JP7561521B2

JP7561521B2 - クルミを検出するためのプライマーセット及びそれを用いたクルミの検出方法

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Publication number: JP7561521B2
Application number: JP2020094219A
Authority: JP
Inventors: 聡渡辺; 大夢田口
Original assignee: House Foods Group Inc
Current assignee: House Foods Group Inc
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2024-10-04
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: JP2021185820A

Description

本発明は、飲食品中の食物アレルゲンであるクルミを検出するために利用することができるプライマーセット及びそれを用いたクルミの検出方法に関する。

クルミは、クルミ科クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）に属する植物であり、その仁の部分がナッツとして食用される。

クルミはアレルギーを引き起こす食物アレルゲンの１つであり、患者によっては微量の摂取であっても重篤なアナフィラキシーショックを引き起こす場合がある。また、食物アレルギー患者の数は近年増加の一途をたどっており、世界的に大きな社会問題の一つとなっている。
非特許文献１には、クルミ属に属する複数の植物種を調べたところ、いずれもアレルゲンタンパク質を含んでいたことが記載されている。

飲食品中のクルミを検出する方法として、クルミに特有のＤＮＡの塩基配列を、プライマーセットを用いた核酸増幅法により増幅し、増幅産物の有無を検出する方法が挙げられる。クルミを検出するための核酸増幅法を開示する文献として、例えば非特許文献２～８が挙げられる。なお、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸増幅反応のうち、ＤＮＡポリメラーゼを用いて連鎖的に目的とする配列の核酸を増幅させる反応を指す。

なお、クルミ属と近縁でナッツとして食用される植物としてカリア属（Ｃａｒｙａ）植物が知られている。商業的に栽培されるカリア属植物は主に、Ｃａｒｙａｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ（ペカン）及びＣａｒｙａｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ（山核桃）である。ペカンはクルミとは異なる食品として一般に認識されている。

一方、特許文献１には、飲食品中に含まれるアレルゲンである小麦、そば、落花生を共通のＰＣＲ条件でのリアルタイムＰＣＲ法により検出することができるプライマーセットが開示されている。

特開２０１６－１０１１４２号公報

Comstock, S.S., McGranahan, G., Peterson, W.R., Teuber, S.S., 2004. Extensive in vitro cross-reactivity to seed storage proteins is present among walnut (Juglans) cultivars and species. Clin Exp Allergy 34, 1583-1590. Brezna, B., Hudecova., Kuchta, T., 2006. A novel real-time polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of walnuts in food. Eur Food Res Technol 223, 373-377. Yano, T., Sakai, Y., Uchida, K., Nakao, Y., Ishihata, K., Nakano, S., Yamada, T., Sakai, S., Urisu, A., Akiyama, H., Maitani, T., 2007. Detection of Walnut Residues in Processed Foods by Polymerase Chain Reaction. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71, 1793-1796. Wang, H., Yuan, F., Wu, Y., Yang, H., Xu, B., Liu, Z., Chen, Y., 2009. Detection of Allergen Walnut Component in Food by an Improved Real-Time PCR Method. Journal of Food Protection 72, 2433-2435. Lopez-Calleja, I.M., de la Cruz, S., Gonzalez, I., Garcfa, T., Martin, R., 2015. Market analysis of food products for detection of allergenic walnut (Juglans regia) and pecan (Carya illinoinensis) by real-time PCR. Food Chemistry 177, 111-119. Linacero, R., Ballesteros, I., Sanchiz, A., Prieto, N., Iniesto, E., Martinez, Y., Pedrosa, M.M., Muzquiz, M., Cabanillas, B., Rovira, M., Burbano, C., Cuadrado, C., 2016. Detection by real time PCR of walnut allergen coding sequences in processed foods. Food Chemistry 202, 334-340. Ito, M., Mizota, T., Kitaguchi, T., Ohno, K., Ohba, T., Tanaka, M., 2018. Simultaneous detection of eight species of tree nut in foods using two tetraplex polymerase chain reaction assays. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 82, 1985-1991. Kim, J.H., Hong, J.Y., Moon, J.-C., Kwon, K., Jang, C.S., 2018. Development of molecular markers for detecting almond, peanut, pine nut, and walnut in commercial food using quantitative real-time PCR. Appl Biol Chem 61, 345-354.

本発明の一以上の実施形態は、カリア属植物と区別してクルミを検出するための新たな手段を提供する。

本明細書は本発明の以下の１以上の実施形態を開示する。
（１）クルミを検出するためのプライマーセットであって、
（Ａ１）配列番号１に示す塩基配列Ａ１、
（Ａ２）塩基配列Ａ１と相同な塩基配列Ａ２、
（Ａ３）塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３、及び、
（Ａ４）塩基配列Ａ３と相同な塩基配列Ａ４
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに
（Ｂ１）配列番号２に示す塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）塩基配列Ｂ１と相同な塩基配列Ｂ２、
（Ｂ３）塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３、及び、
（Ｂ４）塩基配列Ｂ３と相同な塩基配列Ｂ４
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含むプライマーセット。
（２）（Ｃ１）配列番号３に示す塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）塩基配列Ｃ１と相同な塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）塩基配列Ｃ１のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、
（Ｃ４）塩基配列Ｃ３と相同な塩基配列Ｃ４、
（Ｃ５）塩基配列Ｃ１と相補的な塩基配列Ｃ５、
（Ｃ６）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ６、
（Ｃ７）塩基配列Ｃ５のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ７、
（Ｃ８）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ８
（Ｃ９）配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ９、及び、
（Ｃ１０）塩基配列Ｃ９と相補的な塩基配列Ｃ１０
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含む、（１）に記載のプライマーセット。
（３）試料中のクルミを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、（１）又は（２）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
（４）前記プライマーセットが、（２）に記載のプライマーセットであり、
前記増幅産物の検出を、前記増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出することにより行う、
（３）に記載の方法。
（５）前記試料が飲食品試料である、（３）又は（４）に記載の方法。

本発明の一以上の実施形態によれば、カリア属植物と区別してクルミを検出することができる。

図１は、実施例のプライマープローブセットを用い条件１により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。図２は、比較例のプライマープローブセットを用い条件１’により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。図３は、比較例のプライマープローブセットを用い条件２により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。図４は、実施例及び比較例で用いたプライマープローブセットの、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）のクルミの４種（Ｊ．ｒｅｇｉａ、Ｊ．ｎｉｇｒａ、Ｊ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ、Ｊ．ａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ）と、カリア属（Ｃａｒｙａ）のペカンの２種（Ｃ．ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ）のＩＴＳ－２の塩基配列（配列番号７～１２）との対応関係を示す。一重下線で示した塩基は、クルミ属に共通し、且つ、Ｃａｒｙａ属と異なる塩基を指す。二重下線で示した塩基は、Ｊｕｇｌａｎｓ属内で多型のある塩基を指す。

＜１．目的＞
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及びそれを用いた検出方法は、以下の要求を満たすことを目的とする。

（検出対象）
非特許文献１から、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）に属する植物はいずれもアレルゲン性を有すると考えられる。このため、アレルゲンとしてのクルミを検出する目的では、種間の区別なく検出できることが望まれる。

一方、Ｃａｒｙａｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ（ペカン）、Ｃａｒｙａｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ（山核桃）等のカリア属植物はクルミとは異なる食品として一般に認識されているため、カリア属植物と区別してクルミ属植物のみを検出することが望ましい。

そこで本発明の一以上の実施形態は、カリア属植物のＤＮＡを増幅せず、クルミのＤＮＡを種に関わらず同程度の効率で増幅することができるプライマーセット及び該プライマーセットを用いたクルミの検出方法を提供することを目的とする。

本明細書においてクルミとは、クルミ属植物を指す。商業的にクルミとして栽培されているクルミ属植物としては、具体的には、Ｊｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａ（カシグルミ、セイヨウグルミ、ペルシャグルミ、テウチグルミ）、Ｊｕｇｌａｎｓｎｉｇｒａ（クログルミ）、Ｊｕｇｌａｎｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ、Ｊｕｇｌａｎｓａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ等が挙げられる。Ｊｕｇｌａｎｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ及びＪｕｇｌａｎｓａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａは、どちらもナガグルミ、シナノグルミ又はオニグルミと称される場合がある。

（感度）
アレルゲンの検出のためには、１μｇクルミタンパク質／ｇ試料（＝１ｐｐｍ）相当の濃度の検出を可能にすることが望ましい。

クルミの仁のタンパク質含有量は１４．６ｇ／１００ｇ（食品成分データベース）であるから、１μｇクルミタンパク質／ｇ試料は、６．８μｇクルミ／ｇ試料に相当する。

試料及びクルミから同じ収率でＤＮＡが回収できると仮定した場合、６．８μｇクルミ／ｇ試料は、３４０ｆｇクルミＤＮＡ／５０ｎｇ試料ＤＮＡに相当する。

そこで本発明の一以上の実施形態は、３４０ｆｇクルミＤＮＡ／５０ｎｇ試料ＤＮＡの濃度で存在するクルミＤＮＡを増幅することができるプライマーセット及び該プライマーセットを用いたクルミの検出方法を提供することを目的とする。

（頑健性）
飲食品中に含まれる原料由来のＤＮＡは、加工の過程で断片化される可能性がある。このため、核酸増幅反応によりクルミＤＮＡを増幅し、増幅産物の有無を検出する場合、増幅される標的ＤＮＡ断片長は短いほど、加工の影響を受けず安定した検出が可能である。

そこで本発明の一以上の実施形態は、クルミＤＮＡに含まれる１５０ｂｐ以下の断片長の標的配列を増幅することができるプライマーセット及び該プライマーセットを用いたクルミの検出方法を提供することを目的とする。

（従来技術との比較）
非特許文献２～８には、クルミに特有のＤＮＡの塩基配列を、所定のプライマーセットを用いた核酸増幅法により増幅し、増幅産物の有無を検出する方法が記載されている。しかし、上記の要求を満たす方法は開示されていない。

例えば非特許文献２に記載の方法は、検出感度がタンパク質濃度として１００μｇ／ｇ試料であり、上記の感度の要求を満たさない。
非特許文献３に記載の方法は、ペカンとクルミとを区別せずに検出する方法であり、上記の検出対象の要求を満たさない。
非特許文献４に記載の方法は、検出感度がタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ試料であり、上記の感度の要求を満たさない。
非特許文献６に記載の方法は、検出感度がタンパク質濃度として１００μｇ／ｇ試料であり、上記の感度の要求を満たさない。
非特許文献７に記載の方法では、標的ＤＮＡ断片長が５０１ｂｐであり、上記の頑健性の要求を満たさない。
非特許文献８に記載の方法は、ペカンとクルミとを区別せずに検出する方法であり、上記の検出対象の要求を満たさない。

非特許文献５に記載の方法は、クルミをペカンと区別して検出することができ、検出感度がタンパク質量として０．１μｇ／ｇ試料であり、標的ＤＮＡ断片長が７０である。しかし、後述する実施例で確認されているように、非特許文献５に記載のプライマープローブセットを用いた検出方法では、カシグルミとオニグルミの検出感度が大きく異なることが確認されている。このため上記の検出対象の要求を満たさない。

（ＰＣＲ条件）
特許文献１では、小麦、そば及び落花生のＤＮＡを、共通のＰＣＲ条件（具体的には実施例に示す条件１）によるリアルタイムＰＣＲ法により検出することが記載されている。特許文献１に記載の小麦、そば及び落花生のＤＮＡを増幅するための共通のＰＣＲ条件は、サイクル数が比較的短い。クルミＤＮＡを、特許文献１に記載の前記ＰＣＲ条件により増幅することができれば、ユーザーにとって簡便な操作で、クルミ、小麦、そば及び落花生のＤＮＡの有無を検出することが可能になる。

そこで本発明の一以上の実施形態は、より好ましくは、クルミのＤＮＡを、特許文献１に記載の小麦、そば及び落花生のＤＮＡを増幅するための共通のＰＣＲ条件により増幅することができるプライマーセット及び該プライマーセットを用いたクルミの検出方法を提供することを更なる目的とする。

＜２．クルミを検出するためのプライマーセット＞
本発明の一以上の実施形態に係る、クルミを検出するためのプライマーセットは、
（Ａ１）配列番号１に示す塩基配列Ａ１、
（Ａ２）塩基配列Ａ１と相同な塩基配列Ａ２、
（Ａ３）塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３、及び、
（Ａ４）塩基配列Ａ３と相同な塩基配列Ａ４
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに
（Ｂ１）配列番号２に示す塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）塩基配列Ｂ１と相同な塩基配列Ｂ２、
（Ｂ３）塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３、及び、
（Ｂ４）塩基配列Ｂ３と相同な塩基配列Ｂ４
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含むことを特徴とする。

なお前記プライマーＡ、プライマーＢ及び後述するプライマーＣに関して、二つの塩基配列が「相同」であるとは、互いに相同な二つの塩基配列を塩基配列Ｘが塩基配列Ｙとした場合、好ましくは、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のいずれか１以上の関係を満たすことを指す。
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと８０％以上１００％未満の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができる。

前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。また、「欠失、置換、付加及び／又は挿入」はより好ましくは置換である。

前記（Ｂ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２，１９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，１９９０を参照されたい。

前記（Ｂ）において、同一性は、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。

前記（Ｃ）を含め、本明細書において「ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）」とは、２つの核酸断片が標準的なハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることを意味する（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（１９８９））ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７－９．６２及び１１．４５－１１．６１）。より具体的には、例えば以下の式で求められるＴｍ値を基準としてハイブリダイゼーション（例えば約３．０×ＳＳＣまたは２．０×ＳＳＣ、３０℃または３７℃）を行った後、ハイブリダイゼーションの条件よりストリンジェンシーの高い条件での洗浄（例えば約２．０×ＳＳＣ、３０℃、３７℃、４０℃、４４℃もしくは４８℃以上、または１．０×ＳＳＣもしくは０．５×ＳＳＣ、３７℃以上など）を行うことを意味する。ハイブリダイズする塩基配列などに応じて適宜ハイブリダイゼーションおよび洗浄に適切な「ストリンジェントな条件」を選択することは、当技術分野では周知技術である。
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（ｆｒａｃｔｉｏｎＧ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）
［Ｎａ^＋］：Ｎａ^＋のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
ｆｒａｃｔｉｏｎＧ＋Ｃ：オリゴヌクレオチド中のＧおよびＣの割合（％）
Ｎ：オリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）

なお、「ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）」とは、特に記載しない限り、以下においても同じ意味で使用する。

当該プライマーセットはクルミに由来するＤＮＡ、より詳細にはリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒ）－２にある一部の領域を増幅することができるように設計されている。

プライマーＡは、クルミに由来する二本鎖ＤＮＡのＩＴＳ－２の一方の鎖上の、配列番号１に示す塩基配列Ａ１の相補配列と、ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができる。また、プライマーＢは、クルミに由来するＤＮＡのＩＴＳ－２の他方の鎖上の、配列番号２に示す塩基配列Ｂ１の相補配列と、ストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができる。プライマーＡとプライマーＢとを含むプライマーセットを用い、クルミ由来ＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うと、クルミ由来ＤＮＡのＩＴＳ－２に含まれる１５０ｂｐ以下の領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。

配列表、図４及び実施例の表１を参照して、プライマーＡとプライマーＢとを含む前記プライマーセットが、クルミのＤＮＡを種に関わらず同程度の効率で増幅することができ、且つ、カリア属植物のＤＮＡを増幅しないことの理由を説明する。

プライマーＡの具体例として、配列番号１に示す塩基配列Ａ１からなるオリゴヌクレオチドからなる、実施例に記載の「ＪＩ２フォワードプライマー」が挙げられる。プライマーＢの具体例として、配列番号２に示す塩基配列Ｂ１からなるオリゴヌクレオチドからなる、実施例に記載の「ＪＩ２リバースプライマー」が挙げられる。ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＤＮＡのＩＴＳ－２の塩基配列（ＡＦ３０３８０９．１）の一部を配列番号７に示す。図４に示すように、ＪＩ２フォワードプライマーは配列番号７の第１～２１位に一致し、ＪＩ２リバースプライマーは配列番号７の第５６～７４位の逆相補鎖に一致する。ＪＩ２フォワードプライマーとＪＩ２リバースプライマーを用い、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うことにより、ＩＴＳ－２の７４ｂｐからなる標的領域のＤＮＡ断片を増幅することができる。増幅される標的領域は１５０ｂｐよりも短いため、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＤＮＡを含む試料が加熱等の加工を受けていても残存している可能性が高い。

また、図４では、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＩＴＳ－２の配列番号７に示す標的領域と、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）に属するＪｕｇｌａｎｓｎｉｇｒａ、Ｊｕｇｌａｎｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ及びＪｕｇｌａｎｓａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ、並びに、カリア属（Ｃａｒｙａ）に属するＣａｒｙａｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ及びＣａｒｙａｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓの対応する領域（それぞれ配列番号８、９、１０、１１及び１２に示す）とのアライメント結果を示す。ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＩＴＳ－２の配列番号７に示す標的領域のうち第２１位、第２５位、第３３位、第４３位、第５２位、第５６位、第６４位、第６５位は、クルミ属に共通しカリア属では異なる塩基（一重下線で示す）である。また、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＩＴＳ－２の配列番号７に示す標的領域のうち第４６位、第４９位は、クルミ属内で多型のある塩基（二重下線で示す）である。

ＪＩ２フォワードプライマー（配列番号１に示す塩基配列からなる）は、クルミ属に共通しカリア属では異なる塩基を、特異性に影響の大きい３’末端の第２１位に含む。ＪＩ２リバースプライマー（配列番号２に示す塩基配列からなる）は、クルミ属に共通しカリア属では異なる塩基を、特異性に影響の大きい３’末端の第１９位に含み更に第１０位及び第１１位に含む。このためＪＩ２フォワードプライマーとＪＩ２リバースプライマーとを用い、クルミのＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行った場合、クルミのＤＮＡを種に関わらず同程度の効率で増幅産物を増幅することができ、且つ、カリア属植物のＤＮＡは増幅されない。ＪＩ２フォワードプライマーがハイブリダイズするクルミＤＮＡのＩＴＳ－２の領域にハイブリダイズすることができるプライマーＡと、ＪＩ２リバースプライマーがハイブリダイズするクルミＤＮＡのＩＴＳ－２の領域にハイブリダイズすることができるプライマーＢとを含む本実施形態に係るプライマーセットを用いた場合にも、同様に、カリア属植物のＤＮＡを増幅せずに、クルミのＤＮＡを種に関わらず同程度の効率で増幅産物を増幅することが可能である。

なお図４では比較のために、非特許文献５に記載のＷａｌＩＴＳフォワードプライマー（配列番号４）とＷａｌＩＴＳリバースプライマー（配列番号５）のＩＴＳ－２塩基配列上の対応位置を示す。これらのプライマーは３’末端の塩基がクルミ属とカリア属の共通した塩基である。このため、これらのプライマーを用いた核酸増幅反応では、カリア属植物のＤＮＡを誤って増幅する可能性があり、クルミの検出の目的では好ましくないと考えられる。

続いて、プライマーＡ及びプライマーＢのより好ましい実施形態について説明する。
プライマーＡにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２、塩基配列Ａ３及び塩基配列Ａ４から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ａの５’末端側に付加された他の塩基配列を含んでいてもよいし、塩基配列Ａのみからなるものであってもよい。プライマーＡにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３５塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２８塩基以下、より好ましくは２６塩基以下、より好ましくは２５塩基以下である。プライマーＡは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、前記オリゴヌクレオチドに標識物質、タグ等の他の要素が連結されたものであってもよい。前記他の要素は前記オリゴヌクレオチドのどの位置に連結されていてもよいが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されていることが特に好ましい。
塩基配列Ａ１は、配列番号１に示す塩基配列を指す。

塩基配列Ａ２は、塩基配列Ａ１と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ａ２は、塩基配列Ａ１と、少なくとも、塩基配列Ａ１（配列番号１）の第２１位の塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ａ２は、その３’末端塩基から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の部分塩基配列Ａ２－３’が、塩基配列Ａ１（配列番号１）の３’末端塩基（配列番号１の第２１位塩基）から連続した同塩基数の部分塩基配列Ａ１－３’と同一であり、塩基配列Ａ２の、部分塩基配列Ａ２－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ａ２－５’が、塩基配列Ａ１の、部分塩基配列Ａ１－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ａ１－５’と相同である。

塩基配列Ａ３は、塩基配列Ａ１（配列番号１）のうち、３’末端塩基（すなわち配列番号１の第２１位塩基）から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の部分塩基配列である。

塩基配列Ａ４は、塩基配列Ａ３と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ａ４は、塩基配列Ａ３と、少なくとも、塩基配列Ａ１（配列番号１）の第２１位に相当する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ａ４は、その３’末端塩基から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の部分塩基配列Ａ４－３’が、塩基配列Ａ３の３’末端塩基（配列番号１の第２１位塩基に対応する）から連続した同塩基数の部分塩基配列Ａ３－３’と同一であり、塩基配列Ａ４の、部分塩基配列Ａ４－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ａ４－５’が、塩基配列Ａ３の、部分塩基配列Ａ３－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ａ３－５’と相同である。

プライマーＢにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ｂ１、塩基配列Ｂ２、塩基配列Ｂ３及び塩基配列Ｂ４から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ｂの５’末端側に付加された他の塩基配列を含んでいてもよいし、塩基配列Ｂのみからなるものであってもよい。プライマーＢにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３０塩基以下、好ましくは２８塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２３塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。プライマーＢは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、前記オリゴヌクレオチドに標識物質、タグ等の他の要素が連結されたものであってもよい。前記他の要素は前記オリゴヌクレオチドのどの位置に連結されていてもよいが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されていることが特に好ましい。
塩基配列Ｂ１は、配列番号２に示す塩基配列を指す。

塩基配列Ｂ２は、塩基配列Ｂ１と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｂ２は、少なくとも、塩基配列Ｂ１と、塩基配列Ｂ１（配列番号２）の第１９位、第１１位及び第１０位の塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｂ２は、その３’末端塩基から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１１塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｂ２－３’が、塩基配列Ｂ１（配列番号２）の３’末端塩基（配列番号２の第１９位塩基）から連続した同塩基数の部分塩基配列Ｂ１－３’と同一であり、塩基配列Ｂ２の、部分塩基配列Ｂ２－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ｂ２－５’が、塩基配列Ｂ１の、部分塩基配列Ｂ１－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ｂ１－５’と相同である。

塩基配列Ｂ３は、塩基配列Ｂ１（配列番号２）のうち、３’末端塩基（すなわち配列番号２の第１９位塩基）から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１１塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列である。

塩基配列Ｂ４は、塩基配列Ｂ３と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｂ４は、少なくとも、塩基配列Ｂ３と、塩基配列Ｂ１（配列番号２）の第１９位、第１１位及び第１０位に相当する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｂ４は、その３’末端塩基から連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１１塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｂ４－３’が、塩基配列Ｂ３の３’末端塩基（配列番号２の第１９位塩基に対応する塩基）から連続した同塩基数の部分塩基配列Ｂ３－３’と同一であり、塩基配列Ｂ４の、部分塩基配列Ｂ４－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ｂ４－５’が、塩基配列Ｂ３の、部分塩基配列Ｂ３－３’の５’末端側の残りの部分塩基配列Ｂ３－５’と相同である。

上記のプライマーＡ及びプライマーＢを含むクルミを検出するためのプライマーセットには、更にプローブを含めることができる。プローブはプライマーＡ及びプライマーＢを用いた核酸増幅反応により増幅された増幅産物中の標的配列の少なくとも一部の領域にストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができるオリゴヌクレオチドを含むものであればよい。

プローブは、オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、オリゴヌクレオチドに蛍光物質（例えば、ＦＡＭ^ＴＭ、ＴＥＴ^ＴＭ、ＶＩＣ^ＴＭ、ＨＥＸ^ＴＭ、ＮＥＤ^ＴＭ、ＰＥＴ等）及び／又は消光物質（クエンチャー）（例えば、ＴＡＭＲＡ^ＴＭ、ＲＯＸ^ＴＭ、ＭＧＢ、ＢＨＱ（ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ）^ＴＭ、ＢＢＱ（ＢｌａｃｋｂｅｒｒｙＱｕｅｎｃｈｅｒ）^ＴＭ等）で標識されていてもよい。このように標識されたプローブはＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブとも称される。好ましくは、オリゴヌクレオチドの一方の端に蛍光物質が連結され他方の端に消光物質が連結される。

プローブは、より好ましくは、
（Ｃ１）配列番号３に示す塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）塩基配列Ｃ１と相同な塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）塩基配列Ｃ１のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、
（Ｃ４）塩基配列Ｃ３と相同な塩基配列Ｃ４、
（Ｃ５）塩基配列Ｃ１と相補的な塩基配列Ｃ５、
（Ｃ６）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ６、
（Ｃ７）塩基配列Ｃ５のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ７、
（Ｃ８）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ８
（Ｃ９）配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ９、及び、
（Ｃ１０）塩基配列Ｃ９と相補的な塩基配列Ｃ１０
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣである。

配列表、図４及び実施例の表１を参照して、プローブＣが、クルミの種に関わらずプライマーＡ及びプライマーＢによるクルミＤＮＡの増幅産物に同程度の効率で結合することができることの理由を説明する。

プローブＣの具体例として、配列番号３に示す塩基配列Ｃ１からなるオリゴヌクレオチドからなる、実施例に記載の「ＪＩ２プローブ」が挙げられる。図４に示すように、ＪＩ２プローブは、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＤＮＡのＩＴＳ－２の塩基配列（ＡＦ３０３８０９．１）の一部である配列番号７の第２６～４５位の塩基配列の逆相補配列である。ＪＩ２プローブは、プライマーＡ及びプライマーＢによるクルミＤＮＡの増幅産物のうち、配列番号７の第２６～４５位に相当する塩基配列にハイブリダイズすることができる。

また、図４に示す通り、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＩＴＳ－２の配列番号７に示す標的領域のうち第３３位、第４３位は、クルミ属に共通しカリア属では異なる塩基（一重下線で示す）であり、第４６位、第４９位はクルミ属内で多型のある塩基（二重下線で示す）である。

ＪＩ２プローブ（配列番号３に示す塩基配列からなる）は、ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａのＩＴＳ－２の配列番号７に示す塩基配列のうち第２６～４５位に相当する塩基配列にハイブリダイズするため、クルミの種に関わらずプライマーＡ及びプライマーＢによるクルミＤＮＡの増幅産物に同程度の効率でハイブリダイズすることができる。同様に、ＪＩ２プローブがハイブリダイズするクルミＤＮＡのＩＴＳ－２の領域又はその相補鎖にハイブリダイズすることができる他のプライマーＣもまた、クルミの種に関わらずプライマーＡ及びプライマーＢによるクルミＤＮＡの増幅産物に同程度の効率でハイブリダイズすることができる。

なお図４では比較のために、非特許文献５に記載のＷａｌＩＴＳプローブ（配列番号６）のＩＴＳ－２塩基配列上の対応位置を示す。ＷａｌＩＴＳプローブは、クルミ属内で多型のある配列番号７の第４６位及び第４９位の塩基にハイブリダイズする部分を含んでいる。このため核酸増幅反応による増幅産物の検出にＷａｌＩＴＳプローブを用いる場合、クルミ属の種間で検出感度が異なる可能性があり好ましくないと考えられる。

続いて、プローブＣのより好ましい実施形態について説明する。
プローブＣにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ｃ１、塩基配列Ｃ２、塩基配列Ｃ３、塩基配列Ｃ４、塩基配列Ｃ５、塩基配列Ｃ６、塩基配列Ｃ７及び塩基配列Ｃ８から選択される塩基配列Ｃを少なくとも一部に含むものであればよく、塩基配列Ｃの３’末端側及び／又は５’末端側（好ましくは５’末端側のみ）に付加された他の塩基配列を含んでいてもよいし、塩基配列Ｃのみからなるものであってもよい。プローブＣにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３０塩基以下、好ましくは２８塩基以下、より好ましくは２５塩基以下である。プローブＣは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドに、前記蛍光物質及び／又は前記消光物質が連結されたものである。
塩基配列Ｃ１は、配列番号３に示す塩基配列を指す。

塩基配列Ｃ２は、塩基配列Ｃ１と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｃ２は、少なくとも、塩基配列Ｃ１と、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の第３位及び第１３位の塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｃ２は、連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｃ２－１が、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の対応する部分塩基配列Ｃ１－１と同一であり、塩基配列Ｃ２の、部分塩基配列Ｃ２－１以外の残りの部分塩基配列が、塩基配列Ｃ１の、部分塩基配列Ｃ１－１以外の残りの部分塩基配列と相同である。

塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１（配列番号３）のうち連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１（配列番号３）のうち少なくとも第３位及び第１３位の塩基を含む部分塩基配列であることが好ましい。

塩基配列Ｃ４は、塩基配列Ｃ３と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｃ４は、少なくとも、塩基配列Ｃ３と、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の第３位及び第１３位に相当する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｃ４は、連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｃ４－１が、塩基配列Ｃ３の対応する部分塩基配列Ｃ３－１と同一であり、塩基配列Ｃ４の、部分塩基配列Ｃ４－１以外の残りの部分塩基配列が、塩基配列Ｃ３の、部分塩基配列Ｃ３－１以外の残りの部分塩基配列と相同である。
塩基配列Ｃ５は、配列番号３に示す塩基配列Ｃ１と相補的な塩基配列を指す。

塩基配列Ｃ６は、塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｃ６は、少なくとも、塩基配列Ｃ５と、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の第３位及び第１３位の塩基に対応する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｃ６は、連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｃ６－１が、塩基配列Ｃ５の対応する部分塩基配列Ｃ５－１と同一であり、塩基配列Ｃ６の、部分塩基配列Ｃ６－１以外の残りの部分塩基配列が、塩基配列Ｃ５の、部分塩基配列Ｃ５－１以外の残りの部分塩基配列と相同である。

塩基配列Ｃ７は、塩基配列Ｃ５のうち連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ７は、塩基配列Ｃ５のうち、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の第３位及び第１３位の塩基に対応する塩基を含む部分塩基配列であることが好ましい。

塩基配列Ｃ８は、塩基配列Ｃ７と相同な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｃ８は、少なくとも、塩基配列Ｃ７と、塩基配列Ｃ１（配列番号３）の第３位及び第１３位に対応する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｃ８は、連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｃ８－１が、塩基配列Ｃ７の対応する部分塩基配列Ｃ７－１と同一であり、塩基配列Ｃ８の、部分塩基配列Ｃ８－１以外の残りの部分塩基配列が、塩基配列Ｃ７の、部分塩基配列Ｃ７－１以外の残りの部分塩基配列と相同である。

塩基配列Ｃ９は、配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列のうち連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ９は、配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列のうち、５’末端から第３位及び第１３位の塩基を少なくとも含む部分塩基配列であることが好ましい。

塩基配列Ｃ１０は、塩基配列Ｃ９と相補的な塩基配列である。好ましくは、塩基配列Ｃ１０は、少なくとも、塩基配列Ｃ９と、配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列の、５’末端から第３位及び、第１３位に相当する塩基は同一である。より好ましくは、塩基配列Ｃ１０は、連続した５塩基以上、好ましくは８塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列Ｃ１０－１が、塩基配列Ｃ９の対応する部分塩基配列Ｃ９－１と同一であり、塩基配列Ｃ１０の、部分塩基配列Ｃ１０－１以外の残りの部分塩基配列が、塩基配列Ｃ９の、部分塩基配列Ｃ９－１以外の残りの部分塩基配列と相同である。

上記のプライマーＡ、プライマーＢ又はプローブに含まれるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することができる。

本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは上記の各要素が、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、また一回の使用及び使用量ごとに容器に収容されていてもよい。あるいは、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。上記の各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。

本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、ｄＮＴＰミックス、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＲ^{（登録商標）}ＧｒｅｅｎＩ、塩化マグネシウム、及び使用説明書より選択される一以上の要素を含めることができる。

本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、食物アレルゲンを検出するための一以上の別のプライマーセットと組み合わせて、食物アレルゲン検出用キットとしてもよい。

前記食物アレルゲンを検出するための一以上の別のプライマーセットとしては、小麦、そば、落花生等の食物アレルゲンを検出するための一以上のプライマーセットが挙げられる。小麦を検出するためのプライマーセット、そばを検出するためのプライマーセット、及び／又は落花生を検出するためのプライマーセットとしては、特許文献１（特開２０１６－１０１１４２号公報）に記載のプライマーセットが好ましい。本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、特許文献１に記載の、小麦、そば及び落花生を検出するための共通のＰＣＲ条件でのリアルタイムＰＣＲ法によりクルミＤＮＡの増幅と検出が可能である。このため、本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを用いることによって、小麦及、そば及び／又は落花生検出用のＰＣＲ条件下にて、クルミの検出を行うことが可能である。このため、小麦及、そば及び／又は落花生、並びにクルミの検出を、同一条件下にて同時に進めることができ、分析の手間を少なくすることができる。

＜３．試料中のクルミを検出する方法＞
本発明の一以上の実施形態に係る、試料中のクルミを検出する方法は、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、クルミを検出するための前記プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含むことを特徴とする。

前記試料は、好ましくは飲食品試料である。飲食品試料とは、飲食品組成物、飲食品組成物の原料、加工途中の飲食品原料、或いは、これらの処理物（例えば抽出物、粉砕物、溶解物）等を含む試料であってよい。このクルミの検出方法で得られた結果は、アレルギー表示の正しさの確認や、アレルギー表示をするべきか否かの判断材料に用いることができる。
検出対象となるクルミの範囲は既述の通りである。

試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、及びそれらの組合せを用いて行うことができる。また、市販のＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔやＧｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ２０／Ｇ、ＤＮｅａｓｙｍｅｒｉｃｏｎＦｏｏｄＫｉｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）、ＧＭｑｕｉｃｋｅｒ４（ニッポンジーン社）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。

抽出されたＤＮＡの濃度および精製度は、分光光度計を用いて波長２３０、２６０、及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより評価することができる。
例えば抽出されたＤＮＡの濃度は、下記式を用いて算出することができる。
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）＝波長２６０ｎｍにおける吸光度×５０

ＤＮＡの精製度は、核酸増幅反応が良好に行われるべく２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８～２．０であることが好ましい。

さらに、抽出されたＤＮＡについて、植物又は動物が共通に持つ内在性遺伝子に対するプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物が得られることを確認してもよい。

試料から抽出されたＤＮＡは、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に記載されるＤＮＡの調製方法に基づいて適宜濃度を調整することができる。濃度調整したＤＮＡは、適宜鋳型ＤＮＡとして利用することができる。好ましくは５～５００ｎｇとなる量にて、より好ましくは５０ｎｇとなる量にて鋳型ＤＮＡとして利用する（この量は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」にて特定される量である）。

核酸増幅反応は、耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよいし、鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよい。ポリメラーゼは好ましくはＤＮＡポリメラーゼである。

ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅反応法としてはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が挙げられる。

ＰＣＲ法は、例えばＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４（１９８５）や植物細胞工学別冊、植物のＰＣＲ実験プロトコル、島本功・佐々木卓治監修（１９９５年）等に記載されている通常の方法に基づいて行うことができる。ＰＣＲ条件（変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度及び時間、ならびにサイクル数等）、ＰＣＲ反応液の組成（緩衝液の種類、プライマー濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類や濃度、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等）は、前記プライマーセットを用いたＰＣＲにおいて高感度でＰＣＲ増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等がほぼ最適化されたＰＣＲ用マスターミックス等が市販されており、これらを利用してもよい。

前記ＰＣＲ法として、定性ＰＣＲ法を利用することができる。定性ＰＣＲ法においては、試料から抽出されたＤＮＡ中に含まれるクルミＤＮＡを、プライマーＡ及びプライマーＢを含む前記プライマーセットを利用するＰＣＲにより増幅し、それを電気泳動により分離、染色することで検出することができる。

プライマーＡ及びプライマーＢを含む前記プライマーセットを用いた場合には、増幅産物の有無、好ましくは約７４ｂｐのサイズの増幅産物の有無を指標として、クルミの混入を検出することができる。クルミのＩＴＳ－２配列の少なくとも一部を含む、好ましくは上記サイズの増幅産物が検出されれば、試料にクルミが混入していると判定することができ、前記増幅産物が検出されなければ、試料にクルミが混入していないと判定することができる。

前記プライマーセットを用いることにより高感度でのクルミの検出が可能である。下記実施例に詳述されるとおりＰＣＲ反応液２５μＬの系で、５０ｆｇのクルミＤＮＡを検出することができる。この検出感度はクルミの種間で同程度である。

前記プライマーセットは、好ましくは、プローブを更に含み、より好ましくは前記プローブＣを含む。増幅産物の検出を、増幅産物とプローブとの結合を検出することにより行うことができる。プローブを用いる検出方法としては、後述するＴａｑＭａｎ^ＴＭ法によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。

前記ＰＣＲ法として、リアルタイムＰＣＲ法を利用することができる。

リアルタイムＰＣＲ法は、インターカレーター法及びＴａｑＭａｎ^ＴＭ法のいずれも用いることができるが、好ましくはＴａｑＭａｎ^ＴＭ法を利用する。

インターカレーター法では、蛍光を発する化合物（例えば、ＳＹＢＲ^{（登録商標）}ＧｒｅｅｎＩ等）をＰＣＲ反応液に含むことにより、これが増幅されたＤＮＡに結合する。これに励起光を照射することにより蛍光を発し、この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。

一方、ＴａｑＭａｎ^ＴＭ法では、蛍光物質で標識されたプローブ（ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ）をＰＣＲ反応液に含むことにより、これがアニーリングステップで増幅されたＤＮＡ中の標的配列に結合（ハイブリダイズ）する。その後の伸長反応ステップで、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡに結合（ハイブリダイズ）したプローブが分解され、その際、蛍光物質がプローブから遊離し蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。リアルタイムＰＣＲを行う装置は特に限定されず、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ライフテクノロジーズ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等、リアルタイムＰＣＲを可能とする様々な機種を用いることができ、特に限定はされない。

リアルタイムＰＣＲ法においては、試料から抽出されたＤＮＡ中に含まれるクルミＤＮＡを、前記プライマーセットを利用するＰＣＲにより増幅し、上記のとおり、蛍光強度を測定することによりＰＣＲ増幅産物の生成量を測定し、増幅曲線を得る。次に、蛍光シグナルが有意に増加したサイクル数（Ｃｑ値）を指標とするか、または蛍光シグナルがサイクル数に対して指数関係にある領域で、蛍光量増加（ΔＲｎ）の適当な閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定し、適当なサイクル数条件下にて、増幅曲線と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が交わるサイクル数（Ｃｔ値（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ））を指標とすることで、クルミの混入有無を検出することができる。すなわち、適当なサイクル数条件下にて、蛍光シグナルの有意な増加が見られるか、または増幅曲線と閾値が交わる場合には、試料中にクルミが混入していることを示し、一方、蛍光シグナルの有意な増加が見られないか、または増幅曲線と閾値が交わらない場合には、試料中にクルミが混入していないことを示す。

前記プライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法と、特許文献１に記載の小麦検出用プライマーセット、そば検出用プライマーセット、及び／又は落花生検出用プライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法とは、同一の条件下でも、いずれも目的とする感度を維持しつつ、目的とする配列でのみ標的増幅産物が得られる。このため、本発明のクルミの検出方法は、特許文献１に記載の小麦の検出方法、そばの検出方法、及び／又は、落花生の検出方法と、同一の条件下にて同時に行うことができ、試料中の食物アレルゲンを、迅速かつ効率的に検出することができる。

以下、実施例に基づいて本発明の具体的な実施形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

＜１．目標＞
クルミ定性リアルタイムＰＣＲ法を、小麦そば落花生定性リアルタイムＰＣＲ法と同じＰＣＲ温度条件で分析可能であること、及び、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）に属するクルミを特異的に検出することができ、且つ、クルミ属の種間で感度が異ならないことを目標として行った。

＜２．方法＞
＜２．１．試料＞
以下４種類の試料を市場から入手した。いずれも焙煎されていた。
殻付きカシグルミ（Ｊｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａ）
殻付きオニグルミ（Ｊｕｇｌａｎｓｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ、またはＪｕｇｌａｎｓａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ）
殻付きペカン（Ｃａｒｙａｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ）
山核桃（Ｃａｒｙａｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ）の仁

＜２．２．ＤＮＡ抽出＞
オニグルミは殻を割って取り出した仁０．１ｇから、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ２０／Ｇを用い、キットの説明書に従って抽出ＤＮＡ溶液を得た。

カシグルミ、ペカンは殻を割って取り出した仁、それぞれ０．１ｇ、０．５ｇから、ＧＭｑｕｉｃｋｅｒ４を用い、キットの説明書に従って抽出ＤＮＡ溶液を得た。

山核桃は仁の周囲を削って得られた１．０ｇから、ＧＭｑｕｉｃｋｅｒ４を用い、キットの説明書に従って抽出ＤＮＡ溶液を得た。

抽出ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度は微量分光光度計で定量し、ＴＥ（ｐＨ８．０）で２０ｎｇ／μＬに希釈した。

オニグルミ、カシグルミ抽出ＤＮＡの段階希釈溶液は、サケ精子ＤＮＡ２０ｎｇ／μＬを用いて１０倍ずつ希釈した。終濃度がそれぞれ２０ｐｇ／μＬ、２ｐｇ／μＬ、２００ｆｇ／μＬ、２０ｆｇ／μＬの抽出ＤＮＡ溶液をリアルタイムＰＣＲに用いた。

＜２．３．プライマー、プローブ＞

＜２．４．リアルタイムＰＣＲ＞
ＰＣＲ反応液は、１ｘＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ、０．２μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、０．１Ｍプローブを含み、２．５μＬの鋳型ＤＮＡ試料液を入れて全量２５μＬとなるように作製した。装置はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６を用いた。

ＰＣＲ温度条件は、下記の３種類である。

条件１は、特許文献１（特開２０１６－１０１１４２号公報）に記載の、小麦、そば及び落花生を検出するための共通のＰＣＲ条件である。

条件１’は、条件１のサイクル数を４２サイクルから５０サイクルに延ばした条件である。

条件２は、比較例のプライマープローブセット（ＷａｌＩＴＳ）によるＰＣＲに最適化した条件である。

Ｃｑ値の算出に用いた解析条件は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６ではデフォルトを用いた。

鋳型ＤＮＡ試料液として前記抽出ＤＮＡ液を用いた。測定試料中のＤＮＡ量は以下の通り。
カシグルミＤＮＡ、オニグルミＤＮＡ：それぞれ５０ｐｇ、５ｐｇ、５００ｆｇ、５０ｆｇ
ペカンＤＮＡ、山核桃ＤＮＡ：５０ｎｇ（＝５×１０^７ｆｇ）

＜２．５．ＤＮＡ量の算出＞
カシグルミＤＮＡ試料の名目ＤＮＡ量のｆｇベースでの常用対数をｘ軸、得られたＣｑ値をｙ軸として検量線を作成した。検量線の傾きと切片からＤＮＡ量を算出した。
ＤＮＡ量（ｆｇ）＝１０＾（（試料のＣｑ値－切片）／傾き）

＜３．結果＞
ＰＣＲ結果から算出されたＤＮＡ量を次表に示す。

実施例のプライマープローブセットを用い条件１により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を図１に示す。

比較例のプライマープローブセットを用い条件１’により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を図２に示す。

比較例のプライマープローブセットを用い条件２により行ったリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を図３に示す。

実施例のプライマープローブセットを用い、特許文献１（特開２０１６－１０１１４２号公報）に記載の、小麦、そば及び落花生を検出するための共通のＰＣＲ条件である条件１により行ったリアルタイムＰＣＲ法により、ペカン、山核桃を誤って検出せず、且つ、オニグルミとカシグルミを検出することができた。カシグルミの検出感度に対して、オニグルミの検出感度は１／２～２倍以内であった。

比較例のプライマープローブセットを用い条件１によりリアルタイムＰＣＲ法を行った場合、４２サイクルの時点で増幅産物量が閾値に達していない試料があった。そこで、比較例のプライマープローブセットを用い、サイクル数を５０まで延ばした以外は条件１と同様の条件１’によりリアルタイムＰＣＲ法を行った。その結果、ペカンを誤って検出することはなかったものの、オニグルミの検出感度は、カシグルミの検出感度の約１／１００であった。

比較例のプライマープローブセットを用い、比較例のプライマープローブセットの配列に応じて最適化した条件２によりリアルタイムＰＣＲ法を行ったところ、オニグルミの検出感度は、カシグルミの検出感度の約１／２程度にまで改善されたものの、増幅曲線形状がオニグルミとカシグルミで異なり、山核桃を誤って検出した（図３）。

＜４．考察＞
実施例のプライマープローブセットは、特許文献１（特開２０１６－１０１１４２号公報）に記載の、小麦、そば及び落花生を検出するための共通のＰＣＲ条件でのリアルタイムＰＣＲ法によりクルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）に属するクルミを特異的に検出することができ、且つ、クルミ属の種間で感度が異ならなかった。すなわち上記の目標が達成された。

一方、比較例のプライマープローブセットは、小麦、そば及び落花生を検出するための共通のＰＣＲ条件、及び、最適化されたＰＣＲ条件のどちらでも、クルミ属の種間で検出感度は異なり、上記の目標を達成することはできなかった。

本発明は、飲食品の分野におけるアレルゲンの検出の目的で利用することができる。

Claims

クルミを検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に示す塩基配列Ａ１を３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに
配列番号２に示す塩基配列Ｂ１を３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含むプライマーセット。
（Ｃ１）配列番号３に示す塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）塩基配列Ｃ１と相同な塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）塩基配列Ｃ１のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、
（Ｃ４）塩基配列Ｃ３と相同な塩基配列Ｃ４、
（Ｃ５）塩基配列Ｃ１と相補的な塩基配列Ｃ５、
（Ｃ６）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ６、
（Ｃ７）塩基配列Ｃ５のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ７、
（Ｃ８）塩基配列Ｃ５と相同な塩基配列Ｃ８
（Ｃ９）配列番号７の第２２～４５位と相補的な塩基配列のうち連続した５塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ９、及び、
（Ｃ１０）塩基配列Ｃ９と相補的な塩基配列Ｃ１０
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含む、請求項１に記載のプライマーセット。
試料中のクルミを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
前記プライマーセットが、請求項２に記載のプライマーセットであり、
前記増幅産物の検出を、前記増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出することにより行う、
請求項３に記載の方法。
前記試料が飲食品試料である、請求項３又は４に記載の方法。