JP6706261B2 - 化合物を封入するためのナノ粒子、その製造および使用 - Google Patents

Description

本発明は、製薬分野およびナノテクノロジー分野に包含され、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマーに由来する新規なポリマーコンジュゲートのナノ粒子を用いた有効成分の封入に関する。本発明はまた、前記コンジュゲートおよびナノ粒子の両方を生産するための方法、前記コンジュゲートまたはナノ粒子を含有する組成物、およびその適用に関する。

多くの抗腫瘍薬を含む有効成分（薬物）の多くは非経口的に投与され、これが種々の問題を引き起こしている。経口経路による抗腫瘍薬の投与に含まれると思われる主要な利点の中でも、患者の生活の質の向上ならびに健康管理コストの削減が強調されるべきである。この投与経路は好適かつ持続的な濃度レベルで癌細胞の抗腫瘍薬物への継続的暴露を可能とするはずであり、これが次に治療係数を改善し、副作用を軽減する。

薬物が経口的に与えられる場合、そのバイオアベイラビリティは、溶解度、消化管内での安定性、透過性、および初回通過代謝などのいくつかの要因のために一般に低い：
・低溶解度および低透過性の化合物は経口投与形の処方を困難にする。
・消化管は、粘液の急速なターンオーバーと相対的に一定の通過時間のために難しい投与部位であることが分かっている。
・薬物は腸壁、次いで、門脈循環を通過して肝臓にたどり着かなければならず、両部位は初回通過代謝の共通部位である。
・薬物の吸収もまた、特に化合物が親油性である場合には、流出機構によって制限を受け得る。例えば、上皮細胞の粘膜表面に存在する分泌輸送体Ｐ糖タンパク質が、種々の薬物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはカンプトテシン）の低くかつ変動のあるバイオアベイラビリティの一因である。

これらの要因は、吸収（溶解度および透過性）と代謝という２つの相関のあるカテゴリーに分類でき、薬物の経口バイオアベイラビリティを最適化する際に考慮されるべきである(Hayden Thomas et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006;2(4):591-608)。

上述の欠点を克服するための１つの可能性のある戦略が、経口薬物送達用の担体としてのポリマーナノ粒子の使用であり得る。ナノ粒子系への薬物の封入は、消化管の過酷な条件からそれらを保護し、積載された薬物を吸収細胞の表面まで導き、それらの放出を制御する。生体接着が薬物投与をさらに改善した。生体接着性薬物送達システムを持つことにはいくつかの利点がある：（ｉ）接着の結果として、処方物が送達部位により長く留まること；（ｉｉ）特異的生体接着分子を使用することにより、例えば消化管（ＧＩ）内などの特定の部位または組織を標的とすることが可能となること；および（ｉｉｉ）滞留時間の延長は、薬物の放出制御と組み合わせると、投与頻度の低減をもたらし得ること(Woodley, Clin Pharmacokinet 2001;40(2):77-84)。しかしながら、十分な生体接着特性に関して、粘液層を通過した後に上皮の表面で接着相互作用を確立するためには、ナノ粒子は粘膜透過性を示さなければならない。

キトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはメチルビニルエーテルと無水マレイン酸の間の種々のコポリマー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＩＳＰ、ＵＳＡからＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）として上市）など、多くのポリマーが経口薬物送達用生体接着性ナノ粒子を作製するために有用な材料として記載されている。

ナノ粒子と好適な親水性化合物の会合またはナノ粒子の好適な親水性化合物でのコーティングはそれらの物理化学的特徴を変化させ、従って、それらの分布および生物学的媒体との相互作用を改変し、封入された薬物の、その作用または吸収に理想的な部位への到達を促し得る。可能性のある戦略は、ペグ化ナノ粒子と呼ばれるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ナノ粒子の使用である。

経口投与におけるそれらの使用に関して、ポリエチレングリコールと従来のナノ粒子への会合はこれらの担体と管腔の成分との相互作用を最小とする。この事実は、ナノ粒子の周囲に親水性コロナを形成し、タンパク質の相互作用を妨げ(Gref et al., Science 1994;263:1600-1603)消化管粘膜の保護粘液層の通過を促進する滑りのよい表面を与えるＰＥＧの能力と関連付けられる。

この戦略の主な欠点はポリエチレングリコールとナノ粒子の表面の会合の安定性である(Peracchia et al., Life Sci 1997;6:749-761)。タンパク質を退けるポリエチレングリコールの能力はポリマー鎖の構造、電荷、長さおよび柔軟性に依存することが知られている(Torchillin, J Microencapsul 1998;15:1-19)。ナノ粒子の表面を修飾するための方法は、主として、物理的吸着(Stolnik et al., Adv Drug Del Rev 1995;16:195-214)または２ブロックまたは３ブロックの形での共有結合(De Jaeghere et al., J Drug Target 2000;8:143-153)により行われる。共有結合が好ましいことを考慮して、ほとんどのペグ化ナノ粒子は乳酸またはグリコール酸とのポリエチレングリコールコポリマーを用いて作製されてきた。しかしながら、この共重合プロセスは、数種の触媒と特殊な化学条件の使用を必要とする(Beletsi et al., Int. J. Pharm 1999;182:187-197)。さらに、有機合成に使用される有毒な有機溶媒残留物（塩化メチレン、トルエンなど）も問題となり得る。

ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）の表面ナノ粒子の、ポリエチレングリコールでの修飾もまた達成されている。特許ＷＯ２００５／１０４６４８には、ペグ化ナノ粒子を得るための２つの異なる方法、すなわち、（ｉ）ポリマーを脱溶媒和する前の有機溶媒中でのポリマーＰＶＭ／ＭＡおよびポリエチレングリコールの同時インキュベーション、および（ｉｉ）生分解性ポリマーナノ粒子とポリエチレングリコール水溶液とのインキュベーションが記載されている。両方法ともそれらの表面にポリエチレングリコールが会合されたＰＶＭ／ＭＡナノ粒子を作製するためには妥当ではあるが、単純な吸着の主な欠点は、相互作用の不安定性のためにｉｎ ｖｉｖｏでコーティング層が早期に欠損することである(Neal et al., J Pharm Sci 1998;87:242-1248)。

ＷＯ２００５／１０４６４８もまた、ＰＶＭ／ＭＡを欠くポリエチレングリコールのナノ粒子に比べて優れた腸管接着性を有するＰＶＭ／ＭＡのペグ化ナノ粒子を開示している。これらのナノ粒子は、生物学的に活性な分子を封入するための高い融通性を実証した。例えば、ＷＯ２００９／１２１９９７には、ＰＶＭ／ＭＡのナノ粒子の、ポリエチレングリコールによる修飾およびコーティングが相当量の化学合成薬物を封入し得るペグ化ナノ粒子の取得を可能とすることが開示されている。しかしながら、そのコーティングの安定性は低く、そのコーティング層は時間が経つと消失し得る。

生体接着性薬物送達システムは、胃腸管粘膜表面への接着によって消化管通過時間の延長をもたらし得るが、良好な接着および通過の遅延が常にバイオアベイラビリティの改善に表れるわけではない(Davis SS. Drug Discovery Today 2005;10(4):249-257)。薬物が容易に溶解しないかまたは流出機構のために上皮膜を透過できない場合には、吸収部位での時間が不十分となり得る。ＷＯ２００８／１２９１０６は、経口投与された際にＰ糖タンパク質の基質である薬物のバイオアベイラビリティを高めることができる、ＰＶＭ／ＭＡとシクロデキストリンを含んでなる薬物投与用の別のナノ粒子を開示している。

しかしながらやはり、経口投与後にいくつかの薬物のバイオアベイラビリティを改善する必要がなおある。ゆえに、良好な物理化学的特性（分解性、安定性および機械的力）を併せ持つ数種の薬物の親水／疎水性と新規ポリマーから製造されたナノ粒子の改良された薬学的特徴（分布、生物接着および放出速度）を適合させるために新規な薬物投与システムを開発する（例えば、新規なポリマーおよびコポリマーを合成する）ための多大な努力がなお必要とされる。これらは薬物の吸収効率の増加、病院での灌流の代替処置の提供、この種の薬物による処置の健康管理コストの削減および患者の生活の質の改善を可能とするであろう。

発明の概要
本発明の目的は、ＧＩ管内で安定であり、相当量の生物学的に活性な化合物（例えば、薬物または有効成分、特に、疎水性薬物）を封入することができ、かつ、経口投与された薬物のバイオアベイラビリティを高めることができる新規な薬物投与システムを開発すること、すなわち、従前に述べた欠点を解決する新規なポリマーコンジュゲートおよびそれから製造されたナノ粒子を提供することである。

本発明に至る研究は、欧州連合第７次フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７−２０１３）から助成金契約第ＮＭＰ４−ＬＡ−２０１１−２８０７６１号として資金援助を受けている。

ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコールまたはヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体との新規なエステルポリマーコンジュゲートは単純な反応により合成でき、生物学的に活性な化合物の投与にとって良好な特徴を有するナノ粒子を容易に生産するのに好適となることが認められた。ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコールまたはヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体とのこれら新規なエステルポリマーコンジュゲートにより形成されたナノ粒子は、相当量の生物学的に活性な化合物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルおよびカンプトテシン(campthotecin)）を封入すること、およびｉｉ）粘液層を通過し、腸細胞の表面と緊密に相互作用する（薬物の吸収を改善する）ことができることが特に見出された。

驚くことに、本発明により提供されるナノ粒子は、腸管粘膜を経た前記生物学的に活性な化合物のバイオアベイラビリティの増強を可能とし、極めて長時間（例えば、ドセタキセルの場合には少なくとも７２時間）のその延長された持続的血漿レベルが得られ、病院での灌流の代替投与を提供し、この種の薬物による処置の健康管理コストの削減および患者の生活の質の改善を可能とする。

よって、第１の態様において、本発明は、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子との新規なエステルポリマーコンジュゲートに関し、前記ヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体から選択される。

本発明の１つの特定の変形形態では、ヒドロキシル基末端分子は、分岐がなく、かつ、置換ヒドロキシル基を持たないポリエチレングリコールである。本発明のこの変形形態では、使用されるポリエチレングリコールは好ましくは、４００〜３５，０００Ｄａの範囲に含まれる分子量を有し、より詳しい実施形態では、ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール１，０００（ＰＥＧ１）、ポリエチレングリコール２，０００（ＰＥＧ２）、ポリエチレングリコール６，０００（ＰＥＧ６）およびポリエチレングリコール１０，０００（ＰＥＧ１０）からなる群から選択される。

本発明の別の特定の変形形態では、ポリエチレングリコールは１個の置換ヒドロキシル基を有する。よって、本発明のこの変形形態では、ヒドロキシル基末端分子は、ヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体であり、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。より詳しい実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ポリエチレングリコールメチルエーテル（ｍＰＥＧ）であり、メトキシ−ポリエチレングリコール１，０００（ｍＰＥＧ１）、メトキシ−ポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）、メトキシ−ポリエチレングリコール６，０００（ｍＰＥＧ６）およびメトキシ−ポリエチレングリコール１０，０００（ｍＰＥＧ１０）からなる群から選択され得る。

別の態様において、本発明は、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子とのエステルポリマーコンジュゲートを生産するための方法であって、前記ヒドロキシル基末端分子はポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体から選択され、
ａ）有機溶媒中でＰＶＭ／ＭＡと本発明のヒドロキシル基末端分子を反応させる工程、および
ｂ）前記有機溶媒を除去する工程
を含んでなる方法に関する。

本発明の前記方法は単純で、産業規模で適用可能である。本発明の１つの好ましい変形形態では、前記方法は、エステルポリマーコンジュゲートを精製する付加的工程ｃ）を含んでなる。

特定の実施形態では、工程ａ）の溶液中のＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子との重量比は、１：０．０１〜０．２５、好ましくは１：０．０１５〜０．２、より好ましくは１：０．０５〜０．１２５である。

別の態様において、本発明は、本発明の前記方法により得られるエステルポリマーコンジュゲートに関する。

別の態様において、本発明は、薬物送達、好ましくは経口薬物送達用のポリマーナノ粒子の製造における、本発明の、または本発明の方法により得られるエステルポリマーコンジュゲートの使用に関する。

別の態様において、本発明は、本発明のエステルポリマーコンジュゲートまたは本発明の方法により得られるエステルポリマーコンジュゲートと、ｉｉ）担体とを含んでなる組成物、ならびに薬物送達、好ましくは、経口薬物送達において使用するための本発明の前記組成物に関する。

さらに別の態様では、本発明は、ｉ）本発明によるエステルポリマーコンジュゲート、または本発明の方法により得られるエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスと、ｉｉ）生物学的に活性な化合物とを含んでなるナノ粒子に関する。特定の実施形態では、生物学的に活性な化合物は抗腫瘍薬である。より詳しい実施形態では、抗腫瘍薬は、ドセタキセル、カンプトテシンおよびパクリタキセルからなる群から選択され、好ましくは、抗腫瘍薬はドセタキセルである。

さらなる態様において、本発明は、
ａ）有機媒体中で本発明のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物を混合する工程、および
ｂ）二価金属の存在下でアルコールおよび水を加えることによりエステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和する工程
を含んでなる、本発明によるナノ粒子を生産するための方法に関する。

好ましくは、工程ａ）は、（ｉ）本発明のエステルポリマーコンジュゲートを含有する有機溶液と（ｉｉ）生物学的に活性な化合物の有機溶液または分散液とを混合することにより行われる。

好ましくは、工程ｂ）は、工程ａ）で得られた混合物に、二価金属を含んでなる水性アルコール混合物を加えることにより行われる。

特定の実施形態では、二価金属は、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、二価金属はカルシウムである。

さらなる特定の実施形態では、工程ａ）の混合物中の本発明のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物との重量比は、１：０．０１〜０．２０、好ましくは１：０．０２〜０．１５、より好ましくは１：０．０３〜０．１０である。

本発明の１つの変形形態では、本発明によるナノ粒子を生産するための前記方法は、有機媒体を除去し、かつ／または場合により精製する付加的工程ｃ）を含んでなり、例えば、それはペレットが得られるまで濾過技術または遠心分離によって成すことができる。同様に、所望により、本発明によるナノ粒子を生産するための前記方法は、形成したナノ粒子を場合により保護剤の存在下で乾燥させる付加的工程ｄ）をさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施形態では、この付加的工程ｄ）は噴霧乾燥またはフリーズドライによって成される。

これに関して、別の態様において、本発明は、本発明の前記方法により得られるナノ粒子に関する。

別の態様において、本発明は、医学において使用するための、本発明によるナノ粒子または本発明の方法により得られるナノ粒子に関する。

別の態様において、本発明は、医薬組成物の製造における、本発明によるナノ粒子の使用、または本発明の方法により得られるナノ粒子の使用に関する。

さらに別の態様では、本発明は、ｉ）少なくとも１種類の本発明によるナノ粒子、または本発明の方法により得られる少なくとも１種類のナノ粒子と、ｉｉ）薬学上許容可能な担体またはビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。本発明の特定の実施形態では、前記担体またはビヒクルは、経口経路によるその投与に許容可能な製薬賦形剤を含んでなる。

別の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の前記医薬組成物に関する。

特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、抗腫瘍薬を含んでなる。よって、別の態様において、本発明は、癌の予防または治療の方法において使用するための抗腫瘍薬を含んでなる本発明の前記医薬組成物に関し、またはあるいは、本発明はまた、癌の予防または治療のための薬剤の製造における、抗腫瘍薬を含んでなる本発明の医薬組成物の使用に関する。

より詳しい実施形態では、本医薬組成物は、
ａ）３８％〜４７％の、ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；
ａ）３８％〜４７％の、ＰＶＭ／ＭＡとメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；ならびに
ａ）３０％〜４０％の、ＰＶＭ／ＭＡとメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
ｂ）０．０８％〜１．５％のカンプトテシン、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物からなる群から選択される。

ＰＶＭ／ＭＡ、ならびにＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ２）、ポリエチレングリコール６，０００（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ６）、ポリエチレングリコール１０，０００（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ１０）、およびメトキシポリエチレングリコール２，０００（ＰＶＭ／ＭＡ−ｍＰＥＧ２）とのエステルポリマーコンジュゲートの赤外線スペクトル。 ＰＶＭ／ＭＡの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。 ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。 ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール６，０００とのエステルポリマーコンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ６）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。 ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール１０，０００とのエステルポリマーコンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡ−ＰＥＧ１０）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。 ＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡ−ｍＰＥＧ２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。 ポリ（無水物）ナノ粒子処方物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）。Ａ）ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ（カンプトテシンを封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）；Ｂ）ＰＥＧ６−ＣＰＴ ｔｒａｄ（カンプトテシンを封入するＰＥＧ６でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）；Ｃ）ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ（カンプトテシンを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）。 ３７℃、人工胃液（０〜２時間）および人工腸液（２〜１２時間）中でのインキュベーション後のＤＴＸナノ粒子（ドセタキセルを封入する従来型のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ（ドセタキセルを封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）およびＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）処方物からのドセタキセル放出プロフィール。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表す。 ３０ｍｇ／ｋｇ用量のタキソテール（登録商標）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の血漿ドセタキセル濃度−時間プロフィール。データは平均±Ｓ．Ｄ．（各時点ｎ＝３）として表す。 ３０ｍｇ／ｋｇの単回経口用量の投与後の血漿ドセタキセル濃度−時間プロフィール。動物に経口タキソテール（登録商標）、ＤＴＸナノ粒子（ドセタキセルを封入する従来型のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ（ドセタキセルを封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）およびＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）処方物。Ａ）最初の８時間内、およびＢ）７２時間中。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）として表す。 ３７℃、６０ｒｐｍの浸漬条件下、人工胃液（０〜２時間）および人工腸液（２〜１４時間）中でのインキュベーション後の、ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ（カンプトテシンを封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ＰＥＧ６−ＣＰＴ ｔｒａｄ（カンプトテシンを封入するＰＥＧ６でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）およびｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ（カンプトテシンを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）処方物からのカンプトテシン放出プロフィール。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表す。 １ｍｇ／ｋｇ用量の懸濁液の静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の血漿カンプトテシン濃度−時間プロフィール。データは平均±Ｓ．Ｄ．（各時点ｎ＝３）として表す。 雄ウィスターラットにおける、ＰＥＧ２−ＣＴＰ ｔｒａｄ（カンプトテシンを封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）およびｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ（カンプトテシンを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）処方物の経口懸濁液の単回用量（１ｍｇ／ｋｇ）後の、カンプトテシンの血漿濃度−時間プロフィール。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）として表す。 単回用量としての経口投与２時間後の、ラットの近位回腸の縦断面における、ルモゲンレッドで蛍光標識されたナノ粒子蛍光顕微鏡画像。（Ａ、Ｂ）ルモゲン（登録商標）レッドを封入する従来型のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子；（Ｃ、Ｄ）ＰＶＭ／ＭＡとルモゲン（登録商標）レッドを封入するｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ｍＰＥＧ２−ＬＵＭ ｃｏｎｊ）。

発明の詳細な説明
本発明は、相当量の生物学的に活性な化合物を封入することができ、ＧＩ管内で安定であり、かつ、経口投与されたす薬物のバイオアベイラビリティを高め得る新規な薬物投与システム（新規なポリマーコンジュゲートおよびそれから作製されたナノ粒子）を提供する。

驚くことに、ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール（またはヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体）との新規なエステルポリマーコンジュゲートは、単純な反応により合成でき、生物学的に活性な化合物の投与にとって改善された特徴を有するナノ粒子を容易に生産するのに好適となることが見出された。特に、これら新規な、ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール（またはヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体）とのエステルポリマーコンジュゲートにより形成されたナノ粒子は相当量の生物学的に活性な化合物を封入することができ、それらの経口バイオアベイラビリティを高めることが見出された。

定義
本発明の理解を助ける目的で、本発明に関して使用されるいくつかの用語および表現の意味を以下に示す。

本明細書で使用される場合、「ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）」（ＰＶＭ／ＭＡ）は、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＩＳＰにより商標Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮとして上市）を意味する。よって、「ＰＶＭ／ＭＡ」、ポリ（無水物）、またはＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮは同義語であり、本明細書では区別無く使用される。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーは、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸の交互単位を含み、下式を有する。

この重合の基本的特徴は無水マレイン酸単位がメチルビニルエーテル単位に隣接しなければならない、またその逆のことを必要とし、これにより真の交互コポリマーとなる。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ構造中の無水物基は、求核置換反応機構を介したこのポリマーとヒドロキシル含有分子との相互作用を可能とする。

Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーは、水に不溶な白色粉末として供給され、製薬および医学的目的で、義歯接着剤、増粘・沈殿防止剤、および経皮パッチの作製のためのアジュバントとして広く使用されている。このコポリマーの経口毒性はかなり低く（モルモットでのＬＤ_５０は約８〜９ｇ／ｋｇである）、従って、ナノ粒子担体の作製のための材料としても使用されている。本発明の特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーは、８０〜２，５００ｋＤａ、好ましくは８５〜２，０００ｋＤａ、より好ましくは９０〜２２０ｋＤａの範囲に含まれる分子量を有する。

本明細書で使用される場合、「エステル」は、少なくとも１個のエステル基を含有するエステル（ＰＶＭ／ＭＡの場合）を意味する（すなわち、ＰＶＭ／ＭＡの少なくとも１つの無水物単位はヒドロキシル基末端分子でエステル化されている）。本発明によれば、ＰＶＭ／ＭＡの少なくとも１つの無水物単位は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体から選択されるヒドロキシル基末端分子でエステル化されている。ＰＶＭ／ＭＡのエステルの非限定的な実例は、置換度が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であるものである。

本明細書で使用される場合、本発明のエステルポリマーコンジュゲートの「エステル化度」（ＤＥ）または「置換度」（ＤＳ）は、本発明によるヒドロキシル基末端分子でエステル化された無水物単位のパーセンテージ、すなわち、形成されたエステル結合のパーセンテージと定義される。特定の実施形態では、エステル化度は、当業者に知られ、下記の実施例に付随する実験の部で例として記載される標準的方法によって測定することができる。

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル基末端分子」は、少なくとも１個の第１級ヒドロキシ（−ＯＨ）基を有する分子である。本発明によれば、前記ヒドロキシル基末端分子は、以下に定義されるように、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体から選択される。

本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」（ＰＥＧ）は、２個の炭素原子が結合したエーテル基、場合により分岐エチレン基を含有する、水に可溶な親水性ポリマーであると理解される。従って、この定義には、分岐または非分岐ポリエチレングリコールが含まれる。

ＰＥＧはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている（これら３つの名称は化学的に同義であり、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを意味する）。この用語にはまた、末端ヒドロキシル基のうち一方の誘導体を含み、これらは修飾可能である（２末端のうちの一方）。よって、本発明によれば、１個の第１級ヒドロキシ（−ＯＨ）基を保持するポリエチレングリコール誘導体が使用可能である。

ポリエチレングリコールは、薬物の経口、非経口および局所投与向けに承認されている（ＦＤＡ）溶性ポリマーである。ポリエチレングリコールは、アルカリ媒体中、水、反応開始剤としてのモノエチレングリコールまたはジエチレングリコールの存在下でのエチレンオキシド（ＥＯ）の重合によって生産される(1,2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxide Polymers and Copolymers”, Encyclopedia of Polymer Science and Engineering; Mark, H.F. (編), John Wiley and Sons Inc., 1986, pp. 225-273)。所望の分子量（一般に粘度のインプロセス測定によって制御される）に達した際に、触媒を酸（乳酸、または酢酸など）で中和することにより重合反応を終了させる。結果として極めて単純な構造：
Ｈ−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−ＯＨ
を有する直鎖ポリマーが得られ、ここで（ｎ）はＥＯモノマーまたは単位の数である。この用語ポリエチレングリコールは通常、これらの分子の物理化学的特性に及ぼすヒドロキシル末端基の大きな影響を示すために用いられる。用語ＰＥＧは通常、数値と組み合わせて使用される。製薬産業では、この数字は平均分子量を示し、化粧品産業では、ＰＥＧの文字に伴う数字はその分子を形成する重合ＥＯ単位を意味する(Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowev R.C., Sheskey P. J., Weller P.J. (編), 第4版, Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association, London, UK, 2003)。ＰＥＧは様々な薬局方に含まれているが、命名法は異なる(International Harmonisation: Polyethylene glycol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612-614)。Handbook of Pharmaceutical Excipients (第4版), 2003, R.C. Rowe, P.J. Sheskey and P.J. Welle編, the Pharmaceutical Press (ロンドン, UK)出版およびthe American Pharmaceutical Association (ワシントン, USA)によれば、ポリオキシエチレングリコールは、ポリエチレングリコール、マクロゴール、またはＰＥＧとも呼ばれる。英国および欧州薬局方ではポリエチレングリコールおよびマクロゴールを用いているが、米国薬局方（ＵＳＰ）ではポリエチレングリコールを用いている。

本発明の１つの変形形態では、使用されるポリエチレングリコールは好ましくは、４００〜３５，０００Ｄａの範囲に含まれる分子量を有する。本発明の１つの好ましい変形形態では、使用されるポリエチレングリコールは、４００以上、より好ましくは１，０００以上の分子量を有し、１，０００〜２０，０００に含まれる値が特に好ましく、２，０００〜１０，０００Ｄａがより好ましい。本発明で使用可能なＰＥＧの限定されない実例には、ポリエチレングリコール１，０００、ポリエチレングリコール２，０００、ポリエチレングリコール６，０００またはポリエチレングリコール１０，０００（それぞれＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１０）が含まれる。

４００未満の分子量を有するＰＥＧは室温で不揮発性の液体である。ＰＥＧ６００は、１７〜２２℃の間に含まれる融点を示し、８００〜２，０００の間に含まれる平均分子量を有するＰＥＧは、低融点のペースト状材料である。分子量３，０００Ｄａを越えるＰＥＧは固体であり、ＰＥＧ３５，０００までが市販されている。他方、ＰＥＧの融点は分子量が大きくなるほど高くなり、沸点は最大値６０℃まで上昇する。同様に、分子量が大きくなるほどその水溶解度は低下する。いずれにせよ、ＰＥＧ３５，０００では、５０％ｗ／ｖに近い量が水に溶解可能である。

毒物学的観点から、ＰＥＧはむしろ非毒性および非免疫原性と考えられる(Hermansky S.J et al., Food Chem Toxic., 1995, 33, 139-140; Final Report on the Safety Assessment of PEGs: J.A. C. T., 1993, 12, 429-457; Polyethylene glycol, 21 CFR 172.820, FDA)。ＷＨＯが定義している最大一日摂取量は１０ｍｇ／ｋｇである(Polyethylene glycols; Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives; World Health Organisation, Geneva; Technical Report Series 1980, 648, 17-18)。

ポリエチレングリコール誘導体は、それらの水溶解度、生理学的不活性、低毒性および極めて多様な条件下での安定性など、従来型ＰＥＧと同様の有利な特徴を有する。これらの誘導体には極めて多様な製品が含まれ、第１級ヒドロキシルに取って代わる官能基によって特徴付けられる。本発明によれば、ヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体が使用可能である。

特定の実施形態では、前記のヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体は、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。ポリオキシエチレンアルキルエーテル化合物は、一般式Ｈ_{（２ｍ＋１）}Ｃ_ｍ（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）ｎＯＨを有する。それらはＣｍＥｎとして表され、ここで、ｍはアルキル鎖の炭素の数を示し、ｎは親水性部分のエチレンオキシド単位の数である。非限定的な実例は、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）としても知られるポリエチレングリコールメチルエーテル；ポリエチレングリコールエチルエーテル；ポリエチレングリコールプロピルエーテル；およびポリエチレングリコールブチルエーテルである。

上述の群に対応するいくつかのポリオキシエチレンアルキルエーテルの化学構造を例として以下に示す：
ａ）Ｈ_３Ｃ（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎＯＨ
ｂ）Ｈ_５Ｃ_２（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎＯＨ
ｃ）Ｈ_７Ｃ_３（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎＯＨ
ｄ）Ｈ_９Ｃ_４（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎＯＨ

本発明で使用可能なポリオキシエチレンアルキルエーテルの非限定例には、ポリエチレングリコール１，０００またはメトキシ−ポリエチレングリコール１，０００（ｍＰＥＧ１）のメチルエーテル；ポリエチレングリコール２，０００またはメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）のメチルエーテル；ポリエチレングリコール６，０００またはメトキシ−ポリエチレングリコール６，０００（ｍＰＥＧ６）のメチルエーテル；ポリエチレングリコール１０，０００またはメトキシ−ポリエチレングリコール１０，０００（ｍＰＥＧ１０）のメチルエーテルが含まれる。

以下は本発明で使用可能なヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体の中でも注目され得るものである：
・ポリ（エチレングリコール）メタクリレート
・ポリ（エチレングリコール）アクリレート
・ポリ（エチレングリコール）モノラウレート
・ポリ（エチレングリコール）モノオレエート
・ポリ（エチレングリコール）（１２）トリデシルエーテル
・ポリ（エチレングリコール）テトラヒドロフルフリルエーテル

ポリエチレングリコールおよび誘導体の選択は、一般化されたシステムの特徴の調整を可能とし、それらの混合物の使用は２以上の変動因子を付加する。実用上の観点から、活性分子に対して、また各投与経路に対して最も好適なシステムを採用および選択することが重要である。

本明細書で使用される場合、「分子量」は、分子の平均モル質量と定義される。小分子とは異なり、ポリマーの分子量は１つの独自の値とならない。むしろ、あるポリマーは、例えばそのポリマーが生産される方法によって、ある分子量分布を持つ。よって、本明細書で使用される場合、ポリマーに関して分子量という用語は、分子量の分布、または平均分子量の分布を意味する。しかしながら、平均分子量を計算するためには多くの方法がある。本発明によれば、下記の実施例に付随する実験の部で例として記載されるように、本発明のプレフォームエステルポリマーの平均分子量は^１Ｈ−ＮＭＲにより決定され、市販のＰＶＭ／ＭＡの平均分子量はＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより決定される。

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、１マイクロメーター（μｍ）未満、好ましくは１０〜９００ナノメーター（ｎｍ）の範囲のサイズの球状または類似の形状のコロイド系（ナノカプセルまたはナノスフェア）を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「生物学的に活性な化合物」（ＢＡＣ）は、予防または治療目的で対象、好ましくはヒトに投与される任意の小分子（例えば、薬物または薬剤の有効成分）またはその誘導体、すなわち、疾患の治療、治癒、予防もしくは診断において、またはヒトおよび動物の心身の安寧を改善するために使用可能な、９００ダルトン未満の分子量を有する任意の物質または化学化合物に関する。本明細書で使用する場合、生物学的に活性な化合物に対して適用される用語「誘導体」には、前記の生物学的に活性な化合物のプロドラッグおよび類似体が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「抗腫瘍薬」、「抗癌薬」または「抗悪性腫瘍薬」（本明細書では区別無く使用される）は一般に、癌細胞の成長および増殖を阻害または抑制する物質を意味する。抗腫瘍薬はまた、癌細胞を破壊するまたは細胞分裂に干渉する化合物、癌に関与する特定のホルモンを遮断する化合物、新血管の成長を阻害または回避する化合物（例えば、血管新生阻害剤）、ＤＮＡを傷害する薬剤（例えば、アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサロプラチン(oxaloplatin)；抗代謝産物；およびトポイソメラーゼ阻害剤）、ならびに抗癌特性を有する化合物（例えば、タキサン、ビンカアルカロイド、および植物アルカロイド）を含み得る。用語「抗腫瘍薬」はまた放射線療法も含む。抗腫瘍薬はまた、癌細胞の調節を欠くタンパク質に特異的な薬剤、例えば、受容体チロシンキナーゼの阻害剤も含み得る。

本明細書で使用される場合、「二価金属」には、薬学上許容可能である限り、原子価が２である任意の金属元素、例えば、アルカリ土類金属、例えば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、または、いくつかの原子価を有する場合には、そのうち１つが２である金属元素、例えば、鉄などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「平均径」は、水性媒体中で一緒に動くナノ粒子集団の平均直径を意味する。これらの系の平均径は、当業者に知られ、下記の実施例に付随する実験の部で例として記載される標準的方法によって測定することができる。粒子の平均径は主として、ＰＶＭ／ＭＡの量と分子量により、本発明のヒドロキシル基末端分子の性質と量により、本発明のナノ粒子中に存在する生物学的に活性な分子の性質と量により（一般に、前記成分の量または分子量が大きいほど、ナノ粒子の平均径も大きくなる）、および前記ナノ粒子の製造方法のいくつかのパラメーターにより影響を受け得る。本発明のナノ粒子は１μｍ未満、一般に１〜９９９ｎｍ、好ましくは１０〜９００ｎｍ、より好ましくは１００〜５００ｎｍ、なおより好ましくは１５０〜４００ｎｍの範囲に含まれる平均粒径を有することを特徴とする。特定の実施形態では、本発明のナノ粒子はおよそ約２５０ｎｍの平均粒径を有する。

本明細書で使用される場合、用語「薬学上許容可能な」は、化合物または化合物の組合せが処方物の他の成分と十分に適合し、かつ、業界標準により許容可能なレベルまで対象に有害でないことを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「担体」は、有効成分または薬物が一緒に投与される希釈剤を意味する。薬学上許容可能な担体の例は現況技術において既知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ，１９９５により“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。好ましくは、本発明の担体は、連邦政府または州政府の規制当局により承認されているか、または米国薬局方もしくは動物、より詳しくはヒトにおける使用に関する別の一般に認知されている薬局方に列挙されている。

本明細書で使用される場合、用語「予防すること」は、このような用語を適用する疾患、障害、もしくは病態、または疾病、障害、もしくは病態と関連している１以上の症状が起こらないようにする、存在しないようにする、またはそうでなければ発症または再発を遅延させることを意味する。用語「予防」は予防することの行為を意味し、「予防すること」はすぐ上に定義されている。

本明細書で使用される場合、用語「治療すること」は、このような用語を適用する障害もしくは病態、またはそのような障害もしくは病態の１以上の症状を逆転させる、緩和する、またはその進行を阻害することを意味する。用語「治療」は、治療することの行為を意味し、「治療すること」はすぐ上に定義されている。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物、特に、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ガチョウ、およびヒトを意味する。特に好ましい対象は、両性のヒトである。

ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）のエステルポリマーコンジュゲート
本発明は、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）とヒドロキシル基末端分子との新規なエステルポリマーコンジュゲートを提供する。本明細書で使用される用語「エステル」、「ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）」および「ヒドロキシル基末端分子」は、従前に定義され、参照により本明細書の一部とされる。よって、本発明によれば、ＰＶＭ／ＭＡポリマーの少なくとも１つの無水物単位は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体から選択されるヒドロキシル基末端分子（以下、「本発明のヒドロキシル基末端分子」という）でエステル化される。

よって、第１の態様において、本発明は、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子とのエステルポリマーコンジュゲート（前記ヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体から選択される）（以下、「本発明のエステルポリマーコンジュゲート」という）に関する。

特定の実施形態では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の無水物単位のＰＶＭ／ＭＡポリマーが本発明のヒドロキシル基末端分子でエステル化される。例えば、少なくとも５％のエステル化度が良好な結果をもたらす。

本発明の１つの変形形態では、ヒドロキシル基末端分子は、分岐がなく、かつ、置換ヒドロキシル基を持たないポリエチレングリコールである。本発明のこの変形形態では、使用されるポリエチレングリコールは好ましくは、４００〜３５，０００Ｄａの範囲に含まれる分子量を有する。本発明の１つの好ましい変形形態では、使用されるポリエチレングリコールは、４００以上、より好ましくは１，０００以上の分子量を有し、１，０００〜２０，０００の範囲に含まれる値が特に好ましく、２，０００〜１０，０００Ｄａがより好ましい。本発明のより好ましい変形形態では、ヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコール１，０００（ＰＥＧ１）、ポリエチレングリコール２，０００（ＰＥＧ２）、ポリエチレングリコール６，０００（ＰＥＧ６）およびポリエチレングリコール１０，０００（ＰＥＧ１０）からなる群から選択されるポリエチレングリコールである。

別の変形では、本発明のヒドロキシル基末端分子は、１個の置換ヒドロキシル基を有するポリエチレングリコールである。よって、本発明のこの変形形態では、ヒドロキシル基末端分子は、ヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。より詳しい実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ポリエチレングリコールメチルエーテル（ｍＰＥＧ）である。なおより好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールメチルエーテルは、メトキシ−ポリエチレングリコール１，０００（ｍＰＥＧ１）、メトキシ−ポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）、メトキシ−ポリエチレングリコール６，０００（ｍＰＥＧ６）およびメトキシ−ポリエチレングリコール１０，０００（ｍＰＥＧ１０）からなる群から選択される。

本発明のエステルポリマーコンジュゲートの平均分子量は広い範囲で変動し得るが、特定の実施形態では、本発明のエステルポリマーコンジュゲートは、８５〜３，０００ｋＤａ、好ましくは９０〜２，５００ｋＤａ、より好ましくは９５〜２５０ｋＤａの範囲に含まれる平均分子量を有する。

本発明のエステルポリマーコンジュゲートを得るための方法
第２の態様において、本発明は、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子とのエステルポリマーコンジュゲート（前記ヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体から選択される）（すなわち、本発明のエステルポリマーコンジュゲート）を生産するための方法（以下、「本発明の方法［ｌ］」という）であって、
ａ）有機溶媒中でＰＶＭ／ＭＡを本発明のヒドロキシル基末端分子を反応させる工程、および
ｂ）前記有機溶媒を除去する工程
を含んでなる方法に関する。

「本発明の方法［ｌ］」のこの工程ａ）は、反応を起こさせるために、例えばアセトンなどの有機溶媒中、ＰＶＭ／ＭＡ、および本発明のヒドロキシル基末端分子を溶解およびインキュベートすることを含む。この混合物のインキュベーションは好ましくは、１５℃〜８０℃の範囲、より好ましくは４５℃〜６５℃の範囲に含まれる温度で、最も好ましくは５５℃での撹拌下で行われる。インキュベーション時間は１〜２４時間で変動し得る。特定の好ましい実施形態では、インキュベーションは２〜４時間行われる。例えば、５５℃で３時間の混合物のインキュベーションで良好な結果が得られる。あるいは、室温（Ｒ／Ｔ）、撹拌下でより長時間（２４〜４８時間）、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子を反応させることもできる。

有機溶媒は、工程ｂ）で、減圧下での蒸発、室温蒸発、または真空下での遠心分離などの任意の好適な方法によって除去される。特定の実施形態では、工程ｂ）は、減圧下での蒸発により有機溶媒を除去することを含んでなる。

好ましい一実施形態では、本発明の方法［１］は、本発明のエステルポリマーコンジュゲートを精製する付加的工程ｃ）を含んでなる。１つの特定の変形形態では、付加的工程ｃ）は、ポリマーが不溶の（ただし、未反応のヒドロキシル基末端分子は不溶でない）液体で数回洗浄すること；および未反応のヒドロキシル基末端分子の痕跡が液体中に検出されなくなるまで（例えば、薄層クロマトグラフィー、ＴＬＣにより測定する）真空下で濾過することを含んでなる。好ましい変形形態では、洗浄液は、ジクロロメタン(dichlorometane)／メタノールの混合物である。例えば、移動相として使用される混合物ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ（９：１）、およびＴＬＣにおける可視化のためのヨウ素で良好な結果が得られる。

本発明のヒドロキシル基末端分子の特定のものが、従前に「定義」の節で、また本発明のエステルポリマーコンジュゲートに関しても述べられ、参照により本明細書の一部とされる。これらによれば、本発明の方法［１］の特定の実施形態では、工程ａ）でＰＶＭ／ＭＡと反応するヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコール、好ましくは、ポリエチレングリコール１，０００（ＰＥＧ１）、ポリエチレングリコール２，０００（ＰＥＧ２）、ポリエチレングリコール６，０００（ＰＥＧ６）、およびポリエチレングリコール１０，０００（ＰＥＧ１０）からなる群から選択されるポリエチレングリコールである。本発明の方法［１］の別の特定の実施形態では、工程ａ）でＰＶＭ／ＭＡと反応するヒドロキシル基末端分子は、ヒドロキシル基末端反応性基を含有するポリエチレングリコール誘導体、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、より好ましくは、ポリエチレングリコールメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、最も好ましくは、メトキシ−ポリエチレングリコール１，０００（ｍＰＥＧ１）、メトキシ−ポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）、メトキシ−ポリエチレングリコール６，０００（ｍＰＥＧ６）およびメトキシ−ポリエチレングリコール１０，０００（ｍＰＥＧ１０）からなる群から選択されるポリエチレングリコールメチルエーテルである。

本発明の方法［１］の工程ａ）の溶液中のＰＶＭ／ＭＡと本発明のヒドロキシル基末端分子との重量比は、広い範囲で変動し得るが、特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡ：ヒドロキシル基末端分子の重量比は、１：０．０１〜１：０．２５、好ましくは１：０．０１５〜１：０．２、より好ましくは１：０．０５〜１：０．１２５の範囲に含まれる。非限定的な実例では、ヒドロキシル基末端分子がポリエチレングリコールである場合、１：０．０５、１：０．１、１：０．１２５、または１：０．２５のＰＶＭ／ＭＡ：ＰＥＧ重量比で良好な結果が得られる。同様に、ヒドロキシル基末端分子がメトキシ−ポリエチレングリコールである場合には、１：０．０１、１：０．０１５、１：０．０２５、１：０．０５、１：０．０１、または１：０．２のＰＶＭ／ＭＡ：ｍＰＥＧ重量比で良好な結果が得られる。

言い換えれば、本発明の方法［１］の工程ａ）の溶液中の本発明のヒドロキシル基末端分子とＰＶＭ／ＭＡとの重量比は、１：４〜１：１００、好ましくは１：５〜１：６６、より好ましくは１：８〜１：２０の範囲に含まれる。非限定的な実例では、ヒドロキシル基末端分子はポリエチレングリコールであり、１：４、１：８、１：１０、または１：２０のＰＥＧ：ＰＶＭ／ＭＡ重量比で良好な結果が得られる。同様に、ヒドロキシル基末端分子がメトキシ−ポリエチレングリコールである場合には、１：５、１：１０、１：２０、１：４０、１：６６、または１：１００のｍＰＥＧ：ＰＶＭ／ＭＡ重量比で良好な結果が得られる。

ａ）有機溶媒中でＰＶＭ／ＭＡと本発明のヒドロキシル基末端分子を反応させること、およびｂ）前記有機溶媒を除去すること含んでなる方法により生産される、本発明の方法［１］により得られるエステルポリマーコンジュゲート、すなわち、ＰＶＭ／ＭＡとヒドロキシル基末端分子とのエステルポリマーコンジュゲート（前記ヒドロキシル基末端分子は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシル基末端反応性を含有するその誘導体から選択される）は、本発明のさらなる態様を成す。

本発明のエステルポリマーコンジュゲートの適用
本発明のプレフォームエステルポリマーコンジュゲートは良好な物理化学的および薬理学的特性を示しており、生物学的に活性な化合物の投与用のナノ粒子の形成において出発材料として使用され得る。よって、別の態様において、本発明は、薬物送達、好ましくは、経口薬物送達用のポリマーナノ粒子の作製における、本発明のエステルポリマーコンジュゲート、または本発明の方法［１］により得られるエステルポリマーコンジュゲートの使用に関する。

別の態様において、本発明は、ｉ）本発明のエステルポリマーコンジュゲート、または本発明の方法［１］により得られるエステルポリマーコンジュゲートと、ｉｉ）担体とを含んでなる組成物（以下、「本発明の組成物［１］」という）に関する。特定の実施形態では、本発明の組成物［１］は、少なくとも２％濃度（ｗ／ｖ）の本発明のエステルポリマーコンジュゲートまたは本発明の方法［１］により得られるエステルポリマーコンジュゲートを含んでなる。

実例として、本発明の前記組成物［１］は、生物学的に活性な化合物の投与用のナノ粒子を製造するための基礎として使用することができる。よって、さらに別の態様では、本発明は、薬物送達、好ましくは、経口薬物送達において使用するための本発明の前記組成物［１］に関する。

ナノ粒子
別の態様において、本発明は、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子に関する。本発明のナノ粒子は、生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）を封入する能力を有し、薬物送達システムとして使用可能である。

よって、場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた特定の実施形態では、ナノ粒子は生物学的に活性な化合物をさらに含んでなり、以下、本明細書では「本発明のナノ粒子」と示す。

用語「生物学的に活性な化合物」（ＢＡＣ）は、従前に定義されており、予防または治療目的で対象好ましくはヒトに投与される任意の小分子（例えば、薬物または薬剤の有効成分）またはその誘導体、すなわち、疾患の治療、治癒、予防、もしくは診断において、またはヒトおよび動物の心身の安寧を改善するために使用可能な、９００ダルトン未満の分子量を有する任意の物質もしくは化学化合物を意味する。本明細書で使用する場合、小分子に適用される用語「誘導体」には、前記分子のプロドラッグおよび類似体が含まれる。

ＢＡＣは、例えば、抗腫瘍または抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、麻酔薬、抗炎症薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、抗狭心症薬、抗喘息薬、抗生物質（ペニシリンを含む）、抗凝固薬、抗鬱薬、抗精神病薬、抗糖尿病薬、抗癲癇薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、抗ムスカリン作用薬、抗マイコバクテリア薬、抗酸化薬、解熱薬、免疫抑制薬、免疫賦活薬、抗甲状腺薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、抗不安薬 鎮静薬（催眠薬および神経抑制薬）、収斂薬、静菌薬、β−アドレノレセプター遮断薬、血液製剤および物質、気管支拡張薬、緩衝剤、強心薬、化学療法薬、造影剤、コルチコステロイド、鎮咳薬（去痰薬および粘液溶解薬）、診断薬、画像診断薬、利尿薬、ドーパミン作動薬（抗パーキンソン病薬）などを含む、様々な既知の薬物種から選択することができる。本発明のナノ粒子は前記ＢＡＣのうち１以上を配合することができる。

本発明によるＢＡＣの例は、ドセタキセル、パクリタキセル、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリンＡ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオール グルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン、フェキソフェナジン、フルオロキノロン、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンフェロール、レボフロキサシン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾール、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、メダゾロラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクローン、それらの誘導体、およびそれらの混合物である。

本発明のナノ粒子は特に、疎水性ＢＡＣ（Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのクラスＩＩおよびクラスＩＶ）の経口経路による投与に有用である。

本発明の１つの特定の実施形態では、本発明のナノ粒子中に存在するＢＡＣは、抗腫瘍薬（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、カンプトテシン、ドキソルビシン、エピルビシン、フルオロウラシル、シクロホスファミド、メトトレキサートなど）である。より詳しい実施形態では、ＢＡＣは、ドセタキセル、カンプトテシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される。なおより詳しい実施形態では、ＢＡＣはドセタキセルである。

本発明のナノ粒子は、生物の粘膜に接近する経路（例えば、経口経路など）によって投与される場合にそれらが含有するＢＡＣの分布を改変することができる。

本発明の前記ナノ粒子は、１μｍ未満の、一般に１〜９９９ｎｍの間、好ましくは１０〜９００ｎｍの間、より好ましくは５０〜５５０ｎｍの間、いっそうより好ましくは１００〜５００ｎｍの間、なおより好ましくは１５０〜４００ｎｍの間に含まれる粒径を有する。

ナノ粒子を得るための方法
別の態様において、本発明は、
ａ）有機媒体中で本発明のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物を混合する工程、および
ｂ）二価金属の存在下でアルコールおよび水を加えることによりエステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和する工程
を含んでなる、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスと生物学的に活性な化合物とを含んでなるナノ粒子（すなわち、本発明のナノ粒子）を生産するための方法（以下、「本発明の方法［２］」という）に関する。

場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた特定の実施形態では、工程ａ）の有機媒体はアセトンであり、かつ、工程ｂ）で使用されるアルコールはエタノールである。

本発明の方法［２］を実施するために使用可能な二価金属は、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組合せからなる群から選択される。場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた好ましい実施形態では、二価金属はカルシウムであり、かつ、例えばカルシウム塩から得ることができる。カルシウム塩の非限定的な実例は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、およびそれらの混合物であり、好ましくは、カルシウム塩は塩化カルシウムである。

本発明の方法［２］の工程ａ）は、当業者に公知の従来の方法により、例えば、
・本発明のエステルポリマーコンジュゲートを有機媒体に溶かし、生物学的に活性な化合物を加えること；あるいはまた、
・（ｉ）本発明のエステルポリマーコンジュゲートを含有する有機溶液と（ｉｉ）生物学的に活性な化合物の有機溶液または分散液を混合すること
によって成される。

本発明の方法［２］の工程ｂ）はまた、当業者に公知の従来の方法により、例えば、
・（ｉｉｉ）工程ａ）で得られた混合物にアルコールを加え、すぐに（ｉｖ）二価金属の水溶液を加えること、あるいはまた、
・（ｖ）工程ａ）で得られた混合物に二価金属を含んでなる水性アルコール混合物を加えること
によってなされる。

本発明の方法［２］は、本明細書に記載の工程ａ）またはｂ）の上記方法のあらゆる可能性のある組合せを包含する。しかしながら、場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた好ましい実施形態では、本発明の方法［２］は、
ａ）本発明のエステルポリマーコンジュゲートを含有する有機溶液と（ｉｉ）生物学的に活性な化合物の有機溶液または分散液を混合する工程、および
ｂ）工程ａ）で得られた混合物に二価金属を含んでなる水性アルコール混合物を加えることにより前記エステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和する工程
を含んでなる。

本発明の特定の実施形態では、場合により、上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせて、水性アルコール混合物は、１：１（ｖ／ｖ）（水／アルコール）である。場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた別の特定の実施形態では、前記水性アルコール混合物は、０．５〜５％、好ましくは１〜３％（ｖ／ｖ）の二価金属源を含んでなる。さらなる特定の実施形態では、前記二価金属源は、０．５〜１％（ｗ／ｖ）の対応する塩を含んでなる水溶液である。

場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせたさらなる特定の実施形態では、工程ａ）の混合物中の本発明のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物との重量比は、１：０．０１〜１：０．２０、好ましくは１：０．０２〜１：０．１５、より好ましくは１：０．０３〜１：０．１０の範囲に含まれる。

非限定的な実例では、ＢＡＣがドセタキセルまたはパクリタキセルである場合、１：０．０５または１：０．１０のエステルポリマーコンジュゲート：ＢＡＣ重量比で良好な結果が得られる。同様に、ＢＡＣがカンプトテシンである場合、１：０．０３または１：０．０６のエステルポリマーコンジュゲート：ＢＡＣ重量比で良好な結果が得られる。

場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた特定の実施形態では、本発明の方法［２］の終了時に得られる混合物中の有機／水性アルコール比（ｖ／ｖ）は１：１〜１：４であり、好ましくは１：２である。

本発明の１つの変形形態では、本発明によるナノ粒子を生産するための前記方法は、有機媒体を除去する除去する（例えば、減圧下での蒸発による）、および／または場合により精製する（例えば、濾過技術、遠心分離または超遠心分離による）付加的工程ｃ）を含んでなる。同様に、所望により、本発明の前記方法［２］は、本発明のナノ粒子を粉末の形態で得るために、形成したナノ粒子を乾燥させる付加的工程ｄ）を含んでもよい。前記ナノ粒子のこの剤形はそれらの安定性に寄与し、さらに医薬製剤におけるそれらの最終適用に特に有用である。

実際に、この乾燥工程を実施するためには、ナノ粒子を乾燥させるのに好適ないずれの従来の技術または方法も使用可能であるが、特定の実施形態では、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥は、噴霧乾燥によるかまたはフリーズドライ（凍結乾燥）により、好ましくはフリーズドライにより行われる。この処理は一般に、糖類、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなど、およびそれらの混合物などの、前記ナノ粒子の好適な保護剤をナノ粒子の懸濁液に加えることによって行われる。前記保護剤は本発明のナノ粒子を乾燥プロセス中の分解ならびに酸化から保護する。

本発明の方法［２］により得ることができるナノ粒子は、本発明のナノ粒子の特徴を有する。従って、本発明の方法［２］により得られるナノ粒子、すなわち、ａ）有機媒体中で本発明のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物を混合すること、およびｂ）二価金属の存在下でアルコールおよび水を加えることにより前記エステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和することを含んでなる方法により生産される、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスと生物学的に活性な化合物とを含んでなるナノ粒子は、本発明のさらなる態様を成す。

特に、（ｉ）本発明のエステルポリマーコンジュゲートを含有する有機溶液と（ｉｉ）生物学的に活性な化合物の有機溶液または分散液を混合すること、およびｂ）工程ａ）で得られた混合物に二価金属を含んでなる水性アルコール混合物を加えることにより前記エステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和することを含んでなる方法により得られた、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスとＢＡＣを含んでなるナノ粒子は、場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせて、本発明のさらなる態様を成す。

ナノ粒子の適用
本発明により提供されるナノ粒子（すなわち、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子、ならびに本発明の方法［２］により直接得られるナノ粒子）は、相当量の生物学的に活性な化合物の封入、および医薬組成物へのその配合を可能とする。前記ナノ粒子は、懸濁液の形態で、好ましくは水性媒体中に提供することもできるし、あるいはまた、それらは乾燥粉末の形態で、例えば、ＢＡＣを安定な状態で維持し、かつ、その長期間の保存を可能とする凍結保護剤を伴った凍結乾燥品として提供すること、もできる。

本発明のナノ粒子は、粘液層を通過し、腸細胞の表面と緊密に相互作用することができ、経口粘膜を経た薬物の吸収を改善すると思われる。重要なこととして、本発明により提供されるナノ粒子は、ＢＡＣの経口バイオアベイラビリティを高め、持続的かつ一定の血漿レベルを与える。従って、別の態様において、本発明は、医学において使用するための、本発明によるナノ粒子、または本発明の方法［２］により得られるナノ粒子に関する。あるいは、本発明は、必要とする対象に本発明のナノ粒子、または本発明の方法［２］により得られるナノ粒子を投与することを含んでなる、疾患の予防または治療のための方法に関する。

ＢＡＣによる処置を必要とする対象に投与される、本発明のナノ粒子の積載用量は、経時的に患者に有益な治療応答を惹起するのに十分なものであるべきである。よって、ナノ粒子は、疾患からの症状および／または合併症を予防する、緩和する、軽減する、治癒させるまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」と定義される。この用量は広範囲に可変であり、他の特徴の中でも、ＢＡＣの性質、その活性または効力、ナノ粒子当たりのＢＡＣの量によって異なる。単に例示として、対象に投与される積載済みナノ粒子の用量は、例えば、体重ｋｇ当たりおよそ０．０１〜およそ１０ｍｇの間、好ましくは体重ｋｇ当たり０．１〜２ｍｇの間に含まれ得る。

ＢＡＣの特定のものは「定義」の節で、また本発明のナノ粒子に関しても述べられ、参照により本明細書の一部とされる。ナノ粒子に含まれるＢＡＣは、処置される疾患に応じて選択される。場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた特定の実施形態では、ＢＡＣは抗腫瘍薬であり、より詳しい実施形態では、ＢＡＣは、ドセタキセル、カンプトテシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される。よって、別の態様において、本発明は、癌の予防または治療の方法において使用するための、ＢＡＣが抗腫瘍薬である場合の、本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスとＢＡＣを含んでなるナノ粒子（すなわち、本発明のナノ粒子または本発明の方法［２］によって得られるナノ粒子）に関し、言い換えれば、本発明はまた、必要とする対象に、ＢＡＣが抗腫瘍薬である場合の本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる、癌の予防または治療のための方法に関する。

別の態様において、本発明は、医薬組成物の製造における本発明のナノ粒子、または本発明の方法［２］により得られるナノ粒子の使用に関する。

別の態様において、本発明は、ｉ）少なくとも１種類の本発明のナノ粒子または少なくとも１種類の本発明の方法［２］により得られるナノ粒子と、ｉｉ）薬学上許容可能な担体またはビヒクルとを含んでなる医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」という）に関する。特定の実施形態では、前記本発明の医薬組成物は、複数の本発明のナノ粒子および／または複数の本発明の方法［２］により得られるナノ粒子を含んでなる。ナノ粒子の特定のものはすでに上記に定義されており、参照により本明細書の一部される。

有利には、本発明の医薬組成物中のナノ粒子は、１０〜９００ｎｍ、好ましくは５０〜５５０、より好ましくは１００〜５００ｎｍ、いっそうより好ましくは１５０〜４００ｎｍ、なおより好ましくは約２５０ｎｍの範囲に含まれる平均サイズを有する。

本発明の医薬組成物は、固体（例えば、錠剤、カプセル剤、コーティング錠、顆粒、坐剤、液体形態とするために再構成可能な無菌結晶性または非晶質固体など）、液体（例えば、ナノ粒子の懸濁液または分散液など）または半固体（ゲル、ポマード、クリームなど）医薬投与形で処方され得る。記載の医薬組成物は、各処方物に好適な担体またはビヒクルを含んでなる。さらに、医薬組成物は、適当であれば、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤などを含有することができる。これらの賦形剤は、選択される医薬投与形に応じて選択される。

特定の実施形態では、前記医薬組成物は、経粘膜経路によるその投与に好適な医薬投与形として処方される。好ましい実施形態では、本発明により提供される医薬組成物は経口投与され、従って、担体またはビヒクルは、経口経路による投与に許容可能な１以上の医薬賦形剤を含んでなる。経口処方物は当業者に公知の方法により慣例的に作製される。有効成分の種々の形態の投与、使用される賦形剤、およびそれらを製造するための方法に関する総説は、書籍“Tratado de Farmacia Galenica”, C. Fauli i Trillo, 第10版, 1993, Luzan 5, S.A. de Edicionesに見出すことができる。

別の特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、乾燥粉末の形態で、例えば、凍結乾燥品として作製される。

本発明による医薬組成物は、ＢＡＣまたは有効成分を０．０５％〜５０％、好ましくは、０．１％〜３０％、より好ましくは０．５％〜２５％、いっそうより好ましくは１％〜２０％の範囲の量で含有してよく、上記パーセンテージは組成物または投与形の総重量に対するｗ／ｗである。しかしながらやはり、好適な割合は配合されるＢＡＣの各場合によって異なる。

別の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の医薬組成物に関する。別の態様において、本発明は、疾患の予防または治療のための薬剤の作製における本発明の医薬組成物の使用に関する。あるいは、本発明は、必要とする対象に本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、疾患の予防または治療のための方法に関する。

投与される医薬組成物の治療上有効な用量は個々の場合によって異なり、慣例として、最適な効果となるように個々の場合の条件に適合される。よって、それは当然のことながら、投与頻度ならびに治療または予防のための各場合で使用されるＢＡＣの効力および作用期間によって異なるだけでなく、疾患および症状の性質および重篤度、ならびに処置される対象の性、齢、体重、同時投薬および個々の反応性、およびその療法が急性的であるか予防的であるかによっても異なる。用量は対象によって、また、小児投与向けに適合させることができる。

場合により上記または下記の種々の実施形態の１以上の特徴と組み合わせた特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ｉ）本発明のエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスとＢＡＣとを含んでなる少なくとも１種類のナノ粒子（すなわち、本発明のナノ粒子または本発明の方法［２］により得られるナノ粒子）、ここで、前記ＢＡＣは抗腫瘍薬である、およびｉｉ）薬学上許容可能な担体またはビヒクルを含んでなる。好ましくは、抗腫瘍薬は、ドセタキセル、カンプトテシンおよびパクリタキセルからなる群から選択され、好ましくはドセタキセルである。

ＢＡＣが抗腫瘍薬であるこの特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、癌の予防または治療の方法において使用可能である。

よって、さらなる態様において、本発明は、必要とする対象に治療上有効な量の、抗腫瘍薬を含んでなる本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる癌予防および／または治療のための方法に関し、あるいは、本発明はまた、癌の予防または治療のための薬剤の作製における、抗腫瘍薬を含んでなる本発明の医薬組成物の使用に関する。

より詳しい実施形態では、本発明の医薬組成物は、
ａ）３８％〜４７％の、ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート
ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；
ａ）３８％〜４７％の、ＰＶＭ／ＭＡとメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；ならびに
ａ）３０％〜４０％の、ＰＶＭ／ＭＡとメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
ｂ）０．０８％〜１．５％のカンプトテシン、
ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
ｄ）１５％〜４０％の糖類、
を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物
からなる群から選択される。

本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態のあらゆる可能性のある組合せを包含する。

以下の実施例は、ポリ（ビニルメチルエーテルおよび無水マレイン酸）コポリー（ＰＶＭ／ＭＡまたはＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ）とポリエチレングリコールまたはヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体とのエステルポリマーコンジュゲートの製造および特徴を記載する。加えて、以下の実施例は、ＰＶＭ／ＭＡと種々のタイプのポリエチレングリコールまたはヒドロキシル基末端反応性基を含有するその誘導体との前記エステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な分子に基づくナノ粒子の製造および特徴を記載する。これらのナノ粒子はｉ）相当量の生物学的に活性な化合物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルおよびカンプトテシン）を封入すること、およびｉｉ）粘液層を通過し、腸細胞の表面と緊密に相互作用する（薬物の吸収を改善する）ことができることが特に見出された。

前記の例に見て取れるように、ドセタキセルが生物学的に活性な化合物として使用される場合、前記ナノ粒子へのその組み込みは前記薬物の一定かつ持続的血漿レベルを少なくとも７２時間維持可能とする。同様に、生物学的に活性な化合物として本発明のナノ粒子中にカンプトテシンが含まれる場合、血漿レベルは少なくとも４８時間維持される。

まず、一般材料を記載する。

材料
ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）またはポリ（無水物）（ＰＶＭ／ＭＡ）［Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ １１９］はＩＳＰ（バルセロナ、スペイン）から購入した。カンプトテシン（９９．０％）、パクリタキセル（ＵＳＰ ２６、等級＞９９．５％）およびドセタキセル（９９．０％）は２１ＣＥＣｐｈａｒｍ（ロンドン、ＵＫ）により供給された。タキソテール（登録商標）は、Ａｖｅｎｔｉｓ−Ｐｈａｒｍａ（セデックス、フランス）から入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、パンクレアチン、メトキシポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）およびポリエチレングリコール２，０００、６，０００および１０，０００（ＰＥＧ２、ＰＥＧ６およびＰＥＧ１０）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（スペイン）により提供された。ペプシン、アセトン、エタノールおよびアセトニトリルは、Ｍｅｒｃｋ（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。脱イオン試薬水（抵抗１８．２ＭΩ）は水精製システム（Ｗａｓｓｅｒｌａｂ、スペイン）により調製した。使用する試薬および化学物質は総て分析級のものであった。

これらの実施例は例として示すものであり、本発明の限定を意図するものではない。

実施例１
従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の作製
空の従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＮＰ）の作製
１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡを５ｍＬのアセトンに溶かし、エタノールと水の混合物（１：１、ｖ／ｖ）を加えることによりナノ粒子を形成した。次に、減圧下での蒸発により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、２７，０００ｘｇで２０分間の遠心分離により２回精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。最後に、スクロース（５％ｗ／ｗ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらは空のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＮＰ処方物（ＮＰ）という）である。

パクリタキセル（ＰＴＸ）を封入する従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の作製
パクリタキセル積載ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子は、若干改変した溶媒置換法により作製した。簡単に述べれば、１０ｍｇのパクリタキセルを、１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡを含有する５ｍＬのアセトンに分散させた。得られた混合物を室温で１時間、磁気振盪下で維持した。その後、１０ｍＬのエタノールの添加とその後の２０ｍｇのエデト酸二ナトリウムを含有する水溶液１０ｍＬの添加によりナノ粒子を形成させた。１０分間の磁気振盪によるホモジナイゼーションの後、減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ−１４４、スイス）により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液をビバスピンチューブにて３０００ｘｇで２０分間のタンデンシャル濾過により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製プロセスを２回繰り返し、最後に、スクロース（５％）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらの処方物はＰＴＸ積載ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＰＴＸ処方物という）である。

ドセタキセル（ＤＴＸ）を封入する従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の作製
ドセタキセル積載ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子は、若干改変した溶媒置換法により作製した。簡単に述べれば、１０ｍｇのドセタキセルを、１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡを含有するアセトン５ｍＬに分散させた。得られた混合物を室温で１時間、磁気振盪下で維持した。その後、１０ｍＬのエタノールの添加とその後の２０ｍｇのエデト酸二ナトリウムを含有する水溶液１０ｍＬの添加によりナノ粒子を形成させた。１０分間の磁気振盪によるホモジナイゼーションの後、減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ−１４４、スイス）により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液をビバスピンチューブにて３０００ｘｇで２０分間のタンデンシャル濾過により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製プロセスを２回繰り返し、最後に、スクロース（５％）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらの処方物はＤＴＸ積載ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＤＴＸ処方物という）である。

カンプトテシン（ＣＰＴ）を封入する従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の作製
１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡおよび１０ｍｇのカンプトテシンをそれぞれ２および３ｍＬのアセトンに溶解および分散させた。カンプトテシンに１分間音波処理を施し、ＰＶＭ／ＭＡ溶液と混合した。すぐに、エタノールと水の混合物（１：１、ｖ／ｖ）の添加によりナノ粒子を形成させた。次に、減圧下での蒸発により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、２７，０００ｘｇで２０分間の遠心分離により２回精製した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｗ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらの処方物はＣＰＴ積載ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＣＰＴ処方物という）である。

実施例２
従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の作製
空の従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ ｔｒａｄ）の作製
ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子を、溶媒置換法により作製した。簡単に述べれば、１２．５ｍｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１０）を３ｍＬのアセトンに溶かした後、２ｍＬの同有機溶媒中、１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡの溶液に加えた。得られた混合物を室温で１時間、磁気振盪下で維持した。その後、１０ｍＬのエタノールの添加とその後の１０ｍＬの水の添加によりナノ粒子を形成させた。減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ−１４４、スイス）により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液をビバスピンチューブにて３０００ｘｇで２０分間のタンデンシャル濾過により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製プロセスを２回繰り返し、最後に、スクロース（５％）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。得られたペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子は、ＰＥＧ２ ｔｒａｄ、ＰＥＧ６ ｔｒａｄおよびＰＥＧ１０ ｔｒａｄ処方物である。

パクリタキセルを封入する従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ−ＰＴＸ ｔｒａｄ）の作製
パクリタキセルを含有するペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子は、若干改変した溶媒置換法により作製した。簡単に述べれば、一方で、１２．５ｍｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１０）を３ｍＬのアセトンに溶かした後、２ｍＬの同有機溶媒中、１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡの溶液に加えた。得られた混合物を磁気振盪下で維持した。並行して、１０ｍｇのパクリタキセルを０．５ｍＬのアセトンに溶かし、ポリマー混合物に加えた。次に、有機相（パクリタキセル、ＰＶＭ／ＭＡおよびＰＥＧを含有）を室温で１時間、磁気撹拌した。その後、１０ｍＬのエタノールの添加とその後の２０ｍｇのエデト酸二ナトリウムを含有する水溶液１０ｍＬの添加によりナノ粒子を形成させた。１０分間の磁気振盪によるホモジナイゼーションの後、減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ−１４４、スイス）により有機溶媒を除去し、得られた懸濁液をビバスピンチューブにて３０００ｘｇで２０分間のタンデンシャル濾過により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製プロセスを２回繰り返し、最後に、スクロース（５％）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。よって、ＰＴＸ積載従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子、（以下、ＰＥＧ２−ＰＴＸ ｔｒａｄ、ＰＥＧ６−ＰＴＸ ｔｒａｄおよびＰＥＧ１０−ＰＴＸ ｔｒａｄ処方物という）が利用可能である。

ドセタキセルを封入する従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ−ＤＴＸ ｔｒａｄ）の作製
まず、ポリエチレングリコール２，０００（１２．５ｍｇ）を３ｍＬのアセトンに溶かし、同じく２ｍＬのアセトン中、１００ｍｇのＰＶＭ／ＭＡの溶液に加えた。得られた混合物を磁気振盪下で維持した。他方、ドセタキセルを０．５ｍＬのアセトンに溶かし、前記溶液に加えた。次に、ドセタキセル、ＰＶＭ／ＭＡおよびＰＥＧ２を含有する有機相を室温、磁気撹拌下で約１時間インキュベートした。その後、１０ｍＬのエタノールの添加とその後のグリシン（５０ｍｇ）とエデト酸二ナトリウム（１８ｍｇ）を含有する水溶液１０ｍＬの添加によりナノ粒子を形成させ、１０分間ホモジナイズした。減圧下での蒸発により有機溶媒を除去し、最終容量をグリシン溶液で１０ｍＬに調整した。この懸濁液をビバスピンチューブ（３００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ、ドイツ）にて４，０００ｘｇで１５分間のタンデンシャル濾過により精製した。ペレットを水に再懸濁させ、この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした。よって、ＤＴＸ積載従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ処方物という）が利用可能である。

カンプトテシンを封入する従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ−ＣＰＴ ｔｒａｄ）の作製
ポリマー／ＣＰＴ／ＰＥＧ比１／０．０３／０．１２５のペグ化ナノ粒子を作製した。ＰＥＧ２またはＰＥＧ６、およびカンプトテシンをアセトンに溶かし、種々の条件で混合した。すぐに、エタノール、水、グリシンおよびエデト酸二ナトリウムの混合物の添加によりナノ粒子を形成した。１０分間のホモジナイゼーションの後、減圧下での蒸発により有機溶媒を除去した。次に、得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、ビバスピンチューブ（３００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ、ドイツ）にて３０００ｘｇで２０分間、２回精製した。最後に、スクロース（５％、ｗ／ｗ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。よって、ＣＰＴ積載従来型ペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（以下、ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄおよびＰＥＧ６−ＣＰＴ ｔｒａｄ処方物という）が利用可能である。

実施例３
ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートの作製および特徴
３．１ ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートの作製
この場合、種々の分子量２，０００、６，０００または１０，０００のポリエチレングリコールおよびメトキシ−ポリエチレングリコール２０００を試験した。

エステルポリマーコンジュゲートを作製するため、５ｇのＰＶＭ／ＭＡを２５０ｍｌの有機溶媒（すなわち、アセトン）に溶かし、種々の量のポリエチレングリコールまたはその誘導体とともに５０℃で、磁気撹拌下、３時間インキュベートした。試験したヒドロキシル基末端分子：（ＰＶＭ／ＭＡ）比は：
・ｍＰＥＧ：（ＰＶＭ／ＭＡ） １：５；ｍＰＥＧ２用
・ＰＥＧ：（ＰＶＭ／ＭＡ） １：２０；１：８；ＰＥＧ２、ＰＥＧ６およびＰＥＧ１０用
であった。

インキュベーション後、溶媒を除去し、得られたエステルポリマーコンジュゲートを減圧蒸発蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により乾燥させた。最後に、得られた乾燥エステルポリマーコンジュゲートを、未反応のヒドロキシル基末端分子の痕跡が薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により液体中に検出されなくなるまで、ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）で洗浄し、真空下で濾過する（オールガラスフィルター、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ）ことにより精製した。この目的で、移動相としてのジクロロメタン／メタノール ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ（９：１）の混合物および可視化のためのヨウ素を用いた。この工程により、有機溶媒中での新規ポリマーコンジュゲートの溶解度が向上する。

３．２ ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートの特性決定
合成後、得られたＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２、ＰＥＧ６およびＰＥＧ１０とのエステルポリマーコンジュゲート（ＰＥＧ：ＰＶＭ／ＭＡ比１：８）およびＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート（ｍＰＥＧ：ＰＶＭ／ＭＡ比１：５）を、ＰＶＭ／ＭＡ主鎖修飾の証拠を得るとともに置換度（ＤＳ）および分子量（Ｍ_ｗ）を評価するために物理化学的に特性決定した。

以下の技術を使用した：
赤外線分光法（ＩＲ）： ＩＲ分光法は、反射率技術に基づくＮｉｃｏｌｅｔ Ａｖａｔａｒ ３６０ＦＴ−ＩＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）にて行った。この技術により、ヒドロキシル基末端分子（ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）の−ＯＨ官能基とＰＶＭ／ＭＡ無水物基との結合を同定することができた。

元素分析（ＣＨＮ）： 総てのプレフォームエステルポリマーコンジュゲートをＣＨＮ−９００ Ｌｅｃｏ装置（Ｌｅｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ、ＵＳＡ）で分析した。この技術は、ポリマーの組成を決定し、ＰＶＭ／ＭＡ構造にヒドロキシル基末端分子（ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が組み込まれる場合にＣ／Ｈ含量関係における違いを検出する助けとなる。

滴定： ＰＶＭ／ＭＡまたはそのエステルポリマーコンジュゲートをまず水和し、それらが完全に可溶化するまで水に分散させた。この時、ポリマーの水溶液を、指示薬として用いるフェノールフタレインの存在下、０．２ＮのＮａＯＨ溶液で滴定した。滴定は遊離カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基のパーセンテージを測定するために使用した。非修飾ＰＶＭ／ＭＡポリマーと比べた場合のエステルポリマーコンジュゲート中の遊離カルボキシル基の減少が分子結合の証拠となった。

サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）： ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ技術は、溶液中のポリマーの分子質量を決定するために重要である。この技術では、サイズ排除カラムでの分子質量に対する溶出時間の検量線を使用し、１つのポリマーの１回の測定でその分子量を知ることができる。

動的光散乱（ＤＬＳ）： この技術は、ポリマーの流体力学的半径（Ｒ_ｈ）を提供し、溶液中のポリマーの最も可能性の高いコンフォメーションの評価を与える。ＤＬＳ測定値は、２４８チャネルマルチタウコリレーターおよびペルティエ効果温度単位（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を備えたＤｙｎａＰｒｏ−ＭＳ／Ｘ光子相関分光計を用いて、散乱角９０°で行った。レーザーの波長は１００％強度で８５２．２ｎｍであった。ポリマーコンジュゲートを、溶媒としてテトラヒドロフランを用いて２５℃で測定した。

核磁気共鳴法（ ^１ Ｈ−ＮＭＲ）： ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、パルスプログラムｚｇ３０およびパルス間待機時間（Ｄ_０）１秒を用い、４００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００装置（Ｂｒｕｋｅｒ、ＵＳＡ）で記録した。プレフォームエステルポリマーコンジュゲートを溶媒としての重水素化アセトン（アセトン−ｄ_６）に溶かした。

３．３ 結果
プレフォームエステルポリマーコンジュゲートの赤外線分光法試験は、ＰＥＧまたはｍＰＥＧのヒドロキシルとＰＶＭ／ＭＡの無水物基との反応の結果として配向される新たなエステルカルボニル基ν（Ｃ＝Ｏ）のストレッチに関連した約１７０５ｃｍ^−１での新規結合の形成を示した（図１参照）。

ＩＲによりポリマーとヒドロキシル基末端分子の間に結合が生じていたという証拠が得られたところで、ポリマーの修飾の証拠を得るためのさらなる研究を行った。

表１は、原型ＰＶＭ／ＭＡポリマーとそのエステルポリマーコンジュゲートに関して決定された炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）および酸素（Ｏ）組成をまとめたものである。元素分析はＣ％の低下およびＯ％の増加を示し、これにより非修飾ＰＶＭ／ＭＡに比べてＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートの組成の著しい変化が確認され、エステルポリマーコンジュゲートの場合には原型コポリマーよりもＣ対Ｏ比（Ｃ／Ｏ比）が低かった。

他方、滴定によれば、無水物環がヒドロキシル基末端分子（ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）結合により湿られているために遊離−ＣＯＯＨ基の量の減少が確認された（表２）。

ＤＬＳは、ＰＶＭ／ＭＡの、およびＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧまたはｍＰＥＧとのエステルポリマーコンジュゲートの流体力学的半径の値を示した。非修飾ＰＶＭ／ＭＡポリマーに比べてわずかに低いが極めて類似した値を示すＰＶＭ／ＭＡ−メトキシポリエチレングリコール２，０００コンジュゲートを除き、総ての場合で、最初のＰＶＭ／ＭＡよりも流体力学的半径が増大している（表３）。これは、ポリマーコンジュゲートが有機溶媒に溶解される際の分子コンフォメーションの変化を示していると思われる。ｍＰＥＧ分子のメトキシ基に水素原子が存在しないことが、ＰＥＧ分子に存在するヒドロキシル基よりも低級で分子の折り畳みを促進するのであろう。

最後に、エステルポリマーコンジュゲートの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、総ての場合で、 分子（ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）中の−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ポリ（エチレン）単位に相当する化学シフトの存在を示した（図２）。

得られたエステルポリマーコンジュゲート中のヒドロキシル基末端分子のパーセンテージ（Ｄ．Ｓ．）を評価するために、ＰＶＭ／ＭＡ分子中の「１」プロトンに関連するピーク面積（図２Ａ参照）と１つの特徴的なヒドロキシル基末端分子ピークの面積の間の比（図２Ｂ〜２Ｅにおいて強調されたエステルポリマーコンジュゲートの新規化学シフト）を計算せいた。

これらの結果を用い、得られたコンジュゲートの平均分子量（Ｍ_ｗ）も評価し、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより計算したところ、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ １１９の分子量は９５．５ｋＤａと考えられる（表４）。

エステルポリマーコンジュゲートが精製および特性決定されたところで、ナノ粒子の作製を行い、それらの特性の試験も行った。

実施例４
ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子の作製
ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなる空のナノ粒子（ＰＥＧ ｃｏｎｊまたはｍＰＥＧ ｃｏｎｊ）の作製
ナノ粒子の作製は次のように行った。ポリエチレングリコール２，０００、ポリエチレングリコール６，０００、ポリエチレングリコール１０，０００［使用したＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）、ＰＥＧ６：（ＰＶＭ／ＭＡ）およびＰＥＧ１０：（ＰＶＭ／ＭＡ）比は１：２０であった］またはメトキシポリエチレングリコール２，０００［ｍＰＥＧプレフォームエステルポリマー２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比は１：５であった］とコンジュゲートしたＰＶＭ／ＭＡの１００ｍｇを５ｍＬのアセトンに溶かし、室温で磁気撹拌下、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液１％（ｖ／ｖ）を含有する水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）１０ｍＬを加えることにより脱溶媒和した。有機溶媒を減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により除去した。得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、４℃、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。このように、ＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２、ＰＥＧ６、ＰＥＧ１０またはｍＰＥＧ２とのプレフォームエステルポリマーコンジュゲートから未積載ナノ粒子を得た：それぞれＰＥＧ２ ｃｏｎｊ、ＰＥＧ６ ｃｏｎｊ、ＰＥＧ１０ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２ ｃｏｎｊ処方物。

パクリタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ｍＰＥＧ２−ＰＴＸ ｃｏｎｊ）の作製
ＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００［ｍＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比１：５］のプレフォームエステルポリマーコンジュゲート１００ｍｇを４ｍＬのアセトンに溶かした。並行して、１０ｍｇのパクリタキセルを１ｍＬのアセトンに分散させた。コンジュゲートの溶液とパクリタキセルの分散液を室温、磁気撹拌下で混合した後、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液１％（ｖ／ｖ）を含有する水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）１０ｍＬを加えることによりナノ粒子を形成させた。有機溶媒を減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により除去した。得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、４℃、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらはｍＰＥＧ２−ＰＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物である。

パクリタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ＰＥＧ２−ＰＴＸ ｃｏｎｊ）の作製
ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００［ＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比１：２０］のプレフォームエステルポリマーコンジュゲート１００ｍｇを４ｍＬのアセトンに溶かした。並行して、１０ｍｇのパクリタキセルを１ｍＬのアセトンに分散させた。コンジュゲートの溶液とパクリタキセルの分散液を室温、磁気撹拌下で混合した後、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液１％（ｖ／ｖ）を含有する水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）１０ｍＬを加えることによりナノ粒子を形成させた。減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により有機溶媒を除去した。得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、４℃、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらはＰＥＧ２−ＰＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物である。

ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ｍＰＥＧ２− ＤＴＸ ｃｏｎｊ）の作製
ＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００［ｍＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比１：５］とのプレフォームエステルポリマーコンジュゲート１００ｍｇを４ｍＬのアセトンに溶かした。並行して、１０ｍｇのドセタキセルを１ｍＬのアセトンに分散させた。コンジュゲートの溶液とドセタキセルの分散液を室温、磁気撹拌下で混合し、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液１％（ｖ／ｖ）を含有する水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）１０ｍＬを加えることによりナノ粒子を形成させた。減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により有機溶媒を除去した。得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、４℃、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらはｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物である。

ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ）の作製
ＰＶＭ／ＭＡとポリエチレングリコール２，０００［ＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比１：２０］とのプレフォームエステルポリマーコンジュゲート１００ｍｇを４ｍＬのアセトンに溶かした。並行して、１０ｍｇのドセタキセルを１ｍＬのアセトンに分散させた。コンジュゲートの溶液とドセタキセルの分散液を室温、磁気撹拌下で混合した後、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液１％（ｖ／ｖ）を含有する１０ｍＬの水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）を加えることによりナノ粒子を形成させた。減圧下での蒸発（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）により有機溶媒を除去した。得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、４℃、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。この精製工程を２回繰り返した。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらはＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物である。

カンプトテシンを封入するＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子（ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ）の作製
ＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００［ｍＰＥＧ２：（ＰＶＭ／ＭＡ）比１：５］とのプレフォームエステルポリマーコンジュゲート１００ｍｇを４ｍＬのアセトンに溶かした。並行して、３ｍｇのカンプトテシンを１ｍＬのアセトンに分散させ、３０秒間、音波処理を施した。コンジュゲートの溶液とカンプトテシンの分散液を室温、磁気撹拌下で混合した後、ＣａＣｌ_２ ０．８％（ｗ／ｖ）水溶液３％（ｖ／ｖ）を含有する水性アルコール混合物１：１（ｖ／ｖ）（水／エタノール）１０ｍｌを加えることによりナノ粒子を形成させた。減圧下で有機溶媒を排出した後（Ｂｕｃｈｉ Ｒ２１０、スイス）、得られた懸濁液を０．４５μｍ膜で濾過し、１７，０００ｒｐｍで２０分の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）により精製した。上清を除去し、ペレットを水に再懸濁させた。最後に、スクロース（５％ｗ／ｖ）を凍結保存剤として用いて、処方物を凍結およびフリーズドライした（Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ、Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）。これらはｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊナノ粒子処方物である。

実施例５
ナノ粒子の物理化学的特徴
これらの試験を行うために、実施例１、２および４に記載のナノ粒子の処方物を用いた。

５．１ 材料および方法
ナノ粒子の平均流体力学的直径およびゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒアナライザーシステム（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク、ＵＳＡ）を用い、それぞれ光子相関分光法（ＰＣＳ）および電気泳動レーザードップラー流速計により決定した。ナノ粒子の直径は超純水に分散させた後（１：１０）に決定し、２５℃で動的光散乱角９０℃により測定した。ゼータ電位も同じ装置で次のように測定した：２００μＬの同じサンプルを２ｍＬの０．１ｍＭ ＫＣｌ溶液に希釈した。

処方物の表面形態の検討もまた、デジタル画像システム（Ｐｏｉｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍＢｈ、ドイツ）と接続したＺｅｉｓｓ ＤＳＭ９４０デジタル走査型電子顕微鏡（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）での走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）により行った。事前に、ナノ粒子を脱イオン水で希釈し、４℃、１７，０００ｒｐｍ（Ｓｉｇｍａ ３ Ｋ３０、ドイツ）で２０分間遠心分離した。ペレットを乾燥させ、Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ ５５０ Ｓｐｕｔｔｅｒ−Ｃｏａｔｅｒ（Ａｈｓｆｏｒｄ、ＵＫ）にて９ｎｍの金層でシェードを付けた。最後に、重量測定によりナノ粒子の作製に用いたポリマーの初期量とフリーズドライサンプルの重量との差からナノ粒子形成の収率を計算した。

ナノ粒子のパクリタキセル含量
ナノ粒子に積載されたパクリタキセルの量をＡｇｉｌｅｎｔモデル１２００シリーズＬＣおよび２２８ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器でのＨＰＬＣ−ＵＶにより定量した。クロマトグラフィーシステムは逆相１５０ｍｍ×３ｍｍ Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉカラム（粒径５μｍ）およびプレカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ Ｃ１８）を装備した。０．５ｍＬ／分で送る移動相は、リン酸バッファー（０．０１Ｍ、ｐＨ２）とアセトニトリル（５０：５０、ｖ／ｖ）の混合物であった。カラムは３０℃に設定し、注入容量は１００μＬとした。ドセタキセルを内部標準として用いた。検量線は８０〜７０００ｎｇ／ｍＬ（ｒ^２＞０．９９９）の間で設計した。定量限界は４０ｎｇ／ｍＬであると計算された。分析のため、ナノ粒子をアセトニトリル（１：５ｖ／ｖ）で可溶化した。サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、蓋をし、ＨＰＬＣオートサンプラーに入れた。各サンプルを３反復でアッセイし、結果をナノ粒子１ｍｇ当たりのパクリタキセル量（μｇ）として表した。

ナノ粒子のドセタキセル含量
ナノ粒子に積載されたドセタキセルの量をＡｇｉｌｅｎｔモデル１２００シリーズＬＣおよび２２８ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器でのＨＰＬＣ−ＵＶにより定量した。クロマトグラフィーシステムは逆相１５０ｍｍ×３ｍｍ Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉカラム（粒径５μｍ）およびプレカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ Ｃ１８）を装備した。０．５ｍＬ／分で送る移動相は、リン酸バッファー（０．０１Ｍ、ｐＨ２）とアセトニトリル（５０：５０、ｖ／ｖ）の混合物であった。カラムは３０℃に置き、注入容量は１００μＬとした。パクリタキセルを内部標準として用いた。検量線は１．２５〜３２０μｇ／ｍＬ（ｒ^２＞０．９９９）の間で設計した。定量限界は６０ｎｇ／ｍＬであると計算された。分析のため、ナノ粒子をアセトニトリル（１：８ｖ／ｖ）で可溶化した。サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、蓋をし、ＨＰＬＣオートサンプラーに入れた。各サンプルを３反復でアッセイし、結果をナノ粒子１ｍｇ当たりのパクリタキセル量（μｇ）として表した。

ナノ粒子のカンプトテシン含量
ナノ粒子に積載されたカンプトテシンの量をＡｇｉｌｅｎｔモデル１１００シリーズＬＣならびに励起および発光をそれぞれ３８０ｎｍおよび４１８ｎｍに設定した蛍光検出器でのＨＰＬＣ−ＦＬＤにより定量した。クロマトグラフィーシステムは逆相１５０ｍｍ×３ｍｍ Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉカラム（粒径５μｍ）およびプレカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ Ｃ１８）を装備した。１ｍＬ／分で送る移動相は、アセトニトリルとトリフルオロ酢酸０．０１％（ｖ／ｖ）の５０：５０（ｖ／ｖ）混合物からなった。カラムは３０℃に置き、注入容量は２０μＬとした。ドセタキセルを内部標準として用いた。検量線は０．４８〜８０００ｎｇ／ｍＬ（ｒ^２＞０．９９９）の範囲で設計した。定量限界は１．３ｎｇ／ｍＬであると計算された。

分析のため、ナノ粒子をアセトニトリル（１：１０ｖ／ｖ）で可溶化した。サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、蓋をし、ＨＰＬＣオートサンプラーに入れた。各サンプルを３反復でアッセイし、結果をナノ粒子１ｍｇ当たりのカンプトテシン量（μｇ）として表した。

５．２ 結果
種々の未積載ナノ粒子処方物の主要な物理化学的特徴を表５にまとめる。

ｍＰＥＧ２−ｃｏｎｊナノ粒子中のヒドロキシル基末端分子（配位子）含量が残りのポリマーコンジュゲートナノ粒子に比べて有意に高いことに気づくことができる。ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートを形成するために使用されたｍＰＥＧ２の最初の量はＰＥＧ２、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１０に関してはずっと多いことから、これは必然的である。

パクリタキセル積載ナノ粒子の特性決定
パクリタキセルを積載した種々のナノ粒子処方物（ＰＥＧ−ＰＴＸ）の主要な物理化学的特徴を表６にまとめる。第一に、ＰＥＧ２コンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート）を含有するナノ粒子は、ｍＰＥＧ２コンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート）を用いたナノ粒子よりも大きな粒径を示した。ＰＥＧ２コンジュゲートでは、粒径は４００ｎｍに近く、ｍＰＥＧ２コンジュゲートを含有する他の処方物では、粒径はより小さく、３００ｎｍ前後であった。

ゼータ電位については、ｍＰＥＧ２コンジュゲートを含有する積載ナノ粒子は、−３８ｍＶ前後というややより負の表面電荷を呈した。ＰＥＧ２コンジュゲートを用いて処方したナノ粒子は−３３ｍＶ前後の表面電荷を示した。さらに、この方法の収率は、両処方物とも７０％前後であると計算された。ナノ粒子に付加されたＰＴＸの量に着目すると、ｍＰＥＧ２およびＰＥＧ２コンジュゲートでは、１６０μｇ／ｍｇ ＮＰ前後であると計算された。

ＰＥＧ２−ＰＴＸ ｔｒａｄ処方物とＰＥＧ２−ＰＴＸ ｃｏｎｊ処方物の間でナノ粒子収率を比較すると、形成されたナノ粒子のパーセンテージは、ＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲートを用いた場合で高かった。

ドセタキセル積載ナノ粒子の特性決定
コンジュゲートナノ粒子は溶媒置換法により首尾良く作製された。ドセタキセルを積載した種々のナノ粒子処方物（ＰＥＧ−ＤＴＸ）の主要な物理化学的特徴を表７にまとめる。第一に、ＰＥＧ２コンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート）を含有する積載ナノ粒子は、ｍＰＥＧ２コンジュゲート（ＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート）を用いた積載ナノ粒子よりも大きな粒径を示した。ＰＥＧ２では、粒径は４００ｎｍに近く、ｍＰＥＧ２を含有する他の処方物では、粒径はより小さく、３００ｎｍ前後であった。

ゼータ電位については、ｍＰＥＧ２を含有するナノ粒子は、−３９ｍＶ前後というややより負の表面電荷を呈した。ＰＥＧ２コンジュゲートを用いて処方したナノ粒子は、−３３ｍＶ前後の表面電荷を示した。

さらに、この方法の収率は、両処方物とも６０％前後であると計算された。ナノ粒子に付加されたドセタキセルの量に着目すると、ｍＰＥＧ２およびＰＥＧ２コンジュゲートでは、１００μｇ／ｍｇ ＮＰ前後であると計算された。

カンプトテシン積載ナノ粒子の特性決定
得られたカンプトテシン含有ナノ粒子の物理化学的特徴を表８にまとめる。ナノ粒子にカンプトテシンを積載する場合、ｍＰＥＧ２ ｃｏｎｊ（ＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート）ナノ粒子では、平均粒径はおよそ１９５ｎｍであった。多分散性指数（ＰＤＩ）は０．３未満であり、これは均質な処方物を意味する。ナノ粒子のゼータ電位を考えると、処方物は−３６ｍＶ前後の負の表面電荷を有する粒子により形成されたものである。さらに、この方法の収率はおよそ７０％であった。薬物積載量については、コンジュゲート由来のナノ粒子に封入されたカンプトテシンの量は１１μｇ／ｍｇに達した。従来型ペグ化ナノ粒子に積載されたカンプトテシンの量は、従来型ＰＥＧ２−ＣＰＴの方が従来型ＰＥＧ６−ＣＰＴよりもやや高く、９μｇ／ｍｇナノ粒子に達した。

走査電子顕微鏡観察による形態分析（図３）は、総てのポリ（無水物）ナノ粒子種が光子相関分光法により測定されたものと同様の大きさの球形粒子の均質な集団からなっていたことを示した。ナノ粒子の表面は平滑と見え、それらの表面に目に見える凹凸は無かった。

実施例６
ドセタキセルのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
６．１ ドセタキセルのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験
放出試験は、ドセタキセルの可溶化剤として０．５％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）を含有する人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．２；ペプシン０．３２％ｗ／ｖ）および腸液（ＳＩＦ；ｐＨ６．８；パンクレアチン １％ｗ／ｖ）を用い、３７℃、浸漬条件下で行った。これらの試験は、ナノ粒子を適当な媒体に分散させた後、Ｖｏｒｔｅｍｐ ５６（商標）振盪インキュベーター（Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、ＮＪ、ＵＳＡ）にて振盪下で行った。

各時点で、ナノ粒子中の５０μｇドセタキセル処方物を２ｍＬの対応する人工液に再懸濁させた。アッセイした処方物は、ＤＴＸナノ粒子（ドセタキセルを封入する従来型のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ（ドセタキセル封入するＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子）、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）およびＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ（ドセタキセルを封入するＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子）であった。

ドセタキセルに関する浸漬条件を評価するために、放出媒体中のナノ粒子の濃度を調整した。種々の処方物をＳＧＦ中では２時間、ＳＩＦ中では１２時間維持した。種々の時点で、サンプルチューブを回収し、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。最後に、上清を濾過し、処方物から放出されたドセタキセルの量をＨＰＬＣにより定量した（ＳＧＦおよびＳＩＦから得た上清中の遊離ドセタキセルの検量線、ｒ^２＞０．９９９）。放出プロフィールを累積放出パーセンテージとして表し、時間に対してプロットした。

６．２ Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるドセタキセル封入ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態試験
マウスへのＤＴＸ積載ナノ粒子の投与
薬物動態試験は、Ｈａｒｌａｎ（バルセロナ、スペイン）から入手したＢａｌｂ／ｃ雌マウス（２０〜２２ｇ）で行った。試験は、動物実験に関する欧州規則（８６／６０９／ＥＵ）に準拠し、施設内動物実験倫理委員会により承認された実験動物での研究に関する倫理指針およびポリシー（プロトコール番号Ｅ２１−１２）に従って行った。実験前に動物を１週間、食物および飲用水を自由に摂らせて順応飼育した（２２±２℃；１２時間明および１２時間暗周期；相対湿度５０〜６０％）。処方物の経口投与前に、吸収による干渉を避けるために動物を一晩絶食させ、なお、水は自由に摂らせた。

薬物動態試験では、マウスを採血時間に基づき無作為に群に分けた。各時点で動物３個体に相当した。試験群は、ＤＴＸ、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ、およびＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子であった。対照として、１群の動物にタキソテール（登録商標）を静脈内（ｉ．ｖ．）に施し、別の群は市販の処方物で経口処置した。各動物に３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量に相当する量のドセタキセルを、鈍針で食道から胃へ経口的に、または尾静脈から静脈内に施した。

血液サンプルを投与後の設定された時点（０、１０分、３０分、１時間、１．５時間、３時間、６時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間）で採取した。ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用した。血液量は、体温に予熱した等量の生理食塩水を用いて腹膜内に戻した。サンプルをすぐに氷上に置き、２，５００ｘｇで１０分間遠心分離した。血漿を清浄なチューブに分離し、ＨＰＬＣ分析まで−２０℃で凍結維持した。

血漿サンプル中のＤＴＸのＨＰＬＣ定量
血漿中のドセタキセルの量をＨＰＬＣ−ＵＶにより決定した。ＤＴＸ／ＰＴＸクロマトグラフィー面積を濃度に変換するために検量線を用いた。較正および品質対照は、適当な容量の標準ドセタキセルエタノール溶液を薬物不含血漿に加えることにより作製した。検量線は１００〜６２５０ｎｇ／ｍＬ（ｒ^２＞０．９９９）の範囲で設計した。血漿アリコート（２００μＬ）と２５μＬの内部標準溶液（パクリタキセル、エタノール中１０μｇ／ｍＬ、予め蒸発）を混合した。ボルテックス混合の後、ボルテックスで穏やかに振盪（1分）させた後に４ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを加えることで、液−液抽出を行った。この混合物を３０００ｘｇで１０分間遠心分離した後、有機層を清浄なチューブに移し、乾燥するまで蒸発させた（Ｓａｖａｎｔ、バルセロナ、スペイン）。最後に、残渣を１２５μＬの再構成溶液（アセトニトリル−リン酸バッファー０．０１Ｍ ｐＨ＝２； ５０：５０、ｖ／ｖ）に溶かし、オートサンプラーバイアルに移し、蓋をし、ＨＰＬＣオートサンプラーに入れた。各サンプルの１００μＬアリコートをＨＰＬＣカラムに注入した。

薬物動態データ分析
種々のＤＴＸ処方物の投与後に得られた時間データに対してプロットした血漿濃度の薬物動態分析を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ５．２ソフトウエア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を用いるノンコンパートメントモデルを用いて分析した。以下のパラメーターを評価した：最大血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、最大濃度に到達する時間（Ｔ_ｍａｘ）、時間０〜∞までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖ）および終末相の半減期（ｔ_１／２ｚ）。

さらに、ドセタキセルの相対的経口バイオアベイラビリティＦ（％）を下式により推定した：

式中、ＡＵＣ ｉ．ｖ．およびＡＵＣ ｏｒａｌはそれぞれ、静脈内投与および経口投与の場合の曲線下面積に相当する。

統計分析
データは少なくとも３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として表す。統計的差異を検討するためにノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、次いでマン・ホイットニーＵ検定を用いた。総ての場合で、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。データ処理は総て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０統計ソフトウエアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。

６．３ 結果
ドセタキセルｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験
ナノ粒子処方物からのドセタキセル放出プロフィールは、２つの異なる媒体、すなわち、可溶化剤として０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（ｗ／ｖ）を含有する人工胃液および腸液中でのそれらのインキュベーション後に評価した。図４は、ＤＴＸナノ粒子、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物からのドセタキセルの放出プロフィールを、時間の関数として放出される薬物の累積パーセンテージとして示す。総ての場合で、ナノ粒子をＳＧＦに分散させた際には、薬物放出は見られなかった。対照的に、ナノ粒子をＳＩＦに分散させた際にはドセタキセルが放出された。

ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄでは、ＳＩＦ中での放出パターンは、最初の３０分の積載薬物の約７５％の重要なバースト効果の後に１０時間までより持続的な送達期間が続くという特徴を示した。他方、ＤＴＸナノ粒子では、ＳＩＦ中でのドセタキセルの放出曲線は、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄよりも遅いドセタキセル放出を示し、その後、それらの積載物のほとんど総てが放出された試験の終了時までより一定の放出が続いた。

ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊナノ粒子処方物はいずれも、類似の放出プロフィールを示した。ＳＩＦの存在下、ドセタキセル放出は、積載薬物の最大９０％の急速な初期バースト放出と、その後のより時速的な送達相を特徴とする二相型の放出パターンを示した。ＤＴＸの完全な放出は総てのサンプルで、試験開始後１０〜１１時間に見られた。

Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるドセタキセル含有ナノ粒子の薬物動態試験
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスへのタキソテール（登録商標）（３０ｍｇ／Ｋｇの単回用量）のｉ．ｖ．投与後のドセタキセルの血漿濃度−時間プロフィールを図５に示す。薬物血漿濃度は二相系で経時的に急速に低下し、データはノンコンパートメントモデルに対して補正した。血漿中のドセタキセルのレベルは投与１２時間後まで定量可能であった。

図６は、市販のタキソテール（登録商標）として投与するか、または種々のポリ（無水物）ナノ粒子処方物、すなわち、従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＤＴＸ処方物）、ＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ）またはＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子（ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ）またはＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子（ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ）に封入された場合の、Ｂａｌｂ／ｃマウスへのドセタキセル（３０ｍｇ／ｋｇの単回用量）の経口投与後の時間に対する血漿濃度のプロフィールを示す。市販のタキソテール（登録商標）を経口経路によりマウスに投与した場合、ドセタキセル漿レベルは、クロマトグラフィー分析技術の定量限界を常に下回ることが判明した。対照的に、ドセタキセルをナノ粒子に積載した場合には、これらの処方物は、持続的血漿レベルを示した。総ての場合で、最初の１．５〜２時間に抗癌薬の血漿レベルに初期の急激な上昇が見られＣ_ｍａｘに達し、その後、ＤＴＸ処方物では少なくとも８時間（図６Ａ参照）、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ処方物では約７０時間（図６Ｂ参照）延長される緩慢な低下が続いた。ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄとＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊを比較すると、ドＰＶＭ／ＭＡとＰＥＧ２０００およびｍＰＥＧ２０００とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子で到達したセタキセルの血漿レベルは、ＰＥＧ２０００でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の場合よりも高かった。

表９に、種々のドセタキセル処方物をマウスに投与した後に得られた実験データのノンコンパートメント分析を用いて計算した薬物動態パラメーターをまとめる。第一に、ｉ．ｖ．経路により投与された市販の処方物では、ＡＵＣの平均値は１４３μｇ ｈ／ｍＬであった。最大濃度（Ｃｍａｘ）は１９８μｇ／ｍＬであり、Ｔｍａｘは０時間であった。ＭＲＴは１．４時間であり、曲線の終末相の半減期（ｔ_１／２ｚ）は１．５時間であると推定された。

他方、ポリ（無水物）ナノ粒子中のドセタキセルのＣ_ｍａｘ値は１．３〜２μｇ／ｍｌの間であり、このパラメーターの順位は、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ＝ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ＞ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ＞ＤＴＸであった。さらに、Ｃ_ｍａｘはタキソテール（登録商標）のｉ．ｖ．投与後０時間で達成され、それはＤＴＸ処方物では０．８時間に、ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ、およびＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ処方物では１．５〜２時間に遅延された。

従来型ＰＥＧとコンジュゲート処方物を比較すると、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊでは、ＡＵＣ値はそれぞれ１．３および１．８倍であり、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄで得られたＡＵＣより高く、これはより高いタキサンの経口吸収促進能を示した。さらに、血漿中の薬物の平均滞留時間（ＭＲＴ）およびその終末相の半減期（ｔ_１／２ｚ）は、エステルポリマーコンジュゲート処方物（ｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊ）中で経口経路により投与された場合には大幅に延長された。

同様に、コンジュゲートナノ粒子に積載された場合の抗癌薬の分布容積（Ｖ）（ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊでは２２５ｍＬおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊでは２４０ｍＬ）は、薬物がタキソテール（登録商標）の形で静脈内に投与された場合（８ｍＬ）より大きく、また、薬物が従来型のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（１５ｍＬ）または従来型のペグ化ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（１９２ｍＬ）に封入されて経口投与された場合よりも大きかった。対照的に、ドセタキセルのクリアランスは常に同等であり、使用した処方物と投与経路の両方に依存していた。

最後に、従来型のペグ化ナノ粒子（ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｔｒａｄ）で送達されたドセタキセルの相対的経口バイオアベイラビリティは、３２％前後であると計算された。非ペグ化ナノ粒子では、経口バイオアベイラビリティは、わずか５％であることが分かった。コンジュゲート処方物では、得られたデータは高く、ＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊおよびｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊでは４０〜５７％まで変動していた。驚くことに、エステルポリマーコンジュゲートから作製された処方物は、ドセタキセルの相対的経口バイオアベイラビリティを高めた。

要するに、従来型ＰＥＧおよびコンジュゲートナノ粒子処方物はドセタキセルを積載することができ、それらの経口投与に好適な特徴を呈した。経口投与される場合、これらのナノ粒子は３日間、ドセタキセルの延長された持続的血漿レベルを与えた。しかしながら、「裸の」ナノ粒子では、ドセタキセル血漿濃度は初期には高いが急速に低下し、投与１２時間後では定量可能なレベルは見られなかった。加えて、薬物動態研究では、特に、従来型ペグ化ナノ粒子の１．８倍という５７％に近い経口バイオアベイラビリティに達したｍＰＥＧ２−ＤＴＸ ｃｏｎｊでの、ドセタキセルの経口バイオアベイラビリティを高めるコンジュゲートナノ担体のより高い能力が明らかとなった。

実施例７
カンプトテシンのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
７．１ カンプトテシンｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験
放出試験は、人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．２；ペプシン０．３２％ｗ／ｖ）および腸液（ＳＩＦ；ｐＨ６．８；パンクレアチン １％ｗ／ｖ）を用い、３７℃、浸漬条件下で行った。これらの試験は、ナノ粒子を適当な媒体に分散させた後、Ｖｏｒｔｅｍｐ ５６（商標）振盪インキュベーター（Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、ＮＪ、ＵＳＡ）にて振盪下で行った。

各時点で、ＰＥＧ２でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ）またはＰＥＧ６でペグ化された従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（ＰＥＧ６−ＣＰＴ ｔｒａｄ）およびＰＶＭ／ＭＡとｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子（ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ）中の０．８μｇカンプトテシンの処方物を１ｍＬの対応する人工液に再懸濁させた。種々の処方物をＳＧＦ中では２時間、ＳＩＦ中では１４時間維持した。種々の時点で、サンプルチューブ(simple tubes)を回収し、ビバスピンューブ（３００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｇｒｏｕｐ、ドイツ）にて３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。処方物から放出されたカンプトテシンの量をＨＰＬＣにより定量した（ＳＧＦおよびＳＩＦから得た上清中の遊離カンプトテシンの検量線、ｒ^２＞０．９９９）。

７．２ ウィスターラットにおけるカンプトテシン封入ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態試験
ラットへのカンプトテシン積載ナノ粒子の投与
薬物動態試験は、Ｈａｒｌａｎ（バルセロナ、スペイン）から入手した雄ウィスターラットで行った。試験は、動物実験に関する欧州規則（８６／６０９／ＥＵ）に準拠し、施設内動物実験倫理委員会により承認された実験動物での研究に関する倫理指針およびポリシー（プロトコール番号０５８−１２）に従って行った。

実験前に動物を１週間、食物および飲用水を自由に摂らせて順応飼育した（２２±２℃；１２時間明および１２時間暗周期；相対湿度５０〜６０％）。処方物の経口投与前に、吸収による干渉を避けるために動物を一晩絶食させ、なお、水は自由に摂らせた。

薬物動態試験では、ラットを無作為に２群に分けた（ｎ＝６）。対照として、１群の動物に１ｍｇ／ｋｇ用量のカンプトテシン懸濁液を経口で施し（食道から胃に鈍針で）、他の群にはカンプトテシン懸濁液を静脈内に施した（尾静脈から）。試験群には、ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊおよびＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄナノ粒子中に処方した等用量のカンプトテシンを経口的に施した。

血液サンプルを投与後の設定された時点（０、０．５、１、２、４、６、８、２４、３０および４８時間）で採取した。ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用した。血液量は、体温に予熱した等量の生理食塩水を用いて腹膜内に戻した。サンプルをすぐに氷上に置き、２，５００ｘｇで１０分間遠心分離した。血漿を清浄なチューブに分離し、ＨＰＬＣ分析まで−２０℃で凍結維持した。

血漿サンプル中のカンプトテシンのＨＰＬＣ定量
カンプトテシンの量をＡｇｉｌｅｎｔモデル１１００シリーズＬＣならびに励起および発光をそれぞれ３８０ｎｍおよび４１８ｎｍに設定した蛍光検出器でのＨＰＬＣ−ＦＬＤにより決定した。クロマトグラフィーシステムは逆相１５０ｍｍ×３ｍｍ Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉカラム（粒径５μｍ）およびプレカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ Ｃ１８）を装備した。１ｍＬ／分で送る移動相は、アセトニトリルとトリフルオロ酢酸０．０１％（ｖ／ｖ）の５０：５０（ｖ／ｖ）混合物からなった。カラムは３０℃に置き、注入容量は１００μＬとした。検量線および品質対照は、ジメチルスルホキシド／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸 １：８．９：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）中、適当な容量の標準カンプトテシンを薬物不含血漿に加えることにより０．４８〜８０００ｎｇ／ｍＬ（ｒ^２＞０．９９９）の範囲で設計した。

血漿タンパク質の沈降を達成するために、血漿のアリコート（１００μＬ）を４容量のアセトニトリルと混合し、２分間ボルテックスにかけた。遠心分離（５０００ｘｇ、５分）後、上清を回収し、乾燥するまで蒸発させた（Ｓａｖａｎｔ、バルセロナ、スペイン）。最後に、残渣を１２０μＬの再構成溶液ジメチルスルホキシド／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸 １：８．９：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）に溶かし、オートサンプラーバイアルに移し、蓋をし、ＨＰＬＣオートサンプラーに入れた。定量限界は、相対標準偏差４．６％で、２．６ｎｇ／ｍＬであると計算された。

薬物動態データ分析
種々のカンプトテシン処方物の投与後に得られた時間データに対してプロットした血漿濃度の薬物動態分析を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ５．２ソフトウエア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を用いるノンコンパートメントモデルを用いて分析した。以下のパラメーターを評価した：最大血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、最大濃度に到達する時間（Ｔ_ｍａｘ）、時間０〜∞までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖ）および終末相の半減期（ｔ_１／２ｚ）。

さらに、カンプトテシンの相対的経口バイオアベイラビリティＦ_ｒを、アッセイした処方物の０から∞までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）と投与されたＣＰＴの経口懸濁液の１つとの間の比として表した。

統計分析
処方物の物理化学的および薬学的特性決定では、データは少なくとも３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として表す。

薬物動態ｉｎ ｖｉｖｏパラメーターを統計的に分析した。統計的差異を検討するためにノンパラメトリックなクラスカル・ワリス、次いでマン・ホイットニーＵ検定を用いた。総ての場合で、０．０５より小さいＰ値を統計的に有意な差と見なした。データ処理は総て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０統計ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて行った。

７．３ 結果
カンプトテシンｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験
ナノ粒子からのカンプトテシン放出動態を人工胃液および腸液（カンプトテシンの可溶化剤としてポリソルベート８０を含有）（図７）中で評価した。このパターンは、ナノ粒子をＳＧＦに分散させた場合には最初の非放出工程、および（ナノ粒子をＳＩＦに分散させた場合）薬物が初期に急速に放出され、次いで、より持続的な送達相が続くという放出工程を特徴とした。従来型ペグ化ナノ粒子（ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄおよびＰＥＧ６−ＣＰＴ ｔｒａｄ）では、このより速い放出は（ＳＩＦ中でのインキュベーション後）最初の５時間効果を生じ、持続放出の最終工程は、ナノ粒子がそれらの積載物の１００％の放出を完了するままで１１時間かかった。ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊからのカンプトテシン放出動態は、３つの異なる相に分けることができる放出プロフィールを示した。最初のものでは、最初の２時間にナノ粒子をＳＧＦに分散させた場合、放出されるカンプトテシンの量は極めて低かった（約１０％）。次に、ナノ粒子をＳＩＦに移した場合、バースト放出効果が見られた。よって、積載された初期薬物の９０％前後がナノ粒子処方物から唐突に放出された。最後に、第三の工程は、残っている薬物の緩徐的かつ持続的放出を特徴とし、それは試験の次の１２時間（試験開始後１４時間）内に完全に放出された。

ウィスターラットにおけるカンプトテシン含有ナノ粒子の薬物動態試験
用量１ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与後のカンプトテシンの血漿濃度−時間プロフィールを図８に示す。カンプトテシンは、粒径１，５００±１４４ｎｍおよびＰＤＩ ０．４４±０．０５の懸濁液として投与した。データはノンコンパートメントモデルにより分析した。カンプトテシン血漿濃度は投与後急速に低下し、投与６時間後では検出不能であった。投与後、薬物血漿濃度は４３０ｎｇ／ｍＬ（Ｃ_ｍａｘ）に達し、ＡＵＣおよびｔ_１／２ｚの値はそれぞれ０．３９μｇ ｈ／ｍＬおよび０．６９時間であった。薬物のクリアランスおよび分布容量はそれぞれ７５５ｍＬ／ｈおよび６８３ｍＬと計算された（表１０）。

図９は、懸濁液としてまたはナノ粒子に積載して雄ウィスターラットに単回経口用量（１ｍｇ／ｋｇ）の投与を行った後のカンプトテシンの血漿濃度プロフィールを示す。薬物懸濁液を経口投与した場合、血漿レベルは急速に上昇し、投与３０分後にＣ_ｍａｘに達した。その後、薬物の持続的血漿レベルが少なくとも４時間維持され、最後に、カンプトテシン レベルは急速に低下した。その後、投与１０時間後、血漿中に検出可能なレベルのカンプトテシンは見られなかった。

ナノ粒子に積載され、同用量（１ｍｇ／ｋｇ）で投与されたカンプトテシンでは、水性懸濁液処方物を用いる場合の主要な違いは、より長時間血漿中に薬物レベルが定量可能であったということであった。よって、従来型ペグ化ナノ粒子（ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ）に含まれたカンプトテシンを受容した動物は、最初の１．５時間、血漿中の薬物レベルが上昇することを特徴とする初期相と、その後、２４時間まで定量可能なレベルのカンプトテシンの緩徐的かつ長時間の低下相を示した。ＡＵＣは、薬物が懸濁液として経口投与された場合の約２倍であることが判明した。加えて、統計的な違いは見られなかったものの、これらのペグ化ナノ粒子中で投与された薬物分布容積は、懸濁として経口投与された裸の薬物のそれの１．５倍であった。

同用量（１ｍｇ／ｋｇ）で投与されたＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲート（ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ）由来のナノ粒子では、血漿曲線の初期プロフィールは極めて類似していたが、定量された薬物量は従来の処方物よりも高く、より重要には、投与４８時間までの時間内で血漿レベルが持続した。全体的に見れば、ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊの経口投与後に血漿中に見られたカンプトテシンのレベルは、水性懸濁液および従来型ペグ化 ナノ粒子（ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ）の場合よりも高く、ＡＵＣはそれぞれ７．６倍および４．２倍であった。

表１０に、種々の処方物をラットに投与した後に得られた試験データのノンコンパートメント分析を用いて評価された主要な薬物動態パラメーターをまとめる。ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊでは、カンプトテシンＡＵＣは、薬物の水性懸濁液の場合よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）ことが判明した。ナノ粒子と懸濁液の間のもう１つの違いは薬物の平均滞留時間（ＭＲＴ）であった。この場合、ＭＲＴは、裸の薬物とｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊの間で有意に異なったが（ｐ＜０．０１）（１０倍）、対照とＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄの間では有意差は見られなかった。同様に、曲線の終末相の半減期（ｔ_１／２ｚ）も、従来型懸濁液として処方された場合よりもカンプトテシンがｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊに封入された場合で有意に高かったが、ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄ中に処方された場合はそうではなかった。この結果によれば、ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ中で投与された場合の薬物のクリアランスは、懸濁液として投与された場合に得られた値の約１１分の１であった（ｐ＜０．０１）。同様に、ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ処方物をＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄと比較すると、ＡＵＣは有意に高いことが分かり（ｐ＜０．０５）、ＭＲＴおよびｔ_１／２ｚに関しても統計的有意性が認められた（ｐ＜ ０．０１）。

要約すると、カンプトテシンを封入する両タイプのナノ粒子（ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄおよびｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊ）は、それらが腸管条件下でインキュベートされるまで薬物の放出が見られなかったことを考えれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて経口投与に好適であると思われる。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは、ｍＰＥＧ２−ＣＰＴ ｃｏｎｊは、ＰＥＧ２−ＣＰＴ ｔｒａｄのそれの４．３倍という著しく高いバイオアベイラビリティを示した。

実施例８
ナノ粒子の生体分布試験
ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲートのマトリックスを含んでなるナノ粒子の分布および消化管粘膜と相互作用する能力を可視化および評価するために、蛍光顕微鏡試験を行った。

８．１ ルモゲン積載ナノ粒子の作製
空の従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子およびＰＶＭ／ＭＡとメトキシポリエチレングリコール２，０００のエステルポリマーコンジュゲート（ｍＰＥＧ２ ｃｏｎｊ）のマトリックスを含んでなるナノ粒子をルモゲンレッドで蛍光標識した。

ルモゲン積載ナノ粒子は、実施例１および４に記載されるようなナノ粒子の形成前に、ＰＶＭ／ＭＡ（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ）またはそのｍＰＥＧ２とのエステルポリマーコンジュゲート（ｍＰＥＧ２−ＬＵＭ ｃｏｎｊ）を含有するアセトン相（５ｍＬ）中に０．５ｍｇのルモゲン（登録商標）レッドを加えることにより作製した。ＬＵＭおよびｍＰＥＧ２−ＬＵＭ ｃｏｎｊ処方物をそれぞれ得た。

８．２ ウィスターラットの消化管粘膜におけるルモゲン積載ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ分布試験
生体分布試験を、ルモゲンレッドを封入する蛍光標識ナノ粒子を用いて行った。

動物実験は、動物実験に関する欧州規則に沿った、施設内動物実験倫理委員会により承認されたプロトコール（プロトコール番号０５９−１３）に従って行った。１０ｍｇの蛍光標識ナノ粒子を含有する水性懸濁液１ｍＬの単回用量を雄ウィスターラットに経口投与した。２時間後、動物を犠牲にし、消化管を摘出した。１ｃｍの回腸部分を採取し、組織プロシーディング媒体Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ中で保存し、−８０℃で冷凍した。次に、各部分をクリオスタットで５μｍの切片とし、スライドグラスに載せた。最後に、これらのサンプルをホルムアルデヒドで固定し、カバーアセンブリの前に１５分ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）とともにインキュベートした。

腸管粘膜における蛍光標識ナノ粒子の存在をＣＣＤカメラ(a coupled camera)（Ａｘｉｏｃａｍ ＩＣｃ３、Ｚｅｉｓｓ）および蛍光源（ＨＢＯ １００、Ｚｅｉｓｓ）を備えた蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｍ１、Ｚｅｉｓｓ）で可視化した。

８．３ 結果
ルモゲン積載ナノ粒子は、空のナノ粒子で決定されたものと類似の物理化学的特性を示した：ＬＵＭナノ粒子では２１５ｎｍ、−３６ｍＶ、およびｍＰＥＧ２−ＬＵＭ ｃｏｎｊ処方物では２０５ｎｍ、−３５ｍＶ。

驚くことに、ｍＰＥＧ２−ＬＵＭ ｃｏｎｊナノ粒子は、回腸粘膜内でＬＵＭナノ粒子とは異なる分布を示した。従来型ＰＶＭ／ＭＡナノ粒子は腸管上皮を覆う粘液層に捕捉されると見られるが（図１０Ａ、１０Ｂ）、ＰＶＭ／ＭＡのエステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子は、粘液層を通過し、および腸細胞の表面とより緊密に相互作用する能力を有していた（図１０Ｃ、１０Ｄ）。この所見から、エステルポリマーコンジュゲート由来のナノ粒子の表面が原型ＰＶＭ／ＭＡの場合とは異なることが確認される。ナノ粒子の形成中に、コンジュゲートの親水性領域が水相に配向してナノ粒子の表面に親水性コロナを形成し、これが得られたナノ粒子に「滑りのよい」特性および従って粘液層を通過して腸細胞の表面に到達する能力を付与するという仮説を立てることができる。

Claims (16)

1. ａ）有機媒体中でエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物とを混合する工程、および
   ｂ）二価金属の存在下でアルコールおよび水を加えることによりエステルポリマーコンジュゲートを脱溶媒和する工程
   を含んでなる、ナノ粒子を生産するための方法であって、
   エステルポリマーコンジュゲートが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とヒドロキシル基末端分子とのコンジュゲートであり、
   ヒドロキシル基末端分子が、ポリエチレングリコールおよびポリオキシエチレンアルキルエーテルから選択される、方法。
2. 工程ｂ）が、工程ａ）で得られた混合物に、二価金属を含んでなる水性アルコール混合物を加えることにより行われる、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）の混合物中のエステルポリマーコンジュゲートと生物学的に活性な化合物との重量比が、１：０．０１〜０．２０、好ましくは１：０．０２〜０．１５、より好ましくは１：０．０３〜０．１０である、請求項１または２に記載の方法。
4. エステルポリマーコンジュゲートが、以下の工程：
   （ａ）有機溶媒中でポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とヒドロキシル基末端分子とを反応させる工程、および
   （ｂ）有機溶媒を除去する工程
   を含んでなる方法により得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. エステルポリマーコンジュゲートを精製する工程をさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
6. 工程ａ）の溶液中のポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とヒドロキシル基末端分子との重量比が、１：０．０１〜０．２５、好ましくは１：０．０１５〜０．２、より好ましくは１：０．０５〜０．１２５である、請求項４または５に記載の方法。
7. ヒドロキシル基末端分子が、ポリエチレングリコール１，０００（ＰＥＧ１）、ポリエチレングリコール２，０００（ＰＥＧ２）、ポリエチレングリコール６，０００（ＰＥＧ６）およびポリエチレングリコール１０，０００（ＰＥＧ１０）からなる群より選択されるポリエチレングリコールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ポリオキシエチレンアルキルエーテルが、ポリエチレングリコールメチルエーテルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ポリエチレングリコールメチルエーテルが、メトキシ−ポリエチレングリコール１，０００（ｍＰＥＧ１）、メトキシ−ポリエチレングリコール２，０００（ｍＰＥＧ２）、メトキシ−ポリエチレングリコール６，０００（ｍＰＥＧ６）およびメトキシ−ポリエチレングリコール１０，０００（ｍＰＥＧ１０）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 生物学的に活性な化合物が抗腫瘍薬である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られるナノ粒子。
12. 医学において使用するための、請求項１１に記載のナノ粒子。
13. ｉ）請求項１１に記載の少なくとも１種類のナノ粒子と、ｉｉ）薬学上許容可能な担体またはビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
14. 抗腫瘍薬を含んでなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. ａ）３８％〜４７％の、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
    ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
    ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
    ｄ）１５％〜４０％の糖類、
    を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；
    ａ）３８％〜４７％の、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
    ｂ）３％〜５％のドセタキセル、
    ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
    ｄ）１５％〜４０％の糖類、
    を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物；ならびに
    ａ）３０％〜４０％の、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）とメトキシ−ポリエチレングリコール２，０００とのエステルポリマーコンジュゲート、
    ｂ）０．０８％〜１．５％のカンプトテシン、
    ｃ）０．１％〜０．２％のカルシウム、および
    ｄ）１５％〜４０％の糖類、
    を含んでなる医薬組成物であって、割合は総て組成物の総重量に対する重量によるものである医薬組成物
    からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 医学において使用するための、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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