JP6484467B2 - Method for producing 2-aminobutanoic acid and method for using aspartate decarboxylase - Google Patents
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Description
本発明は、２−アミノブタン酸の製造方法およびアスパラギン酸デカルボキシラーゼ使用方法に関する。 The present invention relates to a manufacturing method and aspartate decarboxylase use how the 2-aminobutanoate.
α−アミノ酸である２−アミノブタン酸（ホモアラニン）は、抗てんかん薬や血圧降下薬等の医薬または農薬の原料として幅広い利用が期待されている。 2-aminobutanoic acid (homoalanine), which is an α-amino acid, is expected to be widely used as a raw material for pharmaceuticals or agricultural chemicals such as antiepileptic drugs and antihypertensive drugs.
α−アミノ酸の合成方法としては、たとえば、ストレッカー反応を利用する方法、α−アミノ酸のヒドロキシ体に脱アミノ酵素（デアミナーゼ）を作用させ得られたケト体に対し、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）を作用させる方法、すなわち２種の酵素を作用させる方法（非特許文献１および２）等がある。 As a method for synthesizing α-amino acid, for example, a method utilizing a Strecker reaction, a dehydrogenase (dehydrogenase) is applied to a keto obtained by allowing deaminase (deaminase) to act on a hydroxy form of α-amino acid. There is a method of acting, that is, a method of acting two kinds of enzymes (Non-patent Documents 1 and 2).
また、２−アミノブタン酸の製造方法としては、たとえば以下のものがある。 Examples of the method for producing 2-aminobutanoic acid include the following.
特許文献１には、光学活性２−アミノブタン酸と光学活性２−フェノキシプロピオン酸誘導体で構成される複合体である光学活性２−アミノブタン酸のジアステレオマーを、水と水に難溶性の有機溶媒との混合液に溶解または懸濁させて攪拌してジアステレオマーを分解させ、水層から光学活性２−アミノブタン酸を回収する方法が開示されている。 Patent Document 1 discloses a diastereomer of optically active 2-aminobutanoic acid, which is a complex composed of optically active 2-aminobutanoic acid and an optically active 2-phenoxypropionic acid derivative, as an organic solvent that is hardly soluble in water and water. Is dissolved in or suspended in a mixed solution and stirred to decompose the diastereomer and recover the optically active 2-aminobutanoic acid from the aqueous layer.
しかしながら、特許文献１や非特許文献１および２に記載の方法は、多段階反応であるため、目的物質の収率低下、設備費用がかさむ等の不都合があり、コストアップの要因となりうる。
そして、２−アミノブタン酸を一段階の反応で合成する酵素は、これまでに報告されていなかった。
However, since the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 and 2 are multistage reactions, there are inconveniences such as a decrease in the yield of the target substance and an increase in equipment costs, which may increase the cost.
An enzyme that synthesizes 2-aminobutanoic acid in a one-step reaction has not been reported so far.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成する方法を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for synthesizing 2-aminobutanoic acid by a one-step enzymatic reaction.
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応に触媒作用を示す酵素を獲得し、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができることを見出し、本発明に至った。 As a result of intensive research in order to achieve the above-mentioned problems, the present inventor obtained an enzyme that exhibits a catalytic action in the reaction of eliminating the γ-position carboxyl group of glutamic acid and converting it into 2-aminobutanoic acid and carbon dioxide. It has been found that 2-aminobutanoic acid can be synthesized by a one-step enzymatic reaction, and has led to the present invention.
本発明によれば、Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼの触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する、２−アミノブタン酸の製造方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a process for producing 2-aminobutanoic acid, which synthesizes 2-aminobutanoic acid from glutamic acid by the catalytic action of aspartate decarboxylase classified as EC 4.1.1.12. The
さらに、本発明によれば、Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼを用いてグルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの使用方法が提供される。 Furthermore, according to the present invention, there is provided a method of using aspartate decarboxylase , which produces 2-aminobutanoic acid from glutamic acid using aspartate decarboxylase classified as EC 4.1.1.12. The
さらに、本発明によれば、上記遺伝子を保有するベクターが提供される。 Furthermore, according to the present invention, a vector carrying the gene is provided.
さらに、本発明によれば、上記遺伝子を含む、形質転換体が提供される。 Furthermore, according to this invention, the transformant containing the said gene is provided.
本発明によれば、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成する方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for synthesizing 2-aminobutanoic acid by a one-step enzymatic reaction can be provided.
以下、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法について説明する。 Hereinafter, the method for producing 2-aminobutanoic acid according to this embodiment will be described.
＜２−アミノブタン酸の製造方法＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法は、脱炭酸酵素の触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する構成を採用している。上記構成によれば１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応を利用するものである。
<Method for producing 2-aminobutanoic acid>
The method for producing 2-aminobutanoic acid according to this embodiment employs a configuration in which 2-aminobutanoic acid is synthesized from glutamic acid by the catalytic action of decarboxylase. According to the above configuration, 2-aminobutanoic acid can be synthesized by a one-step enzymatic reaction. The method for synthesizing 2-aminobutanoic acid according to the present embodiment utilizes a reaction in which the carboxyl group at the γ-position of glutamic acid is eliminated and converted to 2-aminobutanoic acid and carbon dioxide.
脱炭酸酵素としては、たとえば、アスパラギン酸のβ位のカルボキシル基を脱離してアラニンと二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２）（非特許文献４）や、グルタミン酸のα位のカルボキシル基を脱離してγアミノ酪酸と二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すグルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１５）等がある。 As the decarboxylase, for example, aspartate decarboxylase (EC 4.1.1.1. Which exhibits a catalytic action for the reaction of eliminating the carboxyl group at the β-position of aspartate and converting it to alanine and carbon dioxide. 12) (Non-Patent Document 4) and glutamic acid decarboxylase (EC 4.1.) Which shows a catalytic action for the reaction of eliminating the α-position carboxyl group of glutamic acid and converting it to γ-aminobutyric acid and carbon dioxide. 1.15).
そして、これまでに、脱炭酸酵素がグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示すことについては、知られていなかった。 Until now, it has not been known that decarboxylase catalyzes a reaction for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
従来、２−アミノブタン酸等のα−アミノ酸を合成する場合、上記背景技術の項で説明したように、多段階の有機合成反応を利用する方法や、２種の酵素反応を組み合わせて利用する方法が考えうる。これに対し、本実施形態では、脱炭酸酵素の触媒作用により１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。すなわち、グルタミン酸を直接、２−アミノブタン酸に転化することができる。本実施形態によれば、１段階の酵素反応で安価に２−アミノブタン酸を得ることができる。 Conventionally, when synthesizing an α-amino acid such as 2-aminobutanoic acid, as described in the background section above, a method using a multistage organic synthesis reaction or a method using a combination of two enzyme reactions Can be considered. In contrast, in the present embodiment, 2-aminobutanoic acid can be synthesized by a one-stage enzymatic reaction by the catalytic action of decarboxylase. That is, glutamic acid can be directly converted to 2-aminobutanoic acid. According to this embodiment, 2-aminobutanoic acid can be obtained at low cost by a one-stage enzyme reaction.
そして、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法におけるグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応液のｐＨは、特に限定されないが、たとえば、ｐＨ４以上１０以下であることが好ましく、ｐＨ５以上９以下であるとさらに好ましい。なお、反応中にｐＨが変動する場合は、適宜調整すればよい。 The pH of the reaction solution for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid in the method for synthesizing 2-aminobutanoic acid according to this embodiment is not particularly limited, but is preferably, for example, pH 4 or more and 10 or less, and pH 5 or more and 9 More preferably, it is as follows. In addition, what is necessary is just to adjust suitably, when pH fluctuates during reaction.
また、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法におけるグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応温度は、脱炭酸酵素の酵素活性を維持できる温度であれば特に限定されないが、たとえば、２０℃以上６０℃以下であることが好ましく、２５℃以上５０℃以下であるとさらに好ましい。 The reaction temperature for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid in the method for synthesizing 2-aminobutanoic acid according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a temperature capable of maintaining the enzyme activity of decarboxylase. The temperature is preferably 60 ° C. or lower and more preferably 25 ° C. or higher and 50 ° C. or lower.
＜２−アミノブタン酸＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸は、上記２−アミノブタン酸の製造方法によって得られたものである。
<2-Aminobutanoic acid>
The 2-aminobutanoic acid according to this embodiment is obtained by the above-described method for producing 2-aminobutanoic acid.
＜脱炭酸酵素＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法は、脱炭酸酵素の触媒作用を利用することを特徴としている。そして、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示すものである。なお、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸の合成に使用されるものである。
<Decarboxylase>
The method for producing 2-aminobutanoic acid according to this embodiment is characterized by utilizing the catalytic action of decarboxylase. And the decarboxylase which concerns on this embodiment shows a catalytic action with respect to reaction which synthesize | combines 2-aminobutanoic acid from glutamic acid. The decarboxylase according to this embodiment is used for synthesis of 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
本実施形態に係る脱炭酸酵素は、真正細菌の生物種としてＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素であることが好ましい。さらに好ましくは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門のＢａｃｉｌｌｉ網またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ網に分類されている菌株由来の酵素、またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門のＡｌｐｈａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網、ＢｅｔａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網、ＧａｍｍａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ 網、ＤｅｌｔａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ またはＥｐｓｉｌｏｎＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網に分類されている菌株由来の酵素であることがより好ましい。 The decarboxylase according to the present embodiment is preferably an enzyme derived from a strain classified as Firmictes as an eubacteria species or an enzyme derived from a strain classified as Proteobacteria. More preferably, an enzyme from a strain classified as Bacilli or Clostridia in the Firmicutes, or an AlphaProteobacteria, BetaProteobacteria, or Proteobacter from the Proteobacteria It is more preferable.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素の中では、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＨａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属からなる群より選択されるいずれか１種の菌株由来の酵素であるとさらに好ましい。 In addition, the decarboxylase according to the present embodiment, among enzymes derived from strains classified as Firmicutes, includes the genus Alycyclobacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Clostridium, Clostridium, More preferably, the enzyme is derived from any one strain selected from the group consisting of the genus Peptoclostridium, Desulfosporinus, Eubacterium, and Halobacterium.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素の中では、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ属、Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ属、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属 、Ｐａｎｄｏｒａｅａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ属、Ｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、またはＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属からなる群より選択されるいずれか１種の菌株由来の酵素であるとさらに好ましい。 Further, among the enzymes derived from strains classified as Proteobacteria, the decarboxylase according to this embodiment includes the genus Erwinia, Pluralibacter genus, Vibrio genus, Acinetobacter genus, Francisella genus, Gilamella genus, Frischella genus, Selladola sellad , Ralstonia genus, Cupriavidus genus, Burkholderia genus, Pandoraea genus, Achromobacter genus, Delftia genus, Comonas genus, Janthinobacterium genus, Colimonas genus, Minibacteria genus, Minibacteria genus, Minibacteria genus selected from the genus us, the genus Parvivacum, the genus Sinorhizobium, the genus Rhizobium, the genus Ochrobactrum, the genus Bradyrhizobium, the genus Methylobacterium, the genus Zymomonas, the genus Acetobirlus, or the Azospiri genus preferable.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来の酵素であることが好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来の酵素、またはＶｉｂｒｉｏ属の中でもＶｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｉｉ由来の酵素であるとさらに好ましい。本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼまたはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼであることが好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼであるとさらに好ましい。 In addition, the decarboxylase according to the present embodiment is preferably an enzyme derived from a strain of the genus Lactobacillus or Vibrio. Of the Lactobacillus genus, an enzyme derived from Lactobacillus sakei or an enzyme derived from Vibrio shiroii among the Vibrio genus is more preferable. The decarboxylase according to this embodiment is preferably an aspartate decarboxylase derived from a strain of the genus Lactobacillus or an aspartate decarboxylase derived from a strain of the genus Vibrio. Aspartate decarboxylase derived from Lactobacillus sakei or aspartate decarboxylase derived from Vibrio shilonii is more preferred.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼであることが好ましい。なお、従来、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの反応基質となる化合物としては、たとえば、Ｌ−アスパラギン酸、アミノマロン酸、β−クロロ−Ｌ−アラニン、エリトロ−β−ヒドロキシアスパラギン酸、Ｌ−システインスルフィン酸またはトレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸等の化合物が知られていたが、グルタミン酸が反応基質となることは知られていなかった。 The decarboxylase according to this embodiment is preferably aspartate decarboxylase. Conventionally, as a compound serving as a reaction substrate of aspartate decarboxylase, for example, L-aspartic acid, aminomalonic acid, β-chloro-L-alanine, erythro-β-hydroxyaspartic acid, L-cysteine sulfinic acid or Although compounds such as threo-β-hydroxyaspartic acid were known, it was not known that glutamic acid would be a reaction substrate.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素、または配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む酵素であることが好ましい。 Further, the decarboxylase according to the present embodiment is an enzyme comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, or 5, or the amino acid of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, or 5 It is preferably an enzyme comprising a peptide in which 1 to 6 amino acids are deleted, substituted or added in the sequence.
ここで、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、天然に存在する菌体が保持する脱炭酸酵素であってもよく、遺伝子工学的手法により合成した脱炭酸酵素であってもよい。 Here, the decarboxylase according to the present embodiment may be a decarboxylase retained by a naturally occurring microbial cell, or a decarboxylase synthesized by a genetic engineering technique.
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すものであれば、融合蛋白質として発現させたり、タグを付加して発現させたりする場合のように、本実施形態に係る脱炭酸酵素のＮ末端やＣ末端に数残基のアミノ酸が結合していたとしても、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成することができれば使用することができる。 In addition, the decarboxylase according to the present embodiment is expressed as a fusion protein as long as it exhibits a catalytic action for the reaction of eliminating the γ-position carboxyl group of glutamic acid and converting it to 2-aminobutanoic acid and carbon dioxide. Or when amino acids of several residues are bound to the N-terminus or C-terminus of the decarboxylase according to the present embodiment, as in the case of expression with addition of a tag or 2-aminobutane. If an acid can be synthesized, it can be used.
上述の本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する際に用いるものである。このとき、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示すため、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。 The decarboxylase according to this embodiment described above is used when producing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid. At this time, since the decarboxylase according to the present embodiment exhibits a catalytic action for the reaction of synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid, it can synthesize 2-aminobutanoic acid by a single-stage enzymatic reaction.
＜脱炭酸酵素の使用方法＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素の使用方法は、本実施形態に係る脱炭酸酵素そのものだけでなく、脱炭酸酵素産生能を有する微生物、または高等生物由来の細胞、脱炭酸酵素をコードする遺伝子が形質転換された細胞そのもの、またはこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物、または該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した脱炭酸酵素活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。
<How to use decarboxylase>
The method of using the decarboxylase according to the present embodiment is not limited to the decarboxylase itself according to the present embodiment, but a microorganism having a decarboxylase producing ability, a cell derived from a higher organism, or a gene encoding the decarboxylase is used. The transformed cells themselves, or crushed cells of these cells can also be used, but the cells, the crushed cells of the cells, or the crushed cells of the cells are purified by treatment with ammonium sulfate precipitation or column chromatography. An immobilized product in which a fraction containing the decarboxylase activity is supported on a carrier can also be used.
＜脱炭酸酵素の製造方法＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素を製造する方法は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示す酵素が得られる方法であれば、特に限定されないが、たとえば、以下の方法がある。
<Method for producing decarboxylase>
The method for producing the decarboxylase according to the present embodiment is not particularly limited as long as an enzyme exhibiting a catalytic action for the reaction of synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid is obtained. For example, the following method is used. There is.
本実施形態に係る脱炭酸酵素は、公知の遺伝子工学的手法により取得することができる。上記微生物が産生する脱炭酸酵素の分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酵素をコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子や発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、脱炭酸酵素を産生する遺伝子組換え体を作出することができる。 The decarboxylase according to the present embodiment can be obtained by a known genetic engineering technique. By analyzing the molecular biological properties and amino acid sequence of the decarboxylase produced by the microorganism, the gene encoding the enzyme is obtained from the microorganism strain, and the control region necessary for the gene and expression is inserted. A genetically modified plasmid that produces a decarboxylase can be produced by constructing the resulting genetically modified plasmid and introducing it into an arbitrary host.
ここで、本実施形態に係る宿主細胞としては、特に限定されないが、たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属の菌株、放線菌、乳酸菌または酵母等の微生物菌株等を利用することができる。 Here, the host cell according to the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, microbial strains such as actinomycetes, lactic acid bacteria, and yeast. Can be used.
また、本実施形態に係る形質転換体には、２−アミノブタン酸合成において有効な複数のプラスミドが宿主内に存在してもよい。 In the transformant according to this embodiment, a plurality of plasmids effective in 2-aminobutanoic acid synthesis may exist in the host.
また、脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）には、形質転換体内で当該脱炭酸酵素の発現に必要な制御領域が挿入されている。ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、及び転写終結配列等を示している。 In addition, a control region necessary for expression of the decarboxylase in the transformant is inserted into the plasmid for decarboxylase synthesis (vector). The control region necessary for expression herein refers to a promoter sequence (including an operator sequence that controls transcription), a ribosome binding sequence (SD sequence), a transcription termination sequence, and the like.
本実施形態に係る制御領域としては、特に限定されないが、下記公知例があげられる。 Although it does not specifically limit as a control area | region which concerns on this embodiment, The following well-known example is mention | raise | lifted.
宿主細胞として大腸菌や枯草菌などのバクテリアを用いる場合、ベクターに挿入するプロモーター配列は、特に限定されないが、たとえば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、λファージ由来のＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター、または独自に改変・設計されたｔａｃプロモーター等の配列等を利用することができる。 When bacteria such as E. coli and Bacillus subtilis are used as host cells, the promoter sequence to be inserted into the vector is not particularly limited. For example, the trp operator of tryptophan operon derived from E. coli, the lac operator of lactose operon, the PL promoter derived from λ phage , Using a PR promoter derived from λ phage, a gluconic acid synthase promoter derived from Bacillus subtilis, an alkaline protease promoter, a neutral protease promoter, an α-amylase promoter, or a tac promoter that is uniquely modified and designed. Can do.
宿主細胞として大腸菌や枯草菌などのバクテリアを用いる場合、ベクターに挿入するリボソーム結合配列は、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されないが、たとえば、１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列や、脱炭酸酵素をコードする遺伝子の上流に位置するＳＤ配列等を利用することができる。 When bacteria such as E. coli and Bacillus subtilis are used as the host cell, the ribosome binding sequence inserted into the vector is not particularly limited as long as it is a sequence that functions in a desired host cell such as E. coli or Bacillus subtilis. A sequence in which a consensus sequence in which a sequence complementary to the 3′-terminal region of RNA is continuous for 4 or more bases is prepared by DNA synthesis, an SD sequence located upstream of a gene encoding decarboxylase, and the like can be used.
ベクターに挿入する転写終結配列は、必ずしも必要ではないが、たとえば、リポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等のρ因子非依存性の配列等を利用することができる。 The transcription termination sequence to be inserted into the vector is not necessarily required, but, for example, a ρ-factor-independent sequence such as a lipoprotein terminator or a trp operon terminator can be used.
脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）において、上述した制御領域の配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、脱炭酸酵素をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並べて利用することができる。 In the plasmid (vector) for decarboxylase synthesis, the sequence of the above-mentioned control region should be used by arranging the promoter sequence, the ribosome binding sequence, the gene encoding decarboxylase, and the transcription termination sequence from the 5 ′ end upstream. Can do.
このような脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）の作成に用いるクローニングベクターは、特に限定されないが、たとえば、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３―３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５、さらには２種類以上の宿主内で自律複製が可能なｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７またはｐＢＳ７等を利用することができる。 The cloning vector used for the preparation of such a plasmid for decarboxylase synthesis (vector) is not particularly limited. For example, pBR322, pUC18, pBluescript II SK (+ ), PKK223-3, pSC101, and pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, φ105, and two or more types of hosts that have autonomously replicable regions in Bacillus subtilis. pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 or the like can be used.
脱炭酸酵素をコードする遺伝子に変異を加える方法としては、特に限定されないが、たとえば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法、ファージを用いる方法、シャペロンを用いる方法等を利用することができる。 A method for adding a mutation to a gene encoding decarboxylase is not particularly limited. For example, a method using PCR (polymerase chain reaction), a method using phage, a method using chaperone, and the like can be used.
＜遺伝子＞
本実施形態に係る遺伝子は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればよい。
<Gene>
The gene according to this embodiment may be any gene as long as it contains a base sequence encoding a peptide that forms a decarboxylase that catalyzes a reaction for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
本実施形態に係る遺伝子は、上記本実施形態に係る脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードするものである。このため、本実施形態に係る遺伝子は、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子、または配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子であることが好ましい。 The gene according to the present embodiment encodes a peptide that forms the decarboxylase according to the present embodiment. Therefore, the gene according to this embodiment is a gene containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5, or SEQ ID NO: 1, 2, 3 It is preferably a gene comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a peptide comprising an amino acid sequence in which one or more and six or less amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of 4 or 5.
＜ベクター＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む、本実施形態に係る遺伝子を保有するものである。
<Vector>
The plasmid (vector) for decarboxylase synthesis according to this embodiment includes a base sequence encoding a peptide that forms a decarboxylase that catalyzes a reaction for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid. Possesses such genes.
＜形質転換体＞
本実施形態に係る形質転換体は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む、本実施形態に係る遺伝子を含むものである。
<Transformant>
The transformant according to the present embodiment includes the gene according to the present embodiment, which includes a base sequence encoding a peptide that forms a decarboxylase that catalyzes a reaction for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
本実施形態に係る形質転換体は、宿主細胞中に上記脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）を保有するものである。 The transformant according to the present embodiment has the above-mentioned plasmid (vector) for decarboxylase synthesis in a host cell.
ここで、本実施形態に係る形質転換体の宿主細胞としては、特に限定されないが、たとえば、大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌または酵母等を利用することができる。 Here, the host cell of the transformant according to the present embodiment is not particularly limited, and for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, lactic acid bacteria, yeast or the like can be used.
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．脱炭酸酵素の触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する２−アミノブタン酸の製造方法。
２．前記脱炭酸酵素が、真正細菌の生物種としてＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素である１．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
３．前記脱炭酸酵素が、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ属、Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ属、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｐａｎｄｏｒａｅａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ属、Ｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、またはＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属からなる群より選択されるいずれか一種の菌株由来の酵素である１．または２．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
４．前記脱炭酸酵素が、アスパラギン酸デカルボキシラーゼである１．乃至３．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
５．前記脱炭酸酵素が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来の酵素である１．乃至４．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
６．前記脱炭酸酵素が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である１．乃至５．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
７．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素である１．乃至６．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
８．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示される前記ペプチドからなる酵素である７．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
９．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む酵素である１．乃至６．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
１０．前記脱炭酸酵素が、遺伝子工学的手法により合成した酵素である１．乃至９．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
１１．１．乃至１０．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法により得られた、２−アミノブタン酸。
１２．グルタミン酸からの２−アミノブタン酸の合成に使用される脱炭酸酵素。
１３．当該脱炭酸酵素がアスパラギン酸デカルボキシラーゼである１２．に記載の脱炭酸酵素。
１４．前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である１３．に記載の脱炭酸酵素。
１５．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む１２．乃至１４．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素。
１６．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む１２．乃至１４．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素。
１７．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドからなる脱炭酸酵素。
１８．１２．乃至１７．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素を用いてグルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する、脱炭酸酵素の使用方法。
１９．１２．乃至１７．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素を製造する工程を含む、脱炭酸酵素の製造方法。
２０．脱炭酸酵素を製造する前記工程が、遺伝子工学的手法により脱炭酸酵素を合成する工程を含む、１９．に記載の脱炭酸酵素の製造方法。
２１．グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。
２２．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素である２１．に記載の遺伝子。
２３．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドからなる酵素である２２．に記載の遺伝子。
２４．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含む２１．に記載の遺伝子。
２５．２１．乃至２４．のいずれか一項に記載の遺伝子を保有するベクター。
２６．２１．乃至２４．のいずれか一項に記載の遺伝子を含む形質転換体。
２７．宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌または酵母からなる群より選択される１種の菌体である２６．に記載の形質転換体。
As mentioned above, although embodiment of this invention was described, these are illustrations of this invention and various structures other than the above are also employable.
Hereinafter, examples of the reference form will be added.
1. A process for producing 2-aminobutanoic acid, wherein 2-aminobutanoic acid is synthesized from glutamic acid by the catalytic action of decarboxylase.
2. The decarboxylase is an enzyme derived from a strain classified as Firmictes as an eubacteria species or an enzyme derived from a strain classified as Proteobacteria. A process for producing 2-aminobutanoic acid as described in 1. above.
3. The decarboxylase, Alicyclobacillus spp, Lactococcus spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Melissococcus genus, Tetragenococcus genus, Clostridium genus, Cellulosilyticum genus, Peptoclostridium genus, Desulfosporosinus spp, Eubacterium spp, Halobacteroides spp, Erwinia spp, Pluralibacter spp, Vibrio spp , Acinetobacter genus, Francisella genus, Gilliamella genus, Frischella genus, Snodgrassella genus, Ralstonia genus, Cupriavidus genus, Burkholder a genus, Pandoraea spp., Achromobacter sp., Delftia spp., Comamonas sp., Janthinobacterium genus, Collimonas genus, Minibacterium genus, Sulfurovum spp., Desulfovibrio spp., Myxococcus spp., Corallococcus genus, Parvibaculum spp., Sinorhizobium spp., Rhizobium sp., Ochrobactrum spp., Bradyrhizobium sp. 1. An enzyme derived from any one strain selected from the group consisting of the genus Methylobacterium, Zymomonas, Acetobacter, and Azospirillum. Or 2. A process for producing 2-aminobutanoic acid as described in 1. above.
4). 1. The decarboxylase is aspartate decarboxylase To 3. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
5). The decarboxylase is an enzyme derived from a strain of the genus Lactobacillus or Vibrio. To 4. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
6). The decarboxylase is an enzyme derived from Lactobacillus sakei or Vibrio shironii. To 5. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
7). 1. The decarboxylase is an enzyme comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. To 6. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
8). 6. The decarboxylase is an enzyme comprising the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. A process for producing 2-aminobutanoic acid as described in 1. above.
9. The decarboxylase is an enzyme comprising a peptide in which 1 to 6 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. To 6. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
10. The decarboxylase is an enzyme synthesized by a genetic engineering technique. Thru 9. The manufacturing method of 2-aminobutanoic acid as described in any one of these.
11.1. To 10. 2-aminobutanoic acid obtained by the method for producing 2-aminobutanoic acid according to any one of the above.
12 Decarboxylase used for the synthesis of 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
13. 11. The decarboxylase is aspartate decarboxylase Decarboxylase described in 1.
14 12. The aspartate decarboxylase is an enzyme derived from Lactobacillus sakei or Vibrio shilonii. Decarboxylase described in 1.
15. 11. comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. To 14. The decarboxylase according to any one of the above.
16. 11. A peptide in which 1 to 6 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. To 14. The decarboxylase according to any one of the above.
17. A decarboxylase comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5.
18.12. To 17. A method for using decarboxylase, wherein 2-aminobutanoic acid is produced from glutamic acid using the decarboxylase according to any one of the above.
19.12. To 17. The manufacturing method of a decarboxylase including the process of manufacturing the decarboxylase as described in any one of these.
20. 18. The step of producing a decarboxylase includes a step of synthesizing a decarboxylase by a genetic engineering technique. A method for producing the decarboxylase described in 1.
21. A gene comprising a base sequence encoding a peptide that forms a decarboxylase that catalyzes a reaction for synthesizing 2-aminobutanoic acid from glutamic acid.
22. 20. The decarboxylase is an enzyme comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. The gene according to.
23. 21. The decarboxylase is an enzyme comprising a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. The gene according to.
24. 21. The decarboxylase comprises a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 6 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. The gene according to.
25.21. To 24. A vector carrying the gene according to any one of the above.
26.21. To 24. A transformant comprising the gene according to any one of the above.
27. 26. The host cell is one cell selected from the group consisting of Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, lactic acid bacteria, or yeast. A transformant according to 1.
以下、本発明を実施例、参考例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example, a reference example, and a comparative example explain the present invention, the present invention is not limited to these.
[参考例１]
＜Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＮＢＲＣ３５４１を２５ｍＬのＮＢＲＣ培地Ｎｏ．８０４に植菌し、３０℃で数日嫌気培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。次に、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来アスパラギン酸デカルボキシラーゼ配列の公知情報（２３Ｋ：ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＹＰ＿３９４９２０.１）をもとに配列番号６および配列番号７に示した２種のプライマーを作製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒間、４０℃で３０秒間、６８℃で１．６分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った。その結果、約１．６ｋｂｐの増幅断片を得た。
[Reference Example 1]
<Manufacture of a vector having an aspartate decarboxylase gene derived from Lactobacillus sakei (manufacture of a vector for synthesizing decarboxylase)>
Lactobacillus sakei NBRC3541 in 25 mL of NBRC medium No. Inoculated to 804, anaerobic culture was performed at 30 ° C. for several days, and the cells were collected by centrifugation. Next, genomic DNA was extracted from the cells using DNeasy Tissue Kit (QIAGEN).
Based on the known information (23K: NCBI ACCESSION No. YP — 39492.1) of the aspartate decarboxylase sequence derived from Lactobacillus sakei, two types of primers shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were prepared, and the resulting genomic DNA was used as a template. PCR was performed under the following conditions using KOD-plus polymerase (manufactured by TOYOBO). After holding at 94 ° C. for 2 minutes, thermal cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 40 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1.6 minutes were performed 30 cycles. As a result, an amplified fragment of about 1.6 kbp was obtained.
次に、得られた増幅断片を制限酵素処理（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）し、ｐＵＣ１８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳと命名した。 Next, the obtained amplified fragment was subjected to restriction enzyme treatment (EcoRI and PstI) and ligated to pUC18 (manufactured by Stratagene) to prepare a plasmid containing a gene encoding aspartate decarboxylase. This plasmid was named pLS.
次に、ｐＬＳを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ／ＤＨ５α）を作製した。作製した形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号１に示す。 Next, pLS was transformed into E. coli DH5α strain to prepare a transformant (pLS / DH5α) containing a gene encoding aspartate decarboxylase. The produced transformant was inoculated into LB broth (manufactured by Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin, aerated and stirred for 15 hours at 30 ° C., and the cells were collected by centrifugation. A plasmid was extracted from the microbial cells, a sample was prepared using BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems / HITACHI base analysis was used). The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
[参考例２]
＜Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（変異型脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
参考例１で獲得したｐＬＳを鋳型として、配列番号８と配列番号９のプライマーペアで、ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９６℃で１分間保持した後、９６℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサーマルサイクルを１６サイクル行った。得られたＰＣＲ反応液をＤｐｎＩ処理することで、鋳型としたｐＬＳを分解し、ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡを精製、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種した。得られた形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、得られた菌体からプラスミドを回収し、塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳ１と命名した。同様に、ｐＬＳを鋳型として、配列番号１０と配列番号１１のプライマーペアで、ＰＣＲ、その後の処理および塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドを、ｐＬＳ２と命名した。
[Reference Example 2]
<Production of a vector having an aspartate decarboxylase gene derived from Lactobacillus sakei (production of a vector for synthesizing mutant decarboxylase)>
Using pLS obtained in Reference Example 1 as a template, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 using KOD-plus polymerase (manufactured by TOYOBO) under the following conditions. After holding at 96 ° C. for 1 minute, 16 thermal cycles of 96 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 5 minutes were performed. The obtained PCR reaction solution is treated with DpnI to decompose pLS as a template, DNA contained in the PCR reaction solution is purified, transformed into E. coli DH5α, and an LB agar medium containing 0.1 mg / ml ampicillin Sowing. The obtained transformant was inoculated into LB broth (manufactured by Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin, aerated and stirred at 15 ° C. for 15 hours, and the plasmid was recovered from the obtained cells. The base sequence was analyzed, and a plasmid of about 4.5 kb containing a mutant of the gene encoding aspartate decarboxylase was prepared. This plasmid was named pLS1. Similarly, using pLS as a template, the primer pair of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 was subjected to PCR, subsequent treatment and analysis of the base sequence, and about 4.5 kb containing a mutant of the gene encoding aspartate decarboxylase. A plasmid was prepared. This plasmid was named pLS2.
次に、ｐＬＳ１を鋳型として、配列番号１０と配列番号１１のプライマーペアで、同様にＰＣＲ、その後の処理および塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳ３と命名した。 Next, using pLS1 as a template, PCR, subsequent treatment and base sequence analysis were similarly performed using the primer pair of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, and about 4 containing a mutant of a gene encoding aspartate decarboxylase. A .5 kb plasmid was prepared. This plasmid was named pLS3.
上記３種のプラスミド（ｐＬＳ１、ｐＬＳ２、ｐＬＳ３）をそれぞれ、宿主細胞である大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５α）を作製した。 Each of the above three plasmids (pLS1, pLS2, and pLS3) is transformed into E. coli DH5α strain which is a host cell, and transformants (pLS1 / DH5α, pLS2 / DH5α, pLS3) containing a gene encoding aspartate decarboxylase are used. / DH5α).
上記３種の形質転換体（ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５α）それぞれを、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって、菌体を回収した。
菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。ｐＬＳ１を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３に、ｐＬＳ２を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４に、ｐＬＳ３を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号５に示す。
Each of the above three transformants (pLS1 / DH5α, pLS2 / DH5α, pLS3 / DH5α) was inoculated into LB broth (manufactured by Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin and aerated at 30 ° C. for 15 hours. Stirring culture was performed, and the cells were collected by centrifugation.
A plasmid was extracted from the microbial cells, a sample was prepared using BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems / HITACHI base analysis was used). The amino acid sequence of a peptide synthesized using pLS1, the amino acid sequence of a peptide synthesized using pLS2 in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of a peptide synthesized using pLS3 in SEQ ID NO: 4, The number 5 is shown.
[参考例３]
＜Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ ＢＡＡ−９１を２５ｍＬのＡＴＣＣ培地＃２に植菌し、２６℃で数日嫌気培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。次に、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来アスパラギン酸デカルボキシラーゼ配列の公知情報（ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＺＰ＿０１８６６６４５.１）をもとに配列番号１２および配列番号１３に示した２種のプライマーを作製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒間、４０℃で３０秒間、６８℃で１．６分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った。その結果、約１．６ｋｂｐの増幅断片を得た。
[Reference Example 3]
<Production of a vector having an aspartate decarboxylase gene derived from Vibrio shilonii (production of a vector for synthesizing decarboxylase)>
Vibrio shilonii BAA-91 was inoculated into 25 mL of ATCC medium # 2, and anaerobic culture was performed at 26 ° C. for several days, and the cells were collected by centrifugation. Next, genomic DNA was extracted from the cells using DNeasy Tissue Kit (QIAGEN).
Based on the known information on the aspartate decarboxylase sequence derived from Vibrio shilonii (NCBI ACCESSION No. ZP — 01866645.1), two types of primers shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 were prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template for KOD -PCR was performed under the following conditions using plus polymerase (manufactured by TOYOBO). After holding at 94 ° C. for 2 minutes, thermal cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 40 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1.6 minutes were performed 30 cycles. As a result, an amplified fragment of about 1.6 kbp was obtained.
次に、得られた増幅断片を制限酵素処理（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）し、ｐＵＣ１８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＶＳと命名した。 Next, the obtained amplified fragment was subjected to restriction enzyme treatment (KpnI and BamHI) and ligated to pUC18 (manufactured by Stratagene) to prepare a plasmid containing a gene encoding aspartate decarboxylase. This plasmid was named pVS.
次に、ｐＶＳを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＶＳ／ＤＨ５α）を作製した。作製した形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号２に示す。 Next, pVS was transformed into Escherichia coli DH5α strain to prepare a transformant (pVS / DH5α) containing a gene encoding aspartate decarboxylase. The produced transformant was inoculated into LB broth (manufactured by Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin, aerated and stirred for 15 hours at 30 ° C., and the cells were collected by centrifugation. A plasmid was extracted from the microbial cells, a sample was prepared using BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems / HITACHI base analysis was used). The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
[参考例４]
＜アスパラギン酸デカルボキシラーゼ合成用大腸菌の製造＞
アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む５種の形質転換体（ｐＬＳ／ＤＨ５α、ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５αおよびｐＶＳ／ＤＨ５α）から抽出した５種のプラスミド（ｐＬＳ、ｐＬＳ１、ｐＬＳ２、ｐＬＳ３およびｐＶＳ）を、それぞれ、宿主細胞である大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０、ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０、ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を作製した。作製した形質転換体をそれぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
[Reference Example 4]
<Production of Escherichia coli for Aspartate Decarboxylase Synthesis>
Five plasmids (pLS, pLS1, pLS2) extracted from five transformants (pLS / DH5α, pLS1 / DH5α, pLS2 / DH5α, pLS3 / DH5α and pVS / DH5α) containing a gene encoding aspartate decarboxylase , PLS3 and pVS) are transformed into host cells E. coli K12W3110 strain (ATCC27325), respectively, and transformants containing the gene encoding aspartate decarboxylase (pLS / W3110, pLS1 / W3110, pLS2 / W3110, pLS3 / W3110, pVS / W3110) were prepared. Each of the produced transformants was inoculated into LB broth (manufactured by Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin, aerated and stirred for 15 hours at 30 ° C., and the cells were collected by centrifugation.
[参考例５]
＜アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有さない大腸菌の製造＞
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）に、ｐＵＣ１８を形質転換し、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を作製した。作製した形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
[Reference Example 5]
<Production of Escherichia coli not having a gene encoding aspartate decarboxylase>
Escherichia coli K12W3110 (ATCC27325) was transformed with pUC18 to produce a transformant (pUC18 / W3110). The produced transformant (pUC18 / W3110) was inoculated into LB broth (Difco) containing 0.1 mg / ml ampicillin, aerated and stirred at 30 ° C. for 15 hours, and the cells were collected by centrifugation. did.
＜グルタミン酸からの２−アミノブタン酸の合成＞
[実施例１]
上記方法により得た形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いて、グルタミン酸を原料として２−アミノブタン酸の合成を行った。
グルタミン酸（ＳＩＧＭＡ社製）０．０２ｍｍｏｌ／ｇ、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）０．０６ｍｍｏｌ／ｇ、リン酸ピリドキサール（第一製薬社製）０．０００８ｍｍｏｌ／ｇに、形質転換体の１０％菌体懸濁液０．１gを添加して、２８℃で反応した。反応液はＬＣ-ＭＳおよびＨＰＬＣを用いて分析した。
<Synthesis of 2-aminobutanoic acid from glutamic acid>
[Example 1]
Using the transformant (pLS / W3110) obtained by the above method, synthesis of 2-aminobutanoic acid was performed using glutamic acid as a raw material.
Glutamic acid (manufactured by SIGMA) 0.02 mmol / g, 3-morpholinopropanesulfonic acid (manufactured by DOJINDO) 0.06 mmol / g, and pyridoxal phosphate (manufactured by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.0008 mmol / g 0.1 g of 10% bacterial cell suspension was added and reacted at 28 ° C. The reaction solution was analyzed using LC-MS and HPLC.
[実施例２]
＜ＬＣ-ＭＳ分析＞
上記反応液を純水に溶解した後、ＬＣ−ＭＳ分析に供し、マススペクトルを取得した。ＬＣ−ＭＳ分析は、以下の条件で行った。２−アミノブタン酸の標品は、ＳＩＧＭＡ社製Ａ１８７９を用いた。
カラム：Ｘ−ＴｅｒｒａＭＳ１８ ５０×２．１ｍｍＩ．Ｄ．（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３５℃
キャリア：Ａ：ＣＨ３ＣＮ、Ｂ：Ｈ２Ｏ、Ｃ：２ｍＭＩＣＰＰ-ＭＳ-７含有１０ｖｏｌ％ＣＨ３ＣＮａｑ
グラジエント：Ａ／Ｂ／Ｃ＝０／５０／５０〜１５／３５／５０
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
検出：質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＳＱｄｅｔｅｃｔｏｒ）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
[Example 2]
<LC-MS analysis>
After the reaction solution was dissolved in pure water, it was subjected to LC-MS analysis to obtain a mass spectrum. LC-MS analysis was performed under the following conditions. As a preparation of 2-aminobutanoic acid, A1879 manufactured by SIGMA was used.
Column: X-TerraMS18 50 × 2.1 mmI. D. (Waters)
Column temperature: 35 ° C
Carrier: A: CH 3 CN, B: H 2 O, C: 10 vol% CH 3 CNaq containing 2 mM ICPP-MS-7
Gradient: A / B / C = 0/50/50 to 15/35/50
Flow rate: 0.3 ml / min
Detection: Mass spectrometer (manufactured by Waters, SQdetector)
Ionization method: Electrospray ionization method
得られたマススペクトルより、定性分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液のマススペクトルには標品と同等のｍ／ｚ値および同位体比を示すピークが検出され、グルタミン酸から、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いて、２−アミノブタン酸が合成されたことが示された。 Qualitative analysis was performed from the obtained mass spectrum. As a result, in the mass spectrum of the reaction solution using the transformant (pLS / W3110), a peak showing the same m / z value and isotope ratio as the standard product was detected, and the transformant (pLS / W) was detected from glutamic acid. W3110) was used to show that 2-aminobutanoic acid was synthesized.
[実施例３]
＜ＨＰＬＣ分析＞
上記反応液を、ＨＰＬＣ分析に供し、クロマトグラムを取得した。ＨＰＬＣ分析は、以下の条件で行った。２−アミノブタン酸の標品は、ＳＩＧＭＡ社製Ａ１８７９を用いた。
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ３ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
カラム温度：４０℃
キャリア：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ：ＣＨ３ＣＯＯＨ＝２：３ ５ｍＭ ＣＨ３(ＣＨ２)７ＳＯ３Ｎａ
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ（キャリア）、０．４ｍｌ／ｍｉｎ（ＯＰＡ）
検出：蛍光検出器（オルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム誘導体化法、ＪＡＳＣＯ社製、Ｘ−ＬＣ３１２０ＦＰ）
[Example 3]
<HPLC analysis>
The reaction solution was subjected to HPLC analysis to obtain a chromatogram. The HPLC analysis was performed under the following conditions. As a preparation of 2-aminobutanoic acid, A1879 manufactured by SIGMA was used.
Column: Inertsil ODS3 250 × 4.6 mmI. D. (GL Science)
Column temperature: 40 ° C
Carrier: 0.1 M CH 3 COONa: CH 3 COOH = 2: 3 5 mM CH 3 (CH 2 ) 7 SO 3 Na
Flow rate: 0.8 ml / min (carrier), 0.4 ml / min (OPA)
Detection: Fluorescence detector (post-column derivatization method using orthophthalaldehyde, manufactured by JASCO, X-LC3120FP)
得られたクロマトグラムより定量分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、４．８μｇ/ｇの２−アミノブタン酸が生成していることが示された。 Quantitative analysis was performed from the obtained chromatogram. As a result, it was shown that 4.8 μg / g of 2-aminobutanoic acid was produced in the reaction solution using the transformant (pLS / W3110).
[実施例４]
実施例１、２および３と同様の方法で、３種の形質転換体（ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０）を用いてそれぞれ反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、いずれの反応液においても実施例１、２および３と同程度の２−アミノブタン酸が生成していることが示された。
[Example 4]
In the same manner as in Examples 1, 2, and 3, reaction, LC-MS analysis, and HPLC analysis were performed using three types of transformants (pLS1 / W3110, pLS2 / W3110, and pLS3 / W3110), respectively. As a result, 2-aminobutanoic acid of the same level as in Examples 1, 2, and 3 was produced in the reaction solutions using the transformants (pLS1 / W3110, pLS2 / W3110, pLS3 / W3110). It was shown that
[実施例５]
実施例１、２および３と同様の方法で、形質転換体（ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を用いて、反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、７．８μｇ/ｇの２−アミノブタン酸が生成していることが示された。
[Example 5]
In the same manner as in Examples 1, 2, and 3, reaction, LC-MS analysis, and HPLC analysis were performed using the transformant (pVS / W3110). As a result, it was shown that 7.8 μg / g of 2-aminobutanoic acid was produced in the reaction solution using the transformant (pVS / W3110).
[比較例１]
実施例１、２および３と同様の方法で、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を用いて、反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、２−アミノブタン酸が生成していないことが示された。
[Comparative Example 1]
In the same manner as in Examples 1, 2, and 3, reaction, LC-MS analysis, and HPLC analysis were performed using the transformant (pUC18 / W3110). As a result, it was shown that 2-aminobutanoic acid was not produced in the reaction solution using the transformant (pUC18 / W3110).
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