JP6484012B2

JP6484012B2 - Ｐｃｒによる落花生の検出方法及びキット

Info

Publication number: JP6484012B2
Application number: JP2014242327A
Authority: JP
Inventors: 渡辺　聡; 聡渡辺; 明子鴨井; 宜司平尾
Original assignee: House Foods Group Inc
Current assignee: House Foods Group Inc
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2019-03-13
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: JP2016101142A

Description

本発明は、飲食品中の食物アレルゲンである落花生について陽性／陰性判定を行うためのＰＣＲ検査法にて利用することができる、増幅効率の高い新規の落花生検出用のプライマーセット及びそれを用いた検査法に関する。

落花生は、小麦、そば等と共にアレルギーを引き起こす主要な食物アレルゲンとして知られており、患者によっては微量の摂取であっても重篤なアナフィラキシーショックを引き起こす。また、食物アレルギー患者の数は近年増加の一途をたどっており、世界的に大きな社会問題の一つとなっている。

この様な背景のもと、日本をはじめとする諸外国において、食物アレルギー表示制度が施行されている。この表示制度は、特定のアレルゲンが含まれない食品を選択するために必要な情報を患者に提供することを目的としたもので、併せて表示の妥当性を検証する手段としての検査方法が必要となる。日本では、義務表示となる特定原材料７品目、推奨表示となる特定原材料に準ずる２０品目が対象として指定されており（非特許文献１）、そのうち小麦、そば、落花生などの特定原材料については検査方法が通知されている（非特許文献２）。これら通知によると、特定原材料などのタンパク質が一定量（数μｇ／ｇ、数μｇ／ｍＬ）以上含まれている食品には表示が必要となり、食品採取重量１ｇあたりの特定原材料などに由来するタンパク質含量がＥＬＩＳＡによる定量のスクリーニング検査で１０μｇ以上となったものを陽性と判断するとされる。また、スクリーニング検査で陽性と判断された食品については、必要に応じてＰＣＲ法やウェスタンブロット法による定性の確認検査が行われている。ここで、アレルゲンの確認検査に用いられている定性ＰＣＲ法では、増幅産物の有／無を電気泳動で確認して陽性／陰性を判定する。例えば、落花生の定性ＰＣＲによる検査法としては、非特許文献２や特許文献１に記載されているものが報告されている。また、ＰＣＲ反応液中の増幅産物に由来する蛍光シグナル強度をモニタリング検出するリアルタイムＰＣＲがあり、アレルゲンである小麦、そば、落花生の検査法（特許文献２、３）が報告されている。

特許第４６５８８１６号公報特開２０１３−１８８１６４号公報特許第４３９９４１７号公報

アレルギー物質を含む食品に関する表示指導要領（消費者庁ホームページ）アレルギー物質を含む食品の検査方法について（平成２２年９月１０日付け消食表第２８６号）

本発明者らはこれまでに、特許文献３に改良を加えた方法として、特許文献１（以下、特許文献１に記載のＰＣＲ法を「従来ＰＣＲ法」と記載する）に記載された落花生定性プライマーセット（配列番号８−９）と特許文献３に記載された落花生定量用ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１０）を組み合わせた定性リアルタイムＰＣＲ法を確立し、これにより、特許文献２、３に記載された小麦、そばの検査法と、同一条件下にて同時検査を行うことができ、食物アレルゲンの分析の手間を少なくできることを報告した（特願２０１４−５７１０７、以下、当該定性リアルタイムＰＣＲ法を「従来リアルタイムＰＣＲ法」と記載する）。この際、小麦、そば、落花生をタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量となるように添加したモデル加工食品を作製し、このモデル加工食品より抽出したＤＮＡを鋳型として小麦、そば、及び落花生のＤＮＡについてリアルタイムＰＣＲ法により分析した。この結果、落花生ＤＮＡの増幅効率が、小麦ＤＮＡ及びそばＤＮＡの増幅効率と比べて低く、それ故に検査におけるＰＣＲ条件（より詳細には、サイクル数）を最も増幅効率の低い落花生の条件に合わせる必要があった。

しかしながら、この落花生の条件に合わせたＰＣＲ条件（サイクル数）は、小麦の検査法及びそばの検査法にとっては必要以上に長く、検出感度が必要以上に高くなるために、これら検査法においては検査環境由来の微量のコンタミネーションに起因するシグナルを検出し得、これにより検査の精度を低下させる可能性があった。

そこで本発明は、落花生ＤＮＡを検出するための従来ＰＣＲ法および従来リアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマーセットと比べて増幅効率の高い新規のプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、小麦の検査法及びそばの検査法に適したＰＣＲ条件下にて、同時に実施することができる落花生の検査法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたＰＣＲにおいて、落花生ＤＮＡを効率良く増幅できること、またかかるプライマーセットを用いた場合には、小麦の検査法及びそばの検査法に適したＰＣＲ条件下にて、落花生の検査法を同時に実施することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンをＰＣＲ法により検出するためのプライマーセットであって、該プライマーセットが以下の（ａ）と（ｂ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む落花生検出用プライマーセットを含む、上記プライマーセット：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［２］落花生検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｃ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを含む、［１］のプライマーセット：
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［３］さらに、以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む小麦検出用プライマーセット、ならびに／あるいは、
以下の（ｈ）と（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むそば検出用プライマーセット、を含む［１］又は［２］のプライマーセット：
（ｄ）配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｇ）配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［４］小麦検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを含む、ならびに／あるいは、
そば検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを含む、
［３］のプライマーセット：
（ｊ）配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［５］飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンをＰＣＲ法により検出するための方法であって、
該飲食品又は飲食品原材料に由来するＤＮＡを鋳型として、以下の（ａ）と（ｂ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む落花生検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行うこと、次いで、落花生ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定することを含む、上記方法：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［６］同一条件下においてさらに、該飲食品又は飲食品原材料に由来するＤＮＡを鋳型として、以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む小麦検出用プライマーセット、ならびに／あるいは、
以下の（ｈ）と（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むそば検出用プライマーセット、を用いてＰＣＲを行うこと、次いで、小麦ＤＮＡならびに／あるいはそばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定することを含む、［５］の方法：
（ｄ）配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｇ）配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［７］ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅産物の検出をプローブを用いて行う、［５］又は［６］の方法。
［８］落花生ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｃ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを用いて行う、［７］の方法：
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
［９］小麦ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定する場合において、小麦ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを用いて行う、ならびに／あるいは、
そばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定する場合において、そばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むプローブを用いて行う、［７］又は［８］の方法：
（ｊ）配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。

本発明によれば、従来公知の落花生検出用のプライマーセットと比べて増幅効率の高い新規の落花生検出用のプライマーセットを提供することができる。

また、本発明によれば、小麦の検査法及びそばの検査法に適したＰＣＲ条件下にて、同時に実施することができる落花生の検査法を提供することができる。

本発明によれば、従来公知の落花生検出用のプライマーセットと比べて短いＰＣＲサイクル条件で同等の感度・特異性を得ることができるために、小麦の検査法及びそばの検査法に合わせた短いＰＣＲ条件（サイクル数）で、落花生の検出を行うことができ、小麦、そば、及び落花生の同時検査を実施することができる。これにより落花生の検査条件に合わせて必要以上に高感度となっていた小麦の検査法及びそばの検査における問題、すなわち、検査環境由来の微量の小麦コンタミネーションによるシグナルの発生を低減することができる。

図１−１は、配列番号１−２のプライマーセット及び配列番号８−９の従来ＰＣＲ法のプライマーセットを利用した定性ＰＣＲ法（アニーリング温度６８℃）による落花生ＤＮＡ（５ｐｇ、５００ｆｇ、５０ｆｇ）の検出結果を示す。図１−２は、配列番号１−２のプライマーセット及び配列番号８−９の従来ＰＣＲ法のプライマーセットを利用した定性ＰＣＲ法（アニーリング温度６６℃）による落花生ＤＮＡ（５ｐｇ、５００ｆｇ、５０ｆｇ）の検出結果を示す。図２は、市販の加工食品のＤＮＡ抽出量とＤＮＡ分解度の分析結果を示す。Ｘ軸は抽出ＤＮＡ量、Ｙ軸はＤＮＡ断片長をそれぞれ示す。図３は、配列番号１−２と配列番号３のプライマー・プローブセット、配列番号１１、１２、１３及び１４と配列番号１５の小麦検出用のプライマー・プローブセット、及び配列番号１６−１７と配列番号１８のそば検出用のプライマー・プローブセットを利用した、同一条件のリアルタイムＰＣＲ法によるモデル加工食品における各食物アレルゲンの検出結果（Ｃｔ値）を示す。（Ａ）はライフテクノロジーズジャパン社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ、（Ｂ）はロシュ・ダイアグノスティックス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏを使用した解析結果を示す。図４は、落花生ＤＮＡ、牛肉ＤＮＡの存在下における落花生ＤＮＡ、及び牛肉ＤＮＡを鋳型とする、配列番号１−２のプライマーセットを利用したリアルタイムＰＣＲ法による増幅産物を、電気泳動した結果を示す。

１．プライマーセット
本発明のプライマーセットは、ＰＣＲ法により落花生由来のＤＮＡを検出するためのプライマーセット（以下、「落花生検出用のプライマーセット」と記載する）を含み、当該プライマーセットは落花生に由来するＤＮＡ、より詳細にはリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒ）−２領域にある相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができる以下のプライマーを含む：
配列番号１に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
配列番号２に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

「ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）」とは、相補的関係にある２つの核酸断片が標準的なハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることを意味する（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（１９８９））ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１）。より具体的には、例えば以下の式で求められるＴｍ値を基準としてハイブリダイゼーション（例えば約３．０×ＳＳＣまたは２．０×ＳＳＣ、３０℃または３７℃）を行った後、ハイブリダイゼーションの条件よりストリンジェンシーの高い条件での洗浄（例えば約２．０×ＳＳＣ、３０℃、３７℃、４０℃、４４℃もしくは４８℃以上、または１．０×ＳＳＣもしくは０．５×ＳＳＣ、３７℃以上など）を行うことを意味する。ハイブリダイズする塩基配列などに応じて適宜ハイブリダイゼーションおよび洗浄に適切な「ストリンジェントな条件」を選択することは、当技術分野では周知技術である。
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（ｆｒａｃｔｉｏｎＧ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
［Ｎａ^＋］：Ｎａ^＋のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
ｆｒａｃｔｉｏｎＧ＋Ｃ：オリゴヌクレオチド中のＧおよびＣの割合（％）
Ｎ：オリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）

なお、「ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）」とは、特に記載しない限り、以下においても同じ意味で使用する。

本発明における落花生検出用のプライマーセットは、従来ＰＣＲ法のプライマーセット（配列番号８−９）と比べて増幅効率が高いため、従来ＰＣＲ法のプライマーセットと同等の感度及び／又は特異性を維持しながらＰＣＲサイクル条件、より詳細には、サイクル数を短縮することができる。

落花生検出用のプライマーセットには上記プライマーに加えてさらに、プローブを含めることができる。プローブは上記プライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ中の標的配列にストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができるものであればよく特に限定はされないが、好ましくは配列番号３に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。

プローブは、蛍光物質（例えば、ＦＡＭ^TM、ＴＥＴ^TM、ＶＩＣ^TM、ＨＥＸ^TM、ＮＥＤ^TM、ＰＥＴ等）及び／又は消光物質（クエンチャー）（例えば、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ等）で標識されていてもよい。このように標識されたプローブはＴａｑＭａｎプローブとも称される。

本発明のプライマーセットは、上記「落花生検出用のプライマーセット」に加えてさらに、ＰＣＲ法により小麦由来のＤＮＡを検出するためのプライマーセット（以下、「小麦検出用のプライマーセット」と記載する）及び／又はＰＣＲ法によりそば由来のＤＮＡを検出するためのプライマーセット（以下、「そば検出用のプライマーセット」と記載する）を含めることができる。

小麦検出用のプライマーセットは、増幅効率の高い従来公知のプライマーセット（特開２０１３−１８８１６４号公報）を利用することができ、以下のプライマーを含む：
配列番号１１に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
配列番号１２に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
配列番号１３に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
配列番号１４に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

小麦検出用のプライマーセットには上記プライマーに加えてさらに、プローブを含めることができる。プローブは上記プライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ中の標的配列にストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができるものであればよく特に限定はされないが、好ましくは、配列番号１５に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。プローブは、上記蛍光物質及び／又は消光物質（クエンチャー）で標識されていてもよい。

そば検出用のプライマーセットは、増幅効率の高い従来公知のプライマーセット（特許第４３９９４１７号公報）を利用することができ、以下のプライマーを含む：
配列番号１６に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
配列番号１７に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

そば検出用のプライマーセットには上記プライマーに加えてさらに、プローブを含めることができる。プローブは上記プライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ中の標的配列にストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができるものであればよく特に限定はされないが、好ましくは、配列番号１８に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。プローブは、上記蛍光物質及び／又は消光物質（クエンチャー）で標識されていてもよい。

本発明における落花生検出用のプライマーセットは、増幅効率の高い従来公知の上記小麦検出用のプライマーセット及び／又はそば検出用のプライマーセットを用いたＰＣＲ条件と同一条件で試料中に存在する落花生由来のＤＮＡを高感度に検出することができる。すなわち、本発明のプライマーセットを利用することによって、小麦及び／又はそば検出用のＰＣＲ反応条件下にて、落花生の検出を行うことが可能であり、小麦及び／又はそば、ならびに落花生の検出を、同一条件下にて同時に進めることができ、分析の手間を少なくすることができる。

また、本発明においては、上記配列番号にて示されるそれぞれの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、同様にプライマー又はプローブとしての機能を有するオリゴヌクレオチドも、上記プライマー及びプローブとして利用することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記配列番号にて示される塩基配列を有するプライマー及びプローブを用いたＰＣＲ反応と同じ条件、特にアニーリングステップと同じ条件を指す。本明細書においては、このようなプライマー又はプローブのことを上記配列番号にて示される塩基配列を有するプライマー及びプローブの「変異体」と記載する場合があるが、特に記載しない限り、上記プライマー及びプローブには当該「変異体」も含まれる。このような変異体には、上記配列番号にて示されるいずれかの塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、４塩基以内、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記配列番号にて示されるいずれかの塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。

上記プライマー又はプローブとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することができる。

本発明のプライマーセットは上記の各要素が、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、また一回の使用及び使用量ごとに容器に収容されていてもよい。あるいは、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。上記の各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。

本発明のプライマーセットはさらに、ｄＮＴＰミックス、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、塩化マグネシウム、及び使用説明書より選択される一以上の要素を含めることができる。

２．落花生の検出方法
本発明によれば、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる落花生ＤＮＡをＰＣＲ法を用いて検出することができる。本発明にて得られた結果は、アレルギー表示の正しさの確認や、アレルギー表示をするべきか否かの判断材料に用いることができる。

本発明において「落花生」とは、落花生属のうち食用として広く流通するものを意味し、より詳細には、Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａを意味する。

「飲食品又は飲食品原材料」とは、食物アレルゲンである落花生が含まれる又は含まれる可能性のある飲食品、及びそれらの原料や、加工過程にある飲食品原料などを意味する。

飲食品又は飲食品原材料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、及びそれらの組合せを用いて行うことができる。また、市販のＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔやＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇ、ＤＮｅａｓｙｍｅｒｉｃｏｎＦｏｏｄＫｉｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いても良い。

抽出されたＤＮＡの濃度および精製度は、分光光度計を用いて波長２３０、２６０、及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより評価することができる。すなわち、抽出されたＤＮＡの濃度は、下記式を用いて算出することができる。
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）＝波長２６０ｎｍにおける吸光度×５０

また、ＤＮＡの精製度は、ＰＣＲ反応が良好に行われるべく２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８〜２．０であることが好ましい。

さらに、抽出されたＤＮＡについて、植物又は動物が共通に持つ内在性遺伝子に対するプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が得られることを確認してもよい。

抽出されたＤＮＡは、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（上記非特許文献２）に記載されるＤＮＡの調製方法に基づいて適宜濃度を調整することができる。濃度調整したＤＮＡは、適宜鋳型ＤＮＡとして利用することができる。好ましくは５〜５００ｎｇとなる量にて、より好ましくは５０ｎｇとなる量にて鋳型ＤＮＡとして利用する（この量は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（上記非特許文献２）にて特定される量である）。

ＰＣＲ反応は、例えばＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４（１９８５）や植物細胞工学別冊、植物のＰＣＲ実験プロトコル、島本功・佐々木卓治監修（１９９５年）等に記載されている通常の方法に基づいて行うことができる。ＰＣＲ条件（変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度及び時間、ならびにサイクル数等）、ＰＣＲ反応液の組成（緩衝液の種類、プライマー濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類や濃度、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等）は、前記のプライマー対を用いたＰＣＲにおいて高感度でＰＣＲ増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等がほぼ最適化されたＰＣＲ用マスターミックス等が市販されており、これらを利用してもよい。

一態様において、本発明方法は定性ＰＣＲ法を利用することができる。定性ＰＣＲ法においては、飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡ中に含まれる落花生ＤＮＡを、上記落花生検出用のプライマーを利用するＰＣＲ反応により増幅し、それを電気泳動により分離、染色することで検出することができる。

上記落花生検出用のプライマーを用いた場合には、およそ７１〜７３ｂｐ、好ましくはおよそ７１ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物の有無を指標として、落花生の混入を検出することができる。すなわち、落花生のＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含む、上記サイズのＰＣＲ増幅産物が検出されれば、飲食品又は飲食品原材料中に落花生が混入していることを示し、一方、落花生のＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含む、上記サイズのＰＣＲ増幅産物が検出されない場合には、飲食品又は飲食品原材料中に落花生が混入していないことを示す。

上記落花生検出用のプライマーを用いた場合には高感度の検出が可能であり、下記実施例に詳述されるとおりＰＣＲ反応液２５μＬの系で、落花生ＤＮＡ５０ｆｇを検出することができる。

また、別の態様において、本発明方法はリアルタイムＰＣＲ法を利用することができる。

リアルタイムＰＣＲ法は、インターカレーター法及びＴａｑＭａｎ法のいずれも用いることができるが、好ましくはＴａｑＭａｎ法を利用する。インターカレーター法では、蛍光を発する化合物（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ等）をＰＣＲ反応系に加えることにより、これが増幅されたＤＮＡに結合する。これに励起光を照射することにより蛍光を発し、この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。一方、ＴａｑＭａｎ法では、蛍光物質で標識されたプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加えることにより、これがアニーリングステップで増幅されたＤＮＡ中の標的配列に結合（ハイブリダイズ）する。その後の伸長反応ステップで、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡに結合（ハイブリダイズ）したプローブが分解され、その際、蛍光物質がプローブから遊離し蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。リアルタイムＰＣＲ反応を行う装置は特に限定されず、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ライフテクノロジーズ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等、リアルタイムＰＣＲ反応を可能とする様々な機種を用いることができ、特に限定はされない。

リアルタイムＰＣＲ法においては、飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡ中に含まれる落花生ＤＮＡを、上記落花生検出用のプライマーを利用するＰＣＲ反応により増幅し、上記のとおり、蛍光強度を測定することによりＰＣＲ増幅産物の生成量を測定し、増幅曲線を得る。次に、蛍光シグナルが有意に増加したサイクル数（Ｃｑ値）を指標とするか、または蛍光シグナルがサイクル数に対して指数関係にある領域で、蛍光量増加（ΔＲｎ）の適当な閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定し、適当なサイクル数条件下にて、増幅曲線と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が交わるサイクル数（Ｃｔ値（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ））を指標とすることで、落花生の混入有無を検出することができる。すなわち、適当なサイクル数条件下にて、蛍光シグナルの有意な増加が見られるか、または増幅曲線と閾値が交わる場合には、飲食品又は飲食品原材料中に落花生が混入していることを示し、一方、蛍光シグナルの有意な増加が見られないか、または増幅曲線と閾値が交わらない場合には、飲食品又は飲食品原材料中に落花生が混入していないことを示す。

蛍光強度が有意に増加したサイクル数（Ｃｑ値）、または増幅曲線と閾値が交わるサイクル数はＣｔ値として示されるが、以下本明細書では両者を区別せずＣｔ値とする。プライマーに依拠してＣｔ値は増減し得、他の条件（ＰＣＲ条件、ＰＣＲ反応液の組成等）が同じであれば、増幅効率が高いプライマーを使用することによってＣｔ値を小さくすることができる。上記落花生検出用のプライマーは従来ＰＣＲ法の落花生検出用のプライマー（配列番号８−９）よりも増幅効率が高く、同量の落花生ＤＮＡを検出するに際し小さいＣｔ値、より詳細には３〜８程度小さいＣｔ値を有する。

本発明に係る上記落花生検出用プライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法と、上記小麦検出用のプライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法、ならびに／あるいは、上記そば検出用のプライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法とは、同一の条件下にて、鋳型ＤＮＡ量として同程度の検出感度を示す。故に、本発明の落花生の検出方法は、上記小麦検出用のプライマーセットを使用して同様に実施される小麦の検出方法、及び／又は、上記そば検出用のプライマーセットを使用して同様に実施されるそばの検出方法と、同一の条件下にて同時に行うことができ、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンを、迅速かつ効率的に検出することができる。

以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：プライマー・プローブの設計
（１）落花生属植物の配列
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている落花生（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ）、落花生の祖先種（Ａｒａｃｈｉｓｉｐａｅｎｓｉｓ、Ａｒａｃｈｉｓｖｉｌｌｏｓａ）の配列のＩＴＳ−１及びＩＴＳ−２領域を収集し、下記表１に記載するアクセッション番号の配列が得られた。

（２）プライマー・プローブの配列
落花生及び落花生の祖先種のＩＴＳ−２領域のうち、配列が他のものと大きく異なるＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ由来の配列（ＨＱ５３７４５８）を除いて他の全ての配列にハイブリダイズすると予想された配列を選定し、配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマーセット、および配列番号３の塩基配列を有するプローブをそれぞれ合成した。
配列番号１：５’−ＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴＣ−３’
配列番号２：５’−ＣＡＣＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＡＣＣ−３’
配列番号３：ＦＡＭ−５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧ−３’−ＭＧＢ

同様に、落花生及び落花生の祖先種のＩＴＳ−１領域のうち、配列が他のものと大きく異なるか、または配列情報の一部が無いＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ配列（ＨＱ５３７４５８）及びＡｒａｃｈｉｓｉｐａｅｎｓｉｓ配列（ＡＹ８６２３１１）を除いて他の全ての配列にハイブリダイズすると予想された配列を選定し、配列番号４及び５の塩基配列を有するプライマーセット、ならびに配列番号６及び７の塩基配列を有するプライマーセットをそれぞれ合成した。
配列番号４：５’−ＴＣＡＴＴＧＴＣＧＡＴＧＣＣＧＣＡＣ−３’
配列番号５：５’−ＣＣＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＴＣ−３’
配列番号６：５’−ＧＧＣＧＣＣＣＣＧＴＣＴＣＡＡ−３’
配列番号７：５’−ＴＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧ−３’

実施例２：ＰＣＲによる感度の評価
（１）プライマーの選別
実施例１で設計・合成した３つのプライマーセット（配列番号１−２、４−５、及び６−７）について、従来ＰＣＲ法にて用いられているプライマーセット（配列番号８−９）よりも短いサイクル数で検出できる増幅効率の良いプライマーセットを選別するため、リアルタイムＰＣＲ法及び定性ＰＣＲ法により落花生希釈ＤＮＡのＣｔ値および増幅産物の有無を評価し、従来ＰＣＲ法にて用いられているプライマーセットとの比較を行った。

＜落花生ＤＮＡの抽出＞
落花生ＤＮＡの抽出はＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇを用い、以下の方法で行った。

細かく粉砕した落花生試料約０．５ｇを５０ｍＬ容チューブに入れ、７．５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＧ２、２０μＬのＲＮａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）、２００μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え混合後、５０℃，２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、６ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＣでカラムを洗浄し、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＦでＤＮＡを溶出させてイソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。ＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ濃度を求め、適宜希釈した液を落花生希釈ＤＮＡとした。

＜ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩを用いたリアルタイムＰＣＲ＞
上記で調製した落花生希釈ＤＮＡを実施例１で設計したプライマーの組み合わせ３セット（配列番号１−２、４−５、６−７）および従来ＰＣＲ法のプライマーセット（配列番号８−９）によりＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩを用いたリアルタイムＰＣＲ測定に供し、増幅シグナルが得られる／得られない、及び増幅シグナルから求められたＣｔ値が従来ＰＣＲ法プライマーよりも小さい／大きいかを確認した。

従来ＰＣＲ法のプライマーは、特許第４６５８８１６号公報の開示に基づいて以下の塩基配列を有するプライマーセットをそれぞれ合成して使用した。
配列番号８：５’−ＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡ−３’
配列番号９：５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＣ−３’

リアルタイムＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔを用い、以下の方法で行った。

１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘに各プライマーを終濃度で０．２μＭと鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。鋳型は落花生ＤＮＡ５ｐｇと５００ｆｇとなるようにそれぞれ加えた。また、各鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。リアルタイムＰＣＲ装置はロシュ・ダイアグノスティクス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏを用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の８連ＰＣＲチューブを用いた。ＰＣＲ反応液を入れた容器をリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９５℃，３０秒（変性）に続いて６８℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４６回繰り返して反応させた。反応終了後、反応液の温度を６０℃から９７℃まで０．１℃／秒で上昇させ、融解曲線分析を行った。解析条件は装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。なお、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏでＣｑ値と呼ばれる値は、Ｃｔ値と読み替えた。

伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した結果、配列番号４−５及び６−７の各プライマーセットを用いた場合には増幅シグナルが得られずＣｔ値は求められなかった。

一方、配列番号１−２のプライマーセットからは増幅シグナルが得られ、２点併行測定の落花生ＤＮＡ５ｐｇの平均Ｃｔ値は３４．１、５００ｆｇの平均Ｃｔ値は３７．９となった。

また、従来ＰＣＲ法のプライマーセット（配列番号８−９のプライマーセット）においては、落花生５ｐｇの平均Ｃｔ値は３５．７、５００ｆｇの平均Ｃｔ値は４０．１となった。

配列番号１−２のプライマーセットおよび従来ＰＣＲ法のプライマーセットの融解曲線はシングルピークとなり、非特異的増幅が起こっている可能性は低いと判断した。

以上の結果より、同じ落花生ＤＮＡ量を鋳型とした時に、配列番号１−２のプライマーセットは従来ＰＣＲ法のプライマーセットよりも小さいＣｔ値が得られたため、より増幅効率の高いプライマーと判断し、配列番号１−２プライマーセットを選別することとした。

＜ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ＞
上記にて選別した配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブ、及び従来リアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマーセット（配列番号８−９のプライマーセット）とプローブ（下記配列番号１０のプローブ：特許第４３９９４１７号公報）を、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ測定に供し、Ｃｔ値との比較を行った。
配列番号１０：ＦＡＭ−５’−ＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣ −３’−ＭＧＢ

リアルタイムＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲＫｉｔを用い、以下の方法で行った。

１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘに、各プライマーを終濃度で０．２μＭとＴａｑＭａｎプローブを終濃度で０．１μＭ、ならびに鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。鋳型は落花生ＤＮＡ５ｐｇと５００ｆｇとなるようにそれぞれ加えた。また、各鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。リアルタイムＰＣＲ装置はロシュ・ダイアグノスティクス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏを用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の８連チューブを用いた。ＰＣＲ反応液を入れた容器をリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９５℃，３０秒（変性）に続いて６８℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４６回繰り返して反応させた。反応終了後、伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した。解析条件は装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。

伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した結果を下記表２に示す。配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを用いた場合には、２点併行測定の落花生ＤＮＡ５ｐｇの平均Ｃｔ値は３０．６となり、落花生ＤＮＡ５００ｆｇの平均Ｃｔ値は３４．０となった。

一方、従来リアルタイムＰＣＲ法のプライマーセットとプローブを用いた場合には、落花生ＤＮＡ５ｐｇの平均Ｃｔ値は３５．９となり、落花生ＤＮＡ５００ｆｇの平均Ｃｔ値は４０．０となった。

以上の結果より、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを用いることによって、従来リアルタイムＰＣＲ法のプライマーセットとプローブを用いた場合よりも落花生ＤＮＡ５ｐｇでＣｔ値が５．３小さく、５００ｆｇでＣｔ値が６．０小さいことから、従来リアルタイムＰＣＲ法よりも短いサイクル数で従来リアルタイムＰＣＲ法と同等の感度が得られることが確認された。

＜リアルタイムＰＣＲ装置を用いないＰＣＲ＞
リアルタイムＰＣＲ装置を用いないＰＣＲでも、従来ＰＣＲ法と比べて感度高い検査が可能であるか確認するため、配列番号１−２のプライマーセットと従来ＰＣＲ法のプライマーセット（配列番号８−９）を用いたＰＣＲを行い、落花生希釈ＤＮＡから増幅された産物について検出し易さを比較した。増幅産物の検知差を明確にするため、アニーリング温度はリアルタイムＰＣＲ条件で用いた６８℃と２℃下げた６６℃でもＰＣＲを行った。

ＰＣＲはＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘＫｉｔを用い、以下の方法で行った。

１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘに、各プライマーを終濃度で０．２μＭと鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。鋳型ＤＮＡは落花生ＤＮＡ５ｐｇ、５００ｆｇ、５０ｆｇとなるようにそれぞれ加え、各鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。ＰＣＲ装置はライフテクノロジーズジャパン社製Ｖｅｒｉｔｉを使用し、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の９６ｗｅｌｌプレートを用いた。ＰＣＲ反応液を入れた容器をＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９５℃，３０秒（変性）に続いて６８℃または６６℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４０回繰り返した後、７２℃，４分間保持させた。得られたＰＣＲ反応液を島津製作所製のＭｕｌｔｉＮＡＭＣＥ−２０２によりＤＮＡ−５００キットで蛍光物質にＳＹＢＲＧｏｌｄを用いて電気泳動し解析した。

その結果、アニーリング温度６８℃でのＰＣＲでは、配列番号１−２のプライマーセットを用いた場合には落花生ＤＮＡ５０ｆｇの２点のうち１点で標的増幅産物が検出されたが、従来ＰＣＲ法のプライマーセットを用いた場合には落花生ＤＮＡ５０ｆｇの２点ともに標的増幅産物は検出されなかった（図１−１）。なお、本実施例においては配列番号１−２のプライマーセット由来の標的増幅産物は７８−８０ｂｐの位置に、従来ＰＣＲ法のプライマーセット由来の標的増幅産物は９２−９４ｂｐの位置に検出されているが、別途行なったシークエンス等により、それぞれ約７１ｂｐ、約８６ｂｐであることを確認している。また、Ｍｕｐｉｄアガロースゲル電気泳動装置／エチジウムブロマイド解析、ＭｕｌｔｉＮＡＭＣＥ−２０２／ＧｅｌＳｔａｒ解析では、配列番号１−２のプライマーセット由来の標的増幅産物はそれぞれ約７１ｂｐ、８６ｂｐ付近に検出されている。

従来ＰＣＲ法のプライマーセットとの差異を明確にするためにアニーリング温度６６℃で行ったＰＣＲでは、配列番号１−２のプライマーセットを用いた場合には落花生ＤＮＡ５０ｆｇの２点について共に検出されたが、従来ＰＣＲ法のプライマーセットを用いた場合には５０ｆｇの２点共に検出されなかった（図１−２）。

各ＤＮＡ濃度の増幅産物のバンドの濃さを比較すると、いずれも配列番号１−２のプライマーセットを用いた場合の方が濃く検出されていた。

これらの結果より、リアルタイムＰＣＲ装置を用いないＰＣＲでも配列番号１−２のプライマーセットを用いた場合の方が、従来ＰＣＲ法のプライマーセットを用いた場合よりも検出感度が高いことが確認された。

（２）モデル加工食品による感度評価
タンパク質濃度１０μｇ／ｇ相当量の落花生を添加して加工した食品を、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブによりリアルタイムＰＣＲ測定に供して感度を確認し、小麦及びそば検査法と同時測定が可能なサイクル数を設定した。

＜リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品の選定＞
１）ＤＮＡ抽出量とＤＮＡ分解度の分析
リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品を選定する指標として、（１）ＤＮＡ抽出量と（２）ＤＮＡ分解度を用いることができる。加工食品はそれぞれ異なる原材料を含んでおり、食品毎に１ｇ（又は単位重量）あたりから抽出されてくるＤＮＡ量は異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたＤＮＡ量が多いもの程、ＰＣＲの鋳型として２０ｎｇ／μＬに調整した鋳型ＤＮＡ試料液の希釈率が高くなり、その中に含まれる食物アレルゲンのＤＮＡ濃度は低くなる。よって、ＤＮＡが多く抽出されるもの程、検査が難しい食品であるといえる。また、多くの加工食品では、食品自体のｐＨや加工による加熱などによりＤＮＡが短く分解されており、その程度も異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたＤＮＡの分解が進んでいるもの程、食物アレルゲンのＤＮＡ由来の標的配列を含むＤＮＡ分子の残存量は少なくなる。よって、ＤＮＡが短く断片化されているもの程、リアルタイムＰＣＲ検査が難しい食品であるといえる。

市販されているさまざまな種類の加工食品について、下記方法により抽出ＤＮＡ量とＤＮＡ分解度を求めた。

＜ＤＮＡ抽出量の算出＞
ＤＮＡ抽出はＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇを用い、以下の方法で行った。

細かく粉砕した試料約２ｇを５０ｍＬ容チューブに入れ、１５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＧ２、２０μＬのＲＮａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１００μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え混合後、５０℃にて２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、６ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＣでカラムを洗浄し、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＦでＤＮＡを溶出させてイソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。ＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ濃度を求め、食品２ｇから抽出されるＤＮＡ量（μｇ）を算出した。

＜ＤＮＡ分解度の分析＞
上記方法で抽出したＤＮＡ試料をＤＮＡ濃度２０ｎｇ／μＬとなるようにＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて適宜希釈した。それらＤＮＡ試料をＤＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡＭＣＥ−２０２（島津製作所）およびＤＮＡ−２５００キットと蛍光物質にＳＹＢＲＧｏｌｄを用いて電気泳動し、ＤＮＡ断片長によってそれぞれのＤＮＡを分離した。ＤＮＡ二重らせんにインターカレートする化合物を利用して得られた蛍光強度の極大値、および極大値に対応するＤＮＡ断片長（ｂｐ）を求めた。極大値に対応するＤＮＡ断片長は、ＤＮＡ分解が激しいほど短くなる。

２）市販の加工食品評価
市販の加工食品３８品の抽出ＤＮＡ量とＤＮＡ断片長を上記方法により分析した。

Ｘ軸に抽出ＤＮＡ量、Ｙ軸にＤＮＡ断片長としたグラフを用いて加工食品の評価を行い、検査の難しい加工食品を選定することとした。分析した各加工食品の結果（図２）から、グラフの一番右下にプロットされたあさり水煮（缶詰食品）を検査が難しい加工食品として見出した。あさり水煮の殺菌条件は、黒変リスクへの対応として１２０℃でＦ_０値３５程度（日本缶詰協会発行「缶・びん詰・レトルト食品・飲料製造講義ＩＩ（各論編）」平成１４年５月２０日）と設定されており、一般的な水産缶詰食品の殺菌条件とされるＦ_０値５〜８程度と比べて非常に厳しいものとなっている。そのため、缶詰食品のあさり水煮は、他の食品に比べてＤＮＡ分解が進んでおり、リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品となっていると考えられる。

＜検査の難しい加工食品（あさり水煮）での感度確認＞
タンパク質濃度１０μｇ／ｇ相当量の落花生を添加して加工したあさり水煮モデル加工食品から抽出したＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ測定に供し、各プライマーセットとプローブを用いてＣｔ値を求め、その感度を評価した。リアルタイムＰＣＲ条件は上記の＜ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ＞に記載した方法および装置を用いた。あさり水煮モデル加工食品からのＤＮＡ抽出は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」の別添１に従って２併行抽出で行い、得られたＤＮＡは動物ＤＮＡ検出用プライマー対を用いたＰＣＲで増幅することを確認した。鋳型ＤＮＡ量は５０ｎｇとなるように加え、それぞれの抽出液から１点で測定を行った。ポジティブコントロールは落花生希釈ＤＮＡを５ｐｇと５００ｆｇとなるように加え、各鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。解析条件は付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。

結果、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを用いた場合にあさり水煮モデル加工食品の平均Ｃｔ値は３１．１となり、一方、従来リアルタイムＰＣＲ法のプライマーセット（配列番号８−９）とプローブ（配列番号１０）を用いた場合のＣｔ値は３６．６となった（下記表４）。

よって、検出が難しい加工食品でも配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを用いることによって、従来リアルタイムＰＣＲ法のプライマーセットとプローブを用いた場合よりもＣｔ値が５．５小さくなることが確認された。

ここで、リアルタイムＰＣＲ装置の機種を限定せずに検査で陽性／陰性判定を行う場合、被検試料と同時に測定して判定する基準を設定する必要がある。この基準としては、検査の難しいあさり水煮モデル加工食品を確実に陽性と判定できるＣｔ値を与える既知量の落花生ＤＮＡや落花生標的配列を含むプラスミド分子などを用いることが有効である。例えば落花生ＤＮＡ希釈系列のＣｔ値とあさり水煮モデル加工食品のＣｔ値との比較から、落花生ＤＮＡ５００ｆｇを判定基準に設定することができる。従来リアルタイムＰＣＲ法のプライマーセットとプローブを用いた場合、落花生ＤＮＡ５００ｆｇの平均Ｃｔ値は４０．０であったためサイクル数は４０より長く設定する必要があるが、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを使用した場合、落花生ＤＮＡ５００ｆｇの平均Ｃｔ値は３４．０となったため、サイクル数を４０と短くしても十分に検査可能となる。

＜様々なモデル加工食品を用いた小麦、そば、落花生のＣｔ値の比較＞
各種タンパク質濃度１０μｇ／ｇ相当量となるような小麦、そば、落花生を添加して加工した様々な加工食品を作製し、３種のリアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値を比較した。作製したモデル加工食品は、白粥、オレンジジュース、味噌汁、トマトパスタソース、鶏肉団子、フリーズドライ野菜スープ、ふりかけ及び上記で用いたあさり水煮の８品とした。

小麦及びそばのリアルタイムＰＣＲ法による検査法は以下の手法で行った。
・小麦
小麦検出のリアルタイムＰＣＲでは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘに、配列番号１１のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号１２のプライマーを終濃度で０．１μＭと、配列番号１３と配列番号１４のプライマーを終濃度でそれぞれ０．０５μＭと、配列番号１５のＴａｑＭａｎプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。

＜小麦検出用のプライマー及びプローブ＞
配列番号１１：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣ−３’
配列番号１２：５’−ＡＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＣＴＧ−３’
配列番号１３：５’−ＴＧＡＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧ−３’
配列番号１４：５’−ＴＧＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＣＴＧ−３’
配列番号１５：ＦＡＭ−５’−ＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＩＴＴＧＡＴＡＡＡＧ−３’−ＭＧＢ

・そば
そば検出のリアルタイムＰＣＲでは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘに、配列番号１６のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号１７のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号１８のＴａｑＭａｎプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。

＜そば検出用のプライマー及びプローブ＞
配列番号１６：５’−ＣＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＴ−３’
配列番号１７：５’−ＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧ−３’
配列番号１８：ＦＡＭ−５’−ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣ−３’−ＭＧＢ

８品のモデル加工食品を測定し、小麦、そば検出のリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値と配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブを用いて落花生リアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値を比較して同時測定が可能なサイクル数を確認した。なお、モデル加工食品からのＤＮＡ抽出は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」の別添１に従って２併行抽出で行い、得られたＤＮＡは植物検出用プライマー対を用いたＰＣＲまたは動物検出用プライマー対を用いたＰＣＲで増幅することを確認した。リアルタイムＰＣＲ条件は上記の＜ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ＞に記載した方法で行った。リアルタイムＰＣＲ装置は２機種（ロシュ・ダイアグノスティックス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏ、ライフテクノロジーズジャパン社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ）を用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の８連ＰＣＲチューブまたは９６ｗｅｌｌプレートを用いた。鋳型ＤＮＡ量は５０ｎｇとなるように加え、それぞれの抽出液から１点で測定を行った。ポジティブコントロールとして、小麦のＰＣＲ標的ＤＮＡ配列とそばのＰＣＲ標的ＤＮＡ配列とを含むｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を調製し、これを５００，１００コピーとなるように加え、落花生は落花生希釈ＤＮＡを５ｐｇと５００ｆｇとなるように加えた。各種ポジティブコントロールは鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏ装置での解析条件は付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ装置での解析条件は付属する解析ソフトのデフォルト条件で行い、閾値（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＬｉｎｅ）のみ、ポジティブコントロールの測定ｗｅｌｌの解析によって算出された値を用いた。

８種類のモデル加工食品を２機種のリアルタイム装置で測定した結果、小麦、そば、落花生リアルタイムＰＣＲにおける同一モデルのＣｔ値は±３．０サイクルの幅の中に収まった（図３）。よって、全てのモデルのＣｔ値は４０サイクル未満となったことと併せて、リアルタイムＰＣＲ測定サイクル数を４０サイクルに統一しても、必要な感度で小麦、そば、落花生を同時に検査できることが確認できた。

実施例３：リアルタイムＰＣＲによる特異性の評価
７７品の食材から抽出したＤＮＡを用いて、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブによる落花生リアルタイムＰＣＲを行い特異性を評価した。更に得られた反応液を電気泳動で解析し、非特異産物が得られた試料への落花生検出感度への影響を確認した。

１）ＤＮＡ抽出
下記表５に示す７７品の食材から以下ＱＩＡＧＥＮ社製３キットのいずれかを用いてＤＮＡ抽出を行い、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」の別添１に従って抽出したＤＮＡは、植物検出用プライマー対を用いたＰＣＲまたは動物検出用プライマー対を用いたＰＣＲで増幅することを確認した。

Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇキットを用いた場合、細かく粉砕した試料を５０ｍＬ容チューブに入れ、７．５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＧ２、１０μＬのＲＮａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１００μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え混合後、５０℃，２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、６ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＣでカラムを洗浄し、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＱＦでＤＮＡを溶出させてイソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。ＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ濃度を求め、２０ｎｇ／μＬに調整した液を鋳型ＤＮＡ溶液とした。

ＤＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉキットを用いた場合は、細かく粉砕した試料を２ｍＬ容チューブに入れ、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒＡＰ１、１０μＬのＲＮａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合した後、６５℃，２時間保温した。その後、これに１３０μＬのＢｕｆｆｅｒＰ３を加えて、氷中で５分間放置し、遠心分離によりその上清液を得た。得られた上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎに供し、遠心分離によりＣｏｌｕｍｎのパス液を得た。このパス液に１．５倍容量のＢｕｆｆｅｒＡＷ１を加えて混合した後、ＤＮｅａｓｙＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎに一回６５０μＬずつ供し、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着された。これを、全液量処理するまで繰返した。その後、Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬのＢｕｆｆｅｒＡＷ２を加え、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄、再度５００μＬのＢｕｆｆｅｒＡＷ２をＣｏｌｕｍｎに加え、最高速度で１分間遠心分離して、Ｃｏｌｕｍｎに残っているＢｕｆｆｅｒＡＷ２を完全に除去した。最終的に６５℃で予め保温しておいた２００μＬの滅菌水をＣｏｌｕｍｎに加え、約６，０００×ｇで１分間遠心分離して得たＣｏｌｕｍｎ溶出液に２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２００μＬのイソプロパノールを加え、混合した。遠心分離した後の上清を廃棄し、沈殿物に２００μＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールを加えて混合後、上清を廃棄した。その沈殿物を完全に乾燥させた後、５０μＬのＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解し、２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ濃度を求め、２０ｎｇ／μＬに調整した液を鋳型ＤＮＡ溶液とした。

ＤＮｅａｓｙｍｅｒｉｃｏｎＦｏｏｄキットを用いた場合は、キットに添付されているプロトコルに従って抽出を行い、ＴＥｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）によりＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μＬに調整した液を鋳型ＤＮＡ溶液とした。

２）リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ条件は上記の＜ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ＞に記載した方法で、サイクル数を４０と設定し行った。リアルタイムＰＣＲ装置はライフテクノロジーズジャパン社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴを用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の９６ｗｅｌｌプレートを用いた。鋳型ＤＮＡ量は５０ｎｇとなるように加え、各食材ＤＮＡ抽出液から１点で測定を行った。ポジティブコントロールとして落花生希釈ＤＮＡを５ｐｇと５００ｆｇとなるように加え、各濃度２点併行で測定した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ装置での解析条件は付属する解析ソフトのデフォルト条件で行い、閾値（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＬｉｎｅ）のみ、ポジティブコントロールの測定ｗｅｌｌの解析によって算出された値を用いた。

その結果、落花生以外の全７７試料から増幅シグナルは得られず、Ｃｔ値は求められなかった。よって、配列番号１−２のプライマーセットと配列番号３のプローブは落花生のみを特異的に増幅してシグナルを検出させると判断した。

３）反応液中の非特異産物による落花生検出感度の確認
リアルタイムＰＣＲ反応後の溶液を島津製作所製のＭｕｌｔｉＮＡＭＣＥ−２０２によりＤＮＡ−５００キットで蛍光物質にＳＹＢＲＧｏｌｄを用いて電気泳動し解析した結果、表５の試料名ＮＯ．５９の牛肉の反応液中に非特異産物が検出された。そこで、牛肉ＤＮＡ５０ｎｇに落花生ＤＮＡ５００ｆｇを添加して得られたＣｔ値が非特異産物の影響により大きくならないこと（落花生ＤＮＡの検出感度を低下させないこと）を確認した。

リアルタイムＰＣＲ条件は上記の＜ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ＞に記載した方法で、サイクル数を４０と設定し行った。リアルタイムＰＣＲ装置はロシュ・ダイアグノスティクス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏを用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の８連ＰＣＲチューブを用いた。鋳型量は落花生ＤＮＡ５００ｆｇ、落花生ＤＮＡ５００ｆｇ＋牛肉ＤＮＡ５０ｎｇ、牛肉ＤＮＡ５０ｎｇとなるように加え、それぞれ２点併行で測定した。解析条件は付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。更に、得られたＰＣＲ反応液を島津製作所製のＭｕｌｔｉＮＡＭＣＥ−２０２によりＤＮＡ−５００キットで蛍光物質にＳＹＢＲＧｏｌｄを用いて電気泳動し、解析した。

その結果、下記表６に示すとおり、落花生ＤＮＡ５００ｆｇ＋牛肉ＤＮＡ５０ｎｇから得られたＣｔ平均値は３３．７となり、落花生ＤＮＡ５００ｆｇのＣｔ平均値３４．０とほぼ同等の値となった。

また、落花生ＤＮＡ５００ｆｇ＋牛肉ＤＮＡ５０ｎｇのＰＣＲ反応後の非特異産物バンドは薄くなることが確認された（図４）。これらの結果より、牛肉ＤＮＡ５０ｎｇから検出された非特異産物は落花生検出感度を低下させることはないことが確認できた。

Claims

飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンをＰＣＲ法により検出するためのプライマーセットであって、該プライマーセットが以下の（ａ）と（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む落花生検出用プライマーセットを含む、上記プライマーセット：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
落花生検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、請求項１に記載のプライマーセット：
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
さらに、以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチドを含む小麦検出用プライマーセット、ならびに／あるいは、
以下の（ｈ）と（ｉ）のオリゴヌクレオチドを含むそば検出用プライマーセット、を含む請求項１又は２に記載のプライマーセット：
（ｄ）配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｇ）配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
小麦検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、ならびに／あるいは、
そば検出用プライマーセットがさらに、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、
請求項３に記載のプライマーセット：
（ｊ）配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンをＰＣＲ法により検出するための方法であって、
該飲食品又は飲食品原材料に由来するＤＮＡを鋳型として、以下の（ａ）と（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む落花生検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行うこと、次いで、落花生ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定することを含む、上記方法：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
同一条件下においてさらに、該飲食品又は飲食品原材料に由来するＤＮＡを鋳型として、以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のオリゴヌクレオチドを含む小麦検出用プライマーセット、ならびに／あるいは、
以下の（ｈ）と（ｉ）のオリゴヌクレオチドを含むそば検出用プライマーセット、を用いてＰＣＲを行うこと、次いで、小麦ＤＮＡならびに／あるいはそばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定することを含む、請求項５に記載の方法：
（ｄ）配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｇ）配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅産物の検出をプローブを用いて行う、請求項５又は６に記載の方法。
落花生ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて行う、請求項７に記載の方法：
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
小麦ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定する場合において、小麦ＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて行う、ならびに／あるいは、
そばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の有無を判定する場合において、そばＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物の検出を、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて行う、請求項７又は８に記載の方法：
（ｊ）配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。