JP6488264B2 - NIK inhibitor - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の生存、増殖に必要な遺伝子を発現させる転写因子であるＮｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ （ＮＦ−κＢ）の活性を調節するＮｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ （ＮＩＫ）を特異的に阻害する薬剤を提供する。 The present invention specifically inhibits nuclear factor kappa B-inducing kinase (NIK), which regulates the activity of nuclear factor kappa B (NF-κB), a transcription factor that expresses genes necessary for cell survival and proliferation. Provide drugs.
Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ （ＮＦ−κＢ）は、細胞の生存、増殖に必要な遺伝子を発現させる転写因子であり、この因子の活性制御異常は、がん、炎症性疾患などの原因となる。Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ （ＮＩＫ）はセリン／スレオニンキナーゼで、ＮＦ−κＢの活性化を調節する重要な因子である。 Nuclear factor kappa B (NF-κB) is a transcription factor that expresses a gene required for cell survival and proliferation. Abnormal activity control of this factor causes cancer, inflammatory diseases, and the like. Nuclear factor kappa B-inducing kinase (NIK) is a serine / threonine kinase and an important factor that regulates the activation of NF-κB.
ＮＩＫを阻害する薬剤は、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している疾患に対して有効である可能性が考えられるが、ＮＩＫを特異的に阻害する薬剤はほとんどなく、実臨床においては存在しない。 Drugs that inhibit NIK may be effective against diseases in which NF-κB is constitutively activated, but there are few drugs that specifically inhibit NIK, and there is no clinical practice .
特許文献１には、ＮＩＫ阻害剤として用いて抗ＮＩＫ抗体を用いた技術が開示されている。特許文献１では、ＮＩＫ由来のペプチドを複数種用い、ＮＩＫに特異的に結合するモノクロナール抗体を得ている。 Patent Document 1 discloses a technique using an anti-NIK antibody as an NIK inhibitor. In Patent Document 1, a plurality of NIK-derived peptides are used to obtain a monoclonal antibody that specifically binds to NIK.
特許文献２および特許文献３は、合成によって得られるピラゾロイソキノリン誘導体が、ＮＩＫ阻害効果があることを開示している。 Patent Document 2 and Patent Document 3 disclose that a pyrazoloisoquinoline derivative obtained by synthesis has a NIK inhibitory effect.
特許文献４もＮＩＫを阻害する一連の合成化合物を示している。 Patent Document 4 also shows a series of synthetic compounds that inhibit NIK.
本発明は安価に入手できる材料を用いたＮＩＫ阻害剤を提供することを目的とする。本発明の目的は、がんの発生及び進行などに関与するＮＦ−κＢ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ（ＮＩＫ）の活性化を抑制し、ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ（ＩＫＫ）／ＮＦ−κＢ経路を調節することで、当該経路が関与する疾患を予防及び治療する効能を有する薬剤を提供する。ＮＩＫ／ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ系阻害物質を含有する医薬組成物はＮＦ−κＢが恒常的に活性化しているがん、炎症性疾患を予防及び治療することができる。 An object of this invention is to provide the NIK inhibitor using the material which can be obtained cheaply. An object of the present invention is to suppress the activation of NF-κB inducing kinase (NIK) involved in the development and progression of cancer and regulate the IκB kinase (IKK) / NF-κB pathway so that the pathway is Provided is a drug having an effect of preventing and treating a disease involved. A pharmaceutical composition containing a NIK / IKK / NF-κB system inhibitor can prevent and treat cancers and inflammatory diseases in which NF-κB is constantly activated.
本発明者らは、上記の課題を解決すべくＮＩＫを阻害する化合物を探索したところ、マンギフェリンがＮＩＫの阻害作用を有し、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化しているがんに対して細胞死を誘導することを見出し、発明を完成させた。 The present inventors searched for a compound that inhibits NIK in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, cells against cancer in which mangiferin has an inhibitory action on NIK and NF-κB is constantly activated. The inventor found out that death was induced and completed the invention.
すなわち、本発明に係るＮＩＫ阻害剤は、マンギフェリンを有効成分とする多発性骨髄
腫または悪性黒色腫治療のためのものであることを特徴とする。
That is, the NIK inhibitor according to the present invention is characterized in that it is for the treatment of multiple myeloma or malignant melanoma containing mangiferin as an active ingredient.
本発明によれば、ＮＩＫを阻害することで多発性骨髄腫及び悪性黒色腫をはじめとするＮＦ−κＢが恒常的に活性化している悪性腫瘍に対して有用な医薬組成物を提供することができる。また現在、ＮＩＫを特異的阻害する薬剤はほとんどなく、実臨床においては存在しない。本発明はＮＩＫを特異的に阻害することでその下流のＩＫＫ／ＮＦ−κＢ経路を抑制することから、新たながん分子標的薬として有用である。 According to the present invention, it is possible to provide a pharmaceutical composition useful for malignant tumors in which NF-κB is constantly activated, such as multiple myeloma and malignant melanoma, by inhibiting NIK. it can. At present, there are few drugs that specifically inhibit NIK, and there is no actual clinical practice. Since the present invention specifically inhibits NIK and suppresses the downstream IKK / NF-κB pathway, it is useful as a new cancer molecule targeting drug.
以下に本発明に係るＮＩＫ阻害剤について説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。 The NIK inhibitor according to the present invention will be described below. In addition, the following description is the illustration about one embodiment and one Example of this invention, Comprising: This invention is not limited to the following description. The following embodiments can be modified without departing from the spirit of the present invention.
本発明に係るＮＩＫ阻害剤はマンギフェリンを有効成分として含む。マンギフェリンは、トンガの伝統民間薬であるオンガエルの葉の主成分で、抗炎症作用があることが確認されている。マンギフェリン（Ｃ１９Ｈ１８Ｏ１１：体系名：２−β−Ｄ−グルコピラノシル−１，３，６，７−テトラヒドロキシ−９Ｈ−キサンテン−９−オン２，３，６，８−テトラヒドロキシ−７−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−９Ｈ−キサンテン−９−オン）は、コタラヒム（学名Ｓａｌａｃｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）やマンゴー（学名Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）にも多く含まれている物質で、（１）式の構造を有している。 The NIK inhibitor according to the present invention contains mangiferin as an active ingredient. Mangiferin is the main component of Onga frog leaves, a traditional folk medicine of Tonga, and has been confirmed to have anti-inflammatory effects. Mangiferin (C 19 H 18 O 11 : System name: 2-β-D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxy-9H-xanthen-9-one 2,3,6,8-tetrahydroxy-7 -(Β-D-glucopyranosyl) -9H-xanthen-9-one) is a substance that is also included in many of Kotarahim (scientific name Salacia reticulata) and mango (scientific name Mangifera indica) and has the structure of formula (1). doing.
マンギフェリンは、主としてマンゴーから抽出するのが簡単である。マンギフェリンはこれまで糖尿病や抗肥満作用に効果があるとされていたので、抽出方法も溶媒抽出だけでなく、亜臨界水を用いたものまで、さまざまな研究がされている。 Mangiferin is easy to extract mainly from mango. Mangiferin has been considered to have an effect on diabetes and anti-obesity, so various studies have been conducted on not only solvent extraction but also subcritical water.
マンギフェリンは、比較的低分子量化合物で、水に良く溶け、経口摂取が可能である。本発明に係るＮＩＫ阻害剤はマンギフェリンを有効成分として含む。またその他の薬剤として許容される成分を含んでいて良い。 Mangiferin is a relatively low molecular weight compound that dissolves well in water and can be taken orally. The NIK inhibitor according to the present invention contains mangiferin as an active ingredient. Moreover, the component accept | permitted as another chemical | medical agent may be included.
ここで有効成分とは、ＮＩＫ阻害作用を発揮する程度の量が含まれていれば足りる。また、本発明は癌若しくは炎症性疾患の予防薬、治療薬として用いてもよい。 Here, the active ingredient is sufficient if it contains an amount that exhibits NIK inhibitory action. The present invention may also be used as a preventive or therapeutic agent for cancer or inflammatory diseases.
医薬組成物としての形態は特に限定されるものではなく、カプセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等で提供される。 The form as a pharmaceutical composition is not particularly limited, and capsules, granules, solutions, emulsions, suspensions, powders, tablets, liquids, soaking agents, decoction, troches, fluid extracts, tinctures , Eye drops, nasal drops, ointments, creams, lotions, injections, suppositories and the like.
また、本発明は加工食品若しくは補助食品として用いてもよい。加工食品若しくは補助食品（以下「加工食品等」と呼ぶ。）に含まれるマンギフェリンの量はＮＩＫ阻害作用を発揮する程度の量が含まれていれば足りる。 Moreover, you may use this invention as processed food or a supplementary food. The amount of mangiferin contained in the processed food or supplement (hereinafter referred to as “processed food etc.”) is sufficient if it contains an amount that exerts an NIK inhibitory action.
加工食品としては、例えば、飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等といった一般加工食品だけでなく、軟エキス剤、乾燥エキス剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤といったエキス剤や、アルコール飲料を含んでもよい。以下実施例に基づいて本発明に係るＮＩＫ阻害剤を説明する。 Processed foods include, for example, rice cake, gum, jelly, biscuits, cookies, rice crackers, bread, noodles, fish and meat paste products, tea, soft drinks, coffee drinks, milk drinks, whey drinks, lactic acid bacteria drinks, yogurt, ice cream Not only general processed foods such as cream and pudding, but also extracts such as soft extract, dry extract, capsule, granule, powder, tablet, liquid, soaking agent, decoction, troche, flow extract, tincture, Alcoholic beverages may be included. The NIK inhibitor according to the present invention will be described below based on examples.
＜実施例１：マンギフェリン投与によるＮＩＫ活性化阻害の検討＞
多発性骨髄腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いて、マンギフェリン投与によるＮＩＫ阻害作用について、イムノブロッティングで検討した結果、ＮＩＫの活性化阻害を認めた（図１）。
<Example 1: Examination of NIK activation inhibition by administration of mangiferin>
As a result of investigating the NIK inhibitory effect by administration of mangiferin by immunoblotting using IM9 cell which is a multiple myeloma cell line, NIK activation inhibition was recognized (FIG. 1).
ＩＭ９細胞、を１５０ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養したもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＩＭ９細胞を１５０ｃｍ２フラスコに播種し、２４時間前培養後、ＩＭ９細胞にマンギフェリンを最終濃度が０、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬになるように添加し３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で７２時間培養した。この培養液から細胞溶解液にてタンパク質を抽出し、サンプルとした。なお、最終濃度が０μｇ／ｍＬとは、マンギフェリンを溶解した溶媒だけをいれたもの（Ｖｅｈｉｃｌｅ）である。 IM9 cells were seeded in a 150 cm 2 flask, cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 72 hours (Control), and IM9 cells were seeded in a 150 cm 2 flask. After 24 hours of pre-culture, IM9 cells were Mangiferin was added to final concentrations of 0, 5, 10, 25, and 50 μg / mL, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 72 hours. Protein was extracted from this culture solution with a cell lysate to prepare a sample. The final concentration of 0 μg / mL is a vehicle containing only a solvent in which mangiferin is dissolved (Vehicle).
各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体および抗ＮＩＫ抗体を用いてＮＩＫのリン酸化を検討した。 Each sample was transferred to a PVDF membrane after SDS-PAGE, and phosphorylation of NIK was examined using an anti-phospho-NIK antibody and an anti-NIK antibody.
イムノブロッティングの結果を図１に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬ添加された場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体の場合（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と表示した）および抗ＮＩＫ抗体の場合（「ＮＩＫ」と表示した）を示した。抗ＮＩＫ抗体の写真では、全てのサンプルのアッセイ結果に違いはなかった。一方、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体の場合は、マンギフェリンの添加量が増えるに連れて、イムノブロッティングの写真が薄くなった。 The result of immunoblotting is shown in FIG. In the horizontal direction of the photograph, cases where Control, Vehicle, and Mangiferin were added at 5, 10, 25, and 50 μg / mL were shown side by side. In the vertical direction, antibody species are shown. Specifically, the case of anti-phospho-NIK antibody (indicated as “Phospho-NIK”) and the case of anti-NIK antibody (indicated as “NIK”) are shown. In the anti-NIK antibody photographs, there was no difference in the assay results of all samples. On the other hand, in the case of anti-phospho-NIK antibody, as the amount of mangiferin added increased, the immunoblotting photograph became thinner.
より具体的には、マンギフェリンが添加されていないＣｏｎｔｒｏｌとＶｅｈｉｃｌｅよりも、マンギフェリンが５μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬ添加されたサンプルのイムノブロッティングの結果は薄くなった。また、マンギフェリンが５μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬよりもマンギフェリンが２５μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬの方が、サンプルのイムノブロッティングの結果はより薄かった。 More specifically, the results of immunoblotting of the samples to which mangiferin was added at 5 μg / mL and 10 μg / mL were thinner than those from Control and Vehicle to which mangiferin was not added. Moreover, the results of immunoblotting of the samples were thinner with mangiferin at 25 μg / mL and 50 μg / mL than with mangiferin at 5 μg / mL and 10 μg / mL.
＜実施例２：マンギフェリン投与によるＮＩＫの下流シグナルの検討＞
マンギフェリン投与により、ＮＩＫの下流シグナルであるＩＫＫ、ＩκＢ、ＮＦ−κＢの活性動態について、イムノブロッティングで検討した結果、ＩＫＫ、ＩκＢの活性化阻害、ＩκＢの発現増加、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の核移行阻害を認めた（図２）。
<Example 2: Examination of downstream signal of NIK by administration of mangiferin>
The activity of IKK, IκB, and NF-κB, which are downstream signals of NIK, was examined by immunoblotting by administration of mangiferin. Inhibition of nuclear translocation was observed (FIG. 2).
実施例１と同様にＣｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの６種のサンプルを用意し、各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体および抗ＩＫＫ抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体および抗ＩκＢ抗体、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体および抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体、抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００抗体および抗ＮＦ−κＢ２ｐ５２抗体、および抗β−ａｃｔｉｎ抗体を用いてアッセイを行った。 As in Example 1, six samples of Control, Vehicle, and Mangiferin were prepared at 5, 10, 25, and 50 μg / mL, and each sample was transferred to a PVDF membrane after SDS-PAGE, and an anti-phospho-IKK antibody and Anti-IKK antibody, anti-phospho-IκB antibody and anti-IκB antibody, anti-NF-κBp65 antibody and anti-NF-κBp52 antibody, anti-LaminA / C antibody, anti-NF-κBp65 antibody, anti-NF-κB2p100 antibody and anti-NF-κB2p52 antibody, Assays were also performed using anti-β-actin antibodies.
イムノブロッティングの結果を図２に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ」と記載）、抗ＩκＢ抗体（「ＩκＢ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（「ＬａｍｉｎＡ／Ｃ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）である。 The result of immunoblotting is shown in FIG. In the lateral direction of the photograph, cases of Control, Vehicle, and Mangiferin of 5, 10, 25, and 50 μg / mL are shown side by side. In the vertical direction, antibody species are shown. Specifically, an anti-phospho-IKK antibody (described as “Phospho-IKK”), an anti-IKK antibody (described as “IKK”), an anti-phospho-IκB antibody (described as “Phospho-IκB”), an anti-IκB antibody ( “IκB”), anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65nuclear”), anti-NF-κBp52 antibody (described as “NF-κBp52nuclear”), anti-LaminA / C antibody (described as “LaminA / C”) ), Anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65 cytoplasm”), anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as “NF-κB2p100 cytoplasm”), anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as “NF-κB2p52 cytoplasm”) And anti-β-actin antibodies Is a description) and "β-actin".
なお、ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒとＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒは、それぞれ核内のＮＦ−κＢｐ６５とＮＦ−κＢｐ５２を表す。また、ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍとＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍとＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍは、それぞれ細胞質内のＮＦ−κＢｐ６５、ＮＦ−κＢ２ｐ１００、ＮＦ−κＢ２ｐ５２である。また、ＮＦ−κＢ２ｐ１００とＮＦ−κＢ２ｐ５２の検出は同一の抗体を使用している。したがって、これを「抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体」とした。 In addition, NF-κBp65 nuclear and NF-κBp52 nuclear represent NF-κBp65 and NF-κBp52 in the nucleus, respectively. NF-κBp65 cytoplasm, NF-κB2p100 cytoplasm, and NF-κB2p52 cytoplasm are NF-κBp65, NF-κB2p100, and NF-κB2p52 in the cytoplasm, respectively. Moreover, the same antibody is used for the detection of NF-κB2p100 and NF-κB2p52. Therefore, this was designated as “anti-NF-κB2p100 / p52 antibody”.
また、細胞から核と細胞質基質を分離するのは、メルク株式会社製のＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標） Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて細胞質分画および核分画を抽出した。 In addition, separation of the nucleus and the cytoplasmic substrate from the cells was performed by extracting the cytoplasmic fraction and the nuclear fraction using a ProteoExtract (registered trademark) Subcellular Proteome Extraction Kit manufactured by Merck Co., Ltd.
抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）を参照して、ＩＫＫ自体は、マンギフェリンの添加量に係らず一定であった。しかし、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体では、マンギフェリンの添加量が多くなると、イムノブロッティングの結果では影が薄くなり、マンギフェリンが２５μｇ／ｍＬ以上では、影がなくなった。これは、マンギフェリンの添加量が２５μｇ／ｍＬ以上になると、ＩＫＫのリン酸化が行われなくなったことを示す。 Referring to the anti-phospho-IKK antibody (described as “Phospho-IKK”) and the anti-IKK antibody (described as “IKK”), IKK itself was constant regardless of the amount of mangiferin added. However, in the anti-phospho-IKK antibody, when the amount of mangiferin added was increased, the shadow was lightened as a result of immunoblotting, and when the amount of mangiferin was 25 μg / mL or more, the shadow disappeared. This indicates that phosphorylation of IKK was not performed when the amount of mangiferin added was 25 μg / mL or more.
次に抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ」と記載）および抗ＩκＢ抗体（「ＩκＢ」と記載）を参照する。ＩκＢは、写真ではわかりにくいが、マンギフェリンの添加量が増加するにしたがって増加した（写真では影が濃くなった。）。一方、リン酸化ＩκＢはマンギフェリンの添加量の増大に応じて減少し、マンギフェリンが２５μｇ／ｍＬ以上になると、ほとんどなくなった（写真上で影はなくなる。）。 Reference is now made to anti-phospho-IκB antibody (described as “Phospho-IκB”) and anti-IκB antibody (described as “IκB”). Although IκB was difficult to see in the photograph, it increased as the amount of mangiferin added increased (the shadow became darker in the photograph). On the other hand, phosphorylated IκB decreased with an increase in the amount of mangiferin added and almost disappeared when the amount of mangiferin was 25 μg / mL or more (the shadow disappeared on the photograph).
ＩＫＫはＩκＢキナーゼであるので、ＩＫＫが活性化されなければ、ＩκＢも活性化されない。活性化されていないＩκＢの増加もこの現象を裏づけている。この結果は、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）の結果と対応するものである。 Since IKK is an IκB kinase, if IKK is not activated, IκB is not activated. The increase in unactivated IκB also supports this phenomenon. This result corresponds to the results of anti-phospho-IKK antibody (described as “Phospho-IKK”) and anti-IKK antibody (described as “IKK”).
次に細胞核内物質に対する抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）および抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（「ＬａｍｉｎＡ／Ｃ」と記載）を参照する。ＬａｍｉｎＡ／Ｃは、マンギフェリンの添加量に係らず存在しているが、核内のＮＦ−κＢｐ６５は、マンギフェリンを５μｇ／ｍＬ添加しただけでも、ほとんど存在を認められなくなった。写真としては影が見えない。また、核内のＮＦ−κＢｐ５２は、マンギフェリンの添加量の増加にしたがって、減少した（影が薄くなった）。 Next, anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65 nuclear”), anti-NF-κBp52 antibody (described as “NF-κBp52 nuclear”) and anti-LaminA / C antibody (described as “LaminA / C”) against intracellular substances Refer to LaminA / C is present regardless of the amount of mangiferin added, but NF-κBp65 in the nucleus was hardly observed even when 5 μg / mL of mangiferin was added. The shadow is not visible as a photograph. Moreover, NF-κBp52 in the nucleus decreased (the shadow became lighter) as the amount of mangiferin added increased.
ラミン（Ｌａｍｉｎ）は、細胞核内で構造の維持と転写の調節を行う繊維状タンパク質である。したがって、全てのサンプルで核内物質を検出している状態で、マンギフェリンを添加した場合には核内のＮＦ−κＢｐ６５やＮＦ−κＢｐ５２は存在しない若しくは、存在しても非常に少ないことを示している。 Lamin is a fibrous protein that maintains structure and regulates transcription in the cell nucleus. Therefore, when mangiferin is added in the state in which nuclear substances are detected in all samples, NF-κBp65 and NF-κBp52 in the nucleus are not present or are present even if they are present. Yes.
一方、細胞質基質に対する抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）を参照する。細胞質内のＮＦ−κＢｐ６５およびβ−ａｃｔｉｎは、マンギフェリンの添加量に係らず、存在が確認された。ＮＦ−κＢは、制御タンパク質であるＩκＢと結合した状態で細胞質内に存在し、ＩκＢの分解によりＮＦ−κＢが活性化されて核内へと移行し、炎症性サイトカインや接着分子などの標的遺伝子の発現を制御する転写因子として機能することが知られている。 On the other hand, an anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65 cytoplasm”), an anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as “NF-κB2p100 cytoplasm”), an anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (“NF-κB2p52cyp”) against the cytoplasmic substrate. And an anti-β-actin antibody (denoted “β-actin”). The presence of NF-κBp65 and β-actin in the cytoplasm was confirmed regardless of the amount of mangiferin added. NF-κB is present in the cytoplasm in a state of being bound to IκB, which is a control protein, and NF-κB is activated by the degradation of IκB and moves into the nucleus, and target genes such as inflammatory cytokines and adhesion molecules It is known to function as a transcription factor that regulates the expression of.
上記の結果は、マンギフェリンが添加されていない状況では、細胞質内に存在しているＮＦ−κＢが核内に移動するが、マンギフェリンの添加によって、ＮＦ−κＢの核内移動が抑制されていることを示している。 The above results show that, in the situation where mangiferin is not added, NF-κB existing in the cytoplasm moves into the nucleus, but the addition of mangiferin suppresses NF-κB from moving into the nucleus. Is shown.
細胞質基質内のＮＦ−κＢ２ｐ１００は、マンギフェリンの添加にしたがって、増加しているように観察された（影が濃くなった）。一方、細胞質基質内のＮＦ−κＢ２ｐ５２は、マンギフェリンの添加にしたがって、減少しているように観察された（影が薄くなった）。ＮＦ−κＢ２ｐ１００はＩＫＫαの活性によりプロセシングされＮＦ−κＢ２ｐ５２に限定分解されると活性することが知られている。 NF-κB2p100 in the cytoplasmic substrate was observed to increase with the addition of mangiferin (shaded). On the other hand, NF-κB2p52 in the cytoplasmic substrate was observed to decrease with the addition of mangiferin (the shadow became lighter). It is known that NF-κB2p100 is processed by the activity of IKKα and becomes active when limited to NF-κB2p52.
したがって、図２の結果は、マンギフェリンの増加によって、ＮＦ−κＢ２の活性も抑制されていることを示している。これはリン酸化されたＩＫＫ（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」）がマンギフェリンの添加量を増やすと減少する（ＩＫＫの活性が低下する）こととも対応している。 Therefore, the result of FIG. 2 shows that the activity of NF-κB2 is also suppressed by the increase of mangiferin. This also corresponds to the fact that phosphorylated IKK (“Phospho-IKK”) decreases (increases IKK activity) when the amount of mangiferin added is increased.
なお、β−ａｃｔｉｎはマンギフェリンの増加があっても、量に変化はなかった。細胞骨格を形成するβ−ａｃｔｉｎに変化が無かったことから、細胞のプレパレーションからイムノブロッティング法の過程において、誤差要因は入らなかったと考えられる。 Note that the amount of β-actin did not change even when mangiferin increased. Since there was no change in β-actin forming the cytoskeleton, it is considered that no error factor was introduced in the process of immunoblotting from the preparation of cells.
＜実施例３：マンギフェリン投与による生存シグナルの検討＞
マンギフェリン投与によるＮＩＫ／ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ経路以外の生存シグナル因子であるＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲの活性動態について、イムノブロッティングで検討した結果、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲの活性動態に変化を認めなかった（図３）。
<Example 3: Examination of survival signal by administration of mangiferin>
The activity kinetics of ERK, JNK and mTOR, which are survival signal factors other than the NIK / IKK / NF-κB pathway by administration of mangiferin, were examined by immunoblotting. As a result, no change was observed in the activity kinetics of ERK, JNK and mTOR ( FIG. 3).
実施例１と同様にＣｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの６種のサンプルを用意し、各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体および抗ＥＲＫ１／２抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体および抗ＪＮＫ１／２抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体および抗ｍＴＯＲ抗体を用いてアッセイを行った。 In the same manner as in Example 1, 6 types of samples of Control, Vehicle, and Mangiferin were prepared at 5, 10, 25, and 50 μg / mL. Each sample was transferred to a PVDF membrane after SDS-PAGE, and anti-phospho-ERK1 / 2. Assays were performed using antibodies and anti-ERK1 / 2 antibodies, anti-phospho-JNK1 / 2 antibodies and anti-JNK1 / 2 antibodies, anti-phospho-mTOR antibodies and anti-mTOR antibodies.
イムノブロッティングの結果を図３に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２」と記載）および抗ＥＲＫ１／２抗体（「ＥＲＫ１／２」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２」と記載）および抗ＪＮＫ１／２抗体（「ＪＮＫ１／２」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ」と記載）および抗ｍＴＯＲ抗体（「ｍＴＯＲ」と記載）である。 The result of immunoblotting is shown in FIG. In the lateral direction of the photograph, cases of Control, Vehicle, and Mangiferin of 5, 10, 25, and 50 μg / mL are shown side by side. In the vertical direction, antibody species are shown. Specifically, anti-phospho-ERK1 / 2 antibody (described as “Phospho-ERK1 / 2”), anti-ERK1 / 2 antibody (described as “ERK1 / 2”), anti-phospho-JNK1 / 2 antibody (“Phospho-”) JNK1 / 2 ”and anti-JNK1 / 2 antibody (described as“ JNK1 / 2 ”), anti-phospho-mTOR antibody (described as“ Phospho-mTOR ”) and anti-mTOR antibody (described as“ mTOR ”). .
図３を参照する。抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２」と記載）および抗ＥＲＫ１／２抗体（「ＥＲＫ１／２」と記載）を参照して、ＥＲＫ１／２も、リン酸化したＥＲＫ１／２もマンギフェリンの添加に係らず一定であった。 Please refer to FIG. With reference to anti-phospho-ERK1 / 2 antibody (described as “Phospho-ERK1 / 2”) and anti-ERK1 / 2 antibody (described as “ERK1 / 2”), both ERK1 / 2 and phosphorylated ERK1 / 2 It was constant regardless of the addition of mangiferin.
抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２」と記載）および抗ＪＮＫ１／２抗体（「ＪＮＫ１／２」と記載）を参照して、ＪＮＫ１／２も、リン酸化したＪＮＫ１／２もマンギフェリンの添加に係らず一定であった。 With reference to anti-phospho-JNK1 / 2 antibody (described as “Phospho-JNK1 / 2”) and anti-JNK1 / 2 antibody (described as “JNK1 / 2”), both JNK1 / 2 and phosphorylated JNK1 / 2 It was constant regardless of the addition of mangiferin.
抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ」と記載）および抗ｍＴＯＲ抗体（「ｍＴＯＲ」と記載）を参照して、ｍＴＯＲも、リン酸化したｍＴＯＲもマンギフェリンの添加に係らず一定であった。 With reference to anti-phospho-mTOR antibody (described as “Phospho-mTOR”) and anti-mTOR antibody (described as “mTOR”), both mTOR and phosphorylated mTOR were constant regardless of the addition of mangiferin.
ＥＲＫ１／２およびＪＮＫ１／２はともに分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）と呼ばれているシグナル系列の物質である。またｍＴＯＲは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の中の物質で、細胞分裂や細胞死や血管新生やエネルギー産生などに作用してがん細胞の増殖を促進するといわれている。マンギフェリンはこれらのシグナル系列の物質には、なんの影響も与えなかった。 Both ERK1 / 2 and JNK1 / 2 are signal series substances called mitogen-activated protein kinases (MAP kinases). MTOR is a substance in the PI3K / Akt / mTOR pathway, and is said to act on cell division, cell death, angiogenesis, energy production, and the like to promote cancer cell growth. Mangiferin had no effect on these signal series substances.
＜実施例４：マンギフェリンの細胞死誘導効果の検討＞
多発性骨髄腫細胞株を用いて、マンギフェリンによる細胞死誘導効果について、トリパンブルーダイ法で検討した結果、図４に示されるように、全ての多発性骨髄腫細胞株においてマンギフェリンにより細胞死誘導効果を認めた。
<Example 4: Examination of cell death-inducing effect of mangiferin>
As a result of examining the cell death inducing effect by mangiferin by the trypan blue dye method using multiple myeloma cell lines, as shown in FIG. 4, the cell death inducing effect by mangiferin in all the multiple myeloma cell lines. Admitted.
ＩＭ９細胞（多発性骨髄腫細胞株）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞株）、ＡＲＨ−７７細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞株）を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種後、各濃度のマンギフェリンを添加し、トリパンブルーダイ法により細胞生存率を測定した。結果を図４から図６に示す。 After seeding IM9 cells (multiple myeloma cell lines), RPMI8226 cells (human multiple myeloma cell lines), ARH-77 cells (human multiple myeloma cell lines) in 96-well plate, each concentration of mangiferin was added. The cell viability was measured by the trypan blue dye method. The results are shown in FIGS.
ＩＭ９細胞、ＲＰＭＩ８２２６細胞、ＡＲＨ−７７細胞ともに５％ＣＯ２、３７℃の条件で、培養を行った。培養液は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンとウシ胎児血清を添加したものを用いた。 IM9 cells, RPMI8226 cells, and ARH-77 cells were cultured under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The culture solution used was RPMI-1640 medium supplemented with 100 μg / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin and fetal bovine serum.
図４はＩＭ９細胞の場合の結果を示す。横軸は投与後経過日数（日）である。縦軸は細胞生存率（％）を示す。また、マンギフェリンを入れなかったもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、水だけをいれたもの（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、マンギフェリンを５、１５、２５、５０μｇ／ｍＬの濃度で添加したものについての結果を示す。 FIG. 4 shows the results for IM9 cells. The horizontal axis represents the number of days (days) after administration. The vertical axis represents the cell viability (%). Moreover, the result about what added mangiferin at the density | concentration of 5, 15, 25, and 50 microgram / mL which does not contain mangiferin (Control), the thing containing only water (Vehicle), and mangiferin is shown.
図５はＲＰＭＩ８２２６細胞の場合の結果を示す。図６は、ＡＲＨ−７７細胞の場合の結果を示す。なお、ＲＰＭＩ８８２６細胞およびＡＲＨ−７７細胞については、マンギフェリンは５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加している。結果、いずれの場合も、すべての細胞株において濃度依存的に細胞生存率の低下が確認された。 FIG. 5 shows the results for RPMI8226 cells. FIG. 6 shows the results for ARH-77 cells. For RPMI 8826 cells and ARH-77 cells, Mangiferin is added at concentrations of 50, 100, 200, and 400 μg / mL. As a result, in all cases, a decrease in cell viability was confirmed in all cell lines in a concentration-dependent manner.
＜実施例５：Ｉｎ ｖｉｖｏでのマンギフェリンの腫瘍増殖抑制効果＞
悪性黒色腫細胞を用いてマンギフェリンによる腫瘍増殖抑制効果について検討した結果、図７に示されるようにマンギフェリン投与により腫瘍増殖抑制効果を認めた。
<Example 5: Tumor growth inhibitory effect of mangiferin in vivo>
As a result of examining the tumor growth inhibitory effect of mangiferin using malignant melanoma cells, as shown in FIG.
Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＢ１６ＢＬ６細胞（マウスメラノーマ細胞）を移植後、マンギフェリンを連日経口投与し、腫瘍増殖抑制効果を検討した。図７を参照する。図７は、横軸が投与後経過日数（日）であり、縦軸が腫瘍体積ｍｍ３である。白丸はＶｅｈｉｃｌｅ、黒四角は５０ｍｇ／ｋｇ、黒三角は１００ｍｇ／ｋｇ、黒菱形は２００ｍｇ／ｋｇの結果である。その結果、マンギフェリン投与の量が多いほど、腫瘍体積の増加が抑制された。 After transplanting B16BL6 cells (mouse melanoma cells) into C57BL6 / J mice, mangiferin was orally administered every day, and the tumor growth inhibitory effect was examined. Please refer to FIG. In FIG. 7, the horizontal axis represents the number of days elapsed after administration (days), and the vertical axis represents the tumor volume mm 3 . The white circle is the vehicle, the black square is 50 mg / kg, the black triangle is 100 mg / kg, and the black rhombus is 200 mg / kg. As a result, the increase in tumor volume was suppressed as the dose of mangiferin was increased.
＜実施例６：Ｉｎ ｖｉｖｏでのマンギフェリン投与におけるＮＩＫ抑制効果＞
Ｉｎ ｖｉｖｏでのマンギフェリンのＮＩＫ抑制効果について悪性黒色腫細胞にて担癌マウスを作製し、検討を行った結果、図８に示されるようにマンギフェリン投与によりＮＩＫ、ＩＫＫ及びＮＦ−κＢの抑制効果を認めた。
<Example 6: NIK inhibitory effect of mangiferin administration in vivo>
In vivo, the effect of mangiferin on NIK inhibitory effect was confirmed by preparing tumor-bearing mice using malignant melanoma cells and examining the effect of mangiferin administration on NIK, IKK and NF-κB as shown in FIG. recognized.
Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＢ１６ＢＬ６細胞（マウスメラノーマ細胞）を移植後、マンギフェリンを連日経口投与し、１７日後に腫瘍を切除した。この腫瘍からタンパクを回収し、イムノブロッティング法によりＮＩＫ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の活性化を測定した。 After transplanting B16BL6 cells (mouse melanoma cells) into C57BL6 / J mice, mangiferin was orally administered every day, and tumors were excised 17 days later. Proteins were collected from this tumor, and activation of NIK, IKK, NF-κB and NF-κB2 was measured by immunoblotting.
イムノブロッティングの結果を図８に示す。写真横方向には、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５０、１００、２００ｍｇ／ｋｇの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と記載）および抗ＮＩＫ抗体（「ＮＩＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ」と記載）および抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）である。 The result of immunoblotting is shown in FIG. In the horizontal direction of the photograph, the cases of Vehicle and Mangiferin of 50, 100 and 200 mg / kg are shown side by side. In the vertical direction, antibody species are shown. Specifically, an anti-phospho-NIK antibody (described as “Phospho-NIK”) and an anti-NIK antibody (described as “NIK”), an anti-phospho-IKK antibody (described as “Phospho-IKK”) and an anti-IKK antibody ( “IKK”), anti-phospho-NF-κB antibody (described as “Phospho-NF-κB”) and anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65”), anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (“ NF-κB2p100 ”), anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as“ NF-κB2p52 ”) and anti-β-actin antibody (described as“ β-actin ”).
抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と記載）および抗ＮＩＫ抗体（「ＮＩＫ」と記載）を参照して、ＮＩＫの影はマンギフェリンの投与量では変化なかった。しかし、ＮＩＫのリン酸化はマンギフェリンの添加量に比例し、写真において影が薄くなった。図１で示したＩＭ９細胞の結果と同じであった。 With reference to anti-phospho-NIK antibody (described as “Phospho-NIK”) and anti-NIK antibody (described as “NIK”), the shadow of NIK did not change with the dose of mangiferin. However, the phosphorylation of NIK was proportional to the amount of mangiferin added, and the shadow became faint in the photograph. The result was the same as that of IM9 cells shown in FIG.
また、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）を参照して、ＩＫＫはマンギフェリンの添加によって変化は無かった。しかし、リン酸化ＩＫＫはマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。これも図２で示したＩＭ９細胞の結果と同じであった。 In addition, referring to anti-phospho-IKK antibody (described as “Phospho-IKK”) and anti-IKK antibody (described as “IKK”), IKK was not changed by the addition of mangiferin. However, phosphorylated IKK lightened the shadow of the photograph due to the increase of mangiferin. This was also the same as the result of IM9 cells shown in FIG.
抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ」と記載）および抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５」と記載）を参照して、ＮＦ−κＢはマンギフェリンの添加によって影が濃くなっていった。そして、リン酸化ＮＦ−κＢはマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。 Referring to anti-phospho-NF-κB antibody (described as “Phospho-NF-κB”) and anti-NF-κBp65 antibody (described as “NF-κBp65”), NF-κB is shaded by the addition of mangiferin. I went. Phosphorylated NF-κB had a lighter shadow due to an increase in mangiferin.
これはＮＦ−κＢのリン酸化がマンギフェリンの増加によって減少し、それに伴って非リン酸化ＮＦ−κＢ自体の量が増加したということである。ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢが分解した後、ｐ６５部位がリン酸化され、核内に移動し、ＤＮＡと結合し、遺伝子の転写を活性化することで、細胞の増殖や生存を促進する。マンギフェリンの増加によって、リン酸化ＮＦ−κＢが減り、非リン酸化ＮＦ−κＢが増加したということは、核内に移行するＮＦ−κＢが減少したことを示している。 This means that phosphorylation of NF-κB was decreased by the increase of mangiferin, and the amount of non-phosphorylated NF-κB itself increased accordingly. NF-κB promotes cell growth and survival by phosphorylating the p65 site after I-κB is degraded, moving into the nucleus, binding to DNA, and activating gene transcription. An increase in mangiferin decreased phosphorylated NF-κB and increased non-phosphorylated NF-κB, indicating that NF-κB transferred into the nucleus decreased.
抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００」と記載）および抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２」と記載）を参照して、ＮＦ−κＢ２ｐ１００はマンギフェリンの添加によって影が濃くなっていった。そして、ＮＦ−κＢ２ｐ５２はマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。 Referring to anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as “NF-κB2p100”) and anti-NF-κB2p100 / p52 antibody (described as “NF-κB2p52”), NF-κB2p100 is darkened by the addition of mangiferin. I went. The shadow of the photograph of NF-κB2p52 became lighter due to the increase of mangiferin.
これは、ＩＫＫαの活性化によるＮＦ−κＢ２の限定分解が抑制されたことを表している。したがって、ＮＦ−κＢ２においても核内に移行するＮＦ−κＢ２ｐ５２が減少したことを示している。 This indicates that limited degradation of NF-κB2 due to activation of IKKα was suppressed. Therefore, NF-κB2 also shows that NF-κB2p52 transferred into the nucleus has decreased.
したがって、マンギフェリン投与群ではＮＩＫ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の活性化が抑制されることを確認した。また、上記の結果は、マンギフェリンのＮＩＫ阻害活性は、経口摂取によっても効果が得られることをも確認できた。 Therefore, it was confirmed that activation of NIK, IKK, NF-κB and NF-κB2 was suppressed in the mangiferin administration group. In addition, the above results confirmed that the NIK inhibitory activity of mangiferin can also be obtained by oral ingestion.
なお、β−ａｃｔｉｎはマンギフェリンの増加があっても、量に変化はなかった。細胞骨格を形成するβ−ａｃｔｉｎに変化が無かったことから、細胞のプレパレーションからイムノブロッティング法の過程において、誤差要因は入らなかったと考えられる。 Note that the amount of β-actin did not change even when mangiferin increased. Since there was no change in β-actin forming the cytoskeleton, it is considered that no error factor was introduced in the process of immunoblotting from the preparation of cells.
本発明に係るＮＩＫ阻害剤は、ＮＩＫだけを選択的に阻害するので、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している悪性腫瘍に対して有用な医薬組成物とすることができる。 Since the NIK inhibitor according to the present invention selectively inhibits only NIK, it can be a pharmaceutical composition useful for malignant tumors in which NF-κB is constantly activated.
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