JP6563721B2

JP6563721B2 - ソフォロリピッド高生産性変異株

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Publication number: JP6563721B2
Application number: JP2015144760A
Authority: JP
Inventors: 孝浩市原; 正敏東畑; 温子早瀬; 史員高橋
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2019-08-21
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Description

本発明は、ソフォロリピッド高生産性変異株、及び当該変異株を使用したソフォロリピッドの製造方法に関する。

ソフォロリピッドは、微生物、主に酵母により生産される、長鎖ヒドロキシ脂肪酸とソホロースが結合した糖脂質である。ソフォロリピッドは、強い界面活性をもち、且つ生分解性に優れた両親媒性脂質であるため、近年、バイオサーファクタントとしての用途が注目されている。ソフォロリピッドは、微生物生産物であり、かつノニオン成分が主体であるため皮膚親和性がよいことから、化粧品の浸透性向上剤として使用されている。またソフォロリピッドは、生分解性に優れ、少量の添加でも効果があることから、食器用洗剤等の洗浄剤の分野でも使用が進んでいる。

ソフォロリピッドを生産する酵母としては、非病原性の担子菌酵母であるスターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａｂｏｍｂｉｃｏｌａ）〔旧名称キャンディダ・ボンビコーラ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｍｂｉｃｏｌａ）〕がよく知られている。スターメレラ・ボンビコーラにより生産されるソフォロリピッドは、ラクトン型又は酸型の構造を有し、臨界ミセル濃度は４０〜１００ｍｇ／Ｌを示し、水の表面張力を７２．８ｍＮ／ｍから３０ｍＮ／Ｎまで低下させる（非特許文献１）。ソフォロリピッドは、その構造の違いにより物理化学的性質が異なる。ソフォロリピッドのラクトン型と酸型との間で、又はソフォロリピッドを構成する脂肪酸種が異なると、抗菌性、界面活性力などの性質が変化することが報告されている（非特許文献１、２）。

洗浄剤や化粧品材料としてソフォロリピッドを使用する場合には、現在使用されている界面活性剤との競争を余儀なくされる。従来一般的な界面活性剤はバルク化学薬品であるため、極めて低コストで製造されている。したがって、ソフォロリピッドの製造コストの低減が強く所望される。さらに、ソフォロリピッドの利用可能性を広げるためには、多様な鎖長の構成脂肪酸を有するソフォロリピッドの生産が望まれている。

ソフォロリピッドの生産プロセスに対しては、従来、主に収率、精製法、起泡性付与技術などの研究及び改善が行われてきた（特許文献１、２）。また、スターメレラ・ボンビコーラに対し遺伝子改変を加えることにより、細胞内でのβ酸化代謝を停止させて、主に炭素鎖長が１２の中鎖ソフォロリピッドを製造する方法が報告されている（非特許文献３、特許文献３）。この遺伝子改変では、酵母のペロキシソームでのβ酸化における水酸化反応及び脱水素反応の２つを担う遺伝子であるＭＦＥ−２（又はＦＯＸ−２）（非特許文献４）を欠損させて、β酸化反応を停止させている。

一方、酵母のペルオキシソーム上にはＰＸＡ１及びＰＸＡ２遺伝子が存在する（非特許文献４）。この２つの遺伝子はヘテロダイマーを形成し、β酸化の反応基質であるＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働く。ＰＸＡ１／ＰＸＡ２は、ＡＢＣ（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーターとしてＡＴＰ依存的に働き、主に長鎖（＞Ｃ１６）のＡｃｙｌ−ＣｏＡをペルオキシソーム内へ輸送する。

特開２００３−９８９６号公報特開２０１４−１５０７７４号公報米国特許第８，５３０，２０６号公報

ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈ，２００７，７６（１）：２３−３４ＪＳＵＲＦＡＣＴＤＥＴＥＲＧ，２００６，９，ＱＴＲ１：５７−６２ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓ，２００９，９：６１０−６１７ＣｅｌｌＭｏｌＬｉｆｅＳｃｉ，２００３，６０（９）：１８３８−１８５１

本発明は、ソフォロリピッドを高効率で生産することができる酵母変異株、及びそれを用いたソフォロリピッドの製造方法に関する。

本発明者らは、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化したソフォロリピッド生産性酵母が、そのソフォロリピッド生産能を向上させることを見出した。

したがって、本発明は、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターが欠失又は不活性化した、ソフォロリピッド生産性酵母変異株を提供する。
また本発明は、ソフォロリピッド生産性酵母において、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化することを含む、ソフォロリピッド生産性酵母変異株の製造方法を提供する。
また本発明は、ソフォロリピッド生産性酵母において、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化することを含む、ソフォロリピッド生産性酵母のソフォロリピッド生産能の向上方法を提供する。
また本発明は、上記ソフォロリピッド生産性酵母変異株を培養することを含む、ソフォロリピッドの製造方法を提供する。

本発明は、ソフォロリピッド生産能の高い酵母変異株を提供する。本発明の酵母変異株によれば、種々の鎖長の構成脂肪酸を有するソフォロリピッドを効率よく生産することができる。

ＰＸＡ１遺伝子又はＰＸＡ２遺伝子欠損スターメレラ・ボンビコーラ変異株におけるソフォロリピッド生産能の向上。Δｐｘａ１；Δｐｘａ１変異株、Δｐｘａ２；Δｐｘａ２変異株。ＰＥ；パルミチン酸エチル、ＳＬ；ソフォロリピッド。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝３）。スターメレラ・ボンビコーラ変異株における各種ソフォロリピッドの生産量。Δｆｏｘ２；Δｆｏｘ２変異株、Δｐｘａ１；Δｐｘａ１変異株。Ｃ１２〜Ｃ１８は、それぞれ構成脂肪酸鎖長がＣ１２〜Ｃ１８のソフォロリピッドを表す。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝３）。

（１．定義）
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。

本明細書において、「ソフォロリピッド生産性酵母」とは、ソフォロリピッドを生産する能力を備えた酵母をいう。ソフォロリピッド生産性酵母の例としては、スターメレラ属（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びウイッカーハミーラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ）などの子嚢菌類が挙げられ、好ましくは、スターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｅｒｍｅｒｅｌｌａｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、カンジダ・ボゴリエンシス（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・バチステ（Ｃａｎｄｉｄａｂａｔｉｓｔａｅ）、カンジダ・アピコラ（Ｃａｎｄｉｄａａｐｉｃｏｌａ）及びウィッカーハミーラ・ドメルキー（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ）が挙げられる。より好ましい例としては、スターメレラ・ボンビコーラが挙げられる。

（２．ソフォロリピッド生産性酵母変異株）
本発明のホロリピッド生産性酵母変異株は、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターが欠失又は不活性化した変異株である。好ましくは、本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、ソフォロリピッド生産性酵母において、人工的な改変により、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失させるか又は不活性化することによって製造された変異株である。

好ましくは、本発明のペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターが欠失又は不活性化した酵母変異株とは、変異前の株（親株）と比べて、該トランスポーターの活性（すなわち、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送する活性）が低減又は消失している変異株である。例えば、本発明の変異株においては、上記トランスポーターの発現が抑制されているか、又は発現したタンパク質のトランスポーター活性が低減若しくは消失している。

ソフォロリピッド生産性酵母におけるペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターの例としては、ＰＸＡ１、ＰＸＡ２、及びそれらに相当するタンパク質が挙げられる。したがって、一実施形態において、本発明の変異株は、当該トランスポータータンパク質のいずれかの発現量が、親株と比べて５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、なお好ましくは５％以下に低下している変異株であり得る。タンパク質の発現量は、通常使用されるタンパク質発現定量法、例えば、これらに限定されないが、定量ＰＣＲによるｍＲＮＡ量測定、比色定量法、蛍光法、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等により測定することができる。

本明細書において、ＰＸＡ１とは、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質である。また本明細書において、ＰＸＡ２とは、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質である。

本明細書において、ＰＸＡ１に相当するタンパク質とは、配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をいう。

本明細書において、ＰＸＡ２に相当するタンパク質とは、配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をいう。

上記トランスポーターの欠失又は不活性化のための手段としては、該トランスポーターをコードする遺伝子を欠失又は不活性化する方法が挙げられる。この方法は、該トランスポータータンパク質の発現量を抑制し、あるいは発現したタンパク質の活性を変化させることで、酵母におけるペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送する活性の低減又は消失をもたらす。

したがって、一実施形態において、本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターをコードする遺伝子が欠失又は不活性化した変異株である。好ましい実施形態において、本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はそれらに相当する遺伝子が欠失又は不活性化した変異株である。

本明細書において、ＰＸＡ１遺伝子とは、配列番号２で示されるアミノ配列からなるＰＸＡ１タンパク質をコードする遺伝子である。ＰＸＡ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、その相補鎖、又はそれらから構成されるＤＮＡからなる遺伝子であり得る。また本明細書において、ＰＸＡ２遺伝子とは、配列番号４で示されるアミノ配列からなるＰＸＡ２タンパク質をコードする遺伝子である。ＰＸＡ２遺伝子は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、その相補鎖、又はそれらから構成されるＤＮＡからなる遺伝子であり得る。

ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子とは、ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子である。ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、その相補鎖、又はそれらから構成されるＤＮＡからなる遺伝子であり得る。

ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子とは、ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子である。ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、その相補鎖、又はそれらから構成されるＤＮＡからなる遺伝子であり得る。

酵母細胞の遺伝子を欠失又は不活性化する手段としては、標的の遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入（欠失、挿入、置換若しくは付加）、該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、又は該ヌクレオチド配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。あるいは、該標的の遺伝子のプロモーター領域に対して、同様の突然変異導入やヌクレオチド配列の置換、挿入又は削除を行ってもよい。

上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換、挿入又は削除のための具体的な手法としては、当該分野で公知の微生物の遺伝的改変のための方法を用いることができる。当該方法の例としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）を用いた相同組換え法などを挙げることができるが、これらに限定されない。

上記突然変異導入やヌクレオチド配列の置換、挿入又は削除の後、遺伝子解析、又は標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現量若しくは活性の評価を行って、所望の変異を有する細胞を選択すれば、本発明の変異株を取得することができる。

あるいは、遺伝子を欠失又は不活性化する手段がＳＯＥ−ＰＣＲを用いた相同組換え法の場合、標的遺伝子ＤＮＡと置換する遺伝子欠失用ＤＮＡ断片に薬剤耐性マーカー遺伝子を組み込み、該欠失用ＤＮＡ断片を導入した細胞を薬剤を含む培地上で培養し、生育するコロニーを分離することにより、標的遺伝子が欠失した変異株を得ることができる。さらに、上述した遺伝子解析又はタンパク質の発現量若しくは活性評価を行って、変異を確認してもよい。以上の手順により、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターをコードする遺伝子が欠失又は不活性化した本発明の酵母変異株を得ることができる。

（３．変異株におけるソフォロリピッド生産能の向上）
上述したペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターの欠失又は不活性化により製造された本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、変異前の株（親株）と比べて、ソフォロリピッド生産能が向上している。したがって、本発明の一実施形態は、ソフォロリピッド生産性酵母において、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化することを含む、ソフォロリピッド生産性酵母のソフォロリピッド生産能の向上方法であり得る。

（４．ソフォロリピッドの製造）
本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、ソフォロリピッド生産能が向上している。また本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株は、種々の鎖長の炭化水素鎖、脂肪酸等を基質としてソフォロリピッドを生産することができる。したがって、本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株を適切な鎖長の基質とともに培養すれば、所望の鎖長の構成脂肪酸を含むソフォロリピッドを効率よく製造することができる。したがって、本発明はまた、上記本発明のソフォロリピッド生産性酵母変異株を培養することを含む、ソフォロリピッドの製造方法を提供する。

本発明のソフォロリピッドの製造方法においては、上記本発明の変異株を、脂肪酸、脂肪酸アルキルエステル、アルカン、アルケン、アルキン、アルコール、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、油脂等の基質を含む培地で培養する。培養後の培地からソフォロリピッドを回収し、必要に応じて適宜精製することにより、ソフォロリピッドを製造することができる。

上記培養に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。また該培地は、合成培地及び天然培地のいずれであってもよい。

上記培地に含まれる炭素源および窒素源は、培養する変異株が利用可能ないずれの種類であってもよい。炭素源の例としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類；酢酸、クエン酸等の有機酸；エタノール等のアルコール類、などが挙げられる。これらの炭素源は、いずれか単独又は２種以上の組み合わせで用いることができる。窒素源の例としては、アンモニア；硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩；硝酸塩、などが挙げられる。

上記無機塩類の例としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が挙げられる。上記有機微量栄養素の例としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、及びこれらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が挙げられる。生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが好ましい。

上記培地に含まれ得る基質の好ましい例としては、Ｃ１２〜２０脂肪酸及びそのアルキルエステル、Ｃ１２〜２０アルカン、Ｃ１２〜２０アルケン、Ｃ１２〜２０アルキン、Ｃ１２〜２０アルコール、Ｃ１２〜２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、ならびにＣ１２〜２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂が挙げられる。より好ましい例としては、Ｃ１２〜１８脂肪酸及びそのアルキルエステル、Ｃ１２〜１８アルカン、Ｃ１２〜１８アルケン、Ｃ１２〜１８アルキン、Ｃ１２〜１８アルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸又はそのアルキルエステルを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、ならびにＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂が挙げられる。さらに好ましい例としては、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸及びそのアルキルエステルが挙げられる。

上記基質のより詳細な例としては、限定ではないが、上記Ｃ１２〜２０脂肪酸としては、ドデカン酸（ラウリン酸）、トリデカン酸、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸（ペンタデシル酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘキサデセン酸、ヘプタデカン酸（マルガリン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、オクタデセン酸、オクタデカジエン酸、オクタデカントリデカエン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸などが挙げられ；上記Ｃ１２〜２０のアルカン、アルケン、アルキン及びアルコールとしては、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘキサデセン、へプタデカン、オクタデカン、オクタデセン、オクタデシン、ノナデカン、エイコサン、エイコセン、エイコシンドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘキサデセナール、へプタデカノール、オクタデカノール、オクタデセノール、オクタデシノール、ノナデカノール、エイコサノールなどが挙げられ；上記Ｃ１２〜２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂としては、やし油、パーム油、パーム核油、オリーブ油、菜種油、米ぬか油、大豆油、ヒマシ油、マフア油などが挙げられる。

上記脂肪酸アルキルエステルの例としては、上記に挙げた脂肪酸の炭素数１〜４のアルキルエステル、好ましくはメチルエステル及びエチルエステルが挙げられる。

上記に挙げた基質は、いずれか単独又は２種以上の組み合わせで用いることができる。好ましくは、Ｃ１２〜Ｃ１８のいずれかの鎖長の脂肪酸若しくはそのアルキルエステル、又はそれらを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール若しくは油脂、あるいはＣ１２〜１８のいずれかの鎖長のアルカン、アルケン、アルキン又はアルコールが使用され、より好ましくはＣ１２〜Ｃ１８のいずれかの鎖長の脂肪酸又はそのアルキルエステルが使用される。

培地中に含まれ得る上記基質の含有量（培養開始時）は、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上で、かつ好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下、さらに好ましくは１５質量％以下である。あるいは、好ましくは１〜３０質量％、１〜２０質量％、１〜１５質量％、３〜３０質量％、３〜２０質量％、３〜１５質量％、５〜３０質量％、５〜２０質量％、若しくは５〜１５質量％である。

培養の条件は、本発明の変異株によりソフォロリピッドが発酵生産される条件であればよい。培養は、好気的条件下が好ましく、通気攪拌培養、振盪培養等の一般的な方法を適用することができる。培養温度は、２０〜３３℃が好ましく、２５〜３０℃がより好ましく、２８〜３０℃がさらに好ましい。培地の初発ｐＨ（３０℃）は２〜７が好ましく、３〜６がより好ましい。培養時間は、２４時間〜２００時間程度が好ましく、５０〜２００時間がより好ましい。

上記培養では、本発明の変異株を細胞が増殖する条件下で培養して、ソフォロリピッドを発酵生産させてもよく、また、本発明の変異株が休止菌体の状態、すなわち生育及び増殖を止めた状態で培養して、ソフォロリピッドを発酵生産させてもよい。

培養後の培地からソフォロリピッドを回収する方法は、特に限定されず、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、酢酸エチル等を用いた溶剤抽出、分別沈殿、液液分配、カラムクロマトグラフ、高速液体クロマトグラフ等を単独又は適宜組み合わせることによって、培地中のソフォロリピッドを回収又は精製することができる。

（５．例示的実施形態）
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターが欠失又は不活性化した、ソフォロリピッド生産性酵母変異株。

〔２〕好ましくは、上記ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターがＰＸＡ１、ＰＸＡ２、又はそれらに相当するタンパク質である、〔１〕記載の変異株。

〔３〕好ましくは、
上記ＰＸＡ１が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質であり、
上記ＰＸＡ２が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質であり、
上記ＰＸＡ１に相当するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質であり、
上記ＰＸＡ２に相当するタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質である、
〔２〕記載の変異株。

〔４〕好ましくは、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はそれらに相当する遺伝子が欠失又は不活性化している、〔２〕又は〔３〕記載の変異株。

〔５〕好ましくは、
上記ＰＸＡ１遺伝子が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ２遺伝子が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子が、ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が、ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子である、
〔４〕記載の変異株。

〔６〕上記ソフォロリピッド生産性酵母が、
好ましくは、スターメレラ属微生物であり、
より好ましくはスターメレラ・ボンビコーラである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の変異株。

〔７〕変異前の株と比べてソフォロリピッド生産性が向上している、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の変異株。

〔８〕ソフォロリピッド生産性酵母において、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化することを含む、ソフォロリピッド生産性酵母変異株の製造方法。

〔９〕ソフォロリピッド生産性酵母において、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターを欠失又は不活性化することを含む、ソフォロリピッド生産性酵母のソフォロリピッド生産能の向上方法。

〔１０〕好ましくは、上記ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターがＰＸＡ１、ＰＸＡ２、又はそれらに相当するタンパク質である、〔８〕又は〔９〕記載の方法。

〔１１〕好ましくは、
上記ＰＸＡ１が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質であり、
上記ＰＸＡ２が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質であり、
上記ＰＸＡ１に相当するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質であり、
上記ＰＸＡ２に相当するタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質である、
〔１０〕記載の方法。

〔１２〕好ましくは、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はそれらに相当する遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。

〔１３〕好ましくは、
上記ＰＸＡ１遺伝子が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ２遺伝子が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子が、ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
上記ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が、ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子である、
〔１２〕記載の方法。

〔１４〕上記ソフォロリピッド生産性酵母が、
好ましくは、スターメレラ属微生物であり、
より好ましくはスターメレラ・ボンビコーラである、〔８〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。

〔１５〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載のソフォロリピッド生産性酵母変異株を培養することを含む、ソフォロリピッドの製造方法。

〔１６〕好ましくは、上記培養のための培地が下記基質を含有する、〔１５〕記載の方法：
Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸及びそのアルキルエステル、Ｃ１２〜Ｃ２０アルカン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルケン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、ならびにＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂からなる群より選択される少なくとも１種の基質；
Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸及びそのアルキルエステル、Ｃ１２〜Ｃ１８アルカン、Ｃ１２〜Ｃ１８アルケン、Ｃ１２〜Ｃ１８アルキン、Ｃ１２〜Ｃ１８アルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸又はそのアルキルエステルを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、ならびにＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂からなる群より選択される少なくとも１種の基質；
又は、
Ｃ１２〜１８脂肪酸及びそのアルキルエステルからなる群より選択される少なくとも１種の基質。

〔１７〕上記培地中の基質の含有量が、
好ましくは、１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上で、かつ好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下、さらに好ましくは１５質量％以下であるか、
又は
好ましくは、１〜３０質量％、１〜２０質量％、１〜１５質量％、３〜３０質量％、３〜２０質量％、３〜１５質量％、５〜３０質量％、５〜２０質量％、若しくは５〜１５質量％である、〔１６〕記載の方法。

〔１８〕好ましくは、上記培養後の培地からソフォロリピッドを回収することをさらに含む、〔１５〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

実施例１遺伝子欠損変異株の作製
（１）遺伝子欠失用断片の構築
ＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた相同組換え法により、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はＦＯＸ２遺伝子を欠損した変異株を作製した。

形質転換の選抜にはハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号５）を使用した。ハイグロマイシン耐性遺伝子断片は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｈｙｇｒｏ−ｌｏｘＰ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）をテンプレートとして、配列番号１８と１９のプライマーを用いてＰＣＲにより調製した。ＵＲＡ３遺伝子のプロモーター及びターミネーターの断片は、スターメレラ・ボンビコーラのゲノムをテンプレートとして、それぞれ配列番号２０と２１のプライマー、及び配列番号２２と２３のプライマーを用いてＰＣＲにより調製した。ＳＯＥ−ＰＣＲにて、ハイグロマイシン耐性遺伝子断片をＵＲＡ３遺伝子のプロモーター断片及びターミネーター断片に連結した。

ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はＦＯＸ２遺伝子を欠損させるための遺伝子欠失用断片を調製した。スターメレラ・ボンビコーラのゲノムをテンプレートとして、各遺伝子の上流領域の断片を、それぞれ配列番号６と７、配列番８と９、及び配列番１０と１１のプライマーを用いて、下流領域の断片を、それぞれ配列番号１２と１３、配列番１４と１５、及び配列番１６と１７のプライマーを用いて、ＰＣＲにより調製した。また、プロモーター断片及びターミネーターを含むハイグロマイシン耐性遺伝子断片を、上記ＳＯＥ−ＰＣＲ産物をテンプレートに、配列番号２０と２３のプライマーを用いたＰＣＲにより調製した。得られた各遺伝子の上流領域断片と下流領域断片、及びハイグロマイシン耐性遺伝子断片の３断片を、ＳＯＥ−ＰＣＲにて連結した。得られた断片を、それぞれＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、及びＦＯＸ２遺伝子欠失用断片として使用した。

（２）遺伝子欠損株の作製
スターメレラ・ボンビコーラを、５ｍＬのＹＰＤＢｒｏｔｈを含む１００ｍＬ形試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＹＰＤ培地５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ溶液（ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はＦＯＸ２遺伝子欠失用断片を含む）を１μｇ加え、氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５μＦ、３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。パルス印加した液に氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤＢｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体を２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、イーストエクストラクト１％（ｗ／ｖ）、ペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、ハイグロマイシン５００ｐｐｍを含む寒天培地を使用した。生育したコロニーをコロニーＰＣＲにかけ、各欠損標的遺伝子の領域から増幅される配列長が変化していることを確認して、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、又はＦＯＸ２遺伝子の欠損した変異株（Δｐｘａ１変異株、Δｐｘａ２変異株、及びΔｆｏｘ２変異株）を得た。

実施例２ Δｐｘａ１変異株及びΔｐｘａ２変異株のソフォロリピッド生産性
（１）変異株の培養
予め滅菌した酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、ペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）を含む培地を大型試験管に５ｍＬ注入し、これへ実施例１で得られたΔｐｘａ１変異株、Δｐｘａ２変異株、及びそれらの親株のいずれかを一白金耳接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて４８時間振とう培養を行い、これを種培養液とした。上記種培養液を、酵母エキス２％（ｗ／ｖ）、脂肪酸エステル５％（ｗ／ｖ）、グルコース１２．５％（ｗ／ｖ）を含む混合培地５ｍＬに１％（ｖ／ｖ）となるように接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて９６時間振とう培養を行った。脂肪酸エステルにはパルミチン酸エチルを用いた。

（２）ソフォロリピッド生産性評価
培養終了後、培養液中のパルミチン酸エチル（ＰＥ）とソフォロリピッド（ＳＬ）を抽出し、その量を測定した。ＰＥの抽出では、まず（１）で培養した大型試験管中の培養液全量をファルコンチューブ（グライナー）に移し、次いで該大型試験管にヘキサンを４ｍＬ加えボルテックスで５秒間撹拌し、その全量を同じファルコンチューブに移した。ボルテックスを５秒行って液をよく混合した後、３０００ｒｐｍ、２５℃、５分間遠心分離した。上清のヘキサン画分をパスツールピペットにてガラスチューブに全量回収した。残った液に対して上記と同じヘキサン抽出をもう一度繰り返すことで、ＰＥ全量を抽出した。ＳＬの抽出では、（１）で培養した大型試験管に酢酸エチル４ｍＬを加え５秒間ボルテックスし、全量をファルコンチューブへ回収した。その後、３０００ｒｐｍ、２５℃、５分間遠心分離し、上清の酢酸エチル画分をパスツールピペットにて新しいガラスチューブに全量回収した。残った液に対して上記の酢酸エチル抽出をもう一度繰り返すことで、ＳＬ全量を回収した。
回収したヘキサン画分又は酢酸エチル画分から、窒素ガスの吹き付けによりヘキサン又は酢酸エチルを揮発させ、溶存していたＰＥ又はＳＬを抽出した。抽出したＰＥ又はＳＬを含むガラスチューブの重量と、回収前のガラスチューブの重量との差を、培養液中のＰＥ量又はＳＬ量として算出した。

結果を図１に示す。また、親株のソフォロリピッド生産性を１００％とした場合の各変異株のソフォロリピッド生産性の相対値を表２に示す。ＰＸＡ１遺伝子又はＰＸＡ２遺伝子が欠損した変異株は、親株と比べてソフォロリピッド生産性が向上した。

実施例３ Δｐｘａ１変異株とΔｆｏｘ２変異株とのソフォロリピッド生産性比較
実施例２と同様の手順で、Δｐｘａ１変異株、Δｆｏｘ２変異株、及びそれらの親株を培養し、培養液中の脂肪酸エステルとソフォロリピッドの量を測定した。ただし、脂肪酸エステルを含む混合培地での培養時間は７２時間とし、脂肪酸エステルにはラウリン酸エチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸エチル（Ｃ１４）、パルミチン酸エチル（Ｃ１６）又はステアリン酸エチル（Ｃ１８）を用いた。

結果を図２に示す。また、親株において各鎖長の脂肪酸を基質として使用した場合のソフォロリピッド生産性を１００％とした場合の、Δｆｏｘ２変異株及びΔｐｘａ１変異株のソフォロリピッド生産性の相対値を表３に示す。

酵母のβ酸化代謝に関わるＦＯＸ２遺伝子の破壊により中鎖ソフォロリピッドの生産性が向上することが報告されている（非特許文献３、特許文献３）。本実施例でも、Δｆｏｘ２変異株は、Ｃ１２及びＣ１４脂肪酸を基質とした場合、親株と比べてソフォロリピッド生産性が向上した。しかし、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸を基質とした場合は、親株に比較してソフォロリピッド生産性が低下した。一方、本発明のΔｐｘａ１変異株は、Ｃ１２及びＣ１４脂肪酸を基質とした場合、Δｆｏｘ２変異株よりもソフォロリピッド生産性がさらに高かった。さらに、Δｐｘａ１変異株は、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸のいずれを基質とした場合でも、親株と比べて、ソフォロリピッド生産性が向上していた。

Claims

ソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物変異株であって、
ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子、又はＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化されており、
該ＰＸＡ１遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質であり、
該ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質である、
変異株。
前記スターメレラ属微生物がスターメレラ・ボンビコーラである、請求項１記載の変異株。
ソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物において、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子、又はＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化することを含み、
該ＰＸＡ１遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質であり、
該ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質である、
ソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物変異株の製造方法。
前記スターメレラ属微生物がスターメレラ・ボンビコーラである、請求項３記載の方法。
ソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物において、ＰＸＡ１遺伝子、ＰＸＡ２遺伝子、ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子、又はＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化することを含み、
該ＰＸＡ１遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子であり、
該ＰＸＡ１遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ２遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成してペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号２で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質であり、
該ＰＸＡ２又はそれに相当するタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ配列からなるタンパク質、又は配列番号４で示されるアミノ配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列からなり、かつＰＸＡ１又はそれに相当するタンパク質とヘテロダイマーを形成して、ペルオキシソームへＡｃｙｌ−ＣｏＡを輸送するトランスポーターとして働くタンパク質である、
ソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物のソフォロリピッド生産能の向上方法。
前記スターメレラ属微生物がスターメレラ・ボンビコーラである、請求項５記載の方法。
請求項１又は２記載のソフォロリピッド生産性スターメレラ属微生物変異株を培養することを含む、ソフォロリピッドの製造方法。
前記培養のための培地が、Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸及びそのアルキルエステル、Ｃ１２〜Ｃ２０アルカン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルケン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキン、Ｃ１２〜Ｃ２０アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含むトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロール、ならびにＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む油脂からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項７記載の方法。
前記培養のための培地がＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸又はそのアルキルエステルを含有する、請求項７記載の方法。