JP6488264B2

JP6488264B2 - Ｎｉｋ阻害剤

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Publication number: JP6488264B2
Application number: JP2016147543A
Authority: JP
Inventors: 升三西田; 正寛椿; 朋也武田
Original assignee: Kindai University
Current assignee: Kindai University
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2019-03-20
Anticipated expiration: 2036-07-27
Also published as: JP2017031146A

Description

本発明は、細胞の生存、増殖に必要な遺伝子を発現させる転写因子であるＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）の活性を調節するＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｋｉｎａｓｅ（ＮＩＫ）を特異的に阻害する薬剤を提供する。

ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）は、細胞の生存、増殖に必要な遺伝子を発現させる転写因子であり、この因子の活性制御異常は、がん、炎症性疾患などの原因となる。ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｋｉｎａｓｅ（ＮＩＫ）はセリン／スレオニンキナーゼで、ＮＦ−κＢの活性化を調節する重要な因子である。

ＮＩＫを阻害する薬剤は、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している疾患に対して有効である可能性が考えられるが、ＮＩＫを特異的に阻害する薬剤はほとんどなく、実臨床においては存在しない。

特許文献１には、ＮＩＫ阻害剤として用いて抗ＮＩＫ抗体を用いた技術が開示されている。特許文献１では、ＮＩＫ由来のペプチドを複数種用い、ＮＩＫに特異的に結合するモノクロナール抗体を得ている。

特許文献２および特許文献３は、合成によって得られるピラゾロイソキノリン誘導体が、ＮＩＫ阻害効果があることを開示している。

特許文献４もＮＩＫを阻害する一連の合成化合物を示している。

特表２００７−５３０４３７号公報特表２００６−５１３１３７号公報特表２００７−５２１２２７号公報特表２０１１−５２５９１５号公報

「特集：次世代シグナル伝達研究−先駆的基礎解析と臨床・創薬への展開− がんの分子標的治療と耐性シグナル」矢野聖二、生化学、第８５巻、第６号、ｐｐ．４７５−４８５、２０１３

本発明は安価に入手できる材料を用いたＮＩＫ阻害剤を提供することを目的とする。本発明の目的は、がんの発生及び進行などに関与するＮＦ−κＢｉｎｄｕｃｉｎｇｋｉｎａｓｅ（ＮＩＫ）の活性化を抑制し、ＩκＢｋｉｎａｓｅ（ＩＫＫ）／ＮＦ−κＢ経路を調節することで、当該経路が関与する疾患を予防及び治療する効能を有する薬剤を提供する。ＮＩＫ／ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ系阻害物質を含有する医薬組成物はＮＦ−κＢが恒常的に活性化しているがん、炎症性疾患を予防及び治療することができる。

本発明者らは、上記の課題を解決すべくＮＩＫを阻害する化合物を探索したところ、マンギフェリンがＮＩＫの阻害作用を有し、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化しているがんに対して細胞死を誘導することを見出し、発明を完成させた。

すなわち、本発明に係るＮＩＫ阻害剤は、マンギフェリンを有効成分とする多発性骨髄
腫または悪性黒色腫治療のためのものであることを特徴とする。

本発明によれば、ＮＩＫを阻害することで多発性骨髄腫及び悪性黒色腫をはじめとするＮＦ−κＢが恒常的に活性化している悪性腫瘍に対して有用な医薬組成物を提供することができる。また現在、ＮＩＫを特異的阻害する薬剤はほとんどなく、実臨床においては存在しない。本発明はＮＩＫを特異的に阻害することでその下流のＩＫＫ／ＮＦ−κＢ経路を抑制することから、新たながん分子標的薬として有用である。

多発性骨髄腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いて、マンギフェリン投与によるＮＩＫ阻害作用について、イムノブロッティングの結果を示す写真である。マンギフェリン投与により、ＮＩＫの下流シグナルであるＩＫＫ、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＮＦ−κＢ２の活性動態について、イムノブロッティングの結果を示す写真である。マンギフェリン投与によるＮＩＫ／ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ経路以外の生存シグナル因子であるＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲの活性動態について、イムノブロッティングの結果を示す写真である。ＩＭ９細胞を用いて、マンギフェリンによる細胞死誘導効果について、トリパンブルーダイ法で検討した結果を示すグラフである。ＲＰＭＩ８２２６細胞を用いて、マンギフェリンによる細胞死誘導効果について、トリパンブルーダイ法で検討した結果を示すグラフである。ＡＲＨ−７７細胞を用いて、マンギフェリンによる細胞死誘導効果について、トリパンブルーダイ法で検討した結果を示すグラフである。悪性黒色腫細胞を用いてマンギフェリンによる腫瘍増殖抑制効果について検討した結果を示すグラフである。ＩｎｖｉｖｏでのマンギフェリンのＮＩＫ抑制効果について悪性黒色腫細胞にて担癌マウスを作製し、悪性黒色腫細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。

以下に本発明に係るＮＩＫ阻害剤について説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。

本発明に係るＮＩＫ阻害剤はマンギフェリンを有効成分として含む。マンギフェリンは、トンガの伝統民間薬であるオンガエルの葉の主成分で、抗炎症作用があることが確認されている。マンギフェリン（Ｃ_１９Ｈ_１８Ｏ_１１：体系名：２−β−Ｄ−グルコピラノシル−１，３，６，７−テトラヒドロキシ−９Ｈ−キサンテン−９−オン２，３，６，８−テトラヒドロキシ−７−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−９Ｈ−キサンテン−９−オン）は、コタラヒム（学名Ｓａｌａｃｉａｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）やマンゴー（学名Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａ）にも多く含まれている物質で、（１）式の構造を有している。

マンギフェリンは、主としてマンゴーから抽出するのが簡単である。マンギフェリンはこれまで糖尿病や抗肥満作用に効果があるとされていたので、抽出方法も溶媒抽出だけでなく、亜臨界水を用いたものまで、さまざまな研究がされている。

マンギフェリンは、比較的低分子量化合物で、水に良く溶け、経口摂取が可能である。本発明に係るＮＩＫ阻害剤はマンギフェリンを有効成分として含む。またその他の薬剤として許容される成分を含んでいて良い。

ここで有効成分とは、ＮＩＫ阻害作用を発揮する程度の量が含まれていれば足りる。また、本発明は癌若しくは炎症性疾患の予防薬、治療薬として用いてもよい。

医薬組成物としての形態は特に限定されるものではなく、カプセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等で提供される。

また、本発明は加工食品若しくは補助食品として用いてもよい。加工食品若しくは補助食品（以下「加工食品等」と呼ぶ。）に含まれるマンギフェリンの量はＮＩＫ阻害作用を発揮する程度の量が含まれていれば足りる。

加工食品としては、例えば、飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等といった一般加工食品だけでなく、軟エキス剤、乾燥エキス剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤といったエキス剤や、アルコール飲料を含んでもよい。以下実施例に基づいて本発明に係るＮＩＫ阻害剤を説明する。

＜実施例１：マンギフェリン投与によるＮＩＫ活性化阻害の検討＞
多発性骨髄腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いて、マンギフェリン投与によるＮＩＫ阻害作用について、イムノブロッティングで検討した結果、ＮＩＫの活性化阻害を認めた（図１）。

ＩＭ９細胞、を１５０ｃｍ^２フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養したもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＩＭ９細胞を１５０ｃｍ^２フラスコに播種し、２４時間前培養後、ＩＭ９細胞にマンギフェリンを最終濃度が０、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬになるように添加し３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養した。この培養液から細胞溶解液にてタンパク質を抽出し、サンプルとした。なお、最終濃度が０μｇ／ｍＬとは、マンギフェリンを溶解した溶媒だけをいれたもの（Ｖｅｈｉｃｌｅ）である。

各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体および抗ＮＩＫ抗体を用いてＮＩＫのリン酸化を検討した。

イムノブロッティングの結果を図１に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬ添加された場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体の場合（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と表示した）および抗ＮＩＫ抗体の場合（「ＮＩＫ」と表示した）を示した。抗ＮＩＫ抗体の写真では、全てのサンプルのアッセイ結果に違いはなかった。一方、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体の場合は、マンギフェリンの添加量が増えるに連れて、イムノブロッティングの写真が薄くなった。

より具体的には、マンギフェリンが添加されていないＣｏｎｔｒｏｌとＶｅｈｉｃｌｅよりも、マンギフェリンが５μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬ添加されたサンプルのイムノブロッティングの結果は薄くなった。また、マンギフェリンが５μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬよりもマンギフェリンが２５μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬの方が、サンプルのイムノブロッティングの結果はより薄かった。

＜実施例２：マンギフェリン投与によるＮＩＫの下流シグナルの検討＞
マンギフェリン投与により、ＮＩＫの下流シグナルであるＩＫＫ、ＩκＢ、ＮＦ−κＢの活性動態について、イムノブロッティングで検討した結果、ＩＫＫ、ＩκＢの活性化阻害、ＩκＢの発現増加、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の核移行阻害を認めた（図２）。

実施例１と同様にＣｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの６種のサンプルを用意し、各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体および抗ＩＫＫ抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体および抗ＩκＢ抗体、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体および抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体、抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００抗体および抗ＮＦ−κＢ２ｐ５２抗体、および抗β−ａｃｔｉｎ抗体を用いてアッセイを行った。

イムノブロッティングの結果を図２に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ」と記載）、抗ＩκＢ抗体（「ＩκＢ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（「ＬａｍｉｎＡ／Ｃ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）である。

なお、ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒとＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒは、それぞれ核内のＮＦ−κＢｐ６５とＮＦ−κＢｐ５２を表す。また、ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍとＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍとＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍは、それぞれ細胞質内のＮＦ−κＢｐ６５、ＮＦ−κＢ２ｐ１００、ＮＦ−κＢ２ｐ５２である。また、ＮＦ−κＢ２ｐ１００とＮＦ−κＢ２ｐ５２の検出は同一の抗体を使用している。したがって、これを「抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体」とした。

また、細胞から核と細胞質基質を分離するのは、メルク株式会社製のＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｏｍｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて細胞質分画および核分画を抽出した。

抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）を参照して、ＩＫＫ自体は、マンギフェリンの添加量に係らず一定であった。しかし、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体では、マンギフェリンの添加量が多くなると、イムノブロッティングの結果では影が薄くなり、マンギフェリンが２５μｇ／ｍＬ以上では、影がなくなった。これは、マンギフェリンの添加量が２５μｇ／ｍＬ以上になると、ＩＫＫのリン酸化が行われなくなったことを示す。

次に抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢ」と記載）および抗ＩκＢ抗体（「ＩκＢ」と記載）を参照する。ＩκＢは、写真ではわかりにくいが、マンギフェリンの添加量が増加するにしたがって増加した（写真では影が濃くなった。）。一方、リン酸化ＩκＢはマンギフェリンの添加量の増大に応じて減少し、マンギフェリンが２５μｇ／ｍＬ以上になると、ほとんどなくなった（写真上で影はなくなる。）。

ＩＫＫはＩκＢキナーゼであるので、ＩＫＫが活性化されなければ、ＩκＢも活性化されない。活性化されていないＩκＢの増加もこの現象を裏づけている。この結果は、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）の結果と対応するものである。

次に細胞核内物質に対する抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）、抗ＮＦ−κＢｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢｐ５２ｎｕｃｌｅａｒ」と記載）および抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（「ＬａｍｉｎＡ／Ｃ」と記載）を参照する。ＬａｍｉｎＡ／Ｃは、マンギフェリンの添加量に係らず存在しているが、核内のＮＦ−κＢｐ６５は、マンギフェリンを５μｇ／ｍＬ添加しただけでも、ほとんど存在を認められなくなった。写真としては影が見えない。また、核内のＮＦ−κＢｐ５２は、マンギフェリンの添加量の増加にしたがって、減少した（影が薄くなった）。

ラミン（Ｌａｍｉｎ）は、細胞核内で構造の維持と転写の調節を行う繊維状タンパク質である。したがって、全てのサンプルで核内物質を検出している状態で、マンギフェリンを添加した場合には核内のＮＦ−κＢｐ６５やＮＦ−κＢｐ５２は存在しない若しくは、存在しても非常に少ないことを示している。

一方、細胞質基質に対する抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）を参照する。細胞質内のＮＦ−κＢｐ６５およびβ−ａｃｔｉｎは、マンギフェリンの添加量に係らず、存在が確認された。ＮＦ−κＢは、制御タンパク質であるＩκＢと結合した状態で細胞質内に存在し、ＩκＢの分解によりＮＦ−κＢが活性化されて核内へと移行し、炎症性サイトカインや接着分子などの標的遺伝子の発現を制御する転写因子として機能することが知られている。

上記の結果は、マンギフェリンが添加されていない状況では、細胞質内に存在しているＮＦ−κＢが核内に移動するが、マンギフェリンの添加によって、ＮＦ−κＢの核内移動が抑制されていることを示している。

細胞質基質内のＮＦ−κＢ２ｐ１００は、マンギフェリンの添加にしたがって、増加しているように観察された（影が濃くなった）。一方、細胞質基質内のＮＦ−κＢ２ｐ５２は、マンギフェリンの添加にしたがって、減少しているように観察された（影が薄くなった）。ＮＦ−κＢ２ｐ１００はＩＫＫαの活性によりプロセシングされＮＦ−κＢ２ｐ５２に限定分解されると活性することが知られている。

したがって、図２の結果は、マンギフェリンの増加によって、ＮＦ−κＢ２の活性も抑制されていることを示している。これはリン酸化されたＩＫＫ（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」）がマンギフェリンの添加量を増やすと減少する（ＩＫＫの活性が低下する）こととも対応している。

なお、β−ａｃｔｉｎはマンギフェリンの増加があっても、量に変化はなかった。細胞骨格を形成するβ−ａｃｔｉｎに変化が無かったことから、細胞のプレパレーションからイムノブロッティング法の過程において、誤差要因は入らなかったと考えられる。

＜実施例３：マンギフェリン投与による生存シグナルの検討＞
マンギフェリン投与によるＮＩＫ／ＩＫＫ／ＮＦ−κＢ経路以外の生存シグナル因子であるＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲの活性動態について、イムノブロッティングで検討した結果、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｍＴＯＲの活性動態に変化を認めなかった（図３）。

実施例１と同様にＣｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの６種のサンプルを用意し、各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体および抗ＥＲＫ１／２抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体および抗ＪＮＫ１／２抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体および抗ｍＴＯＲ抗体を用いてアッセイを行った。

イムノブロッティングの結果を図３に示す。写真横方向には、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５、１０、２５、５０μｇ／ｍＬの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２」と記載）および抗ＥＲＫ１／２抗体（「ＥＲＫ１／２」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２」と記載）および抗ＪＮＫ１／２抗体（「ＪＮＫ１／２」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ」と記載）および抗ｍＴＯＲ抗体（「ｍＴＯＲ」と記載）である。

図３を参照する。抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２」と記載）および抗ＥＲＫ１／２抗体（「ＥＲＫ１／２」と記載）を参照して、ＥＲＫ１／２も、リン酸化したＥＲＫ１／２もマンギフェリンの添加に係らず一定であった。

抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２」と記載）および抗ＪＮＫ１／２抗体（「ＪＮＫ１／２」と記載）を参照して、ＪＮＫ１／２も、リン酸化したＪＮＫ１／２もマンギフェリンの添加に係らず一定であった。

抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ」と記載）および抗ｍＴＯＲ抗体（「ｍＴＯＲ」と記載）を参照して、ｍＴＯＲも、リン酸化したｍＴＯＲもマンギフェリンの添加に係らず一定であった。

ＥＲＫ１／２およびＪＮＫ１／２はともに分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）と呼ばれているシグナル系列の物質である。またｍＴＯＲは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の中の物質で、細胞分裂や細胞死や血管新生やエネルギー産生などに作用してがん細胞の増殖を促進するといわれている。マンギフェリンはこれらのシグナル系列の物質には、なんの影響も与えなかった。

＜実施例４：マンギフェリンの細胞死誘導効果の検討＞
多発性骨髄腫細胞株を用いて、マンギフェリンによる細胞死誘導効果について、トリパンブルーダイ法で検討した結果、図４に示されるように、全ての多発性骨髄腫細胞株においてマンギフェリンにより細胞死誘導効果を認めた。

ＩＭ９細胞（多発性骨髄腫細胞株）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞株）、ＡＲＨ−７７細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞株）を９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種後、各濃度のマンギフェリンを添加し、トリパンブルーダイ法により細胞生存率を測定した。結果を図４から図６に示す。

ＩＭ９細胞、ＲＰＭＩ８２２６細胞、ＡＲＨ−７７細胞ともに５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、培養を行った。培養液は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンとウシ胎児血清を添加したものを用いた。

図４はＩＭ９細胞の場合の結果を示す。横軸は投与後経過日数（日）である。縦軸は細胞生存率（％）を示す。また、マンギフェリンを入れなかったもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、水だけをいれたもの（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、マンギフェリンを５、１５、２５、５０μｇ／ｍＬの濃度で添加したものについての結果を示す。

図５はＲＰＭＩ８２２６細胞の場合の結果を示す。図６は、ＡＲＨ−７７細胞の場合の結果を示す。なお、ＲＰＭＩ８８２６細胞およびＡＲＨ−７７細胞については、マンギフェリンは５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加している。結果、いずれの場合も、すべての細胞株において濃度依存的に細胞生存率の低下が確認された。

＜実施例５：Ｉｎｖｉｖｏでのマンギフェリンの腫瘍増殖抑制効果＞
悪性黒色腫細胞を用いてマンギフェリンによる腫瘍増殖抑制効果について検討した結果、図７に示されるようにマンギフェリン投与により腫瘍増殖抑制効果を認めた。

Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＢ１６ＢＬ６細胞（マウスメラノーマ細胞）を移植後、マンギフェリンを連日経口投与し、腫瘍増殖抑制効果を検討した。図７を参照する。図７は、横軸が投与後経過日数（日）であり、縦軸が腫瘍体積ｍｍ^３である。白丸はＶｅｈｉｃｌｅ、黒四角は５０ｍｇ／ｋｇ、黒三角は１００ｍｇ／ｋｇ、黒菱形は２００ｍｇ／ｋｇの結果である。その結果、マンギフェリン投与の量が多いほど、腫瘍体積の増加が抑制された。

＜実施例６：Ｉｎｖｉｖｏでのマンギフェリン投与におけるＮＩＫ抑制効果＞
ＩｎｖｉｖｏでのマンギフェリンのＮＩＫ抑制効果について悪性黒色腫細胞にて担癌マウスを作製し、検討を行った結果、図８に示されるようにマンギフェリン投与によりＮＩＫ、ＩＫＫ及びＮＦ−κＢの抑制効果を認めた。

Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＢ１６ＢＬ６細胞（マウスメラノーマ細胞）を移植後、マンギフェリンを連日経口投与し、１７日後に腫瘍を切除した。この腫瘍からタンパクを回収し、イムノブロッティング法によりＮＩＫ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の活性化を測定した。

イムノブロッティングの結果を図８に示す。写真横方向には、Ｖｅｈｉｃｌｅ、マンギフェリンが、５０、１００、２００ｍｇ／ｋｇの場合を並べて示した。縦方向には、抗体種を示した。具体的には、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と記載）および抗ＮＩＫ抗体（「ＮＩＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ」と記載）および抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００」と記載）、抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２」と記載）および抗β−ａｃｔｉｎ抗体（「β−ａｃｔｉｎ」と記載）である。

抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＩＫ」と記載）および抗ＮＩＫ抗体（「ＮＩＫ」と記載）を参照して、ＮＩＫの影はマンギフェリンの投与量では変化なかった。しかし、ＮＩＫのリン酸化はマンギフェリンの添加量に比例し、写真において影が薄くなった。図１で示したＩＭ９細胞の結果と同じであった。

また、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＫ」と記載）および抗ＩＫＫ抗体（「ＩＫＫ」と記載）を参照して、ＩＫＫはマンギフェリンの添加によって変化は無かった。しかし、リン酸化ＩＫＫはマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。これも図２で示したＩＭ９細胞の結果と同じであった。

抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ抗体（「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ」と記載）および抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体（「ＮＦ−κＢｐ６５」と記載）を参照して、ＮＦ−κＢはマンギフェリンの添加によって影が濃くなっていった。そして、リン酸化ＮＦ−κＢはマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。

これはＮＦ−κＢのリン酸化がマンギフェリンの増加によって減少し、それに伴って非リン酸化ＮＦ−κＢ自体の量が増加したということである。ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢが分解した後、ｐ６５部位がリン酸化され、核内に移動し、ＤＮＡと結合し、遺伝子の転写を活性化することで、細胞の増殖や生存を促進する。マンギフェリンの増加によって、リン酸化ＮＦ−κＢが減り、非リン酸化ＮＦ−κＢが増加したということは、核内に移行するＮＦ−κＢが減少したことを示している。

抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ１００」と記載）および抗ＮＦ−κＢ２ｐ１００／ｐ５２抗体（「ＮＦ−κＢ２ｐ５２」と記載）を参照して、ＮＦ−κＢ２ｐ１００はマンギフェリンの添加によって影が濃くなっていった。そして、ＮＦ−κＢ２ｐ５２はマンギフェリンの増加によって写真の影が薄くなった。

これは、ＩＫＫαの活性化によるＮＦ−κＢ２の限定分解が抑制されたことを表している。したがって、ＮＦ−κＢ２においても核内に移行するＮＦ−κＢ２ｐ５２が減少したことを示している。

したがって、マンギフェリン投与群ではＮＩＫ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ２の活性化が抑制されることを確認した。また、上記の結果は、マンギフェリンのＮＩＫ阻害活性は、経口摂取によっても効果が得られることをも確認できた。

本発明に係るＮＩＫ阻害剤は、ＮＩＫだけを選択的に阻害するので、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化している悪性腫瘍に対して有用な医薬組成物とすることができる。

Claims

マンギフェリンを有効成分とする多発性骨髄腫または悪性黒色腫治療のためのＮＩＫ阻害剤。
マンギフェリンを有効成分とする多発性骨髄腫または悪性黒色腫の治療薬。