JP6586014B2 - ヒトプログラム死リガンド１（ｐｄ−ｌ１）に結合する抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合し、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析によるヒト組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１発現の検出に有用である特異的配列を有する抗体に関する。本発明はまた、これらの抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を使用する特異的ＩＨＣアッセイに関する。

ＰＤ−Ｌ１は、プログラム死１（ＰＤ−１）のための２つの公知リガンドの１つである細胞表面糖タンパク質であり、これは免疫調節および末梢性トレランスの維持の重要な担い手として認識されている。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ナイーブリンパ球ならびに活性化ＢおよびＴ細胞、単球ならびに樹状細胞を含む種々の免疫細胞の表面上で観察されている（同誌）。更に、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡは、血管内皮細胞、上皮細胞、筋細胞を含む非リンパ系組織により、ならびに扁桃および胎盤組織において発現される。例えば、Ｋｅｉｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４（２００８）；Ｓｈａｒｐ Ａ．Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３９−２４５（２００７）；Ｏｋａｚａｋｉ ＴおよびＨｏｎｊｏ Ｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）を参照されたい。

ＰＤ−Ｌ１発現は種々のヒト癌においても観察されており、ＰＤ−１との腫瘍細胞発現ＰＤ−Ｌ１の相互作用は腫瘍特異的Ｔ細胞の抑制またはアポトーシスを誘導しうる。例えば卵巣、腎臓、結腸直腸、膵臓、肝臓癌およびメラノーマの大きなサンプルセットにおいて、ＰＤ−Ｌ１発現は不良予後と相関し、後続治療に無関係に全生存期間を減少させることが示された。ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は種々の腫瘍型に対する抗腫瘍活性を有することが示されており、初期のヒト臨床データは、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を有する患者が抗ＰＤ−１療法に応答する可能性がより高いことを示唆している。例えば、Ｉｗａｉら，ＰＮＡＳ ９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｏｈｉｇａｓｈｉら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７−２９５３（２００５）；Ｇｈｅｂｅｈら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：１９０−１９８（２００６）；Ｈａｍａｎｉｓｈｉ，Ｊら，ＰＮＡＳ １０４：３３６０−３３６５（２００７）；Ｙａｎｇら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４９（６）：２５１８−２５２５（２００８）；Ｇａｏら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：９７１−９７９（２００９）；Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ．Ｒ．ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８：３１６７−３１７５（２０１０）を参照されたい。

最近の報告は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ヒトメラノーマサンプルにおけるｈＰＤ−Ｌ１の発現を検出する際の有用性に関する１５個の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の比較を記載している（Ｇａｄｉｏｔ，Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ １１７（１０）：２１９２−２２０１（２０１１））。この比較において評価された有用性基準は、（１）パラフィン包埋組織を染色する能力、（２）低いバックグラウンドの染色をもたらすこと、（３）ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の存在下でプレインキュベーションすることにより、ＰＤ−Ｌ１への結合が遮断されることであった。該著者は、ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体（ＰｒｏＳｃｉ，Ｐｏｗａｙ，ＣＡ ＵＳＡ）であるＡｂ＃４０５９が、これらの基準の全てを許容可能に満たした試験された１５個のうちの唯一の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体であると結論づけた（同誌，２１９５，第２欄）。

本発明は、ＰｒｏＳｃｉ Ａｂ＃４０５９により産生されたものより免疫学的に適切であると本発明者らが考えているＦＦＰＥ扁桃組織におけるＩＨＣ染色パターンを与える抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体に関する。後記実施例に記載されているとおり、このＰｒｏＳｃｉ抗体（ＰＲＳ４０５９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈロット４０５９０６０４）は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、本発明の２つの抗体、すなわち、２２Ｃ３および２０Ｃ３は、扁桃陰窩上皮および濾胞ＣＤ６８＋骨髄細胞（これはマクロファージと形態学的に合致している）を選択的に染色したことを、本発明者らは見出した。更に、２２Ｃ３および２０Ｃ３はこれらの２つの別個の細胞集団の間の一貫した強度の相違を示しており、陰窩上皮における染色強度は濾胞マクロファージにおけるものより遥かに大きい。全３個の抗体（ＰＲＳ４０５９、２２Ｃ３および２０Ｃ３）はＰＤ−Ｌ１抗原の存在下のプレインキュベーションにより中和され、このことは、該反応性が抗原結合ドメイン（ＣＤＲ）によりもたらされることを示している。したがって、本発明はまた、ＦＦＰＥ組織切片においてＰＤ−Ｌ１を検出するためのＩＨＣアッセイを含む、ヒト細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１発現の検出における、本発明の抗体の使用に関する。

１つの態様においては、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の、３個の軽鎖ＣＤＲ、ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の、３個の重鎖ＣＤＲを含む。

ＣＤＲＬ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号２１、配列番号９の変異体および配列番号２１の変異体からなる群から選択される。ＣＤＲＬ２は、配列番号２および配列番号２の変異体からなる群から選択される。ＣＤＲＬ３は、配列番号３、配列番号１０、配列番号２２、配列番号１０の変異体および配列番号２２の変異体からなる群から選択される。

ＣＤＲＨ１は、配列番号５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号１４の変異体、配列番号１５の変異体、配列番号２６の変異体および配列番号２７の変異体からなる群から選択される。ＣＤＲＨ２は、配列番号６、配列番号１６、配列番号２８、配列番号１６の変異体および配列番号２８の変異体からなる群から選択される。ＣＤＲＨ３は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２９、配列番号１７の変異体および配列番号２９の変異体からなる群から選択される。

本発明の抗体および抗原結合性フラグメントにおいては、変異体ＣＤＲ配列（軽鎖または重鎖）は、参照配列における１個または２個の保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、参照配列における唯一の保存的アミノ酸置換を有する。好ましい実施形態においては、前記の３個の軽鎖ＣＤＲの多くとも２個は変異体配列であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲの多くとも２個は変異体配列である。より好ましい実施形態においては、前記の６個のＣＤＲの３個、２個または１個のみが変異体配列である。

１つの好ましい実施形態においては、前記の３個の軽鎖ＣＤＲは配列番号１、配列番号２および配列番号３であり、前記の３個の重鎖は配列番号５、配列番号６および配列番号７である。

もう１つの好ましい実施形態においては、前記の３個の軽鎖ＣＤＲは配列番号９、配列番号２および配列番号１０であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲは配列番号１４、配列番号１６および配列番号１７である。

更にもう１つの好ましい実施形態においては、前記の３個の軽鎖ＣＤＲは配列番号２１、配列番号２および配列番号２２であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲは配列番号２６、配列番号２８および配列番号２９である。

本発明の幾つかの抗体および抗原結合性フラグメントは軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、配列番号４、配列番号１３、配列番号１３の変異体、配列番号２５および配列番号２５の変異体からなる群から選択され、重鎖可変領域は、配列番号８、配列番号２０、配列番号２０の変異体、配列番号３２および配列番号３２の変異体からなる群から選択される。そのような実施形態においては、可変体軽鎖可変領域配列は、フレームワーク領域（すなわち、ＣＤＲ以外）における５個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領域における４個未満、３個未満または２個未満の保存的アミノ酸置換を有する。同様に、可変体重鎖可変領域配列は、フレームワーク領域（すなわち、ＣＤＲ以外）における１７個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一であり、好ましくは、フレームワーク領域における１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満または５個未満の保存的アミノ酸置換を有する。

本発明の１つの好ましい抗体または抗原結合性フラグメントにおいては、軽鎖可変領域は配列番号１３であり、重鎖可変領域は配列番号２０である。

本発明のもう１つの好ましい抗体または抗原結合性フラグメントは配列番号２５の軽鎖可変領域および配列番号３２の重鎖可変領域を含む。

更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体または結合性フラグメントは配列番号２５の軽鎖可変領域および配列番号３２の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号３２におけるＸはｐＥである。

更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体または結合性フラグメントは配列番号２５の軽鎖可変領域および配列番号３２の重鎖可変領域を含み、ここで、配列番号３２におけるＸはＱである。

前記の抗体の実施形態の全てにおいては、該単離抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラスの完全長抗体でありうる。好ましくは、該抗体はＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４である。１つの実施形態においては、該抗体はマウスＩｇＧ_１定常領域を含む。

特に好ましい抗体はモノクローナル抗体２０Ｃ３および２２Ｃ３であり、これらは、それぞれハイブリドーマＭＥＢ０３７．２０Ｃ３およびＭＥＢ０３７．２２Ｃ３により発現されるＩｇＧ１抗体である。

本発明はまた、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し２０Ｃ３もしくは２２Ｃ３の又は配列番号２５および配列番号３２を含む参照抗体のヒトＰＤ−Ｌ１への結合を遮断する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは２０Ｃ３および２２Ｃ３のそれぞれの又は（ａ）配列番号１３および配列番号２０を含む参照抗体ならびに（ｂ）配列番号２５および配列番号３２を含む参照抗体のそれぞれのヒトＰＤ−Ｌ１への結合を遮断する。

本発明はまた、前記抗体または抗体フラグメントのいずれかを製剤（処方）中に含む抗体組成物を提供する。１つの適当な製剤は２０ｍＭ 酢酸ナトリウムおよび９％ スクロースをｐＨ５．０で含む。好ましい実施形態においては、該組成物は抗体分子の混合物を含み、この場合、該混合物中の抗体分子の大部分（すなわち、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかを超える）は配列番号２５および配列番号３２（ここで、配列番号３２におけるＸはｐＥである）を含み、該混合物中の抗体分子の残りは配列番号２５および配列番号３２（ここで、配列番号３２におけるＸはＱである）を含む。

前記実施形態のいずれかにおいては、該抗原結合性フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）_２フラグメントである。

前記実施形態のいずれかにおいては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能な標識を更に含みうる。

本発明はまた、前記で開示された抗体可変領域のいずれかをコードする単離された核酸を提供する。１つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番号３３および配列番号３４の一方または両方を含む。もう１つの好ましい実施形態においては、該核酸は配列番号３５および配列番号３６の一方または両方を含む。これらの実施形態のいずれかにおいては、該単離核酸は好ましくは発現ベクターである。

本発明はまた、前記で開示されている抗体可変領域のいずれかをコードする発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、該発現ベクターは配列番号３３および配列番号３４を含み、または配列番号３５および配列番号３６を含む。

本発明はまた、ヒトから摘出されたヒト組織サンプルをＰＤ−Ｌ１発現に関してアッセイする方法を提供する。該アッセイ方法は、ヒトＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−Ｌ１結合試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをＰＤ−Ｌ１結合試薬と接触させ、未結合ＰＤ−Ｌ１結合試薬を除去し、結合したＰＤ−Ｌ１結合剤の存在または非存在を検出することを含む。１つの好ましい実施形態においては、該方法は、結合した結合試薬の量を定量することを更に含む。該結合試薬は前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかである。好ましくは、該結合試薬は、配列番号１３および配列番号２０を含む又は配列番号２５および配列番号３２を含む抗体である。１つの好ましい実施形態においては、該結合試薬は、配列番号２５および配列番号３２を含む抗体分子の混合物を含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分（すなわち、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかを超える）は配列番号３２におけるＸ位にｐＥを有し、該分子の残りは配列番号３２におけるＸ位にＱを有する。

もう１つの態様においては、本発明は、ヒト組織サンプルをＰＤ−Ｌ１発現に関してアッセイするためのキットを提供する。該キットは、ＰＤ−Ｌ１結合剤と、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合した結合剤を含む複合体を検出するための試薬のセットとを含む。該ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記の任意のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントである。前記のモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかである。好ましくは、該抗体または結合性フラグメントは配列番号１３および配列番号２０を含む、または配列番号２５および配列番号３２を含む。１つの好ましい実施
形態においては、該結合試薬は、配列番号２５および配列番号３２を含む抗体分子の混合物を含む抗体組成物であり、この場合、該分子の大部分（すなわち、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかを超える）は配列番号３２におけるＸ位にｐＥを有し、該分子の残りは配列番号３２におけるＸ位にＱを有する。
本発明は、一つの態様において以下を提供する。
[項目１]
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の、３個の軽鎖ＣＤＲ、ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の、３個の重鎖ＣＤＲを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）ＣＤＲＬ１が、配列番号１、配列番号９、配列番号２１、配列番号９の変異体および配列番号２１の変異体からなる群から選択され、
（ｂ）ＣＤＲＬ２が、配列番号２および配列番号２の変異体からなる群から選択され、
（ｃ）ＣＤＲＬ３が、配列番号３、配列番号１０、配列番号２２、配列番号１０の変異体および配列番号２２の変異体からなる群から選択され、
（ｄ）ＣＤＲＨ１が、配列番号５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号１４の変異体、配列番号１５の変異体、配列番号２６の変異体および配列番号２７の変異体からなる群から選択され、
（ｅ）ＣＤＲＨ２が、配列番号６、配列番号１６、配列番号２８、配列番号１６の変異体および配列番号２８の変異体からなる群から選択され、ならびに
（ｆ）ＣＤＲＨ３が、配列番号７、配列番号１７、配列番号２９、配列番号１７の変異体および配列番号２９の変異体からなる群から選択される、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目２]
前記の３個の軽鎖ＣＤＲが配列番号１、配列番号２および配列番号３であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲが配列番号５、配列番号６および配列番号７である、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目３]
前記の３個の軽鎖ＣＤＲが配列番号９、配列番号２および配列番号１０であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲが配列番号１４、配列番号１６および配列番号１７である、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目４]
前記の３個の軽鎖ＣＤＲが配列番号２１、配列番号２および配列番号２２であり、前記の３個の重鎖ＣＤＲが配列番号２６、配列番号２８および配列番号２９である、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目５]
軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）該軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号１３、配列番号１３の変異体、配列番号２５および配列番号２５の変異体からなる群から選択され、ならびに
（ｂ）該重鎖可変領域が、配列番号８、配列番号２０、配列番号２０の変異体、配列番号３２および配列番号３２の変異体からなる群から選択される、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目６]
軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）該軽鎖可変領域が配列番号１３であり、該重鎖可変領域が配列番号２０であり、
（ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号２５であり、該重鎖可変領域が配列番号３２であり、配列番号３２におけるＸがＱであり、または
（ｃ）該軽鎖可変領域が配列番号２５であり、該重鎖可変領域が配列番号３２であり、配列番号３２におけるＸがｐＥである、項目１記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目７]
（ａ）配列番号１３の軽鎖可変領域および配列番号２０の重鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号２５の軽鎖可変領域および配列番号３２の重鎖可変領域を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、参照抗体の結合を遮断する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目８]
該参照抗体が配列番号２５の軽鎖可変領域および配列番号３２の重鎖可変領域を含み、遮断抗体が配列番号３８のアミノ酸１５６〜１７８の第１セグメントにおける残基、および配列番号３８のアミノ酸１９６〜２０６の第２セグメントにおける残基に結合する、項目７記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目９]
遮断抗体が、配列番号３２のアミノ酸３〜９、配列番号３８のアミノ酸１０〜１３、配列番号３８のアミノ酸８８〜９３、および配列番号３８のアミノ酸１３５〜１４７からなる群から選択されるヒトＰＤ−Ｌ１セグメントのいずれか１つ、２つ、もしくは３つ、または４つ全てにおける残基に更に結合する、項目８記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
[項目１０]
抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域の一方または両方をコードする単離された核酸であって、
（ａ）該抗体軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号１３および配列番号２５からなる群から選択され、ならびに
（ｂ）該抗体重鎖可変領域が、配列番号８、配列番号２０および配列番号３２（ここで、配列番号３２におけるＸはＱである）からなる群から選択される、単離された核酸。
[項目１１]
該抗体軽鎖可変領域が配列番号１３または配列番号２５であり、該抗体重鎖可変領域が配列番号２０または配列番号３２である、項目１０記載の単離された核酸。
[項目１２]
（ａ）配列番号３３および配列番号３４の一方もしくは両方、または
（ｂ）配列番号３５および配列番号３６の一方もしくは両方を含む、項目１０記載の単離された核酸。
[項目１３]
発現ベクターである、項目１０〜１２のいずれか１項記載の単離された核酸。
[項目１４]
項目１２記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[項目１５]
ヒトから摘出されたヒト組織サンプルをＰＤ−Ｌ１発現に関してアッセイする方法であって、
（ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−Ｌ１結合試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをＰＤ−Ｌ１結合試薬と接触させ、ここで、該結合試薬は、項目１〜７のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含み、
（ｂ）未結合ＰＤ−Ｌ１結合試薬を除去し、
（ｃ）結合したＰＤ−Ｌ１結合剤の存在または非存在を検出することを含む、方法。
[項目１６]
結合した結合試薬の量を定量することを更に含む、項目１５記載の方法。
[項目１７]
該結合試薬が配列番号１３および配列番号２０を含む、または配列番号２５および配列番号３２を含む、項目１５または項目１６記載の方法。
[項目１８]
項目１〜９のいずれか１項記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合した該抗体または該抗原結合性フラグメントの複合体を検出するための試薬のセットとを含むキット。
[項目１９]
該抗体または抗原結合性フラグメントが配列番号１３および配列番号２０を含む、または配列番号２５および配列番号３２を含む、項目１８記載のキット。
[項目２０]
抗体分子の混合物を含む抗体組成物であって、該混合物における抗体分子の大部分が配列番号２５および配列番号３２（ここで、配列番号３２におけるＸはｐＥである）を含み、該混合物における抗体分子の残りが配列番号２５および配列番号３２（ここで、配列番号３２におけるＸはＱである）を含む、抗体組成物。

詳細な説明
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。

ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ：特に示されていない限り、Ｋａｂａｔ番号付け系を用いて定められた、免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
Ｃｌｏｔｈｉａ（クロチア）：Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，ＪＭＢ ２７３：９２７−９４８（１９９７）に記載されている抗体番号付け系
ＥＣ５０：５０％の効力または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ：酵素結合イムノソルベントアッセイ
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋
ＦＲ：抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域以外の免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＦＮ：インターフェロン
ＩＣ５０：５０％の抑制をもたらす濃度
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ（カバト）：Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により先駆的に案出された免疫グロブリンアライメントおよび番号付け系
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＥＳ：２（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＡ：作用メカニズム
ＮＨＳ：正常ヒト血清
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ｐＥ：ピログルタミン酸
ＰＫ：薬物動態
ＳＥＢ：スタヒロコッカスエンテロトキシンＢ
ＴＴ：破傷風トキソイド
Ｖ領域：異なる抗体間で配列において可変性であるＩｇＧ鎖のセグメント。それは軽鎖内のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖内の同残基１１３に伸長する。

ＶＨ：免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ：免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用途を特に以下に定義する。本明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書で用いられている全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されている意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の単語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、対応する複数形対象物を含む。

「活性化」は、それが細胞または受容体に適用される場合、文脈により又は明示的に特に示されていない限り、リガンドでの細胞または受容体の活性化または処理を意味する。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質、および抗体由来の結合性化合物を含む。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣体を含む。「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的または環境要因により調節される細胞活性化を意味しうる。

分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「活性」は、先天性または適応免疫系の構成要素のモジュレーションを意味しうる。

「投与」および「治療（処理）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体と、外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。「投与」および「治療（処理）」は、例えば、治療方法、プラセボ方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。「細胞の処理」は、該細胞と試薬の接触、および該細胞に接触している流体と試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療）」は、試薬、診断剤、結合性成分または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「対象」なる語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。

「治療（処理）する」または「治療（処理）」は、治療用物質、例えば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを含有する組成物を、該物質が治療活性を有する１以上の疾患症状を有する又は疾患を有すると疑われる対象または患者に内的または外的に投与することを意味する。典型的には、該物質は、いずれかの臨床的に測定可能な度合でそのような症状の退縮を誘導する又はそのような症状の進行を抑制することにより、治療された対象または集団における１以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用物質の量（「治療的有効量」とも称される）は、病態、患者の年齢および体重ならびにその薬物が対象において所望の応答を惹起する能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者により典型的に用いられるいずれかの臨床測定により評価されうる。本発明の１つの実施形態（例えば、治療方法または製造品）は、全ての対象における標的疾患症状を軽減するのに有効でないかもしれないが、それは、スチューデントｔ検定、カイ２乗検定、ＭａｎｎおよびＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、クラスカル−ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール−テルプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定ならびにウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定のような当技術分野で公知のいずれかの統計的検定により決定された統計的に有意な対象数において標的疾患症状を軽減するはずである。

「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的または研究対象に適用される場合には、治療的処置ならびに研究および診断用途を意味する。「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的もしくはまたは研究対象または細胞、組織または器官に適用される場合には、ヒトもしくは動物対象、細胞、組織、生理的区画または生理学的流体との本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの接触を含む。

抗ＰＤ−Ｌ１抗体
抗体２０Ｃ３は、ハイブリドーマサブクローンＭＥＢ０３７．２０Ｃ３．１１６により産生される抗体である。

抗体２２Ｃ３は、ハイブリドーマサブクローンＭＥＢ０３７．２２Ｃ３．１３８により産生される抗体であり、マウスＩｇＧ１のアロタイプＳ４１４Ｒに対応する。２２Ｃ３の成熟重鎖のＮ末端残基はグルタミンまたはピログルタミン酸（ピログルタマート）（ｐＥ）のいずれかであり、これは、遺伝子配列が成熟重鎖または軽鎖におけるＮ末端グルタミンをコードしている場合にモノクローナル抗体において頻繁に認められる一般的な翻訳後修飾である。

本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、あるヒト細胞の表面上で発現されるヒトＰＤ−Ｌ１の成熟形態（リーダーペプチドとも称される前分泌リーダー配列を欠く）に結合する。「ＰＤ−Ｌ１」および「成熟ＰＤ−Ｌ１」なる語は本明細書においては互換的に用いられ、特に示されていない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、同じ分子を意味すると理解される。成熟ヒトＰＤ−Ｌ１分子は以下の配列（配列番号３７）のアミノ酸１９−２９０からなる：ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ。

成熟ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは以下の配列（配列番号３８）からなる：ＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴ。

本明細書中で用いる抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体または抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体を意味する。「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する」抗体または「ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他の抗原と比較してヒトＰＤ−Ｌ１への優先的な結合を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要しない。抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体がヒトＰＤ−Ｌ１に対して特異的とみなされるのは、例えば、ＩＨＣ診断アッセイにおける偽陽性のような望ましくない結果をもたらすことなく、その結合がサンプル中のヒトＰＤ−Ｌ１の存在の決定因子である場合である。本発明の抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体に必要な特異性の度合は該抗体の意図される用途に左右されうるが、いずれにせよ、意図される目的の用途のためのその適合性により定められる。本発明の抗体またはその結合性フラグメントは、いずれかの非ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。本明細書中で用いる抗体が、ある与えられた配列を含むポリペプチド、例えば成熟ヒトＰＤ−Ｌ１（この場合、配列番号３７のアミノ酸１９−２９０）に特異的に結合すると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチドには結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。例えば、配列番号３７の１９−２９０を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は配列番号３７の１９−２９０のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付き形態には結合しうるが、他のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きタンパク質には結合しない。

本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体を意味する。したがって、それは最も広義に用いられ、所望の生物活性を示す限り、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体（これらに限定されるものではない）を含む。「親抗体」は、意図される用途のための抗体の修飾（例えば、ヒト治療用抗体としての使用のための抗体のヒト化）の前の、抗原への免疫系の曝露により得られた抗体である。

「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、抗体の抗原結合性フラグメントを、すなわち、完全長抗体に結合する抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；ナノボディならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「Ｆａｂフラグメント」は１本の軽鎖と１本の重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の生成物でありうる。

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む２本の重鎖フラグメントを含有する。それらの２つの重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合により、およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用により合体している。

「Ｆａｂ’フラグメント」は１本の軽鎖と、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含有する１本の重鎖の一部分またはフラグメント、そしてまた、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の領域を含有していて、２個のＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成しうる。

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部分を２本の重鎖と、２本の軽鎖とを含有していて、それらの２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２本の重鎖の間のジスルフィド結合により合体する２本のＦａｂ’フラグメントから構成される。「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は抗体のペプシン切断の生成物でありうる。

「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる語は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む抗体フラグメントを意味し、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、該ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にする、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際特許出願公開番号ＷＯ ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、２以上のＶ_Ｈ領域がペプチドリンカーと共有結合して２価ドメイン抗体を形成している。２価ドメイン抗体の、２つのＶ_Ｈ領域は、同じ又は異なる抗原を標的としうる。

「２価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。幾つかの場合には、それらの２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、２価抗体は二重特異性である（後記を参照されたい）。

ある実施形態においては、本明細書におけるモノクローナル抗体には、ラクダ化単一ドメイン抗体も含まれる。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５；ＷＯ ９４／０４６７８；ＷＯ ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。１つの実施形態においては、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を伴う２つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。

本明細書中で用いる「ジアボディ」なる語は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）。同一鎖上の２つのドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペア形成を強要され、２つの抗原結合部位を形成する。ジアボディは、例えばＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８に更に詳しく記載されている。操作された抗体変異体の概説としては、全般的には、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１１２６−１１３６を参照されたい。

典型的には、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは（親抗体と比較された場合）そのヒトＰＤ−Ｌ１結合活性の少なくとも１０％（その活性がモルに基づいて表された場合）を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、親抗体としてのヒトＰＤ−Ｌ１結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保有する。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸置換（該抗体の「保存的変異体」または「機能的保存変異体」と称される）を含みうることも意図される。

「単離された抗体」は精製状態を意味し、そのような文脈においては、該分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または細胞残渣および増殖培地のような他の物質を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味することを意図されないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。

本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味する。すなわち、該集団を構成する抗体分子は、少量で存在しうる可能な天然に生じる突然変異以外はアミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、可変ドメイン、特にＣＤＲ内に種々のアミノ酸配列を有する多数の種々の抗体を含み、これらは種々のエピトープに特異的であることが多い。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたという、抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による該抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されることが可能である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いるファージ抗体ライブラリーからも単離されうる。また、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。

一般に、基本的抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０ ７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。

各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同一である。

典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域と整列していて、特異的エピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖および重鎖可変ドメインは共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３の定義に従っている。

本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（配列により抗体のＣＤＲ領域を定めている）を参照されたい。また、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（構造により抗体のＣＤＲ領域を定めている）も参照されたい。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、本明細書中でＣＤＲ残基として定められた超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の、それらが最適に整列（アライメント）された場合の配列類似性を意味する。それらの２つの比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占拠されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の百分率（％）は、それらの２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算したものである。例えば、２つの配列における１０個中８個の位置が、それらの配列が最適に整列された場合に一致（マッチ）している又は相同であれば、それらの２つの配列は８０％相同である。一般に、該比較は、最大の相同性（％）を与えるように２つの配列が整列された場合に行われる。例えば、該比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われることが可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される。

「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが天然で見出される場合に付随しているポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、あるいはそれが天然で連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのいくつかの組合せを意味する。本開示の目的においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は完全な染色体を含まないと理解されるべきである。特定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定された配列に加えて、１０個まで又は更には２０個以上の他のタンパク質またはそれらの一部もしくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、および／またはベクター配列を含むことが可能である。

「制御配列」なる表現は、特定の宿主生物における、機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、所望により存在しうるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公知である。

核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能的に連結（されている）」は、連結されているそれらのＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダー配列の場合には、連続的であり、かつ、リーディングフレームが一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的でなくてもよい。連結は簡便な制限部位における連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。

本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、全てのそのような語は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、導入の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代が厳密に同じＤＮＡの内容を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。

本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているとおり、特定の核酸配列、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅する方法または技術を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、関心のある領域の末端またはその外側の配列情報が用いられる。これらのプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列において同一または類似であろう。それらの２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と一致しうる。ＰＣＲは、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するために用いられうる。全般的には、Ｍｕｌｌｉｓら，（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ編，（１９８９）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本明細書中で用いるＰＣＲは、核酸の特異的断片を増幅し又は生成させるための核酸ポリメラーゼとプライマーとしての既知核酸との使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例（しかし唯一の例ではない）とみなされる。

本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再編成免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を意味する。いずれかの適当な未再編成免疫グロブリンＤＮＡ源が用いられうる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上でＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１に記載されているとおりに得られうる。

典型的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の物理的および機能的特性
本発明は、単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１発現の検出における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例には、抗体２０Ｃ３および２２Ｃ３（図１および２を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。２０Ｃ３および２２Ｃ３抗体は、同一ではないが隣接するエピトープに結合し（実施例２および図９を参照されたい）、このことは、これらのエピトープの一方または両方においてＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する追加的抗体を誘導するために、これらの２つの抗体のＣＤＲが混合されうることを示している。したがって、該単離抗体、またはヒトＰＤ−Ｌ１に結合するその抗原結合性フラグメントは、以下の表１〜３に示す重鎖ＣＤＲの３つ及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の３つを含みうる。

「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、この場合、該変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させずに施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を表４に記載する。

本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明により想定される。本明細書中で用いる「機能保存的変異体」は、所望の特性、例えば抗原アフィニティおよび／または特異性を変化させることなく１以上のアミノ酸残基が改変された抗体またはフラグメントを意味する。そのような変異体には、あるアミノ酸が、類似特性を有するアミノ酸で置換（例えば、表４の保存的アミノ酸置換）されたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。

もう１つの実施形態においては、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、Ｖ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインを有し、表１または２の軽鎖および重鎖ＣＤＲに対する１００％の配列相同性ならびに表１または２の軽鎖および重鎖成熟可変領域に対する少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％の配列相同性を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。

核酸
本発明は、本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体の免疫グロブリン鎖および抗原結合性フラグメントをコードする核酸をも提供する。例えば、本発明は、表１、２および３に記載されているアミノ酸をコードする核酸、ならびにそれにハイブリダイズする核酸を含む。

一般に、該核酸は、低い、中等度の、または高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する能力を維持する抗体をコードしている。第１の核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）で第２の核酸分子にアニールしうる場合、第１の核酸分子が第２の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は該ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳおよび無ホルムアミド；または４２℃での３０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳを含む。典型的な中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は４２℃での５×または６×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含有する４０％ ホルムアミドである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は４２℃あるいは所望により、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）での５０％ ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣである。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，１１．７−１１．８）。

以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメントスコアリング系：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

もう１つの実施形態においては、本発明は、単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメント（本明細書に記載されているもの）のポリペプチド鎖の少なくとも１つをコードする単離された核酸、例えばＤＮＡを提供する。幾つかの実施形態においては、該単離核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードしており、他の実施形態においては、軽鎖および重鎖は別々の核酸分子上でコードされる。もう１つの実施形態においては、該核酸はシグナル配列を更にコードしている。

本発明はまた、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に該宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、および本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供し、該製造方法は、該抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培地内で培養し、該抗原またはその抗原結合性フラグメントを該宿主細胞または培地から単離することを含む。

エピトープ結合
本発明は更に、ヒトＰＤ−Ｌ１への抗体２０Ｃ３または２２Ｃ３の結合を、それぞれ２０Ｃ３または２２Ｃ３と同じエピトープへの結合により遮断する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。実施例２に記載されているオクテット（Ｏｃｔｅｔ）競合分析を含む当技術分野で公知のいずれかの交差遮断または競合分析を用い、ついで、該交差遮断抗体が結合するヒトＰＤ−Ｌ１上のエピトープを特定することにより、そのような抗体および結合性フラグメントは特定されうる。第１抗体が第２抗体の結合を交差遮断するとみなされるのは、標的を第１抗体に飽和状態まで前結合させることが、標的の最大半量結合を達成するのに必要な第２抗体の濃度を２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍またはそれ以上増加させる場合である。交差遮断性抗体に対する結合エピトープは、当技術分野でよく知られた技術を用いて特定されうる。

１つのそのようなエピトープマッピング技術は、タンパク質分解および質量分析と共役した水素／重水素交換（ＨＤＸ−ＭＳ）である。この方法は、重水（Ｄ_２Ｏ）の単体中および対応抗体の存在下で種々の時間間隔でインキュベートされた場合の抗原による重水素の取り込みの度合の正確な測定および比較に基づく。重水素は露出領域におけるタンパク質のアミドバックボーン上の水素と交換され、一方、抗体に結合した抗原の領域は保護され、タンパク質分解フラグメントの液体クロマトグラフィー−縦列質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析の後、より少ない交換を示すか又は交換を全く示さないであろう。

実施例３に記載されているＨＤＸ−ＭＳエピトープマッピングに基づけば、抗体２２Ｃ３に対する成熟ヒトＰＤ−Ｌ１上の提示されているエピトープは細胞外ドメイン（配列番号３８）内の２つの不連続なアミノ酸セグメントにおける残基（１５６〜１７８および１９６〜２０６）を含む。追加的エピトープ残基は、細胞外ドメイン（配列番号３８）内の以下のセグメント内に存在する可能性がある：３〜９、１０〜１３、８８〜９３および１３５〜１４７。

したがって、１つの実施形態においては、２２Ｃ３と同じエピトープへの結合によるヒトＰＤ−Ｌ１への抗体２２Ｃ３の結合を遮断する抗体は、配列番号３８のアミノ酸１５６〜１７８の第１セグメントにおける残基、および配列番号３８のアミノ酸１９６〜２０６の第２セグメントにおける残基に結合し、そして幾つかの実施形態においては、配列番号３８の以下のセグメントの、いずれか１つ、２つ若しくは３つにおける又は４つ全部における残基にも結合する：アミノ酸３〜９、アミノ酸１０〜１３、アミノ酸８８〜９３、およびアミノ酸１３５〜１４７。

抗体およびその抗原結合性フラグメントの製造方法
親（例えば、げっ歯類）モノクローナル抗Ｘ抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当技術分野で一般に公知の方法により産生されうる。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、およびトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６−２０３０）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）、およびサイトパルス大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ ｌａｒｇｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｃｕｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を使用する電場に基づく電気融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、標準的なプロトコールに基づいて、マウス脾細胞を単離し、ＰＥＧで又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞系と融合させる。

ついで、生じたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることが可能である。例えば、免疫化マウスからの脾リンパ球の単個細胞浮遊液を、５０％ ＰＥＧを使用して、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）の数の６分の１と融合させることが可能である。細胞を平底マイクロタイタープレート内で約２×１０^５細胞／ｍＬでプレーティングし、ついで、２０％ 胎児クローン血清（Ｃｌｏｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、１８％ 「６５３」馴らし培地、５％ オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；該ＨＡＴは該融合の２４時間後に添加される）を含有する選択培地内で２週間インキュベートすることが可能である。２週間後、該ＨＡＴがＨＴと交換された培地内で細胞を培養することが可能である。ついで個々のウェルを抗ＸモノクローナルＩｇＧ抗体に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることが可能である。著しいハイブリドーマ増殖が生じたら、通常は１０〜１４日後に培地を観察することが可能である。該抗体分泌性ハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧ抗Ｘモノクローナル抗体に関して尚も陽性である場合には、限界希釈により少なくとも２回サブクローニングすることが可能である。

ついで安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地内で少量の抗体を産生させることが可能である。例えば、約１グラムの２２Ｃ３抗体を産生させ、以下の方法を用いてマウスハイブリドーマ細胞系ＭＥＢ０３７．２２Ｃ３．１３８から精製することが可能である。凍結ＭＥＢ０３７．２２Ｃ３．１３８細胞を解凍し、０．１８ プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８の存在下または非存在下に２ｍＭ 追加的Ｌ−グルタミンを含有するハイブリドーマ無血清培地を使用して振とうフラスコに順応させる。プルロニックＦ−６８の存在は該振とうフラスコ培養の生存性を改善しうる。該細胞が振とうフラスコに完全に順応したら、２０リットルの生産培養を、１０％ ＣＨＯ ＣＤ高効率的フィード（ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ）Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＃Ａ１０２４０−０１）を添加しながら、ＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）内の無血清培地内で行う。細胞増殖のために、１リットルの培養を小さなＷＡＶＥバッグ内で開始させ、ついで該１Ｌ ＷＡＶＥ培養を該ＷＡＶＥバイオリアクター内の２０Ｌ培養へと拡大させる。該２０リットル培養を０．５×１０^６ 生細胞／ｍＬの細胞密度で開始し、第１日に１０％ ＣＨＯ ＣＤ高効率フィードＢを供給し、１Ｎ Ｎａ_２ＣＯ_３でｐＨを毎日調節する。４日後に該細胞を回収する。ＮＯＶＡ解析のために、小さなサンプルを毎日集めることが可能である。

本発明の抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体は以下の方法によりハイブリドーマ培養から精製されうる。１．２マイクロメーターガラス繊維および０．２マイクロメーター酢酸セルロースフィルターを使用するデプス濾過により、該ハイブリドーマ培養を清澄化する。等体積の２×ＰｒｏＳｅｐＡバッファー（１００ｍＭ ホウ酸，５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）を該清澄化回収物に加え、該希釈回収物を１７０ｍＬ床体積プロテインＡカラム上にローディングする。該カラムを５カラム体積（ＣＶ）の１×ＰｒｏＳｅｐＡバッファー（５０ｍＭ ホウ酸，２．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）で洗浄し、ついで２ＣＶの１×ＰＢＳで洗浄し、該抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体を５ＣＶの溶出バッファー（０．１Ｍ グリシン，ｐＨ３．０）で溶出する。ＩｇＧを含有する溶出画分を一緒にし、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨバッファーの１／１０の体積を加えることによりｐＨを中和する。ついで該中和抗体組成物を、１０ｋＤａ 使い捨てＴＦＦカセットを使用して滅菌濾過する。該抗体は、１０リットルの製剤化バッファー（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム，９％ スクロース，ｐＨ５．０）に対するダイアフィルトレーションおよび２０体積の交換により、保存のために製剤化されうる。この方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ ＨＰＬＣおよびＣ８ ＲＰ−ＨＰＬＣ測定により少なくとも９８％の純度を有し、０．１ＥＵ／ｍｌ未満および０．０２ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素レベルを有する、約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体２２Ｃ３が製造されうる。

本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体は組換え法（例えば、前記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系において）によっても製造されうる。この実施形態においては、本発明の抗体分子（例えば、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ）をコードする核酸が、ｐＥＴに基づくプラスミド内に挿入され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７系において発現されうる。当技術分野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造のための方法の一例は米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するためのいずれかの公知方法によるものでありうる。哺乳類細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。また、核酸分子はウイルスベクターにより哺乳類細胞内に導入されうる。細胞の形質転換方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。

抗体ＰＤ−Ｌ１抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている方法のいずれかによっても合成されうる。

本明細書に開示されている抗体またはフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系が含まれる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを判断することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現、またはより好ましくは、該宿主細胞が増殖する培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり、該宿主細胞を培養することにより、該抗体を産生させる。

抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗体（またはそれからの他の部分）の発現は、幾つかの公知技術を用いて増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある条件下の発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は全体的または部分的に欧州特許第０ ２１６ ８４６号、第０ ２５６ ０５５および第０ ３２３ ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に記載されている。

ポリクローナル抗体は、１以上の他の非同一抗体のなかで又はそのような非同一抗体の存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は種々のＢリンパ球（例えば、全て免疫原に対するものである種々の抗体の集団を産生する、関心のある免疫原で処理された動物のＢリンパ球）の集団から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化動物、例えば脾臓、血清または腹水から直接的に得られる。

本発明は更に、本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗体フラグメントを含む。該抗体フラグメントには、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントが含まれ、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断により産生されうる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）_２の還元により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によりＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１鎖に結合したＶ_Ｌ−Ｃ_Ｌ鎖である。Ｆ（ａｂ）_２フラグメントは、２つのジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）_２分子のＦａｂ部分はＦ_ｃ領域の一部を含み、その間にジスルフィド架橋が位置する。ＦｖフラグメントはＶ_ＬまたはＶ_Ｈ領域である。

免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラスに帰属されうる。少なくとも５つの免疫グロブリンの主要クラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、これらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗体および抗原結合性フラグメントを含む。

１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えばγ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。限定的ではない例示に過ぎないが、ヒト重鎖定常領域はγ１であることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう１つの実施形態においては、該抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を有するγ４である（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１−８，２００１）。

幾つかの実施形態においては、種々の定常ドメインは、本明細書に記載されているＣＤＲから誘導されたヒト化Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域に連結されうる。例えば、本発明の抗体（またはフラグメント）の個々の意図される用途がエフェクター機能の改変を望むものである場合には、ヒトＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用されることが可能であり、あるいはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４が利用されうる。

抗体の操作
特定の実施形態においては、以下のとおりに、最終抗体のより大きな化学的安定性を得るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基に変化させることが望ましいであろう。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じ、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらすことが可能であり、これはポリペプチド鎖内に捻じれ（キンク）を導入し、その安定性を低減する（イソアスパラギン酸効果）。ある実施形態においては、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を含有しない。

例えば、いずれかのＡｓｎ−Ｇｌｙ配列における、特にＣＤＲ内のイソアスパルタートの形成の可能性を減少させるために、アスパラギン（Ａｓｎ）残基はＧｌｎまたはＡｌａに変換されうる。Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列においても、類似した問題が生じうる。ＲｅｉｓｓｎｅｒおよびＡｓｗａｄ（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：１２８１。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を低減し、または完全に阻止しうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１（７３４における）を参照されたい。１つの実施形態においては、アスパラギンはグルタミン（Ｇｌｎ）に変換される。脱アミド化（これは、アスパラギンまたはグルタミンの隣に小さなアミノ酸が存在する場合に、より大きな比率で生じる）の可能性を減少させるために、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接するアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ＆ Ｋｏｌｂｅ（１９９４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６２：２６１を参照されたい。また、メチオニン硫黄が酸化する可能性（これは抗原結合アフィニティを減少させ、そしてまた、最終抗体調製物における分子不均一性に寄与しうるであろう）を減少させるために、ＣＤＲにおけるいずれかのメチオニン残基（典型的には溶媒露出Ｍｅｔ）がＬｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅに変換されうる（同誌）。１つの実施形態においては、該メチオニンはアラニン（Ａｌａ）に変換される。また、潜在的なＡｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の切断性を阻止または最小にするために、ＣＤＲ内で見出されるいずれかのＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せをＧｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｓｎ−Ａｌａに改変することが望ましいかもしれない。ついで、該置換がヒトＰＤ−Ｌ１に対する該抗体のアフィニティもしくは特異性または他の所望の生物活性を、許容し得ないレベルへと低減しないことが保証されるように、そのような置換を有する抗体をスクリーニングする。

抗体コンジュゲート
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子はまた、放射性核種または他の検出可能な標識のような化学的部分にコンジュゲート化されうる。放射性核種には、^９９Ｔｃ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１３１Ｉ、^１１Ｃ、^１５Ｏ、^１３Ｎ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^２２６Ｒａ、^６０Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^５７Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^６７ＣＵ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ、^１０９Ｐｄ、^２３４Ｔｈおよび^４０Ｋ、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^５２Ｔｒ、および^５６Ｆｅが含まれる。蛍光または化学発光標識には、発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、^１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルが含まれる。

抗体分子を種々の部分にコンジュゲート化するための当技術分野で公知のいずれかの方法が使用可能であり、これらには、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されている方法が含まれる。抗体をコンジュゲート化する方法は通常のものであり、当技術分野で非常によく知られている。

実験的および診断的用途
本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗体フラグメントは、細胞の表面上で発現されたヒトＰＤ−Ｌ１を特異的に検出するために使用されうる。該細胞は、ヒト個体から得られた組織または血清サンプル中に存在することが可能であり、ＰＤ−Ｌ１発現の検出は、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ方法のいずれかを用いて行われる。

例えば、特定の実施形態はＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）を含み、これは典型的には以下の工程を含む：
（ａ）基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレートの表面）を抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆（コート）し、
（ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ１の存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用し、
（ｃ）該サンプル中の未結合物質が除去されるように、該プレートを洗浄し、
（ｄ）同様にヒトＰＤ−Ｌ１に特異的である検出可能な様態で標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用し、
（ｅ）未結合標識抗体が除去されるように、該基体を洗浄し、
（ｆ）該標識抗体が、結合した酵素である場合には、該酵素により蛍光シグナルへと変換される化学物質を適用し、
（ｇ）該標識抗体の存在を検出する。

もう１つの実施形態においては、ＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な変色を引き起こすペルオキシダーゼで、標識抗体を標識する。あるいは、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の存在下でシンチレーションカウンターにより検出されうる検出可能な放射性同位体（例えば、^３Ｈ）で標識抗体を標識する。

本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその抗原結合性フラグメントはウエスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット法において使用されうる。そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば以下を含む：
（１）ヒトＰＤ−Ｌ１の存在に関して試験されるべき膜または他の固体基体を本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させる。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいてＸの存在に関して試験されるべきタンパク質が（例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で）移されたニトロセルロースまたはビニル系（例えば、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ））膜の形態をとりうる。該抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはフラグメントとの膜の接触の前に、該膜を、所望により、例えば乾燥脱脂乳などでブロッキングして、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合するようにする。

（２）該膜を１回以上洗浄して、未結合抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはフラグメントおよび他の未結合物質を除去する。

（３）結合抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはフラグメントを検出する。該結合抗体またはフラグメントは、検出可能な様態で標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と共に該結合抗体またはフラグメントをインキュベートし、ついで該二次抗体の存在を検出することにより検出されうる。

本明細書に開示されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗原結合性フラグメントは免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおいて使用可能であり、これは当技術分野で公知の種々のＩＨＣ形態を用いて実施可能であり、それは本発明の実施形態を構成する。典型的なＩＨＣアッセイは、顕微鏡スライド上でマウントされ乾燥される約３〜４ミリメートル、好ましくは４マイクロメートルのＦＦＰＥ組織切片を使用し、例えば、（１）組織切片を脱パラフィンおよび水和に付し、該再水和組織切片を抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、（２）該組織内の１以上の細胞の表面上で抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを検出することを含む。該抗体またはフラグメント自体が検出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、該抗体またはフラグメントは、検出可能な様態で標識された検出される二次抗体により結合されうる。

好ましいＩＨＣアッセイは、商業的に入手可能なＤａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ検出系を使用し、これはＤａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ装置（Ｄａｋｏ，ａｎ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と併用されることが意図される。２２Ｃ３抗体、または２２Ｃ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体と共にこの系を使用する場合、ＩＨＣアッセイは以下のとおりに行われうる。スライド上にマウントされた４ミクロンの厚さのＦＦＰＥ組織切片を一晩風乾し、６０℃で４５分間にわたって焼き、脱パラフィン処理し、再水和させる。脱パラフィン後、９７℃、ついで室温で２０分間、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ Ｈｉｇｈ ｐＨ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用してＦＦＰＥスライドを熱誘発性エピトープ回復に付す。ついで該スライドを洗浄し、２μｇ／ｍＬの２２Ｃ３で６０分間染色し、ついで、以下のとおりにＤａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ試薬を使用して検出した：ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ＋ＭＳ Ｌｉｎｋｅｒ（１５分間）、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ／ＨＲＰ（２０分間）、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ ＤＡＢ（１０分間）およびＤＡＢ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（７分間）（介在する洗浄工程を伴う）。

本明細書に開示されている或る抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその抗原結合性フラグメントはインビボ腫瘍イメージングにも使用されうる。そのような方法は、放射能標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを、ＰＤ−Ｌ１発現を伴う腫瘍の存在に関して試験されるべきヒト患者の体内に注射し、ついで、例えば、該腫瘍に結合した高濃度の該抗体またはフラグメントを含む部位における、該標識抗体またはフラグメントの存在を検出するために、患者の身体の核イメージングを行うことを含みうる。

イメージング技術には、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放出型コンピュータ断層撮影）またはＰＥＴイメージング（陽電子放射断層撮影）が含まれる。標識には、例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと組合されたヨウ素−１２３（^１２３Ｉ）およびテクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、または例えばＰＥＴイメージングと組合された^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏもしくは^１８Ｆ、またはインジウム−１１１が含まれる（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５−４４０を参照されたい）。

検出キットおよび治療用キット
便宜上、本明細書に開示されている抗体または特異的結合剤は、キット、すなわち、診断または検出アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージされた組合せとして提供されうる。該抗体が酵素で標識される場合、該キットは基質と、酵素により要求される補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体）とを含むであろう。また、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは細胞溶解バッファー）などのような他の添加剤が含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する該試薬の溶液中の濃度がもたらされるように広範に変動しうる。特に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解に際して与える賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。

また、例えばＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型または競合形態）のようなイムノアッセイを含む種々の検出アッセイにおける使用のための、１以上のそのような試薬を含む診断または検出試薬およびキットを提供する。該キットの成分は固体支持体に予め付着していることが可能であり、あるいは、該キットが使用される際に固体支持体の表面に適用されることが可能である。幾つかの実施形態においては、シグナル生成手段は、本発明の抗体に予め結合したものであることが可能であり、あるいは、使用前に１以上の成分、例えばバッファー、抗体−酵素コンジュゲート、酵素基質などと組合されることを要しうる。キットはまた、追加的試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質などを含みうる。該固相表面はチューブ（管）、ビーズ、マイクロタイタープレート、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを固定化するのに適した他の材質の形態でありうる。特定の態様においては、化学発光もしくは色素原産物の形成または化学発光もしくは色素原基質の還元を触媒する酵素がシグナル生成手段の一成分である。そのような酵素は当技術分野でよく知られている。キットは、本明細書に記載されている捕捉剤および検出試薬のいずれかを含みうる。所望により、該キットは、本発明の方法を実施するための説明をも含みうる。

本明細書に開示されている検出キットはまた、本明細書に開示されている抗体または抗原結合性フラグメントの少なくとも１つと、検出試薬として該組成物を使用するための説明とを含むものとして製造されうる。そのようなキットにおいて使用する容器は、典型的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または該検出組成物の１以上が配置され、好ましくは適切にアリコート化されうる他の適当な容器を含みうる。本明細書に開示されているキットは、典型的には、商業的販売のために密封された、バイアルを含有するための手段、例えば、所望のバイアルが収容される射出成型またはブロー成型プラスチック容器をも含むであろう。放射能標識、色素原、発蛍光または他のタイプの検出可能な標識または検出手段が該キット内に含まれる場合には、該標識剤は検出組成物自体と同じ容器内で提供されることが可能であり、あるいはこの第２の組成物が配置され適切にアリコート化されうる第２の別個の収容手段内に配置されることが可能である。あるいは、該検出試薬は単一容器手段において調製されることが可能であり、ほとんどの場合、該キットは、典型的には、商業的販売および／または簡便なパッケージングおよび運搬のために密封された、該バイアルを収容するための手段をも含むであろう。

本明細書に記載されている検出またはモニタリング方法を行うための装置または器具も提供する。そのような装置は、サンプルが投入されうるチャンバ（室）またはチューブ、流体処理系（これは、所望により、サンプル流を装置へ導くための弁またはポンプを含みうる）、血液から血漿または血清を分離するための所望により含まれうるフィルター、捕捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバ、および捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための所望により含まれうる検出装置を含みうる。サンプル流は受動的なもの（例えば、毛管力、静水力、またはサンプルが一旦適用されると装置の更なる操作を要しない他の力によるもの）または能動的なもの（例えば、機械式ポンプ、電気浸透ポンプにより生じる力、遠心力、増加した空気圧の適用によるもの）または能動的な力および受動的な力の組合せによるものでありうる。

更なる実施形態はまた、プロセッサ、コンピュータ読取可能メモリ、およびコンピュータ読取可能メモリ上に保存され、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うために該プロセッサ上で実行されるように適合化されたルーチンを提供する。適当なコンピューティング（計算）システム、環境および／または構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、携帯式またはラップトップ装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能な大衆消費電子商品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、前記システムまたは装置のいずれかを含む分散コンピューティング環境、あるいは当技術分野で公知のいずれかの他のシステムが含まれる。

一般的方法
分子生物学における標準的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。標準的な方法はＡｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹにも見られ、これは細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載している。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学的分析、化学的修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１）を参照されたい）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造、精製およびフラグメント化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体は製造可能である（例えば、ＳｈｅｐｅｒｄおよびＤｅａｎ（編）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３；ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号を参照されたい）。

ヒト化に代わる手段は、ファージ上で提示されるヒト抗体ライブラリー、またはトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーを使用することである（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４；Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８３７−８３９；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＣｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１−３７７；Ｂａｒｂａｓら（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋａｙら（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｄｅ Ｂｒｕｉｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７−３９９）。

抗原の精製は抗体の製造に必要ではない。関心のある抗原を含有する細胞で動物を免疫化することが可能である。ついで該免疫化動物から脾細胞を単離し、該脾細胞を骨髄腫細胞系と融合させてハイブリドーマを得ることが可能である（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎら，前掲；Ｋａｉｔｈａｍａｎａら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７−５１６４を参照されたい）。

抗体は例えば小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲート化されうる。抗体は治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例えば色素、放射性同位体、酵素または金属、例えばコロイド金に結合した抗体を包含する（例えば、Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；ＨｓｉｎｇおよびＢｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照されたい）。

蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドおよび抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

免疫系の標準的な組織学的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。

例えば抗原フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照されたい）。

図１は、ハイブリドーマＭＥＢ０３７．２０Ｃ３から単離された全ＲＮＡから調製された抗体可変軽鎖および重鎖ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ならびにそれによりコードされる推定アミノ酸配列（太字）を示し、括弧はリーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、下線はＣＤＲ配列を示す。 図２は、ハイブリドーマＭＥＢ０３７．２２Ｃ３から単離された全ＲＮＡから調製された抗体可変軽鎖および重鎖ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ならびにそれによりコードされる推定アミノ酸配列（太字）を示し、括弧はリーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、下線はＣＤＲ配列を示す。 図３は、抗体２０Ｃ３および２２Ｃ３の軽鎖および重鎖の成熟可変領域の整列（アライメント）されたアミノ酸配列を示し、太字は、それらの配列が異なっている位置を示し、下線は、Ｋａｂａｔの番号付け系により定められたＣＤＲ配列を示し、括弧は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け系により定められた重鎖ＣＤＲ１を示す。 図４は、商業的に入手可能な抗体ＰＲＳ４０５９（図４Ａ）または本発明の２２Ｃ３抗体（図４Ｂ）を使用する免疫組織学的アッセイにより得られた扁桃切片の染色を示し、図４Ａおよび４Ｂの右側の切片は、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合に関して抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体と競合するＰＤ−Ｌ１−ＩｇＧ１融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下のプレインキュベーションの後の結果を示す。 図５は隣接正常ＦＦＰＥ扁桃組織切片の写真を示し、これにおいては、抗体２２Ｃ３３を使用するＩＨＣアッセイ（図５Ａ）およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）（図５Ｂ）を用いて、それぞれ、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）ｍＲＮＡ発現をアッセイした。このアッセイにより、２つの特有の細胞集団、すなわち、陰窩上皮（図５Ａ左拡大図および図５Ｂ上図）と濾胞マクロファージ（図５Ａ右拡大図および図５Ｂ下図）との間の異なる染色が示された。 図６は、ｍＲＮＡ分析（ｑＰＣＲ）によるｈＰＤ−Ｌ１の発現に関して陰性であることが判明したＨＴ１４４細胞（図６Ａ）および高レベルのｈＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）を発現することが判明したＬＯＸメラノーマ細胞（図６Ｂ）への種々の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体および同位体対照抗体の結合のフローサイトメトリー評価の結果を示す。 図７は、操作されたＣＨＯ細胞系（図７Ａ）およびヒト細胞系（図７Ｂ、上パネル）のＦＦＰＥ細胞ペレット上で抗体２２Ｃ３により得られたＩＨＣ染色を示し、染色強度が、同じヒト細胞系において測定されたｈＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ発現レベル（図７Ｂ、下パネル）と良く相関することを示している。 図８はｈＰＤ−Ｌ１に対する抗体２２Ｃ３および２０Ｃ３の選択的結合および相対アフィニティを示し、これらのグラフは細胞に基づくＥＬＩＳＡ実験の結果を示し、この場合、ｈＰＤ−Ｌ１を発現しない細胞（図８Ａ）、ｈＰＤＬ−１を発現する細胞（図８Ｂおよび８Ｃ）またはヒトＰＤ−Ｌ２を発現する細胞（図８Ｄ）を、示されている濃度の示されている一次抗体と共にインキュベートし、ついで該一次抗体の結合を二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した（実施例に記載されているとおり）。 図９は、同一ではないが重複するエピトープに抗体２２Ｃ３および２０Ｃ３が結合することを示す抗体結合競合アッセイの結果を示す。 図１０は、示されている腫瘍型からのＦＦＰＥサンプルの２２Ｃ３ ＩＣＨ染色の強度の半定量的ゲシュタルト・スコアリング（ｇｅｓｔａｌｔ ｓｃｏｒｉｎｇ）の結果を示し、染色の度合はスコア数の増加と共に増強する。 図１１は、ＩＨＣアッセイにおいて抗体２２Ｃ３で検出されたヒトＰＤ−Ｌ１発現が抗ヒトＰＤ−１抗体（ＭＫ−３４７５）での治療に対するメラノーマ患者の応答と相関することを示しており、図１１Ａは、ｈＰＤ−Ｌ１発現に関して陽性、陰性または曖昧として解釈される２２Ｃ３−ＩＨＣ染色の代表的イメージを示し、図１１Ｂは、ＩＨＣアッセイによるｈＰＤ−Ｌ１発現に関して（曖昧と評価された患者を含む）陽性または陰性と評価された、陽性または陰性応答を示した患者の数を示す。

実施例
実施例１．抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマの作製およびスクリーニング
アジュバント中のヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ．１５６−Ｂ７−１００）でＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。この融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１フラグメント（Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３００）に融合したＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（Ｐｈｅ１９−Ｔｈｒ２３９）を含有する。１２回の免疫化後、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する高い力価を有する２匹のマウスからのリンパ節を集め、電気融合を行って２バッチのハイブリドーマを得、これを研究名称ＭＥＢ０３３およびＭＥＢ０３７と命名した。

ヒトＰＤ−Ｌ１に対する抗体を産生するハイブリドーマを特定するために、ＭＥＢ０３３およびＭＥＢ０３７ハイブリドーマバッチの上清をスクリーニングした。該スクリーニングは、ヒトｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質への結合に関する、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡ、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１−ＣＨＯ ヒトＰＤ−Ｌ１ＣＨＯ安定形質転換体および陰性対照としての親ＣＨＯ細胞への結合に関する、細胞に基づくＥＬＩＳＡを用いた。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在に関して陽性の試験結果（データ非表示）を示したＭＥＢ０３３ハイブリドーマのクローン２３個およびＭＥＢ０３７のクローン８８個からの上清ならびにそれらのサンプルを正常ヒト扁桃からのＦＦＰＥ組織切片上のＩＨＣ反応性に関して試験した（データ非表示）。

該クローン８８個のうち、ＭＥＢ０３７バッチからのクローン１１個のみが、後記表に挙げられている商業的に入手可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体で得られた染色パターンとの比較に基づいて、更なる評価を保証するのに十分な強度および見掛け特異性の染色パターンを示した。

本発明者らが、該実験抗体で得られた種々の染色パターンを、これらの商業的に入手可能な抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体で得られたパターンと比較したところ、染色の局在化および染色細胞のタイプを含む、染色パターン間の有意な相違を認めた。これらの相違を説明するために、本発明者らは幾つかの追加的実験を行い、これらの商業的に入手可能な抗体がいずれも、ＦＦＰＥ切片におけるＰＤ−Ｌ１発現のＩＨＣにおける使用に要求される以下の属性の組合せを与えないことを見出した：（１）感度 − 陽性対照組織（例えば、ヒト扁桃）における正常生理的発現および腫瘍組織（例えば、ヒトメラノーマサンプル）における発現を検出する能力；（２）特異性 − 染色パターンはＰＤ−Ｌ１の既知解剖的／細胞分布と相関する必要があり、中和可能である必要がある；ならびに（３）頑強（ロバスト） − 「重複」組織切片をアッセイするために使用された場合に染色パターンにおける変動がほとんど乃至全く無い。

例えば、Ｓｉｇｍａ／ＰｒｏＳｃｏ ＰＲＳ４０５９抗体は扁桃ライセート上で複数のバンド（それらはいずれもＰＤ−Ｌ１を表すとは証明できなかった）を示し、フローサイトメトリーではＰＤ−Ｌ１陽性であることを示したＬＯＸメラノーマ細胞系を染色せず、そしてＩＨＣにより陽性細胞系と陰性細胞系とを識別しないことを、本発明者らは見出した。

これらのデータの幾つかを図４に示す。この図において、扁桃切片の免疫組織化学的染色は、ＦＦＰＥ組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現を検出するための１５個の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体のなかで唯一の適当な候補としてＧａｄｉｏｔら（前掲）により特定されたＰＲＳ４０５９抗体と比較して、ＦＦＰＥ組織上で特異かつ有用な免疫組織化学的特性を有する２つの抗体として、２２Ｃ３および２０Ｃ３を特定した。本発明者らにより行われた実験においては、Ｐｒｏｓｃｉ抗体（ＰＲＳ４０５９，ロット４０５９０６０４；０．４ｍｇ／ｍｌ（一次）で使用）およびそれに続くウサギポリマー検出系（ＤＡＫＯ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）は扁桃における造血系列の全てを等しい強度で染色し、一方、２２Ｃ３抗体は扁桃陰窩上皮および濾胞ＣＤ６８＋骨髄細胞（これはマクロファージと形態学的に合致している）を選択的に染色した（図４Ｂ）。抗体２０Ｃ３で実質的に同じ染色パターンが観察された（データ非表示）。更に、２２Ｃ３および２０Ｃ３は、これらの２つの異なる細胞集団の間で、一貫した染色強度の相違を示しており、陰窩上皮での染色強度は濾胞マクロファージでの強度より遥かに大きい。３個全ての抗体がＰＤ−Ｌ１抗原とのプレインキュベーションにより中和可能であった。このことは、該反応性が抗原結合性ドメイン（ＣＤＲ）によりもたらされることを示している。

実施例２．２０Ｃ３および２２Ｃ３抗ＰＤ−Ｌ１抗体の品質評価
この実施例は、ＦＦＰＥ組織切片のＩＨＣアッセイにおける使用のための２０Ｃ３および２２Ｃ３抗体の有用性を評価するために行った追加的実験を記載する。

１つの実験は、正常ヒトＦＦＰＥ扁桃切片のＩＨＣアッセイにおいて或る範囲のヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）タンパク質発現を検出する、これらの２つの抗体の能力を評価した。２２Ｃ３に関する代表的イメージを図５Ａに示す。２２Ｃ３での免疫組織化学的染色は扁桃陰窩上皮を強力に標識し、ＣＤ６８＋濾胞骨髄集団（推定マクロファージ）の弱ないし中等度の染色を示している。両方の抗体（２０Ｃ３のデータは非表示）は、これらの２つの細胞型において、明確な膜／細胞表面パターンで細胞を標識する。扁桃におけるｈＰＤ−Ｌ１発現の妥当性（すなわち、２つの細胞集団（陰窩上皮および濾胞マクロファージ）へのＩＨＣ染色の限局）は、隣接ＦＦＰＥ扁桃組織切片上で、独立した方法（ｈＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡに関するｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション［ＩＳＨ］）により確証された。また、ＩＨＣにより評価されたｈＰＤ−Ｌ１タンパク質の差次的発現（陰窩上皮＞＞濾胞マクロファージ）は、ＩＳＨで観察されたｈＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡの相対存在量に対応している。

もう１つの実験はｈＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する２０Ｃ３および２２Ｃ３の結合特異性を評価した。ｍＲＮＡ分析（ｑＰＣＲ）によりｈＰＤ−Ｌ１の発現に関して陰性であることが判明したＨＴ１４４細胞、および高レベルのｈＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）を発現することが知られているＬＯＸメラノーマ細胞を、前記実施例１に記載されている実験において得られた７個のハイブリドーマからの１マイクログラム／ｍｌの精製マウスＩｇＧで染色した。同じ濃度の無関係なアイソタイプ対照マウス抗体も使用した。一次マウス抗体を検出するために蛍光標識抗マウス二次抗体を使用した。染色および反復洗浄の後、該細胞をフローサイトメトリーにより分析し、該集団に関する中央値蛍光強度を計算した（＞１０，０００の収集事象）。結果を図６に示す。

細胞表面ｈＰＤ−Ｌ１を検出するためのフローサイトメトリー試薬として、２０Ｃ３および２２Ｃ３ならびに他のｈＰＤ−Ｌ１抗体を使用した。アイソタイプ対照抗体曲線と比較した場合の２０Ｃ３および２２Ｃ３ヒストグラム曲線（図６Ａ）の両方の有意な右シフトはｈＰＤ−Ｌ１陽性ＬＯＸメラノーマ細胞系上のｈＰＤ−Ｌ１の選択的検出を反映している。この分析からのこれらのヒストグラムなどに関連した中央値蛍光強度を図６Ｂに示す。２０Ｃ３および２２Ｃ３結合の選択性は陰性細胞系ＨＴ１４４上の有意な結合の欠如（すなわち、アイソタイプと同程度の２２Ｃ３および２０Ｃ３のＭＦＩ）により更に確証される。これとは対照的に、図６Ｂにおけるデータは、ｈＰＤ−Ｌ１陽性ＬＯＸメラノーマ細胞系において、２０Ｃ３および２２Ｃ３の両方が、アイソタイプと比較して、少なくとも１０倍のＭＦＩ増加をもたらすことを示している。したがって、（クローン５Ｆ９、７Ｃ８、１３Ｄ２および３１Ｄ３に加えて）２０Ｃ３および２２Ｃ３はフローサイトメトリー評価によりｈＰＤ−Ｌ１発現細胞への選択的結合を示す。

もう１つの実験は、操作された及びヒト細胞系上のｈＰＤ−Ｌ１の発現を検出する、２２Ｃ３抗体の能力を評価した。ｈＰＤ−Ｌ１に関して陰性であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を、ヒトＰＤ−Ｌ１をコードする発現ベクターでトランスフェクトして、操作された陽性対照細胞系を得た。図７Ｂに示されているとおり、親ＣＨＯ細胞系（陰性対照）およびトランスフェクト化ＣＨＯ細胞系（陽性対照）のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレットの２２Ｃ３での免疫組織化学的染色は適当な陽性および陰性染色を示す。

追加的なＦＦＰＥヒト細胞系ペレット（Ａ３７５、ＨＳ５７８ＴおよびＬＯＸメラノーマ）が２２Ｃ３で染色され、図７Ｂに示されているとおり、ある範囲の染色パターンおよび強度を示した。２２Ｃ３染色はＬｏｘメラノーマ細胞上では強力かつ均一であったが、Ａ３７５およびＨＳ５７８Ｔ細胞ペレットにおいては、稀有な単一陽性細胞を示したに過ぎなかった。２０Ｃ３抗体で、類似した染色が観察された（データ非表示）。これらの３つの細胞系において２２Ｃ３によりＩＨＣアッセイで検出されたｈＰＤ−Ｌ１発現レベルは、ベースラインとしてのユビキチンｍＲＮＡと共にｑＰＣＲを用いて評価されたこれらの細胞系におけるＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡレベルと良く相関した。

ｈＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する２２Ｃ３の選択的結合および相対アフィニティを、細胞に基づくＥＬＩＳＡ実験において評価した。幾つかの細胞系（ｈＰＤＬ１−ＣＨＯＫ１細胞、親ＣＨＯＫ１細胞、ｈＰＤＬ２−ＣＨＯＫ１細胞およびＬＯＸ細胞）をコラーゲン被覆９６ウェルプレートの個々のウェル上でプレーティングし、コンフルエント状態まで増殖させた。培地を除去し、１．４〜３，０００ｎｇ／ｍｌの漸増濃度の一次抗体を含有する新鮮なＣＨＯＫ１培地（１０％ ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）と交換した。以下の一次抗体を使用した：抗体２０Ｃ３および２２Ｃ３の、マウスＩｇＧ１アイソタイプを有するそれぞれ２つの異なる生産ロット、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および対照として働く抗ＰＤ−Ｌ２抗体。該一次抗体を３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃ特異的ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃１０３０−０５）コンジュゲートをＣＨＯＫ１培地中の１：２０００の希釈度で加えた。該二次抗体を３７℃で１時間インキュベートし、前記のとおりに５回洗浄した。ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢを使用して現像し、０．１Ｎ リン酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読取った（６５０ｎｍのバックグラウンド除去を伴う）。図８に示す結果は、ｈＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への２２Ｃ３および２０Ｃ３の選択的結合を示しており、２２Ｃ３の結合アフィニティは、ｈＰＤ−Ｌ１ ＣＨＯＫ１操作細胞およびＬＯＸ細胞の両方に関して、２０Ｃ３より大きい。

２０Ｃ３または２２Ｃ３抗体のいずれかがマウスＰＤ−Ｌ１に結合するかどうかを評価するために、類似したＥＬＩＳＡ実験を行った。マウスＰＤ−Ｌ１へのいずれの抗体の有意な結合も観察されなかった（データ非表示）。

実施例１に記載されている実験において特定された抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体の異なるペアの間の抗体結合競合アッセイ（「交差遮断」）を行った。該アッセイはＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用し、これはバイオ・レイヤー（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ）インターフェロメトリーに基づく。簡潔に説明すると、この技術は、時間（Ｘ時間）の経過に伴いバイオセンサー先端における光学的厚さ（Ｙ軸）を増加させる結合抗体による波長シフト（Δλ）として、バイオセンサー先端表面への初期抗体（ｍＡｂ１）の結合を測定する。該先端は、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃが結合している抗ｈｕＩｇＧセンサーからなる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合の際の光学的厚さの変化は、第１の垂直の赤色点線において始まる上向きの傾きの曲線において反映され（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃにおけるグラフを参照されたい）、これらは溶液中への飽和濃度のｍＡｂ１（１０マイクログラム／ｍｌ）の添加を表す。平衡状態にした後（〜１０００秒）、二次抗体をアッセイ溶液中に注入する（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃにおける第２の垂直の赤色点線により示されている）。該曲線の追加的な可動域により示される、二次ｍＡｂ２の結合は、それらの２つの抗体が非重複エピトープに結合することを示唆しており、一方、該曲線の可動域がほとんど乃至全く無いことは、それらの２つの抗体が重複または同一エピトープに結合することを示唆している。

要約すると、該結果は、２２Ｃ３結合が、５Ｈ９を除くｍＡｂ２として試験された全ての他の抗ｈＰＤＬ−１クローンの追加的結合と競合することを示している（図９Ａ）。同様に、２０Ｃ３も５Ｈ９結合とは競合しないが、２２Ｃ３および４Ｂ７との中間的な度合の追加的結合を示している（図Ｂ）。総合すると、これらのデータは、２０Ｃ３および２２Ｃ３が重複エピトープに結合することを示している。

以下の腫瘍（膀胱、食道、頭頸部、腎臓、ＨＣＣ、乳房、肺、卵巣および胃）から調製されたＦＦＰＥ切片上でＩＨＣ分析を行うことにより、種々の腫瘍型における或る範囲のｈＰＤ−Ｌ１発現を検出する、２２Ｃ３抗体の能力を評価した。これらの腫瘍組織切片との２２Ｃ３反応性の予備的スクリーニングを、染色の度合の半定量的「ゲシュタルト（ｇｅｓｔａｌｔ）」解釈を用いて行った。図１０に示されているとおり、２２Ｃ３は、実質的に染色無し（スコア＝０）から顕著な強力発現（スコア＝４）までの範囲のＰＤ−Ｌ１発現を検出可能であり、これは、免疫抑制性ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻止に応答しうる将来の腫瘍型を誘導するための、２２Ｃ３によるＩＨＣアッセイの有用性を示している。

Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．により開発されている抗ＰＤ１治療用抗体であるＭＫ−３４７５に関する第１相（Ｐ００１）治験に登録された１８名のメラノーマ患者から得られたアーカイブサンプルの２２Ｃ３免疫組織化学的評価を利用する研究において、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する療法に応答する可能性がより高い患者を層別化するための２２Ｃ３抗体の有用性を評価した。症例は２名の病理医により独立して評価され、「陽性」、「陰性」または「曖昧」として帰属された。３つの範疇を示すこれらの代表的イメージを図１１Ａに示す。このサンプルセット（ｎ＝１８）に関する病理医間の一致は１００％であった。

臨床応答を、免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）を用いて評価し、ＩＨＣ結果と相関させた。この分析では、「曖昧」例は陰性とみなされ、７２％のアッセイ感度および８６％の特異性を示した。図１１Ｂに示す結果は、ＦＦＰＥ組織上の２２Ｃ３免疫組織化学的染色が患者選択バイオマーカーとしての有用性を有することを示唆している。

前記実験の結果に基づいて、本発明者らは、前記の８８個の実験用ハイブリドーマのうちの２つ（ＭＥＢ０３７．２０Ｃ３．１３８およびＭＥＢ０３７．２０Ｃ３．１１６）により産生された抗体が、候補ＦＦＰＥ反応性ＩＨＣ診断試薬としての開発のために考慮されるための感度、特異性および頑強さの必須組合せを有すると判定した。

実施例３．２２Ｃ３抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対するヒトＰＤ−Ｌ１上のエピトープのマッピング
１１マーのヒスチジンタグに融合した成熟ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号３８）の細胞外ドメインを含有する抗体２２Ｃ３およびＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタンパク質を使用して、ＨＤＸ−ＭＳエピトープマッピングを行った。ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号３８）の細胞外ドメイン上のセグメント１５６〜１７８および１９６〜２０６は抗体２２Ｃ３への結合に際して強力な防御（＞１０％の平均重水素化レベルの相違）を示した。また、セグメント３〜９、１０〜１３、８８〜９３および１３５〜１４７は、限界的であるが有意な防御を示した（５％〜１０％の平均重水素化レベルの相違）。

本明細書中に引用されている全ての参考文献は、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が、参照により組み入れるという特別な陳述に直に隣接して存在しない場合であっても、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．（米国特許規則）§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．（米国特許規則）§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関するものであることが出願人により意図される。参照により組み入れるという特別な陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。

本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。

前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の変更が前記説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。

Claims (8)

1. ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の、３個の軽鎖ＣＤＲ、ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の、３個の重鎖ＣＤＲを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
   （ａ）
   ＣＤＲＬ１が配列番号９で表され、
   ＣＤＲＬ２が配列番号２で表され、
   ＣＤＲＬ３が配列番号１０で表され、
   ＣＤＲＨ１が配列番号１４もしくは配列番号１５で表され、
   ＣＤＲＨ２が配列番号１６で表され、
   ＣＤＲＨ３が配列番号１７で表され、または、
   （ｂ）
   ＣＤＲＬ１が配列番号２１で表され、
   ＣＤＲＬ２が配列番号２で表され、
   ＣＤＲＬ３が配列番号２２で表され、
   ＣＤＲＨ１が配列番号２６で表され、
   ＣＤＲＨ２が配列番号２８で表され、
   ＣＤＲＨ３が配列番号２９で表され、
   扁桃陰窩上皮および濾胞ＣＤ６８＋骨髄細胞を異なる強度で染色し、ｈＰＤ−Ｌ１陽性ＬＯＸメラノーマ細胞系上のｈＰＤ−Ｌ１を選択的に検出し、ｈＰＤ−Ｌ１陰性ＨＴ１４４細胞系上の有意な結合を欠く、前記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
2. 軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
   （ａ）該軽鎖可変領域が配列番号１３であり、該重鎖可変領域が配列番号２０であり、
   （ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号２５であり、該重鎖可変領域が配列番号３２であり、配列番号３２におけるＸがＱであり、または
   （ｃ）該軽鎖可変領域が配列番号２５であり、該重鎖可変領域が配列番号３２であり、配列番号３２におけるＸがピログルタミン酸である、
   前記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
3. ヒトから摘出された組織サンプルをＰＤ−Ｌ１発現に関してアッセイする方法であって、
   （ａ）ヒトＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−Ｌ１結合試薬の特異的結合を可能にする条件下、該組織サンプルをＰＤ−Ｌ１結合試薬と接触させ、ここで、該結合試薬は、請求項１または２記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含み、
   （ｂ）未結合ＰＤ−Ｌ１結合試薬を除去し、
   （ｃ）結合したＰＤ−Ｌ１結合剤の存在または非存在を検出することを含む、方法。
4. 結合した結合試薬の量を定量することを更に含む、請求項３記載の方法。
5. 該結合試薬が配列番号１３および配列番号２０を含む、または配列番号２５および配列番号３２を含む、請求項３または請求項４記載の方法。
6. 請求項１または２記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合した該抗体または該抗原結合性フラグメントの複合体を検出するための試薬のセットとを含むキット。
7. 該抗体または抗原結合性フラグメントが配列番号１３および配列番号２０を含む、または配列番号２５および配列番号３２を含む、請求項６記載のキット。
8. ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体分子の混合物を含む抗体組成物であって、該混合物における抗体分子が配列番号２５および配列番号３２であって、配列番号３２におけるＸはピログルタミン酸である配列を含み、該混合物における抗体分子の残りが配列番号２５および配列番号３２であって、配列番号３２におけるＸはＱである配列を含む、抗体組成物。

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