JP6563937B2 - 寛容原性組成物およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、アレルギー性疾患、特に喘息および食物アレルギーの予防または治療に関し、とりわけアレルゲンに対する過敏症、特に喘息疾患の予防および／またはアレルゲンに対する脱感作のために有用な組成物に関する。

アレルギー性喘息およびアレルギー性疾病の有病割合は、先進国および開発途上国において成人および小児ともに流行（ｅｐｉｄｅｍｉｃ）の域に達している（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：２２２６−２２３５）。このような公衆衛生上の重要な傾向の主要因としては、衛生設備の改良によって小児の早期感染または微生物への曝露がみられなくなったこと、および常在細菌叢の段階的な減少の双方が提示されている（Ｂｌａｓｅｒ，２００９，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：８８７−８９４）。２０１１年には、全世界で２億３５００万人から３億人の人々が喘息と診断されており、２５万人が死に至った。

現在、発展途上国において小児に最も蔓延している慢性疾病は喘息であり、全世界ではおおよそ３億人がこれに罹患している。喘息は、遺伝因子および環境因子の組み合わせによって引き起こされる。喘息管理の国際指針（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ）によれば、喘息は、気道における慢性の炎症性疾患と定義されている。慢性肺炎症は気道過敏症に付随し、喘息の古典的な症状である喘鳴、息切れ、胸部絞扼感および咳を反復性に起こす。最も一般的な臨床像はアレルギー性喘息である。小児の重篤な喘息患者のうち、アレルギー性のものは９０％を超えており、成人の喘息患者では６０％が空中アレルゲンに感作されている（Ｈｏｌｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２００３；２２：４７０−４７７）。アレルギー性喘息では、アトピー性の個体がアレルゲンに曝露されることによって、炎症および気道閉塞が誘発される。この疾病の基礎をなす病態生理は予想以上に複雑である。アレルギー性気道疾病の発生の基礎をなす炎症過程については、ヒトにおいても、およびこの疾病の動物モデルにおいても研究されてきた。ここ１０年間に、喘息の発生に関連する様々な細胞型およびメディエーターについての理解は深まった。実際に、アレルゲン誘導性の炎症および気道過敏症（ＡＨＲ）の発生に対して、Ｔｈ２細胞およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）が重要な役割を果たすことを支持する知見が存在する。

喘息の急性症状に対する最新の免疫調節性治療には、副腎皮質ステロイドの吸入または経口投与が含まれる。喘息患者は一般に、平滑筋細胞を弛緩させるβ２アドレナリン受容体アゴニスト（例えばサルブタモール）およびロイコトリエンに対して応答する。非常に重篤な症例では、副腎皮質ステロイド、またはインターロイキンに対する中和抗体のような免疫調節性薬物の静脈内投与、および入院が必要とされ得る。現在、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−５および抗ＩＬ−９モノクローナル抗体のすべてについて、喘息に対する治験が行われている。

ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの胃粘膜にコロニーを形成する持続性の細菌病原体である。ヘリコバクター・ピロリは、典型的には小児期の早期に獲得され、抗生物質療法を行わなければ、その宿主の生涯にわたって持続し得る。大部分がＴｈ１および／またはＴｈ１７に偏ったエフェクターＴ細胞によって駆動される活発な獲得免疫応答に対するＨ．ピロリの強力な抵抗能は、ヒトの自然免疫および獲得免疫系へのＨ．ピロリの適応、およびＨ．ピロリによるヒトの自然免疫および獲得免疫系の操作によるものと考えられてきた。Ｈ．ピロリはそのヒト宿主に少なくとも６万年の間コロニーを形成しており、この長期間にわたる共進化の間に、獲得免疫応答を全身的に操作するため、およびＴエフェクター細胞応答を介した免疫原性のＴ細胞応答を超えた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の優先的な誘導を通してＨ．ピロリの残留を促進するための、入念な方法が発達した。Ｔｒｅｇ優勢の応答は大量にコロニー形成された場合の特性であるが、保菌者は無症状である。

Ｈ．ピロリの生菌を、特に新生児期の間に実験的に感染させると、アレルゲンによる感作および誘発によって誘導されるアレルゲン誘導性喘息を効果的に防御可能であることが示されている（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２１：３０８８−３０９３）。機構的に、喘息の防御はＨ．ピロリに対する（Ｔｒｅｇを介した）免疫寛容の発達によるものであり、これによってアレルゲン特異的なＴｈ２応答も交差防御される。Ｈ．ピロリ生菌による防御効果は、抗生物質を用いた細菌の根絶療法によって無効となる（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，上記）。同様に、防御性Ｔｒｅｇの誘導にはｉｎ ｖｉｖｏでの生きた細菌が必要とされ、死菌の抽出物ではこれを達成できなかった。

免疫寛容に必要とされる決定的な細胞型として、Ｔｒｅｇの他には、樹状細胞（ＤＣ）が明らかとなった。Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨ．ピロリに遭遇したＤＣは、寛容性を促進する表現型へと再プログラムされる（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ，１１０（８），３０４７−３０５２）。ＤＣの再プログラムには、Ｈ．ピロリによって分泌される２種のタンパク質（病原性の決定要因または決定因子）である、空胞化サイトトキシン（ＶａｃＡ）およびγグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）が必要であることが観察されたが（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）、このことは、これら２種の病原性因子のうちの１つを欠失する（しかしその他の点では野生型である）Ｈ．ピロリの変異体はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウスのＤＣを再プログラムさせることができず、抑制活性を有するＴｒｅｇが誘導されないためである（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）。結果として、両方のＨ．ピロリ変異株はマウスによって効果的に除去される（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）。さらに、ＧＧＴおよびＶａｃＡの両方は、Ｈ．ピロリに対するワクチン誘導性の防御免疫を引き起こすために使用されてきたか、または使用されるべきであると報告されているが、これはすなわち本発明の目標とは逆の目標（Ｔｒｅｇの応答というよりも、強力なＴエフェクター）である（Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５（３）：７８７−９５）。

Ｈ．ピロリは胃潰瘍および十二指腸潰瘍を誘発し（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｌａｎｃｅｔ １：１３１１−１３１５）、かつＨ．ピロリが胃腺癌の主な原因であることも広く認識されていることから（Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：１１２７−１１３１）、この生物による慢性感染に発癌性の可能性があることは十分に報告されているため、Ｈ．ピロリの生菌を治療的介入または予防手段に用いることは、興味をそそられるものではない。さらに、Ｈ．ピロリを用いたこのようなワクチン接種戦略は、被験体のＨ．ピロリ感染を防御し、かつ免疫系の応答を回避するかまたは迂回するＨ．ピロリの能力を相殺し得るような免疫応答の誘導を目指していることへの留意が重要である。

今日の喘息治療は、すべてが多かれ少なかれ重篤な副作用を起こすため、その代わりとなる治療戦略が是非とも必要とされている。したがって、特に過敏反応を呈する素因のある小児および若年者の喘息発生を予防するため、および喘息が引き起こす症状を治療するための新しい戦略に対する重要な必要性がある。

本発明は、Ｈ．ピロリのＶａｃＡを含む組成物の経口、鼻腔内または腹腔内（すなわち全身性の）投与を規則的な間隔で行うことにより（投与は、例えば圧力式細胞破砕機「フレンチプレス」を用いて、対数増殖期にあるＨ．ピロリを機械的に破砕することによって調製した死細胞抽出物の形で、または精製タンパク質もしくは組換えタンパク質の形で行った）、アレルゲン誘導性喘息を防御できるという、予想外の知見に基づく。残留およびＴｒｅｇの誘導に必要とされる、この病原性の決定要因または決定因子の存在は以前から見出されていたが、これは病原性の決定要因であるＧＧＴと生きた状態の細菌との組み合わせによるものであり、喘息の防御には単独で十分であるということは予想できなかった。さらに、Ｈ．ピロリ特異的なワクチン接種についてのヒトの前臨床試験および第１相臨床試験にＶａｃＡを含めることに成功したという事実は、ＶａｃＡが免疫原性であり（少なくとも適切なアジュバントとの組み合わせにおいて）、かつＴ細胞および／または抗体を介した免疫を引き起こすことを立証するものである。アレルゲン特異的な免疫応答に必要とされる強力な免疫原性および強力な免疫調節性は、通常は相互排他的であり、典型的には同一のタンパク質に見出されるものではないことから、本発明の組成物の寛容原性は特に顕著である。本発明はさらに、ＶａｃＡの使用を通して、Ｈ．ピロリ感染に対する免疫応答を回避する末梢の寛容性を誘導することが可能であり、これによって、寛容原性による免疫調節の、どちらかと言えば非特異的な形を達成できるという予想外の知見に基づく。

本発明の第１の態様によれば、アレルギー性疾患、特にアレルゲン誘導性喘息もしくはアトピー性喘息の予防および／または治療に用いられる、ＶａｃＡタンパク質、その断片もしくは変異形から選択されるポリペプチド、またはその製剤が提供される。

本発明の第２の態様は、アレルゲンに対する寛容化応答を誘導するための、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドに関する。

本発明の第３の態様は、アレルギー性疾患、特にアトピー性喘息の予防および／または治療のため、および／またはアレルゲンに対する寛容化応答の誘導のための薬剤を調製するための、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドの使用に関する。

本発明の第４の態様は、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形、および少なくとも１つの、その薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬製剤に関する。

本発明の第５の態様は、アレルゲンに対する寛容化応答を被験体に誘導するための方法に関し、前記方法は、ＶａｃＡタンパク質、その断片もしくは変異形から選択されるポリペプチド、またはその医薬製剤の有効量を、それを必要とする被験体へ投与することを含む。

本発明の第６の態様は、被験体におけるアレルギー性の応答、特にアレルギー性疾患を予防、阻止または治療するための方法に関し、前記方法は、ＶａｃＡ、その断片もしくは変異形から選択されるポリペプチド、またはその医薬製剤の治療上有効な量を、それを必要とする被験体へ投与することを含む。

本発明の第７の態様は、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドと、アレルギー性疾患、特にアトピー性喘息の予防および／もしくは治療ならびに／またはアレルゲンに対する寛容化応答の誘導に有用な少なくとも１つの共薬剤と、少なくとも１つの、その薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを組み合わせて含む医薬製剤に関する。

本発明の第８の態様は、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形、またはアレルギー性疾患、特に喘息の予防および／もしくは治療のため、ならびに／またはアレルゲンに対する寛容化応答の誘導のための、その医薬製剤に関する。

実施例１に記載する本発明の組成物を用いた処置によって、実験的に誘導した喘息が緩和されたことを示す図である。Ｈ．ピロリの抽出物に接触させた群（−▲−）を、陽性対照（治療をしていない感作マウス）（−■−）および陰性対照（モックによる感作マウス）（−●−）に比較して示す。Ａ、Ｂ：それぞれ、メタコリンの漸増用量（［Ｃ］、ｍｇ／ｍｌによって示す）および１００ｍｇ／ｍｌの最高用量に対する気道過敏症の応答を示す（基線からの変化を％によって示しており、これはすべてのマウスについて個々に決定した）。Ｃ、Ｄ：１ｍｌのＢＡＬＦに含まれる全細胞数および好酸球数を示す。Ｅ〜Ｇ：Ｈ＆ＥおよびＰＡＳ染色した組織切片における２回の盲検実験によってスコア化した、組織炎症および杯細胞化生を示す。元の倍率を１００×（Ｈ＆Ｅ）および４００×（ＰＡＳ）として撮影した、代表的な顕微鏡写真をＧに示す。Ａ〜Ｆには、５回の独立した試験からプールしたデータを示す。Ｈ、Ｉ：卵白アルブミンによって再刺激した単一の肺細胞調製物からのＩＬ−５およびＩＬ−１３の分泌を、実施例１に記載するようにＥＬＩＳＡによって評価した。２回の試験からプールしたデータを示す。 図１ＡＢ参照 図１ＡＢ参照 死細胞抽出物によって誘導された喘息の防御には、ＩＬ−１０のシグナル伝達が必要であることを示す図である。Ａ、Ｂ：実施例２に記載する本発明のＨ．ピロリ死細胞抽出物に、表示する量（［Ｃ］）にて曝露した後の、マウス骨髄由来のＤＣ、および６名の健常志願者から得たヒト単球由来のＤＣによるＩＬ−１０の分泌を示す。Ａ：３回の実験のうちの、代表的な１回について示す。Ｂ：６名のドナーすべてについてプールしたデータを示す。Ｃ〜Ｆ：図１の記載に従って処置したマウスについて示す。表示する群は、実施例２に記載するプロトコルによる誘発期の間に、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体の用量を３回投与された。Ｃ、Ｄ：１ｍｌのＢＡＬＦに含まれる全細胞および好酸球を示す。Ｅ、Ｆ：組織炎症および杯細胞化生を示す。散布図において、各記号は１匹のマウスを示し、水平な線は中央値を示す。 図２ＡＢＣＤ参照 アレルゲン誘導性喘息のモデルにおけるアレルギー性気道疾病の防御に対し、ＶａｃＡは必要かつ十分であることを示した図である。アレルゲンによって感作および誘発されたマウスを、気管支肺胞および肺の炎症、好酸球増多症ならびに杯細胞化生から防御するために、ＶａｃＡ遺伝子を欠損するＨ．ピロリ変異体からの抽出物（「ｅｘｔｒ．ΔＶａｃＡ」）は、野生型からの抽出物（「ｅｘｔｒ．ｗｔ」）よりも常に効率的ではなかった（図３Ａ〜Ｄ）。防御のためにはＶａｃＡ単独で十分であるか否かについて調べるため、実施例１に記載するように、Ｈ．ピロリの培養上清から精製したオリゴマーＶａｃＡを、７日齢から毎週１回腹腔内投与した。最初の投与時の日齢が若かったにもかかわらず、どのマウスにも有害作用はみられなかった。ＶａｃＡは、喘息に対し、抽出物による処置と同程度の著しい防御を示した（図３Ａ〜Ｄ）。ＶａｃＡの細胞傷害性に必須であると報告されている３個のタンデムリピートのアミノ末端の疎水性領域（Ｖｉｎｉｏｎ−Ｄｕｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記）を欠損した陰性対照ＶａｃＡタンパク質、すなわち配列番号３（図５）に示す陰性対照ＶａｃＡタンパク質は、喘息を防御できなかった（図３Ａ〜Ｄ）。 図３ＡＢ参照 アレルギー性喘息に対する、精製したＶａｃＡの様々な濃度、投与経路および投薬計画による有益な効果を示した図である。上記のように調製したＶａｃＡを、様々な濃度および間隔によって、マウスに腹腔内投与または胃内投与した。７日齢から誘発の２週間前まで毎週１回５μｇのＶａｃＡを腹腔内投与すると（下付きの「ａ」によって示す）、気管支肺胞の炎症および好酸球増多症の防御に対して２０μｇのＶａｃＡと同程度に有効であった（図４Ａ、Ｂ）。胃内に（経口的に、ｐ．ｏ．）投与したＶａｃＡもまた（再び、７日齢から誘発の２週間前まで毎週１回送達した）、有意な防御を誘導した（図４Ａ、Ｂ）。ＶａｃＡの用量を３回腹腔内送達した場合（生涯の１、２および３週に送達、図４に下付きの「ｂ」によって示す）、完全な防御には不十分であった（図４Ａ、Ｂ）。卵白アルブミンによる誘発の間に、中和抗体の用量を２回腹腔内に送達してＩＬ−１０のシグナル伝達を遮断すると、防御は無効となった（図４Ａ、Ｂ）。 これらのデータは、精製した形のＶａｃＡの単独投与が、喘息に対して全細胞抽出物と同程度の防御を誘導し得ることから、アレルギー性喘息を阻止するためには、精製した形での投与が可能であることを予想外に支持するものである。 本明細書に記載するＶａｃＡポリペプチドのアミノ酸配列の例を示した図である。Ａ：配列番号１のｓ１ｍ１ ＶａｃＡ（Ｑ４８２４５ Ｈ．ピロリ株 ＡＴＣＣ４９５０３／６０１９０）。Ｂ：配列番号２のｓ２ｍ２ ＶａｃＡ。Ｃ：配列番号３の陰性対照変異体（Δ６−２７）ＶａｃＡ。Ｄ〜Ｋ：配列番号４ないし配列番号１１。 図５ＡＢ参照 図５ＡＢ参照 図５ＡＢ参照 図５ＡＢ参照 図５ＡＢ参照 実施例５に記載する、食物アレルギーの臨床スコア（Ａ）および全身性パラメータ（ＣないしＦ）に基づいた、Ｈ．ピロリ抽出物およびＨｐ ＶａｃＡの有益な効果を示した図である。これらのデータは、精製した形のＶａｃＡの単独投与が、食物アレルギーに対して全細胞抽出物と同程度の防御を誘導し得ることから、アレルギー性喘息を阻止するためには、精製した形での投与が可能であることを予想外に支持するものである。 図６ＡＢ参照 図６ＡＢ参照

用語「アレルギー性疾患」は、アレルゲン誘導性またはアトピー性喘息、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アトピー性鼻炎（枯草熱）、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、職業性アレルギー、アレルギー性気管支−肺アスペルギルス症および過敏性肺炎のような、アレルゲンに対するアレルギー性の状態および過敏症を指す。

用語「喘息」は、気管支平滑筋系をけいれんさせ、かつ上気道および下気道の両方に影響を及ぼす、気道炎症、過敏症および閉塞によって特徴付けられる気道疾患を指す。喘息には、重症度の違いによって特徴付けられる幾つかの型がある。例えば軽度の喘息は、呼吸困難もしくは咳を伴うかまたは伴わない、短時間の喘鳴の発症として定義される。中程度に重篤な喘息は、喘鳴および呼吸困難として定義され、咳および喀痰を伴うかまたは伴わないが、一般に日常活動および／または睡眠が妨げられる。重篤な喘息は、呼吸困難がもたらす無能力によって特徴付けられ、悪化した患者は、典型的には通常のように食事をしたり睡眠をとることが不可能になり、非常に不安であり、しばしば消耗する。喘息発作重積状態として知られる状態は、喘息の最も重篤な形であり、一般には入院による集中治療が必要とされ、致死的と判明することもある。この疾病は、アレルギー性および非アレルギー性両方の機構の結果として起こり得る。

用語「アレルゲン誘導性喘息」または「アトピー性喘息」は、抗原／アレルゲンに対する過敏症からもたらされる喘息を指す。これには、限定はされないが、樹木、草地、雑草もしくは薬草に由来する花粉、またはチリダニ、動物のフケ、ゴキブリ、真菌およびカビのようなその他のアレルゲン群を含む、吸入可能なすべてのアレルゲンが含まれる。さらに、小麦粉、大豆、ラテックスおよび様々なダニ（ケナガコナダニ、サヤアシニクダニ、アシブトコナダニ）のような、職業性アレルゲンも含まれる。アレルゲンに対する過敏症、特に抗原／アレルゲン誘導性喘息は通常、咳、くしゃみ、鼻または眼の刺激／かゆみ、流涙および鼻水の増大、湿疹による皮膚のかゆみ、ならびに食物アレルギーによる悪心、嘔吐、腹痛および腹部不快感および下痢のような症状のパターンに基づいて診断される。アトピー性喘息は、症状の頻度、努力呼気肺活量の１秒量（ＦＥＶ１）または最大呼気流量（ピークフロー）の減少、ピークフローのばらつきの増大、気道過敏症、およびアレルゲン特異的なＩｇＥ濃度の増大に従って臨床的に分類される。

用語「食物アレルギー」は、ある食物タンパク質に対する免疫系の反応によって引き起こされる、無害の食物に対するヒト免疫系の異常な応答を指し、これは通常、食物中に見出される特異的なアレルゲンに対して産生されるヒト抗体に関連する。一般的な食物アレルゲンの例としては、乳、大豆、魚類および甲殻類、種実類、ピーナッツ類、コムギ（グルテン）および卵の成分が挙げられる。

本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、その従来の意味、すなわちアミノ酸配列に対して用いられる。ポリペプチドは、産物の特定の長さに限定されない。したがって、ポリペプチドの定義の範囲内にはペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれ、特に指示のない限り、本明細書においてこれらの用語は互換的に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野において公知である、天然および非天然両方のその他の修飾を意味しないか、または除外する。ポリペプチドはタンパク質全体であってよいか、またはそのサブ配列であってよい。本発明に関連して、関心のもたれる特定のポリペプチドは、寛容原性の断片を含む、アミノ酸のサブ配列である。

用語「断片」は、本明細書で説明されるポリペプチドの連続するアミノ酸に対応するペプチド配列の一部を含むポリペプチドを指し、この用語には、すべての中間的な長さおよびその変異形が含まれる。

用語「ＶａｃＡ」には、ｓ１ｍ１ ＶａｃＡ（配列番号１、４〜１１）およびｓ２ｍ２ ＶａｃＡ（配列番号２）が含まれる。Ｃｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０５７０−１０５７およびＣｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８：７５９−７６９の記載参照。特定の実施態様によれば、ＶａｃＡは配列番号１のｓ１ｍ１ ＶａｃＡである。別の実施態様によれば、ＶａｃＡは配列番号２のｓ２ｍ２ ＶａｃＡである。別の実施態様によれば、ＶａｃＡは配列番号９のｓ１ｍ１ ＶａｃＡである。

用語「変異形」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの両方に適用される。本明細書で用いられる用語としてのポリペプチドの「変異形」は、参照とするペプチド配列と実質的に相同であるが、その参照とは異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドである。このような変異形は天然のものであってよいか、または例えば、当該技術分野において公知の多くの技術のうちのいずれかを用いて、本明細書に記載される、上記本発明のポリペプチド配列の１つ以上を改変することによって合成されてもよい。多くの場合、変異形は保存された置換を含み得る。実質的に相同とは、数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、または６アミノ酸の欠失、挿入および／または置換を除いて、参照ペプチド配列と同一である、変異形のアミノ酸配列を意味する。実質的に相同とは、参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である、変異形のアミノ酸配列を意味する。変異形の核酸配列は、参照核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であってよい。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性は、目視および／または数学的算出によるか、またはさらに容易には、Ｃｌｕｓｔａｌパッケージバージョン１．８３のような、配列比較のために用いられる既知のコンピュータプログラムを用いた配列情報の比較によって決定できる。

変異形は、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を有する配列を含んでよい。「保存された置換」とは、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標の性質が実質的に変化しない（例えば同様の生理化学特性を有する）ことを予想し得るような、アミノ酸の、同様の性質を有する別のアミノ酸への置換である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造には改変が為されてよく、この改変によって、所望の特性、例えば寛容原性を有する変異形または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子がなお得られる。同等か、または改良された、本発明のポリペプチドの寛容原性の変異形または部分を作り出すために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましい場合、当業者は、典型的にはコードするＤＮＡ配列のコドンを１つ以上変更するであろう。このような変更においては、アミノ酸の疎水性親水性指標、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質が考慮される。タンパク質に相互作用的な生物作用を付与するための、アミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ，ｅｔ ａｌ，１９８２，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１）。保存された置換の例としては、１つの脂肪族残基の、別の脂肪族残基への置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａの互いの置換、または１つの極性残基の、別の極性残基への置換、例えばＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの間の置換が挙げられる。その他のこのような保存された置換としては、例えば、同様な疎水性を有する領域全体の置換が知られている（Ｋｙｔｅ，ｅｔ ａｌ，１９８２，上記）。例えば「保存されたアミノ酸の置換」には、その位置のアミノ酸残基の極性もしくは電荷への影響が見られないかまたは少ないような、未変性のアミノ酸残基の変性残基による置換が含まれ得る。所望のアミノ酸の置換（保存されたかまたは保存されていない）は、このような置換の必要時に当業者によって決定され得る。代表的なアミノ酸の置換を以下の表１に示す。用語「変異形」にはまた、参照ペプチド配列と実質的に相同であるが、１つ以上のアミノ酸が化学的に改変されているか、またはアミノ酸類似体によって置換されているために、参照配列のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドも含まれる。この用語にはグリコシル化されたポリペプチドも含まれる。

一般に、元のポリペプチドに存在する１つ以上のアミノ酸に対する置換は、保存的に為されなければならない。本発明のポリペプチド、そのポリペプチド断片および変異形は、投与の際に、抗原／アレルゲンに対する寛容性を誘導することができる。

「寛容原性の断片」は、本出願に記載する抗原／アレルゲンに対する寛容性を誘導できる断片を意味する。特定の実施態様において、寛容原性の断片は、少なくとも完全長ＶａｃＡポリペプチドと同程度に、抗原／アレルゲンに対する寛容性を誘導でき、また特定の実施態様において、寛容原性の断片は、寛容性の誘導において完全長ＶａｃＡポリペプチドよりもさらに効果的であり得る。しかしながら特定の実施態様において、寛容原性の断片は、抗原／アレルゲンに対する寛容性を誘導するが、完全長ＶａｃＡポリペプチドほど効果的には寛容性を誘導し得ない。このような寛容原性の断片は特に、限定はされないが、完全長ＶａｃＡポリペプチドに比較して調製または精製が容易であることのような、その他の好都合な性質を有している場合に、本発明においてなお有用であり得る。当業者が認識し得るように、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答の測定、ＥＬＩＳＡまたはその他の方法によるサイトカイン産生の測定、Ｔ細胞増殖または細胞傷害性アッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産生などを含む様々な公知のアッセイを、寛容性の誘導を評価するために用いることができる。このようなアッセイは当該技術分野において公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。

本発明のポリペプチドは、様々な公知の合成および／または組換え技術のいずれかを用いて調製されるものであり、後者については以下に詳しく述べる。一般に１５０アミノ酸よりも短い、ポリペプチド、部分およびその他の変異形は、当業者に公知の技術を用いた合成手段によって産生できる。一実例によれば、このようなポリペプチドは、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸を連続的に付加するメリフィールド固相合成法のような（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１４６）、市販の固相技術を用いて合成される。

用語「薬剤的に許容される」は、生物学的に、またはその他の点で、望ましくないものではない物質によって構成される担体を指す。

用語「担体」は、医薬製剤中に存在する有効薬剤以外のいずれかの成分を指すことから、希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、注入剤、着色料、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存料などがこれに含まれる。

本明細書で用いられる、「治療」および「治療する」などは、一般に所望の薬理学的および生理的な効果を得ることを意味する。この効果は、疾病、その症状もしくは状態の予防または部分的予防の点から、予防的であってよく、かつ／または、疾病、状態、症状もしくは疾病に起因する有害作用の、部分的または完全な治癒の点から、治療的であってもよい。本明細書で用いられる用語「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾病のいずれの治療も網羅し、この用語は必ずしも治癒または症状の完全な消滅を意味することが意図されるものではないが、患者に利益を与えるどのような型の治療も指し、この用語には、（ａ）例えば家族歴、過体重状態または年齢に基づいて疾病にかかりやすい可能性があるが、まだ診断されていない被験体が、その疾病にかかるのを予防すること、（ｂ）疾病を抑制すること、すなわちその発生を停止させること、または疾病を軽減すること、すなわち損傷の改善または矯正のような、疾病および／またはその症状もしくは状態の後退を引き起こすことが含まれる。

特に、本発明よるアレルギー性疾患の予防および／または治療には、個体の抗原／アレルゲンに対する感受性を正常化させることまたは減少させることが含まれる。用語「治療」は、対象アレルゲン／アレルゲンに対する過敏な免疫応答をこうむっているか、またはそれを起こすリスクがある被験体に利益を与えるどのような型の治療または予防も指し、この用語には、被験体の（例えば１つ以上の症状における）状態の改善、症状の開始の遅延または症状の進行の遅延などが含まれる。特定の態様によれば、本発明によるアレルギー性疾患の予防および／または治療には、アレルゲンに対する末梢の寛容性を誘導することが含まれる。

一つの態様によれば、本発明による治療の効果は、気道過敏症の予防または減少、気管支内への細胞侵入の予防または減少（典型的には、Ｔｈ２細胞から産生され、アレルギー反応の炎症機構に関連するサイトカインであるＩＬ−４の産生を阻害する機能的な機構を通して）、アレルゲン誘導性喘息の特徴である、肺炎症、気管支肺胞の好酸球増多症、杯細胞化生、粘液産生およびＴｈ２サイトカイン産生の予防または減少、のうちの１つ以上を通して観察され得る。治療の成功は、調節性リンパ球もしくはその他の細胞、または肺全体（ＢＡＬＦ、痰）もしくは血清における、ＥＬＩＳＡによって評価可能なＩＬ−１０産生の観察によっても明らかにされ得る。

本明細書で用いられる用語「被験体」は哺乳類を指す。例えば、本発明が意図する哺乳類としては、ヒト、霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタおよびウマ、実験用げっ歯類などが挙げられる。

用語「高リスク」の被験体または個体は、アレルゲン／抗原に対する過敏症を発生するリスク、特にアトピー性またはアレルゲン誘導性喘息を発生するリスクがある被験体である。これらには、近い親類にみられるアトピー性疾患の家族歴のような遺伝的素因、妊娠中の母親の喫煙および出生後の喫煙環境、例えば呼吸器合胞体ウイルスおよびライノウイルスによる、ウイルス性の呼吸器感染症、および既知の職業性アレルゲン（例えば小麦粉）への職業性の曝露が含まれる。アレルゲン／抗原に対する過敏症を発生するリスクまたは素因、特にアトピー性またはアレルゲン誘導性喘息を発生するリスクまたは素因は、患者の家族歴を含む完全な病歴の記録、皮膚穿刺試験、血清ＩｇＥ、特異的な血清ＩｇＥ濃度の評価、および気道の反応亢進の測定によって評価できる。

本発明による治療または方法についての用語「有効性」は、本発明による使用または方法に応答した、疾病または状態の経過の変化に基づいて測定できる。例えば、本発明による治療または方法の有効性は、例えば以下に述べるように、被験体の寛容性の程度を治療の前後に測定することによって、測定できる。

本明細書で参照される用語「寛容性」は、抗原／アレルゲンに対する、通常は疾病の原因に関係する抗原／アレルゲンに対する、免疫の不応答性として定義される。寛容性は、様々な経路から投与された抗原／アレルゲンによって誘導され得るが、経口寛容性は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与した際の抗原／アレルゲンに対して寛容性の誘導をもたらす、組成物の経口投与を指す。したがって寛容性の誘導は、皮膚穿刺試験におけるアレルゲンへの応答の測定、アレルゲン特異的なＩｇＥの評価、およびアレルゲンに対する特異的なＴ細胞応答の評価（増殖およびサイトカイン産生）を含む、様々な技術によってモニターできる。

本明細書で用いられる用語「寛容原性に有効な量」は、ＶａｃＡ、ＶａｃＡ断片およびＶａｃＡ変異形から選択される少なくとも１つのポリペプチド、または本発明による医薬製剤の、投与された被験体に検出可能な寛容原性応答を誘発する量を指す。

本明細書で用いられる用語「抗原」は、体内に入った際に、疾病に対する身体防御の一部として、免疫系の応答を引き起こし、抗体産生をもたらす異物を指す。

用語「アレルゲン」は、動物またはヒトのような個体に、過敏な免疫応答（本明細書に記載されるような）を引き起こすことが可能な抗原を指すことが意図される。アレルゲンは感作アレルゲンまたは交差反応アレルゲンであってよい。

用語「未変性の」は、タンパク質（例えば構造）に変性が観察されないことを指す。このことは、ゲル電気泳動、ゲル濾過またはマススペクトロメトリーのような、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって確認できる。

本発明のポリペプチドおよびその製剤は、例えばアレルギー性疾患、特にアレルギー性喘息における寛容化戦略に有用となり得る免疫調節性を有する。本発明のポリペプチドおよびその製剤は、特に、高リスクの個体に対して喘息を予防するための寛容化治療に有用となり得る。

死細胞抽出物または精製ペプチドの形である、本発明のＶａｃＡポリペプチド
本発明のＶａｃＡポリペプチド、その断片および変異形としては、詳細な説明に記載した物質が挙げられ、これらは、ＶａｃＡを含む細胞抽出物（死細胞）の形、または精製した合成ポリペプチド（組み換えにより産生したか、または合成により得た）の形を含む、様々な形によって投与することができる。

一つの態様において、本発明は、Ｈ．ピロリ菌の死細胞抽出物の形である、その断片および変異形を含む本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。

さらなる態様において、本発明は、Ｈ．ピロリ菌の細胞抽出物の形であって、細菌細胞が未変性のＨ．ピロリ菌死細胞である、その断片および変異形を含む本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。

さらなる態様において、本発明は、Ｈ．ピロリ菌の死細胞抽出物の形であって、Ｈ．ピロリ菌株が、Ｈ．ピロリＰＭＳＳ１（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４０，１９９−２０９）、またはその他のいずれかの有用な、ヒト患者からのＨ．ピロリ分離株、遺伝子欠失もしくは挿入による変異誘発または点突然変異のために１つ以上の遺伝子を欠損した、前記分離株の変異体である、その断片および変異形を含む、本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。

Ｈ．ピロリ細胞抽出物を調製するために用いてもよい方法は当業者に公知であり、このような方法としては、未変性の細菌死細胞を産生する物理的手段の使用、すなわちＬａｅｍｍｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２７７，６８０−に記載されるような未変性の条件下での、例えばいわゆる「圧力式細胞破砕機」（Ｋｅｌｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．３５：４３１−１４１）の使用が挙げられる。

あるいは、超音波処理、または長時間の凍結乾燥、凍結および融解サイクルの反復、凍結乾燥、均質化技術、および物理的な力を用いたその他の細胞破砕技術のようなその他の方法を、それらの方法が、Ｈ．ピロリタンパク質をＢｈａｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６（４）：９４１−３に記載されるような未変性の形にとどめる限り、応用することができる。

別のさらなる態様において、本発明は、
（ｉ）生菌細胞の培養物を回収し、
（ｉｉ）当該回収した細菌を、水中または塩の水溶液中での、数回の凍結／融解サイクルに付し、
（ｉｉｉ）前記細菌細胞を高圧下で破砕し、
（ｉｖ）細胞抽出物を収集すること
を含んでなる方法によって得ることのできる、Ｈ．ピロリの細菌細胞抽出物の形である、本発明のＶａｃＡポリペプチドならびにその断片および変異形を提供する。

別のさらなる態様において、本発明は、細胞抽出物の収集後または収集時に細胞片を除去する工程をさらに含む上記の方法によって得ることのできるＨ．ピロリの細菌細胞抽出物の形である、本発明のＶａｃＡポリペプチドならびにその断片および変異形を提供する。

別の態様において、本発明は、精製したＶａｃＡポリペプチドの形である、その断片および変異形を含む本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。

別のさらなる態様において、本発明は、精製した組換えＶａｃＡポリペプチドの形である、その断片および変異形を含む本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。

別のさらなる態様において、本発明は、本質的に純粋な、すなわちＣａｇＡおよび、またはＮＡＰ（好中球活性化タンパク質）のような、抽出物に固有のその他の抗原成分を本質的に含まないＶａｃＡポリペプチド組成物の形である、その断片および変異形を含む本発明のＶａｃＡポリペプチドを提供する。例えば、このような本質的に純粋なＶａｃＡポリペプチド組成物は、単数又は複数の別の成分の遺伝子がノックアウトされた、例えばＣａｇＡ遺伝子がノックアウトされた変異Ｈ．ピロリ株から得ることができる。

本発明による、ＶａｃＡポリペプチド、その断片および変異形の組み換えによる調製は、当該技術分野において公知の様々な技術によって達成できる。前記ＶａｃＡポリペプチド、その断片および変異形をコードする核酸配列は、例えばＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４^ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１に記載されるような当業者に公知の方法によって、組換え発現ベクター内に挿入できる。

さらなる実施態様において、本発明による組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。

組換えベクターの宿主細胞への導入は、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２ｎｄ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５，およびＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（上記）に記載されるような当業者に公知の方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、微量注入法、陽イオン性の脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染によって行うことができる。

宿主細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、酵母細胞およびアスペルギルス、ストレプトマイセスの細胞のような真菌細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｃ１２７マウス細胞株、シリアンハムスター細胞のＢＨＫ細胞株、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞であってよい。特定の実施態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。

宿主細胞は、例えば本発明のポリペプチドを発現させるために用いることができる。標準的な方法による精製後、本発明のポリペプチドは、以下に記載する方法において用いることができる。

例えば組換えタンパク質を分泌する発現系を用いる際、培地は最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば限外濾過ユニットを用いて濃縮されてよい。濃縮工程に続いて、濃縮物は、ゲル濾過培地のような精製マトリックスへ添加されてよい。あるいは、陰イオン交換および／またはアフィニティー樹脂を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常用いられるその他の型であってよい。あるいは、陽イオン交換工程を用いてもよい。様々に組み合わせた前述の精製工程の幾つか、またはすべては公知であり、実質的に均質な組換えタンパク質を提供するために用いられてよい。

細菌培養液中に産生された組換えポリペプチドは、最初に宿主細胞を破砕し、遠心分離を行い、不溶性ポリペプチドの場合は細胞ペレットから、また可溶性ポリペプチドの場合は上清から抽出を行い、続いて１回以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程に供することによって分離できる。微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または物理的もしくは界面活性剤を含む化学的細胞溶解剤の使用を含む、いずれかの簡便な方法によって破砕できる。

別の態様において、本発明のＶａｃＡポリペプチドは、ＭｃＣｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１２１０１−１２１０８に記載されるように、完全長タンパク質として組み換えにより調製できるか、またはＧｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９：５７４３−５７５２およびＧａｎｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，ＰＮＡＳ，１０４（４１）：１６２９３−８に記載されるように、界面活性剤の存在下で、ＶａｃＡポリペプチドの２つのドメインであるｐ３３およびｐ５５を再構成することによって調製できる。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＶａｃＡポリペプチドの変異形または断片を提供する。通常本発明に包含されるポリペプチドの変異形は、本明細書で説明されるポリペプチド配列に対するその全長に沿って、典型的には少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれを超えた同一性（以下に述べるように決定した）を示す。

別の態様において、ＶａｃＡポリペプチド、その断片および変異形は、薬剤的に許容される塩または薬剤的に許容される複数の塩の組み合わせと共に用いることができる。

組成物
本発明は、ＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片、その医薬組成物、およびアレルゲン／抗原に対する過敏症、特にアレルゲン誘導性喘息もしくはアトピー性喘息または食物アレルギーを患っているか、または抗原／アレルゲンに対する過敏症を発症するリスクがある被験体、特に哺乳類被験体、最も特にヒト患者を治療するための方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、ＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片、その医薬組成物、および被験体の抗原／アレルゲンに対する過敏症を制御するための、特に前記抗原／アレルゲンに対する寛容性を誘導するための方法を提供する。

特定の実施態様において、本発明は、ＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片、および薬剤として使用するための、本発明による医薬製剤を提供する。

本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるいずれかの形である、本発明による少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片を含んでよい。特定の態様によれば、本発明の医薬組成物は寛容原性組成物である。特定の態様において、本発明の医薬組成物は、免疫調節を通して、末梢の寛容性を誘導し、かつ抗原に対する免疫応答を減少させることのできる寛容原性組成物である。特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、免疫原性エピトープまたはアレルゲンのような免疫原性成分を本質的に含まない、少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片を含む。

別の特定の態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片と、既知のアレルゲン、例えば乳、ピーナッツ、魚類または甲殻類、コムギ（グルテン）、大豆、卵などに由来するアレルゲンのような食物アレルゲンとの組み合わせを含む、寛容原性組成物である。

別の特定の態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片と、既知のアレルゲン、例えば草地、樹木、雑草などに由来する花粉のような、花粉に由来するアレルゲンとの組み合わせを含む、寛容原性組成物である。特定の態様によれば、このような寛容原性組成物は、免疫調節を通して、アレルゲン特異的な免疫寛容を誘導し、かつ免疫応答を減少させる能力を有する（脱感作もしくは減感作または免疫療法として知られる）。

特定の態様によれば、本発明の少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片は、既知のアレルゲン、特に食物アレルゲンと組み合わせて投与される。この組み合わせは、前記少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片とアレルゲンとの同時投与、または同じ単一製剤内の、前記少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片とアレルゲンの投与、または前記アレルゲンの一部の免疫原性成分に共有結合させた、前記少なくとも１つのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片の投与によって達成され得る。

本発明の組成物は、ミョウバン、安定剤、抗菌剤、緩衝液、着色料、香味料、アジュバントなどのような、薬剤的に許容される追加成分を１つ以上さらに含んでよい。

本発明による組成物は、従来から用いられるアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と共に、その医薬組成物および単位剤形の形にされてよく、このような形は、錠剤もしくは充填したカプセルのような固体、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤のような液体、またはこれらを充填したカプセルとして、経口用に用いられてよいか、または注射もしくは持続点滴による非経口用（皮下を含む）の無菌注射用溶液の形にされてもよい。注射用組成物は、典型的には、注射用の無菌生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水または当該技術分野において公知のその他の注射用担体に基づく。このような医薬組成物およびその単位剤形は、追加の有効化合物または原則が有るかまたは無い状態で、標準的な割合の成分を含んでよく、このような単位剤形は、使用が意図された一日投与量の範囲に釣り合った、有効成分のいずれかの適切な有効量を含んでよい。特定の実施態様によれば、本発明による組成物は注射用である。

本発明の組成物は、限定はされないが、水性または油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップおよびエリキシル剤のような液体製剤であってよい。該組成物はまた、使用前に水もしくはその他の適切なビヒクルによって再構成するための乾燥製品として処方されてもよい。このような液体製剤は、限定はされないが、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存料のような添加物を含んでよい。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルおよび食用の水素化脂質が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエートおよびアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。保存料としては、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。分散剤または湿潤剤としては、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる材料および製剤の加工技術などについては、参照として本明細書に取り込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ“Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓの第５部に説明される。

本発明の組成物はまた、埋め込みまたは筋肉内注射によって投与され得るデポ製剤として処方されてもよい。

本発明の固体組成物は、従来の様式で処方された錠剤または舐剤の形であってよい。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、限定はされないが、結合剤、注入剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤のような従来の賦形剤を含んでよい。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの漿剤およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。注入剤としては、、ラクトース、糖、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウムおよびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。錠剤は、当該技術分野において公知の方法に従ってコートされてよい。

本発明の組成物はまた、吸入のために処方されてもよく、限定はされないが、乾燥粉末として、または噴霧剤を用いるエアロゾルまたはスプレーのような形で投与されてよい、溶液、懸濁液またはエマルションの形であってよい。

本発明の化合物は、持続放出剤形によって、または持続放出薬物送達システムから、投与することもできる。

特定の実施態様において、単数または複数の治療用化合物は、加圧エアロゾルまたは噴霧製剤として、吸入を通して患者の肺へ直接投与される。このような製剤は肺内および／または鼻腔内吸入投与に有用な、様々な公知のエアロゾル噴霧剤のいずれかを含んでよい。加えて、様々な共溶媒、界面活性剤、安定剤（例えば抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスおよび緩衝液）のいずれかと共に、またはこれらなしで、水が含まれ得る。容器から複数回の用量が投与される組成物には、抗菌剤が典型的に添加される。このような組成物はまた、一般に濾過および滅菌され、安定性を増大させ、かつ溶解度を改善するために凍結乾燥され得る。

本発明の医薬組成物は、エアロゾルとして投与できる投与量単位からなってよい。エアロゾルとの用語は、コロイド性のシステムから、加圧パッケージからなるシステムまで、広範囲にわたるシステムを意味するために用いられる。送達は、液化もしくは圧縮ガス、または有効成分を分配する適切なポンプシステムによって行われてよい。本発明の化合物のエアロゾルは、単数または複数の有効成分を送達するため、単相性、二相性、または三相性のシステムによって送達され得る。エアロゾルの送達には、共にキットを構成し得る、必要な容器、活性剤、バルブ、副容器などが含まれる。当業者は、過度な実験なしに好ましいエアロゾルを決定し得る。

一つの態様によれば、本発明は経口用の医薬組成物を提供する。

一つの態様によれば、本発明は注射用の医薬組成物を提供する。

一つの態様によれば、本発明は吸入用の医薬組成物を提供する。

本明細書の他所に記載するように、特定の実施態様において、本明細書で用いられるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片、その医薬組成物の予防上／治療上有効な用量は、本明細書に記載される様々な方法のいずれかを用いて測定した、抗原／アレルゲンに対して寛容性を誘導するために十分な用量である。さらなる実施態様において、本明細書で用いられるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片、その医薬組成物の予防上／治療上有効な用量は、本明細書に記載される様々な方法、例えばサイトカイン放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーなどのいずれかを用いて測定した、抗原／アレルゲンに対してＴ細胞寛容性を誘導するために十分な用量である。エフェクターＴ細胞と共培養することによって増殖またはサイトカイン分泌の抑制を測定する、機能的Ｔ細胞アッセイ、Ｔ細胞抑制アッセイもまた用いられてよい。

投与の方法
本発明のポリペプチドおよび組成物は、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経口経路、鼻腔内投与、肺内注入または吸入を含むいずれかの方法によって投与されてよい。特定の実施態様において、異なる経路の組み合わせもまた用いられてよい。

ポリペプチドおよび組成物の正確な用量は、特定のポリペプチドおよび組成物の効力、被験体の年齢、体重、性別および生理的状態と共に、本明細書の教示に基づき、当業者によって容易に決定される。

例として、様々な実施態様において、被験体の寛容性を達成する（または維持する）ために必要とされる寛容化ポリペプチドおよび組成物の投与量は、従来の寛容化療法に比較して少ない。例えば、薬剤のわずか１用量か、または少数の用量（例えば約３用量よりも少ないか、または約５用量よりも少ない）が、寛容性の誘導に十分であり得る。例として、寛容化の効果を達成するためには、毎週１回約５ないし約５００ｍｇ／用量が用いられ得る。

一つの実施態様によれば、本発明のポリペプチドおよび組成物は、アレルギーの症状の出現もしくはアレルゲンへの曝露による誘発の前か、またはアレルギーの症状の出現時もしくはアレルゲンへの曝露時に投与される。例えば、本発明のポリペプチドおよび組成物は、典型的には、花粉アレルギーのような季節性アレルギー性疾患にかかるリスクがある患者の場合には、被験体が単数または複数のアレルゲンに曝露される前に、またはアトピー性喘息のようなアレルギー性疾患にかかるリスクがある（例えば遺伝的または環境的リスク）幼児の場合には、患者がアレルギーの症状を示す前に、投与される。例えばＰｆｅｆｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１（６）：１４５３−６３に記載されるように、アトピーのリスクがある妊婦への投与（経口、鼻腔内またはその他のいずれかの経路を通した）もまた同様に計画することができ、これは単独で、または新生児に対する継続治療と組み合わせて行われる。

さらなる実施態様によれば、本発明のポリペプチドおよび組成物は、通常のアレルゲン曝露期間の前の、少なくとも２週間（例えば約２ないし約１２週間）投与される。さらなる実施態様によれば、本発明のポリペプチドおよび組成物は、アレルゲン曝露の前、および／またはアレルゲン曝露まで、および／またはアレルゲン曝露の間を通して、例えば週に約１回または２回ないし月に約１回または２回、繰り返して投与される。新生児の喘息およびアレルギー性のリスクを減少させる目的で妊婦への投与を行う場合、投与は早期に、理想的には妊娠第一期に開始しなければならない（Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）。

組み合わせ
本発明によるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片およびその医薬製剤は、単独で、または過敏症、特にアトピー性喘息のようなアレルギー性疾患の予防および／または治療に有用な共薬剤、例えば気管支拡張薬、抗原／アレルゲンに対する寛容化に有用な共薬剤、例えば抗体または共刺激もしくは共阻害によって干渉する（例えばＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ４０ならびにリンパ球およびその他の免疫細胞に発現するその他のものを通して）その他の試薬による減感作に用いられる共投与アレルゲンから選択される共薬剤と組み合わせて投与できる。

本発明は、個体へのＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片およびその医薬製剤の投与に先立ち、それと同時にまたは連続的に、抗原／アレルゲン過敏症、特にアトピー性喘息のようなアレルギー性疾患を予防もしくは治療するための、その他の治療上の／予防的な／免疫療法または共薬剤を、治療上有効な量投与すること（例えば併用寛容化措置）を包含する。前記共薬剤と同時に投与されるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片およびその医薬製剤は、同じかまたは異なる単数もしくは複数の組成物として、かつ同じかまたは異なる単数もしくは複数の投与経路によって投与できる。

別の態様によれば、本発明によるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片は免疫療法に用いられてよく、ここで本発明によるＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片は、広範囲の抗原（アレルゲン）のうちの少なくとも１つの抗原に付随する。Ｈ．ピロリ抽出物またはＶａｃＡポリペプチドは、チリダニアレルゲン、花粉由来のアレルゲン、または上に挙げたいずれかの食物アレルゲン（ピーナッツ、乳、大豆由来の、またはその他の）、またはアレルゲン特異的な様式で脱感作（減感作）を促進するその他のいずれかのアレルゲンと混合し、投与されてよい（Ｋｈｉｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｌｌｅｒｇｙ，５９（１）：４５−５３）。

一つの実施態様によれば、ＶａｃＡポリペプチド、その変異形または断片を、過敏症、特にアトピー性喘息のようなアレルギー性疾患の予防および／または治療に有用な少なくとも１つの共薬剤、および少なくとも１つの、その薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬製剤が提供される。

単回または複数回の用量として個体へ投与される投与量は、薬物動態特性、患者の状態および特性（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、併用治療、治療頻度および望まれる効果のような、様々な因子に応じて変動し得る。

患者
一つの実施態様において、本発明に従った患者は、アレルゲン誘導性またはアトピー性喘息（湿疹）、アトピー性皮膚炎（枯草熱）、アトピー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、職業性アレルギー、アレルギー性気管支−肺アスペルギルス症および過敏性肺炎のようなアレルギー性疾患から選択される疾患にかかった患者である。

別の実施態様において、本発明に従った患者は、アレルギー性疾患にかかるリスクがある患者である。

別のさらなる実施態様において、本発明に従った患者は、アレルゲン誘導性またはアトピー性喘息にかかった患者である。

別の実施態様において、本発明に従った患者は、食物−花粉アレルギーを含む花粉アレルギーのような、季節性アレルギー性疾患にかかるリスクがある患者である。

別のさらなる実施態様において、本発明に従った患者は、小児または幼児、例えば約３歳未満の幼児である。

別のさらなる実施態様において、本発明に従った患者は、アトピーの高リスクがある妊婦、またはアトピーの高リスクがある小児の母である妊婦であって、これらは妊娠期間中に治療されてよい。

別のさらなる実施態様において、本発明に従った患者は、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎から選択されるアレルギー性疾患にかかっている。

別のさらなる実施態様において、本発明に従った患者は、食物アレルギーを患っている。

本発明による使用
本発明の一つの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドもしくは製剤または組み合わせの使用により、少なくとも１つの抗原／アレルゲンに対して被験体を寛容化させるか、または前記被験体に寛容化応答を誘導するための方法が提供される。本発明によるポリペプチド、製剤または組み合わせは、被験体に寛容性を誘導するために有効な投与計画に従った量によって投与される。

本発明の一つの実施態様において、アレルギー性疾患またはアレルギー性の応答、特にアトピー性喘息の予防、阻止および／または治療のための医薬組成物を調製するための、本発明によるポリペプチドまたはその製剤の使用が提供される。

本発明の別の実施態様において、アレルゲン過敏症の阻止または治療のための医薬組成物を調製するための、本発明によるポリペプチドまたはその製剤の使用が提供される。

本発明の別の実施態様において、被験体を寛容化させるか、または前記被験体に寛容化応答を誘導するための、本発明によるポリペプチドまたはその製剤の使用が提供される。

本発明の別の実施態様において、被験体を寛容化させるか、または前記被験体に寛容化応答を誘導するための方法が提供され、前記方法は、本発明によるポリペプチドまたはその製剤の有効量もしくは寛容化する量を、それを必要とする被験体へ投与することを含む。

別の実施態様において、本発明は、被験体におけるアレルギー性の応答、特にアレルギー性疾患、特にアトピー性喘息を予防、阻止または治療するための方法を提供し、前記方法は、本発明によるポリペプチド、その断片または変異形、または本発明による医薬製剤の、治療上有効な量を、それを必要とする被験体へ投与することを含む。

別の実施態様によれば、本発明は、被験体におけるアレルゲン不耐性を治療するための方法を提供し、前記方法は、前記被験体において前記アレルゲンに対する寛容性を誘導するために有効な量の、本発明によるポリペプチドまたはその組成物と、単数または複数の、アレルゲンもしくは抗原性の成分またはその断片もしくは類似体とを、前記被験体へ連続的または同時に投与することを含む。

本発明のさらなる実施態様において、本発明による使用または方法が提供され、ここで被験体は、例えば家族歴、過体重状態または年齢に基づいて、アレルギー性疾患、特にアトピー性喘息にかかりやすいか、またはこれを発生するリスクがある。

別の実施態様によれば、本発明は、ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドと、アレルギー性疾患、特にアトピー性喘息の予防、阻止および／もしくは治療ならびに／またはアレルゲンに対する寛容化応答の誘導に有用な少なくとも１つの共薬剤と、少なくとも１つの、その薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを組み合わせて含む医薬製剤に関する。

別の実施態様において、本発明による使用または方法が提供され、ここで本発明のポリペプチドまたは組成物は、アレルゲンと組み合わせて用いられる。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここで前記ポリペプチドまたはその組成物は、経口、鼻腔内、肺内、非経口または全身性の経路によって投与される。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここでＶａｃＡはｓ１ｍ１ ＶａｃＡである。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここでＶａｃＡはｓ２ｍ２ ＶａｃＡである。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここでＶａｃＡは、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含むＶａｃＡタンパク質である。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここでＶａｃＡは、配列番号１またはその断片もしくは変異形のアミノ酸配列を含むＶａｃＡタンパク質である。

別の実施態様において、本発明によるポリペプチド、組成物または方法が提供され、ここでＶａｃＡは、配列番号２またはその断片もしくは変異形のアミノ酸配列を含むＶａｃＡタンパク質である。

別の実施態様において、第１区画または一連の区画が、ポリペプチド、その断片もしくは変異形、その組成物を含み、第２区画または一連の区画が、アレルゲンもしくはアレルゲン源または抗原性断片、それらの成分または類似体を含む区画の形を、使用説明書と共に含む、医薬キットが提供される。

以下、本発明を例証する実施例を、さらに詳細に、図面において説明される実施態様への参照によって記載する。

略語は、それぞれ以下のように定義される。
ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）、ＢＣＡ（ビシンコニン酸アッセイ）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）、ｉ．ｐ．（腹腔内に）、ＭＣＴＰ１（肥満細胞プロテアーゼＰ１）、ＭＬＮ（腸間膜リンパ節）、ＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液硫酸塩）、ＲＰＭＩ（ロイヤルパーク記念研究所（培地）。

実施例１：アレルゲン誘導性喘息におけるＨ．ピロリ死細胞抽出物
Ｈ．ピロリ死細胞抽出物の形で提供される本発明の組成物の定期的な投与によって、喘息のようなアレルゲン誘導性の応答を防御可能であるか否かを評価するため、以下のモデルを使用した。以下に述べるように、マウスに、その７日齢から、卵白アルブミンによる感作と、ミョウバンをアジュバントとした卵白アルブミンによる誘発とを行う前まで、死細胞全抽出物（以下に述べるように調製した）の用量を、毎週胃内投与した。卵白アルブミンを投与されたが、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物は投与されなかった対照マウスは、メタコリンに対して気道過敏症を発生し（図１Ａ、Ｂ）、かつ気管支肺胞洗浄によって回収した細胞の染色および定量化によって測定されたように、気管支肺胞の免疫細胞浸潤および好酸球増多症を示し（図１Ｃ，Ｄ）、またＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色パラフィン切片を用いた組織学的評価およびスコア化によって決定されたように、肺炎症および杯細胞化生を示した（図１Ｅ〜Ｇ）。肺調製物の単一細胞を卵白アルブミンを用いて再刺激すると、ＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアレイによって測定されたように（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、製造者による指示に従った）、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−５およびＩＬ−１３の、高濃度の産生が誘導された（図１Ｈ、Ｉ）。対照的に、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物を投与されたマウスは、気道過敏症から防御され（図１Ａ、Ｂ）、気管支肺胞および肺の炎症、好酸球増多症ならびに杯細胞化生の程度が有意に低下した（図１Ｃ〜Ｇ）。アレルゲンを用いて肺調製物を再刺激した後のＴｈ２サイトカインの産生については、ＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアレイによって低下が示された（図１Ｈ、Ｉ）。死細胞抽出物によって処置されたマウスが、喘息のアレルゲン誘導性の症状を示さなかったことは、ＥＬＩＳＡによって測定した卵白アルブミン特異的な血清ＩｇＥ濃度が、すべての感作マウスにおいて同等であったことから、アレルゲンに対する一次応答の障害によるものではなかった。

観察された効果の特異性について取り組み、かつ防御の鍵となる必要条件を解明するため、様々な投与経路および投与計画、治療開始時の年齢、およびその他の胃腸病原体からの抽出物について調べた。興味深いことに、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物の全身性（腹腔内）投与によるアレルゲン誘導性喘息からの防御は、胃内経路と同程度に効率的であった。胃を通した処置を成体マウスに対して開始した場合、新生仔の場合に比較して効果は少なかった。熱により不活性化したＨ．ピロリ抽出物、およびＥ．ｃｏｌｉまたはネズミチフス菌の培養から産生した同量の抽出物を用いて試験を行ったが、アレルギー性気道疾病の特徴からの防御はみられなかった。

結論として、死細胞抽出物による処置の有益な効果は、Ｈ．ピロリ特異的であり、細菌の熱感受性成分を必要とし、若齢マウスに処置を開始した場合に最も顕著である。

Ｈ．ピロリ死細胞抽出物の調製ならびにＧＧＴおよびＶａｃＡの精製
ｓ２ｍ２ ＶａｃＡを分泌するＨ．ピロリ株ＰＭＳＳ１（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．２０１１，上記）を、１０％ＦＣＳを加えたブルセラブロス中で培養し、遠心分離によってペレットにした後、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。細菌を３回の凍結／融解サイクルに供した後、圧力式細胞破砕機（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）に、３０．０００ ｂａｒにて３回通して破砕した。遠心分離によって細胞片を除去した後、上清を２μｍのフィルターを通して濾過し、本実施例で用いる死細胞抽出物を得た。ＢＣＡタンパク質キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてタンパク質濃度を決定した。

以前に公開された手順（Ｃｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０５７０−１０５７；Ｃｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８：７５９−７６９）を、以下に述べるようにわずかに改変し、これを用いてＨ．ピロリ培養上清からＨ．ピロリのＶａｃＡを精製した。最初に記載されたのが１９９０年である（Ｃｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：６０３−６１０）、Ｈ．ピロリ株 ＡＴＣＣ４９５０３／６０１９０を、コレステロールまたは０．５％チャコールのいずれかを含み、亜硫酸塩を含まないブルセラブロス中で培養した。培養液を遠心分離した後、硫酸アンモニウムの５０％飽和溶液を用いて上清中のタンパク質を沈殿させた。オリゴマーの形であるＶａｃＡを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ１６／５０カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって、０．０２％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に分離した。

動物実験
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＬ／６．ＢＡＴＦ３−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、Ｈ．ピロリ株ＰＭＳＳ１（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，上記）を上記のように経口感染させたか、またはＨ．ピロリ野生型ＰＭＳＳ１、ＶａｃＡ遺伝子を欠損した変異株（ＰＭＳＳ１ΔＶａｃＡ）（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）、ネズミチフス菌、もしくはＥ．ｃｏｌｉの死細胞抽出物（上記のように調製した）を、２００μｇの用量で、毎週１回経口もしくはｉ．ｐ．投与したか、または上で説明したように産生したｓ１ｍ１型ＶａｃＡ（配列番号１）−野生型もしくはＶｉｎｉｏｎ−Ｄｕｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３７７３６−３７７４２に記載される、配列番号３の、Ｈ．ピロリ株ＡＴＣＣ４９５０３／０１９０から精製した欠失変異形Δ６−２７を、２５μｇの用量で、毎週１回ｉ．ｐ．投与した。

マウスの８週齢および１０週齢時に、ミョウバンをアジュバントとした卵白アルブミン（２．２５ｍｇの水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）に乳化した２０μｇの卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を腹腔内注射することによって感作を行い、感作後３１、３２および３３日目に、超音波噴霧器（ＮＥ−Ｕ１７、Ｏｍｒｏｎ）を用いて、１％エアロゾル化卵白アルブミンを１日に２０分間噴霧することにより誘発を行った。陰性対照として非感作マウスを用いた。１群には、７日齢から２回目の感作まで、毎週１回２００μｇ用量のＨ．ピロリ死細胞抽出物を胃内投与した。

麻酔し、挿管し、機械的に酸素供給したマウスの気道抵抗測定を行い、気道抵抗は、漸増用量のメタコリンの吸入に対する応答によって記録した（測定にはＢｕｘｃｏ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓのＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いた）。

実施例２に記載する、ＩＬ−１０シグナル伝達のｉｎ ｖｉｖｏにおける遮断は、誘発期の間に２５０μｇの抗ＩＬ−１０Ｒ抗体（クローン１Ｂ１．３Ａ、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を３回ｉ．ｐ．注射することによって達成した。１ｍｌのＰＢＳを用い、気管を通して肺を洗浄した。トリパンブルー色素排除を用いて、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞を計数した。細胞を遠心分離し、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ（登録商標）Ｓｅｔ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて染色した調製物に対して、マクロファージ、リンパ球、好中球および好酸球の差次的な細胞計数を行った。肺の病理組織診断のため、肺を膨張させて固定し、１０％ホルマリンに浸漬した後、パラフィン中に包埋した。Ｈ＆Ｅおよび過ヨウ素酸シッフを用いて組織切片を染色し、ＢＸ４０オリンパス顕微鏡を用いて盲検を行った。気管支周囲の炎症を０ないし４の基準でスコア化した。基底膜１ｍｍあたりのＰＡＳ陽性杯細胞を数量化した。

実施例２：ＩＬ−１０産生における細胞抽出物の役割
Ｈ．ピロリは、様々な免疫細胞分画にＩＬ−１０の産生を誘導すること（Ｓａｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８６：８７８−８９０）、および胃内の高濃度のＩＬ−１０は、Ｈ．ピロリを確実に残留させ、かつＨ．ピロリ特異的な免疫寛容を促進することが知られている（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，上記）。

ＤＣが、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物に応答してＩＬ−１０を産生するか否かについて評価するため、上記のように調製した死細胞抽出物の濃度を漸増させ、マウス骨髄（ＢＭ）由来の培養ＤＣを処理した。実際に、ＢＭ−ＤＣは大量のＩＬ−１０を産生および分泌し、これはＴＬＲ２およびＭｙＤ８８のシグナル伝達に依存するものであった（図２Ａ）。Ｈ．ピロリ死細胞抽出物と共に培養した、６名の独立したドナーから得たヒト血液由来のＤＣにおいてもまた、ＩＬ−１０のはっきりとした用量依存性の分泌が観察された（図２Ｂ）。死細胞抽出物が誘導する寛容化による喘息の防御にＩＬ−１０が必要であるか否かについて取り組むため、２用量のＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）中和抗体を、新生仔期からそれ以降に死細胞抽出物を投与されたマウスへ、プロトコルの誘発期の間に投与したところ、喘息の防御にはＩＬ−１０シグナル伝達が必要であることが示された（図２Ｃ〜Ｆ）。

要約すると、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物はマウスおよびヒトＤＣの両方にＩＬ−１０産生を誘導することができ、アレルギー性喘息に対する死細胞抽出物を用いた治療の有益な効果は、宿主のＩＬ−１０シグナル伝達能に依存するものである。

マウスおよびヒトＤＣの調製ならびにＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ
マウスＢＭ−ＤＣを産生するため、ドナーマウス（ＢＬ／６．ＴＬＲ２−／−、ＢＬ／６．ＴＬＲ４−／−、ＢＬ／６．ＭｙＤ８８−／−マウス、すべてＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手した）の後肢から分離した骨髄を、９６ウェルプレート内の、４ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦを加えたＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中に、１ウェルあたり５０．０００細胞まき、５日間培養した。上記のように調製したＨ．ピロリＰＭＳＳ１抽出物を、表示する量用いて、ＤＣを１６時間刺激した後、上清をｍＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に供した。以下に述べるようにして、末梢血単核細胞からヒト単球由来の樹状細胞を得た。ライデン大学病院治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）によって承認されたプロトコルに従い、６名の健常志願者から静脈血を採取した。Ｆｉｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離後に細胞を収集し、ＣＤ１４マイクロビーズを用いた磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により、ＣＤ１４＋単球をポジティブに分離した。ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ピルビン酸塩（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、グルタミン酸塩（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２０ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ−ＣＳＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．８６ｎｇ／ｍｌ ヒトｒＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、細胞を６日間培養した。３日目に、培地および補充物を新しくした。Ｈ．ピロリ死細胞抽出物によって、単球由来のＤＣを４８時間刺激した。ＤＣによる上清中へのＩＬ−１０の分泌を、ＥＬＩＳＡ（Ｓａｎｑｕｉｎ）によって測定した。

新生児および成人の寛容化を成功させるための差次的な感受性は、Ｔｒｅｇ／Ｔエフェクター細胞の比が高く、外来抗原に対する応答がＴｒｅｇ優勢である、未熟な新生児免疫系の全般的な寛容原性バイアスに起因すると考えられる（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６：４０６−４１１）。これまでに報告されている、ヒトについての平行した観察によれば、Ｈ．ピロリに感染した小児は、Ｔｒｅｇが優勢で、かつ胃のＨ．ピロリ特異的なＴ細胞応答によって特徴付けられるが、成人はそうではない（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３４：４９１−４）。小児は、その喘息リスクの点から、体内にＨ．ピロリを有することによって、成人よりも利益を得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６７：８２１−８２７）。同様に、青年期および若年成人における早発性喘息は、成人に発病した喘息よりも、Ｈ．ピロリの血清陽性に対してさらに強く逆相関している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９８：５５３−５６０）。このように、入手可能な疫学および実験データは、小児期におけるＨ．ピロリへの感染、および若年期の感染に伴うＴｒｅｇ優勢な免疫応答が、アレルゲン特異的なＴ細胞応答の抑制を介して、喘息およびその他のアレルギー性疾病の徴候のリスクを減少させることを示唆している。

本明細書に提示するデータは、喘息を発生するリスクの高い小児が、成人よりも、本発明の寛容化戦略から利益を受ける可能性が高いことを示唆している。

実施例３：本発明に由来する、精製した形のＶａｃＡポリペプチドおよびその切断型変異形の役割
抽出物を用いた寛容化によって付与された喘息の防御には、精製したポリペプチドの形であるＶａｃＡが単独で貢献している可能性を支持するため、野生型細菌およびＶａｃＡ欠損の同質遺伝子変異体（上に述べた）からの細菌抽出物（上記のように調製した）の防御特性を比較した。興味深いことに、アレルゲンによる感作および誘発を受けたマウスを、気管支肺胞および肺の炎症、好酸球増多症および杯細胞化生から防御する点において、変異体の抽出物の効率は、野生型の抽出物よりも一貫して低かった（図３Ａ〜Ｄ）。防御のためにはＶａｃＡ単独で十分であるか否かを調べるため、Ｈ．ピロリの培養上清から上記のように精製したオリゴマーのＶａｃＡを、７日齢以降に毎週１回腹腔内投与した。最初の用量投与時に若齢であったにもかかわらず、いずれのマウスにも有害作用は観察されなかった。ＶａｃＡは、抽出物を用いた処置によって与えられた防御作用に匹敵する程度の、喘息に対する著しい防御を提供した（図３Ａ〜Ｄ）。

ＶａｃＡの細胞傷害性に必須であると報告されている３個のタンデムのアミノ末端の疎水性領域（Ｖｉｎｉｏｎ−Ｄｕｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記）を欠損した陰性対照ＶａｃＡ欠失タンパク質、すなわち配列番号３（図５）に示す陰性対照ＶａｃＡタンパク質は、喘息を防御できない（図３Ａ〜Ｄ）。

実施例４：本発明に由来する、精製した形のＶａｃＡポリペプチドの、様々な濃度および送達経路における役割
最少有効用量、必要とされる用量の回数および至適な送達経路を明らかにするため、上記のように調製した精製ＶａｃＡを、上記のように様々な濃度および間隔によって、マウスに腹腔内投与または胃内投与した。７日齢から誘発の２週間前まで毎週１回５μｇのＶａｃＡを腹腔内投与すると（図４に下付きの「ａ」によって示す）、気管支肺胞の炎症および好酸球増多症の防御に対して、２０μｇのＶａｃＡと同程度に有効であった（図４Ａ、Ｂ）。胃内に（経口的に、ｐ．ｏ．）投与したＶａｃＡもまた（再び、７日齢から誘発の２週間前まで毎週１回送達した）、有意な防御を誘導した（図４Ａ、Ｂ）。ＶａｃＡの用量を３回腹腔内送達した場合（生涯の１、２および３週に送達、図４に下付きの「ｂ」によって示す）、完全な防御には不十分であった（図４Ａ、Ｂ）。卵白アルブミンによる誘発の間に、中和抗体の用量を２回腹腔内に送達してＩＬ−１０のシグナル伝達を遮断すると、防御は無効となった（図４Ａ、Ｂ）。

これらのデータから、精製した形のＶａｃＡを単独で投与した場合に、細胞全抽出物と同程度に喘息を防御可能であることが予想外に支持されるため、アレルギー性喘息を阻止するためには、精製した形で投与してもよい可能性がある。

これらの所見は、Ｈ．ピロリ生菌の抽出物のみがＴｒｅｇの誘導能を示すと考えられていたこと、および、特にｇｇｔ遺伝子を欠損した変異体はマウスにおいて持続的にコロニーを形成できないことが観察されており、かつこの表現型はＧＧＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣの寛容化に帰するものであるため（Ｏｅｒｔｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，上記）、ＶａｃＡ単独で、喘息の防御に十分であるとは予想されていなかったことから、特に予想外であった。

これらのデータをまとめると、本発明の組成物による喘息の防御は特異性が高く、Ｅ．ｃｏｌｉまたはネズミチフス菌のような、その他のグラム陰性腸管病原体からの抽出物によっては付与されなかった。この処置は、成体マウスよりも若齢のマウスにおいて開始した際に、特に成功した。したがって、ＶａｃＡおよびその組成物は、リスクの高い個体における喘息の予防および治療のための実行可能な寛容化戦略として、治療目的のために活用できる。

実施例５：食物アレルギーの前臨床モデルにおける、Ｈ．ピロリ死細胞抽出物および精製した形の本発明のＶａｃＡポリペプチドの役割
Ｈ．ピロリ細胞全抽出物または精製したＶａｃＡの、食物アレルギー発生に対する防御効果を評価するため、以下に述べるように、ミョウバンをアジュバントとした卵白アルブミンの用量をマウスに２回腹腔内投与して感作させた後、卵白アルブミンを胃内投与した。食物アレルギーの症状を、臨床スコアによって、かつ血清中の肥満細胞プロテアーゼのＥＬＩＳＡならびに卵白アルブミン特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１のＥＬＩＳＡによって測定した。卵白アルブミンを用いて再刺激したＭＬＮまたは脾臓の単一細胞の培養において、Ｔｈ２サイトカインを定量化した。

ミョウバンをアジュバントとした卵白アルブミンを用い、２週間の間隔をおいてマウスを２回感作した後、最後の感作から２週間後に始まり、３日間連続して卵白アルブミンを胃内へ送達することによって誘発を行った。マウスの１群には、７日齢以降に、毎週１回２００μｇ用量のＨ．ピロリ株ＰＭＳＳ１野生型抽出物を胃内に投与した（「抽出物ｐ．ｏ．」）。もう１つの群には、Ｈ．ピロリ株ＡＴＣＣ４９５０３／６０１９０由来の精製したＨｐ ＶａｃＡを、毎週１回２０μｇ用量投与した。すべてのマウスに対して、最後の誘発から４０分間観察を行い、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７９：６６９６−６７０３に記載されるような、引っ掻き、目の腫脹、口および鼻ならびにその他のアナフィラキシーの症状についてスコア化した。得られたスコアを図６Ａに示す。血清中の卵白アルブミン特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１、ならびに肥満細胞プロテアーゼＭＣＰＴ１をＥＬＩＳＡによって定量化し、相当するレベルを図６ＢないしＤに示した。上記のアレルゲンを用いて脾細胞を３日間再刺激した後、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−５ならびにＩＬ−１３の産生および分泌をＥＬＩＳＡによって測定し、相当するレベルを図６ＥおよびＦに示した。ＭＣＰＴ１のデータは、陰性対照に対して標準化した。ＶａｃＡによって処置した群を除くすべての群について、３回の試験からプールしたデータを示す。

食物アレルギーモデルにおいて得たこれらのデータをまとめると、Ｈ．ピロリ抽出物およびＶａｃＡタンパク質を用いた処置による防御効果が強く示唆される。

Claims (12)

1. 配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドを有効成分として含む、アレルギー性疾患の予防および／または治療に用いるための医薬組成物であって、前記ＶａｃＡタンパク質が、その他の免疫原性成分をおよそ含まない程度に未変性のＨ．ピロリ菌死細胞由来の抽出物から精製されたものであり、前記断片または変異形が、前記ＶａｃＡタンパク質と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するものである、医薬組成物。
2. Ｈ．ピロリ菌株が、ＡＴＣＣ４９５０３／６０１９０である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＶａｃＡが組換えＶａｃＡである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択されるポリペプチドを有効成分として含む、アレルゲンに対する寛容化応答の誘導に用いるための医薬組成物であって、前記ＶａｃＡタンパク質が、その他の免疫原性成分をおよそ含まない程度に未変性のＨ．ピロリ菌死細胞由来の抽出物から精製されたものであり、前記断片または変異形が、前記ＶａｃＡタンパク質と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するものである、医薬組成物。
5. ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形から選択される前記ポリペプチドが、投与されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記アレルギー性疾患がアトピー性喘息である、請求項１〜３、５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 前記アレルギー性疾患が食物アレルギーである、請求項１〜３、５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 経口、鼻腔内、非経口、肺内または全身性の経路によって投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形、および少なくとも１つの薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでなり、ここで前記ＶａｃＡタンパク質が、その他の免疫原性成分をおよそ含まない程度に未変性のＨ．ピロリ菌死細胞由来の抽出物から精製されたものである、寛容原性医薬製剤であって、
   前記ＶａｃＡタンパク質、その断片または変異形が、アレルギー性疾患またはアレルギー性の応答の予防および／または治療、またはアレルゲンに対する寛容化応答の誘導に有用な少なくとも１つの共薬剤と組み合わされてなり、
   前記断片または変異形が、前記ＶａｃＡタンパク質と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有するものである、医薬製剤。
10. 経口用の医薬製剤である、請求項９に記載の医薬製剤。
11. アレルゲン、特に少なくとも１つの食物アレルゲンをさらに含む、請求項９または１０に記載の医薬製剤。
12. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法であって、
    前記Ｈ．ピロリ菌死細胞由来の抽出物を、
    （ｉ）生菌細胞の培養物を回収し、
    （ｉｉ）当該回収した細菌を、水中または塩の水溶液中での、数回の凍結／融解サイクルに付し、
    （ｉｉｉ）前記細菌細胞を高圧下で破砕し、
    （ｉｖ）細胞抽出物を収集すること
    を含んでなる方法によって得る工程を含む、製造方法。

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