃で培養した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、ハロを形成し、セルロース分解活性を有することがわかった。図１及び図２は、ＣＭＣ−ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄプレートでのハロ形成を示す写真である。

［ＴＬＣによるセルラーゼ活性の解析］
試験管中のＬＢ培地５ｍｌに菌を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍ、Ｏ／Ｎで振とう培養した。培養液を４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上清と菌体に分けた。次に菌体の方に１×ＰＢＳを２ｍｌ加えた。よく混濁した後、オートチューンシリーズ高強度超音波プロセッサー（マイクロテック・ニチオン）を用いて１．５ｍｉｎの超音波破砕処理（ＡＭＰＬＩＴＵＤＥ３０％，ＰＵＬＳＥＲ１：１）し、４℃、１００００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し上清を回収した。

酵素液４８μｌと１０ｍｇ／ｍｌＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム、和光純薬工業株式会社カタログ番号０３９−０１３３５）溶液２μｌをよく混ぜた後、３７℃、Ｏ／Ｎで反応させた。試料をシリカゲルプレートに２０μｌスポットして風乾し、展開用容器に展開溶媒を入れ，展開用容器を密閉し展開を行った。目安として１ｍｇ／ｍｌＣＭＣ、セロビオース、グルコースを８μｌずつスポットした。
展開溶媒：２−プロパノール：酢酸：水＝４：１：１
展開後は５％硫酸エタノール溶液を吹きかけ、ホットプレートで熱した。

その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、いずれも、上清由来の酵素液でＣＭＣがグルコースまで分解されていた。このことから、セルラーゼが菌体の外に分泌されていると考えられる。また、グルコースまで分解されたことから、エンドグルカナーゼ・エキソセロビオヒドロラーゼ・β−Ｄ−グルコシダーゼ等の複数のセルラーゼを発現し分泌していると考えられる。図３及び図４は、ＣＭＣがグルコースまで分解したことを示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果の写真である。

［リグニン分解菌のスクリーニング］
アカテガニ由来消化管細菌に対して、リグニン分解活性を有しているか否かのスクリーニングを行った。スクリーニング法はＲＢＢＲ（ＲｅｍａｚｏｌＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ）法を用いた。ＲＢＢＲはリグニン類似構造をもつ青色色素である。ＲＢＢＲが分解されると脱色するため、プレート上でコロニーのまわりでのハロの形成を指標としてスクリーニングを行った。

ＬＢ培地にＲＢＢＲ（シグマ社製、商品名ＲｅｍａｚｏｌＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲカタログ番号Ｒ８００１−２５Ｇ）を０．０６％添加し、プレートを作成し、アカテガニ由来消化管細菌を植菌し、３７℃で培養した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）は、ハロを形成し、リグニン分解活性を有することがわかった。図５は、ＲＢＢＲプレートでのハロ形成を示す写真である。

［高分子リグニン分解活性の測定］
ＬＢ培地にリグニン（リグニン、関東化学株式会社カタログ番号２４１０４−３２）０．０５％を添加して、濾過滅菌を行った。試験管に濾過滅菌後の培地を２ｍｌ入れ、ＬＢ１，２，５，９，１３の菌を１５μｌ植菌した。２４時間振とう培養後、遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、２０分）を行い、上清を回収し、４８０ｎｍの吸光度を測定した。

その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）、及びＬＢ１１株（スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株）は、４８０ｎｍのリグニンの吸光度が、それぞれ約２３％、及び約６８％減少し、高分子のリグニンを分解する活性を有していることがわかった。これらの吸光度の減少は顕著であり、目視観察によってもリグニンの褐色の脱色が確認できた。図６は、培養によるリグニン吸光度の減少を示すグラフである。図６の縦軸は、４８０ｎｍでの吸光度（ＡＵ）を示す。図７及び図８は、ＬＢ１株及びＬＢ１１株の培養によるリグニン脱色を示す写真である。

［リグニンプレートによる高分子リグニン分解活性の測定］
次の表５の組成のリグニンプレートを作製し、アカテガニ由来消化管細菌をその上に植菌して３７℃で１−２日培養してハロの形成を観察した。その結果、ＬＢ１株（バチルスリケニフォルミスＬＢ１株）は、ハロを形成し、高分子リグニン分解活性を有することがわかった。図９は、ＬＢ１株の培養によるリグニンプレートのハロ形成を示す写真である。

本発明はリグニン分解能を有する新規微生物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。

Claims

以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択された、リグニン分解能及びセルロース分解能を有する好気性微生物を含んでなる、リグニン・セルロース分解剤：
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号１の塩基配列を有する、バチルスリケニフォルミスＬＢ１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８６）、
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が、配列番号２の塩基配列を有する、スタフィロコッカスシウリＬＢ１１株（ＮＩＴＥＰ−０１８８８）。
請求項１に記載のリグニン・セルロース分解剤を、リグニンを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、リグニンの分解方法。
請求項１に記載のリグニン・セルロース分解剤を、セルロースを含むバイオマス資源の存在下で培養する工程を含む、セルロースの分解方法。