JP6762282B2 - Phase contrast microscope - Google Patents
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Description
本発明は、凹形状の液面を有する液体と観察対象とが収容された容器に対して、リング状の照明光を照射して観察対象の位相差像を結像する位相差顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a phase contrast microscope that irradiates a container containing a liquid having a concave liquid surface and an observation object with a ring-shaped illumination light to form a phase contrast image of the observation object. is there.
近年、幹細胞などの培養された透明な細胞を非染色に観察する方法として位相差計測が広く使われ始めている。そして、このような位相差計測を行うものとして位相差顕微鏡が使用されている。 In recent years, phase difference measurement has begun to be widely used as a method for observing cultured transparent cells such as stem cells without staining. A phase-contrast microscope is used to perform such phase-contrast measurement.
一般的な位相差顕微鏡においては、リング状の照明光が観察対象に照射され、観察対象を通過した直接成分の光と回折成分の光が位相板に入射される。そして、直接成分の光は位相板のリング部分によって減光され、回折成分の光は位相板の透明な部分を通過し、この直接成分の光と回折成分の光とが結像されることによって明暗のコントラストのついた像を撮像することができる。 In a general phase contrast microscope, a ring-shaped illumination light is applied to an observation target, and light of a direct component and light of a diffraction component that have passed through the observation target are incident on the phase plate. Then, the light of the direct component is dimmed by the ring portion of the phase plate, the light of the diffraction component passes through the transparent portion of the phase plate, and the light of the direct component and the light of the diffraction component are imaged. It is possible to capture an image with contrast between light and dark.
ここで、位相差顕微鏡によって培養液中の細胞などを観察する場合、培養液の表面張力の影響によって培養液の液面にメニスカスが形成される。そして、このメニスカスのレンズ作用によってリング状の照明光の光路がずれてしまい、位相板に入射される直接成分の光と回折成分の光とに影響を及ぼして明瞭な位相差画像が得られない問題がある。 Here, when observing cells or the like in the culture solution with a phase contrast microscope, meniscus is formed on the liquid surface of the culture solution due to the influence of the surface tension of the culture solution. Then, the optical path of the ring-shaped illumination light is shifted by the lens action of this meniscus, which affects the light of the direct component and the light of the diffraction component incident on the phase plate, and a clear phase difference image cannot be obtained. There's a problem.
そこで、たとえば特許文献１には、メニスカスが形成された液面に対向させて平凸レンズを設け、この平凸レンズによって照明光の光路を補正することが提案されている。 Therefore, for example, Patent Document 1 proposes to provide a plano-convex lens so as to face the liquid surface on which the meniscus is formed, and to correct the optical path of the illumination light by the plano-convex lens.
しかしながら、後で詳述するが、発明者の検討結果によれば、平凸レンズを設けただけでは、視野中心近傍の位相差画像を補正することは可能であるが、周辺部については、コントラストが低く、位相差観察を行うことが難しいことがわかった。 However, as will be described in detail later, according to the results of the study by the inventor, it is possible to correct the phase-contrast image near the center of the field of view only by providing the plano-convex lens, but the contrast is high in the peripheral portion. It was found that it was low and it was difficult to observe the phase contrast.
また、特許文献２および特許文献３にも、光路中に補正レンズを設け、その補正レンズの焦点距離を調整することによってメニスカスの影響を抑制することが開示されているが、このような焦点距離の調整だけでは、特許文献１に記載の方法と同様に、補正できる範囲が限定的であり、特に視野周辺部分の位相差画像のコントラストを向上させることは難しい。 Further, Patent Document 2 and Patent Document 3 also disclose that a correction lens is provided in the optical path and the influence of meniscus is suppressed by adjusting the focal length of the correction lens. Such a focal length Similar to the method described in Patent Document 1, the range that can be corrected is limited only by the adjustment of the above, and it is particularly difficult to improve the contrast of the phase difference image in the peripheral portion of the visual field.
本発明は、上記の問題に鑑み、容器内の液体の液面に形成されたメニスカスの影響を抑制し、位相差画像のコントラストを向上させることができる位相差顕微鏡を提供することを目的とする。 In view of the above problems, it is an object of the present invention to provide a phase contrast microscope capable of suppressing the influence of meniscus formed on the liquid surface of a liquid in a container and improving the contrast of a phase contrast image. ..
本発明の位相差顕微鏡は、容器内に満たされた凹形状の液面を有する液体内の観察対象に対して、リング状の照明光を出射する照明光出射部と、照明光を観察対象に向かって収束させるコンデンサレンズと、液体の液面とコンデンサレンズとの間に配置された光路補正レンズと、観察対象に対向して設けられた対物レンズと、観察対象を通過した照明光の位相を変化させる位相リングが形成された位相板とを備え、光路補正レンズが、観察対象側に凸面を有し、光軸から離れるほど屈折力が増大するメニスカスレンズであって、かつ観察対象を通過した照明光の非点収差を発生させることによって、観察対象を通過した照明光の直接成分を、位相板の位置において位相リングの周方向に延びた分布とする。 The phase difference microscope of the present invention uses an illumination light emitting portion that emits ring-shaped illumination light and an illumination light as an observation target for an observation target in a liquid having a concave liquid surface filled in the container. The phases of the illumination light that has passed through the observation target, the condenser lens that converges toward the observation target, the optical path correction lens that is arranged between the liquid surface of the liquid and the condenser lens, and the objective lens that is provided so as to face the observation target. The optical path correction lens is a meniscus lens having a convex surface on the observation target side and the refractive force increases as the distance from the optical axis increases, and has passed through the observation target, with a phase plate on which a phase ring to be changed is formed. By generating the non-point aberration of the illumination light, the direct component of the illumination light that has passed through the observation target has a distribution extending in the circumferential direction of the phase ring at the position of the phase plate.
また、上記本発明の位相差顕微鏡において、光路補正レンズの上記凸面は、非球面であることが好ましい。 Further, in the phase contrast microscope of the present invention, it is preferable that the convex surface of the optical path correction lens is an aspherical surface.
また、上記本発明の位相差顕微鏡において、光路補正レンズの上記凸面と照明光出射部側の面とは、非球面であることが好ましい。 Further, in the phase contrast microscope of the present invention, it is preferable that the convex surface of the optical path correction lens and the surface on the illumination light emitting portion side are aspherical surfaces.
また、上記本発明の位相差顕微鏡において、照明光出射部は、リング状の照明光を形成するスリットを有し、光路補正レンズは、光路補正レンズへの光線の入射角θｉと、上記光線の光路補正レンズからの出射角θｏとが、下式を満たす光学特性を有することが好ましい。
１．０３＜θｏ／θｉ＜１．２５
ただし、上記光線は、スリットの幅方向の中心位置から出射され、観察対象の設置面と光路補正レンズの光軸との交点位置に至る光線である
Further, in the phase difference microscope of the present invention, the illumination light emitting portion has a slit for forming a ring-shaped illumination light, and the optical path correction lens has an angle of incidence θi of a light ray on the optical path correction lens and the above-mentioned light beam. It is preferable that the emission angle θo from the optical path correction lens has optical characteristics that satisfy the following equation.
1.03 <θo / θi <1.25
However, the above-mentioned light ray is a light ray emitted from the center position in the width direction of the slit and reaches the intersection position between the installation surface of the observation target and the optical axis of the optical path correction lens.
本発明の位相差顕微鏡によれば、容器内に満たされた液体の液面とコンデンサレンズとの間に光路補正レンズを設け、その光路補正レンズを、観察対象側に凸面を有し、光軸から離れるほど屈折力が増大するメニスカスレンズとし、かつ観察対象を通過した照明光の非点収差を発生させることによって、観察対象を通過した照明光の直接成分を、位相板の位置において位相リングの周方向に延びた分布とするものとしたので、容器内の液体の液面に形成されたメニスカスの影響を抑制し、位相差画像のコントラストを向上させることができる。なお、光路補正レンズの作用効果については、後で詳述する。 According to the phase contrast microscope of the present invention, an optical path correction lens is provided between the liquid surface of the liquid filled in the container and the condenser lens, and the optical path correction lens has a convex surface on the observation target side and has an optical axis. By using a meniscus lens whose refractive power increases as the distance from the lens increases and by generating astigmatism of the illumination light that has passed through the observation target, the direct component of the illumination light that has passed through the observation target is transferred to the phase ring at the position of the phase plate. Since the distribution is extended in the circumferential direction, the influence of the meniscus formed on the liquid surface of the liquid in the container can be suppressed, and the contrast of the phase-contrast image can be improved. The action and effect of the optical path correction lens will be described in detail later.
以下、本発明の位相差顕微鏡の一実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の位相差顕微鏡１の概略構成を示す模式図である。 Hereinafter, an embodiment of the phase contrast microscope of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic view showing a schematic configuration of the phase contrast microscope 1 of the present embodiment.
本実施形態の位相差顕微鏡１は、観察対象として、たとえば培養された細胞の位相差画像を撮像するものである。具体的には、位相差顕微鏡１は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、スリット板１２と、コンデンサレンズ１３と、光路補正レンズ１４と、結像光学系３０と、撮像部４０とを備えている。 The phase-contrast microscope 1 of the present embodiment captures, for example, a phase-contrast image of cultured cells as an observation target. Specifically, as shown in FIG. 1, the phase-contrast microscope 1 includes a white light source 11 that emits white light, a slit plate 12, a condenser lens 13, an optical path correction lens 14, and an imaging optical system 30. The image pickup unit 40 is provided.
そして、光路補正レンズ１４と結像光学系３０との間に、ステージ６１が設けられている。ステージ６１上には、細胞などの観察対象Ｓおよび培養液Ｃが収容された培養容器６０が設置される。ステージ６１の中央には、矩形の開口が形成されている。この開口を形成する部材の上に培養容器６０が設置され、培養容器６０内の観察対象Ｓの位相差画像が開口を通過するように構成されている。 A stage 61 is provided between the optical path correction lens 14 and the imaging optical system 30. A culture container 60 containing an observation target S such as cells and a culture solution C is installed on the stage 61. A rectangular opening is formed in the center of the stage 61. The culture vessel 60 is installed on the member forming the opening, and the phase difference image of the observation target S in the culture vessel 60 is configured to pass through the opening.
培養容器６０としては、たとえば複数のウェル（本発明の容器に相当する）を有するウェルプレートが用いられるが、これに限らず、シャーレまたはディッシュなどを用いるようにしてもよい。また、培養容器６０に収容される観察対象Ｓとしては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。 As the culture container 60, for example, a well plate having a plurality of wells (corresponding to the container of the present invention) is used, but the culture container 60 is not limited to this, and a petri dish, a dish, or the like may be used. The observation target S housed in the culture vessel 60 includes pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells, nerves induced to differentiate from stem cells, skin, myocardial and liver cells, and skin taken out from the human body. These include cells of the retina, myocardium, blood cells, nerves and organs.
ステージ６１上に設置された培養容器６０は、その底面が観察対象の設置面Ｐであり、設置面Ｐに観察対象Ｓが配置される。培養容器６０内には培養液Ｃが満たされており、この培養液Ｃの液面には、凹形状のメニスカスが形成される。なお、本実施形態においては、培養液中で培養される細胞を観察対象Ｓとしたが、観察対象Ｓとしてはこのような培養液中のものに限らず、水、ホルマリン、エタノール、およびメタノールなどの液体中において固定された細胞を観察対象Ｓとしてもよい。この場合も、容器内のこれらの液体の液面にメニスカスが形成される。 The bottom surface of the culture vessel 60 installed on the stage 61 is the installation surface P to be observed, and the observation target S is arranged on the installation surface P. The culture container 60 is filled with the culture solution C, and a concave meniscus is formed on the liquid surface of the culture solution C. In the present embodiment, the cells cultured in the culture medium are set as the observation target S, but the observation target S is not limited to those in such a culture solution, and water, formalin, ethanol, methanol, etc. The cells fixed in the liquid of the above may be the observation target S. Again, meniscus is formed on the surface of these liquids in the container.
図２は、スリット板１２の具体的な構成を示す図である。スリット板１２は、図２に示すように、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板１２ｂに対して白色光を透過するリング形状のスリット１２ａが設けられたものであり、白色光がスリット１２ａを通過することによってリング状照明光が形成される。なお、本実施形態においては、白色光源１１とスリット板１２とから、本発明の照明光出射部が構成されている。 FIG. 2 is a diagram showing a specific configuration of the slit plate 12. As shown in FIG. 2, the slit plate 12 is provided with a ring-shaped slit 12a that transmits white light to a light-shielding plate 12b that blocks white light emitted from a white light source 11, and is provided with white light. The ring-shaped illumination light is formed by passing through the slit 12a. In the present embodiment, the illumination light emitting portion of the present invention is composed of the white light source 11 and the slit plate 12.
コンデンサレンズ１３は、スリット板１２から出射されたリング状照明光を観察対象Ｓに向かって収束させるものである。 The condenser lens 13 converges the ring-shaped illumination light emitted from the slit plate 12 toward the observation target S.
光路補正レンズ１４は、上述したメニスカスの影響を抑制するために設けられた光学素子である。光路補正レンズ１４は、具体的には、観察対象Ｓ側に凸面１４ａを有し、その光軸から離れるほど屈折力が増大するメニスカスレンズである。さらに光路補正レンズ１４は、観察対象Ｓを通過した照明光の非点収差を発生させるものである。そして、光路補正レンズ１４は、上述したように非点収差を発生させることによって、観察対象Ｓを通過した照明光の直接成分を、後述する位相板３２の位置において、位相リング３２ａの周方向に延びた分布とする光学特性を有するものである。なお、照明光の直接成分とは、観察対象Ｓを通過した光の成分うち、観察対象Ｓによって回折されずに直進する成分のことである。 The optical path correction lens 14 is an optical element provided for suppressing the influence of the meniscus described above. Specifically, the optical path correction lens 14 is a meniscus lens that has a convex surface 14a on the observation target S side and whose refractive power increases as the distance from the optical axis increases. Further, the optical path correction lens 14 generates astigmatism of the illumination light that has passed through the observation target S. Then, the optical path correction lens 14 causes astigmatism as described above to cause the direct component of the illumination light that has passed through the observation target S to be transmitted in the circumferential direction of the phase ring 32a at the position of the phase plate 32 described later. It has optical characteristics that make it an extended distribution. The direct component of the illumination light is a component of light that has passed through the observation target S and travels straight without being diffracted by the observation target S.
本実施形態の光路補正レンズ１４は、観察対象Ｓ側の凸面１４ａおよび白色光源１１側の凹面１４ｂが、非球面に形成されている。なお、光路補正レンズ１４の作用効果については、後で詳述する。 In the optical path correction lens 14 of the present embodiment, the convex surface 14a on the observation target S side and the concave surface 14b on the white light source 11 side are formed on an aspherical surface. The action and effect of the optical path correction lens 14 will be described in detail later.
結像光学系３０は、観察対象Ｓに対向して設けられた対物レンズ３１、位相板３２、および結像レンズ３３を備えている。位相板３２は、観察対象Ｓを通過した照明光の位相差を変化させるものである。図３は、位相板３２の具体的な構成を示す平面図である。位相板３２は、図３に示すように、照明光の波長に対して透明な透明板３２ｂに対して位相リング３２ａを形成したものである。なお、上述したスリット１２ａの大きさは、この位相リング３２ａと共役な関係にある。 The imaging optical system 30 includes an objective lens 31, a phase plate 32, and an imaging lens 33 provided so as to face the observation target S. The phase plate 32 changes the phase difference of the illumination light that has passed through the observation target S. FIG. 3 is a plan view showing a specific configuration of the phase plate 32. As shown in FIG. 3, the phase plate 32 has a phase ring 32a formed on a transparent plate 32b that is transparent to the wavelength of illumination light. The size of the slit 12a described above has a conjugate relationship with the phase ring 32a.
位相リング３２ａは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相板３２に入射された照明光の直接成分の光は、位相リング３２ａを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象Ｓによって回折された回折成分の光は大部分が位相板３２の透明板３２ｂを通過し、その位相および明るさは変化しない。 The phase ring 32a is formed by forming a ring-shaped phase film for shifting the phase of the incident light by 1/4 wavelength and a dimming filter for dimming the incident light. The light of the direct component of the illumination light incident on the phase plate 32 is out of phase by 1/4 wavelength and its brightness is weakened by passing through the phase ring 32a. On the other hand, most of the light of the diffraction component diffracted by the observation target S passes through the transparent plate 32b of the phase plate 32, and its phase and brightness do not change.
位相差観察において、回折成分の光は直接成分の光に比べて位相が、１／４波長だけ遅れることが知られている。そして、上述した位相板３２により直接成分の光にだけ位相変化を与え、回折成分の光との間にトータルで１／２波長の位相差を生じさせることによって（あるいは回折成分の光との間の位相差を無くすことによって）、通常は観察できない位相差を、明暗差として目に見えるようにすることができる。これにより、無色透明で視認性が悪くても位相変化を持つ物体であれば、その構造を観察することが可能となる。直接成分の光と回折成分の光に１／２波長の位相差がある場合には物体光の振幅が打ち消され背景に対して暗くなり（ダークコントラスト）、位相差がない場合には物体光の振幅が足し合わされ背景に対して明るくなる（ブライトコントラスト）。直接成分の光と回折成分の光とでは光量差があるため、位相板３２は直接成分の光と回折成分の光の明るさが概ね一致するように、直接成分の光を減光するように構成されている。 In phase difference observation, it is known that the light of the diffraction component is delayed in phase by 1/4 wavelength as compared with the light of the direct component. Then, the phase plate 32 described above gives a phase change only to the light of the direct component, and causes a phase difference of 1/2 wavelength in total with the light of the diffraction component (or with the light of the diffraction component). (By eliminating the phase difference of), the phase difference that cannot be normally observed can be made visible as a light-dark difference. As a result, it is possible to observe the structure of an object that is colorless and transparent and has a phase change even if it has poor visibility. When there is a phase difference of 1/2 wavelength between the direct component light and the diffracted component light, the amplitude of the object light is canceled and it becomes darker than the background (dark contrast), and when there is no phase difference, the object light The amplitudes are added to make the background brighter (bright contrast). Since there is a difference in the amount of light between the light of the direct component and the light of the diffraction component, the phase plate 32 dims the light of the direct component so that the brightness of the light of the direct component and the light of the diffraction component roughly match. It is configured.
結像レンズ３３は、位相板３２を通過した直接成分の光および回折成分の光が入射され、これらの光を撮像部４０に結像するものである。 The imaging lens 33 receives light of a direct component and light of a diffraction component that have passed through the phase plate 32, and images these lights on the imaging unit 40.
撮像部４０は、結像レンズ３３によって結像された観察対象Ｓの位相差画像を撮像する撮像素子を備えたものである。撮像素子としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどを用いることができる。 The image pickup unit 40 includes an image pickup element that captures a phase difference image of the observation target S imaged by the imaging lens 33. As the image sensor, a CCD (charge-coupled device) image sensor, a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) image sensor, or the like can be used.
ここで、上述した位相差観察におけるメニスカスの影響について、詳細に説明する。図４は、培養容器６０内に培養液Ｃが満たされていない場合における照明光の光路をシミュレーションした結果を示す図である。また、図５は、培養容器６０内に培養液Ｃが満たされ、培養液Ｃの液面にメニスカスが形成されている場合における照明光の光路をシミュレーションした結果を示す図である。 Here, the influence of the meniscus on the above-mentioned phase difference observation will be described in detail. FIG. 4 is a diagram showing a result of simulating the optical path of the illumination light when the culture solution C is not filled in the culture container 60. Further, FIG. 5 is a diagram showing a result of simulating the optical path of the illumination light when the culture solution C is filled in the culture container 60 and the meniscus is formed on the liquid surface of the culture solution C.
位相差観察においては、直接成分の光にだけ位相差を与えることが好ましく、直接成分の光だけが通る光路中に、位相板３２を配置することが好ましい。ここで、図４に示すシミュレーション結果の光路を見ると、対物レンズ３１を通過した後に照明光が集まっているポイントがある。この位置に位相板３２を配置すれば、直接成分の光にだけ位相を付加することが可能である。 In the phase difference observation, it is preferable to give the phase difference only to the light of the direct component, and it is preferable to arrange the phase plate 32 in the optical path through which only the light of the direct component passes. Here, looking at the optical path of the simulation result shown in FIG. 4, there is a point where the illumination light is collected after passing through the objective lens 31. If the phase plate 32 is arranged at this position, it is possible to add the phase only to the light of the direct component.
しかしながら、図５に示すシミュレーション結果の光路を見ると、結像位置が後方（結像レンズ３３側）にずれていて，かつ像の大きさも異なっている。そのため、直接光への位相付加や光量の調整が不十分となり、適切な位相差観察ができなくなる。このように、位相差観察をする場合にはウェルの液面による光路の変化が無視できない。 However, looking at the optical path of the simulation result shown in FIG. 5, the imaging position is shifted to the rear (imaging lens 33 side), and the size of the image is also different. Therefore, the phase addition to the direct light and the adjustment of the light amount become insufficient, and an appropriate phase difference observation cannot be performed. As described above, when observing the phase difference, the change in the optical path due to the liquid level of the well cannot be ignored.
この問題を解消するためには、光路を補正するレンズやそれを駆動する機構などを設けることが考えられる。 In order to solve this problem, it is conceivable to provide a lens for correcting the optical path and a mechanism for driving the lens.
発明者の実験によれば、光路を補正するレンズを設置しない場合には、照明光の直接成分の光は、メニスカスによって光路が変わり、位相板３２が設置された位置において、その光束が位相リング３２ａの環の内側（中心側）に入り込むことがわかった。そこで、光路を補正するレンズとして、平凸レンズを本実施形態の光路補正レンズ１４の代わりに設置すると、直接成分の光の光路を補正でき、リング状の照明光の径を位相リング３２ａの径と一致させることができた。なお、ここではスリット板１２側に球面の凸面を有する平凸レンズを用いた。 According to the experiment of the inventor, when the lens for correcting the optical path is not installed, the optical path of the light of the direct component of the illumination light is changed by the meniscus, and the luminous flux is the phase ring at the position where the phase plate 32 is installed. It was found that it entered the inside (center side) of the ring of 32a. Therefore, if a plano-convex lens is installed instead of the optical path correction lens 14 of the present embodiment as a lens for correcting the optical path, the optical path of the light of the direct component can be corrected, and the diameter of the ring-shaped illumination light is defined as the diameter of the phase ring 32a. I was able to match. Here, a plano-convex lens having a spherical convex surface on the slit plate 12 side was used.
しかしながら、平凸レンズを設置したとしても、直接成分の光の集光位置は、位相リング３２ａの位置からずれたままであり、全ての光を位相リング３２ａに入射させることができなった。発明者は、平凸レンズを設置した場合の直接成分の光の光路をさらに詳細に検討した。観察対象Ｓの設置面Ｐの中心（光軸が通過する位置）から０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．６ｍｍ、および０．８ｍｍの位置を通過した照明光の、位相板３２の位置での分布をシミュレーションによって確認した。図６は、そのシミュレーション結果を示すものである。図６に示すＬ１は、スリット１２ａの径方向について内側の位置から出射された光束の分布を示しており、Ｌ２は、中間の位置から出射された光束の分布を示しており、Ｌ３は、外側の位置から出射された光束の分布を示している。図６に示されるとおり、観察対象Ｓの設置面Ｐの中心付近、すなわち中心から０．２ｍｍまでの領域を通過した光は、多少ぼけて拡散するものの、ほとんどが位相リング３２ａを通過する。これに対し、さらの外側を通過した光は、大きくボケて位相リング３２ａからはみ出すことがわかった。そして、このために、視野中心から０．２ｍｍ程度までは良好な位相差観察ができるのに対して、それよりも外側では、位相差画像のコントラストが低下することがわかった。 However, even if the plano-convex lens is installed, the light condensing position of the direct component remains deviated from the position of the phase ring 32a, and all the light cannot be incident on the phase ring 32a. The inventor examined the optical path of the light of the direct component when the plano-convex lens was installed in more detail. Illumination light that has passed 0.2 mm, 0.4 mm, 0.6 mm, and 0.8 mm from the center of the installation surface P of the observation target S (the position where the optical axis passes) at the position of the phase plate 32. The distribution was confirmed by simulation. FIG. 6 shows the simulation result. L1 shown in FIG. 6 shows the distribution of the luminous flux emitted from the inner position in the radial direction of the slit 12a, L2 shows the distribution of the luminous flux emitted from the intermediate position, and L3 shows the distribution of the luminous flux emitted from the outer position. The distribution of the luminous flux emitted from the position of is shown. As shown in FIG. 6, the light that has passed through the vicinity of the center of the installation surface P of the observation target S, that is, the region from the center to 0.2 mm is slightly blurred and diffused, but most of the light passes through the phase ring 32a. On the other hand, it was found that the light that passed through the outside was greatly blurred and protruded from the phase ring 32a. For this reason, it was found that good phase difference observation can be performed up to about 0.2 mm from the center of the field of view, whereas the contrast of the phase difference image decreases outside that.
そこで、本実施形態の位相差顕微鏡においては、上述したような実験結果などを踏まえて、上述した光路補正レンズ１４を用いて、照明光の光路を補正するようにした。本実施形態の光路補正レンズ１４は、上述したように、観察対象Ｓ側に非球面の凸面１４ａを有し、その光軸から離れるほど屈折力が増大するメニスカスレンズであり、観察対象Ｓを通過した照明光の非点収差を発生させる。そして、光路補正レンズ１４は、非点収差を発生させることによって、観察対象Ｓを通過した照明光の直接成分を、位相板３２の位置において、位相リング３２ａの周方向に延びた分布とする光学特性を有するものである。 Therefore, in the phase contrast microscope of the present embodiment, the optical path of the illumination light is corrected by using the optical path correction lens 14 described above based on the above-mentioned experimental results and the like. As described above, the optical path correction lens 14 of the present embodiment is a meniscus lens having an aspherical convex surface 14a on the observation target S side and the refractive power increases as the distance from the optical axis increases, and passes through the observation target S. Generates astigmatism of the illuminated illumination light. Then, the optical path correction lens 14 causes astigmatism to cause the direct component of the illumination light that has passed through the observation target S to be distributed at the position of the phase plate 32 in the circumferential direction of the phase ring 32a. It has characteristics.
図７は、本実施形態の光路補正レンズ１４を設置した場合において、観察対象Ｓの設置面Ｐの中心（光軸が通過する位置）から０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．６ｍｍ、および０．８ｍｍの位置を通過した光の、位相板３２の位置での分布を確認した結果である。図７に示すＬ１は、スリット１２ａの径方向について内側の位置から出射された光束の分布を示しており、Ｌ２は、中間の位置から出射された光束の分布を示しており、Ｌ３は、外側の位置から出射された光束の分布を示している。図７に示すように、光路補正レンズ１４によって非点収差を発生させることによって、照明光の直接成分が、位相リング３２ａの周方向に延びた分布となっている。そして、これにより、少なくとも、観察対象Ｓの設置面Ｐの中心から０．６ｍｍの範囲までは、照明光の直接成分のほとんどを位相リング３２ａ内に入射させることが可能となっている。これによりメニスカスによる光路変化に起因するボケを抑制することができ、位相差画像のコントラストを向上させることができる。 FIG. 7 shows 0.2 mm, 0.4 mm, 0.6 mm, and 0 from the center of the installation surface P of the observation target S (the position where the optical axis passes) when the optical path correction lens 14 of the present embodiment is installed. This is the result of confirming the distribution of the light passing through the position of 0.8 mm at the position of the phase plate 32. L1 shown in FIG. 7 shows the distribution of the luminous flux emitted from the inner position in the radial direction of the slit 12a, L2 shows the distribution of the luminous flux emitted from the intermediate position, and L3 shows the distribution of the luminous flux emitted from the outer position. The distribution of the luminous flux emitted from the position of is shown. As shown in FIG. 7, astigmatism is generated by the optical path correction lens 14, so that the direct component of the illumination light has a distribution extending in the circumferential direction of the phase ring 32a. As a result, most of the direct components of the illumination light can be incident on the phase ring 32a at least up to a range of 0.6 mm from the center of the installation surface P of the observation target S. As a result, blurring caused by the change in the optical path due to the meniscus can be suppressed, and the contrast of the phase difference image can be improved.
図８は、本実施形態の光路補正レンズ１４を用いた場合における照明光の直接成分の光路をシミュレーションした結果を示す図である。図８に示すように、本実施形態の光路補正レンズ１４を用いることによって、照明光の直接成分を、位相板３２の位置において、位相リング３２ａ内に集光させることができる。 FIG. 8 is a diagram showing a result of simulating an optical path of a direct component of illumination light when the optical path correction lens 14 of the present embodiment is used. As shown in FIG. 8, by using the optical path correction lens 14 of the present embodiment, the direct component of the illumination light can be focused in the phase ring 32a at the position of the phase plate 32.
なお、本実施形態の光路補正レンズ１４は、上述したように観察対象Ｓ側の凸面１４ａおよび白色光源１１側の凹面１４ｂの両方が、非球面で形成されているので、光路補正の能力を向上させることができる。ただし、この構成に限らず、いずれか一方の面のみを非球面としてもよい。 In the optical path correction lens 14 of the present embodiment, as described above, both the convex surface 14a on the observation target S side and the concave surface 14b on the white light source 11 side are formed of aspherical surfaces, so that the optical path correction capability is improved. Can be made to. However, the present invention is not limited to this configuration, and only one of the surfaces may be an aspherical surface.
また、光路補正レンズ１４は、図９に示すように、光路補正レンズ１４への光線の入射角θｉと、その光線の光路補正レンズ１４からの出射角θｏとが、下式を満たす光学特性を有することが好ましい。
１．０３＜θｏ／θｉ＜１．２５
ただし、上記光線は、スリット１２ａの幅方向の中心位置から出射され、観察対象Ｓの設置面Ｐと光路補正レンズ１４の光軸との交点位置に至る光線である。
Further, as shown in FIG. 9, the optical path correction lens 14 has optical characteristics in which the incident angle θi of the light beam on the optical path correction lens 14 and the emission angle θo of the light ray from the optical path correction lens 14 satisfy the following equation. It is preferable to have.
1.03 <θo / θi <1.25
However, the light beam is a light ray emitted from the center position in the width direction of the slit 12a and reaches the intersection position between the installation surface P of the observation target S and the optical axis of the optical path correction lens 14.
また、上記実施形態においては、結像光学系３０によって結像された位相差画像を撮像部４０によって撮像するようにしたが、撮像部４０を設けることなく、結像光学系３０によって結像された観察対象の位相差像をユーザが直接観察できるように観察光学系などを設けるようにしてもよい。 Further, in the above embodiment, the phase difference image formed by the imaging optical system 30 is imaged by the imaging unit 40, but the image is formed by the imaging optical system 30 without providing the imaging unit 40. An observation optical system or the like may be provided so that the user can directly observe the phase difference image of the observation target.
次に、本実施形態の位相差顕微鏡の具体的な実施例について説明する。ただし、本実施形態の位相差顕微鏡は、以下に説明する実施例のみに限定されるものではない。図１０は、本実施例の位相差顕微鏡の構成を示す図である。なお、図１０は模式図であり、各光学系の形状および大きさ並びに光学系間の距離については正確なものではない。 Next, a specific example of the phase contrast microscope of the present embodiment will be described. However, the phase contrast microscope of this embodiment is not limited to the examples described below. FIG. 10 is a diagram showing a configuration of a phase contrast microscope of this embodiment. Note that FIG. 10 is a schematic view, and the shape and size of each optical system and the distance between the optical systems are not accurate.
（実施例１）
スリット板１２のスリット幅Ｓｗは０．６５ｍｍ、スリット外径Ｓｄｏは１０．６ｍｍ、およびスリット内径Ｓｄｉは９．９５ｍｍである。また、コンデンサレンズは、Ｎｉｋｏｎ社製、ＥＬＷＤ ＰＨ１であり、ｆ＝５０ｍｍ、ＮＡ＝０．３である。
(Example 1)
The slit width Sw of the slit plate 12 is 0.65 mm, the slit outer diameter Sdo is 10.6 mm, and the slit inner diameter Sdi is 9.95 mm. The condenser lens is ELWD PH1 manufactured by Nikon Corporation, and has f = 50 mm and NA = 0.3.
培養容器６０は、培養容器６０内の培養液Ｃの液面Ｃｓの曲率半径Ｒは５ｍｍである。なお、培養液Ｃの液面Ｃｓの曲率半径Ｒは５ｍｍに限られるものではなく、４ｍｍ〜７ｍｍであることが好ましい。培養容器６０としては、例えばCorning International，Inc.製の９６ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き（型番：３５９８）を用いることができる。 In the culture vessel 60, the radius of curvature R of the liquid surface Cs of the culture solution C in the culture vessel 60 is 5 mm. The radius of curvature R of the liquid surface Cs of the culture solution C is not limited to 5 mm, and is preferably 4 mm to 7 mm. As the culture vessel 60, for example, a 96-well multiple well plate with a flat bottom lid (model number: 3598) manufactured by Corning International, Inc. can be used.
対物レンズ３１は、Ｎｉｋｏｎ社製、ＣＦＩ Ｐｌａｎ Ｆｌｏｕｒ ＤＬ １０倍であり、ｆ＝２０ｍｍ、ＮＡ＝０．３である。 The objective lens 31 is manufactured by Nikon Corporation and has a CFI Plan Floor DL of 10 times, f = 20 mm, and NA = 0.3.
位相リング３２ａの内径Ｐｄｉは４．１１ｍｍであり、外径Ｐｄｏは４．８２ｍｍであり、位相リング３２ａの幅Ｐｗは０．７１ｍｍである。 The inner diameter Pdi of the phase ring 32a is 4.11 mm, the outer diameter Pdo is 4.82 mm, and the width Pw of the phase ring 32a is 0.71 mm.
結像レンズ３３は、Ｎｉｋｏｎ社製、ＭＸＡ２０６９６であり、ｆ＝２００ｍｍである。 The imaging lens 33 is MXA20696 manufactured by Nikon Corporation, and f = 200 mm.
そして、コンデンサレンズ１３の観察対象側の先端から観察対象の設置面までの作動距離ＷＤ１は７５ｍｍであり、光路補正レンズ１４の観察対象側の先端から培養容器６０の上面までの作動距離ＷＤ２は１１ｍｍ以上で、位相リング３２ａを通過する光が最も多くなるように調整した。また、培養容器６０（ウェル）の深さＷｄｐは１０．６７ｍｍであり、培養容器６０の底部の厚さＷｔｈは１．２７ｍｍであり、培養液Ｃの深さＳｄｐは３ｍｍであり、観察対象の設置面Ｐから対物レンズ３１の観察対象側の先端までの距離ＷＤ３は１５．２ｍｍである。 The working distance WD1 from the tip of the condenser lens 13 on the observation target side to the installation surface of the observation target is 75 mm, and the working distance WD2 from the tip of the optical path correction lens 14 on the observation target side to the upper surface of the culture vessel 60 is 11 mm. With the above, the light passing through the phase ring 32a is adjusted to be the largest. Further, the depth Wdp of the culture vessel 60 (well) is 10.67 mm, the thickness Wth of the bottom of the culture vessel 60 is 1.27 mm, and the depth Sdp of the culture solution C is 3 mm. The distance WD3 from the installation surface P to the tip of the objective lens 31 on the observation target side is 15.2 mm.
図１１は、図１０に示す光路補正レンズ１４の具体的な構成を示す図である。本実施例の光路補正レンズ１４の材料はＰＭＭＡ（Polymethyl methacrylate）であり、ｄ線（波長５８７．６ｎｍ）に対する屈折率Ｎｄは１．４９１７５６であり、ｄ線（波長５８７．６ｎｍ）に対するアッベ数νｄは５７．４４である。 FIG. 11 is a diagram showing a specific configuration of the optical path correction lens 14 shown in FIG. The material of the optical path correction lens 14 of this embodiment is PMMA (Polymethylcrylic), the refractive index Nd with respect to the d line (wavelength 587.6 nm) is 1.491756, and the Abbe number νd with respect to the d line (wavelength 587.6 nm). Is 57.44.
また、凹面１４ｂの直径Ｌｄ１は１３ｍｍであり、凸面１４ａの直径Ｌｄ２は１７．４ｍｍであり、厚さＬｔは１５ｍｍである。図１１に示すＡＸは光軸であり、光軸ＡＸ上における凸面１４ａの曲率半径は１４．９ｍｍであり、凹面１４ｂの曲率半径は１２．８ｍｍである。 The diameter Ld1 of the concave surface 14b is 13 mm, the diameter Ld2 of the convex surface 14a is 17.4 mm, and the thickness Lt is 15 mm. AX shown in FIG. 11 is an optical axis, the radius of curvature of the convex surface 14a on the optical axis AX is 14.9 mm, and the radius of curvature of the concave surface 14b is 12.8 mm.
また、下表１は、凹面１４ｂと凸面１４ａの非球面係数に関するデータである。表１の非球面係数の数値の「Ｅ±ｎ」（ｎ：整数）は「×１０±ｎ」を意味する。非球面係数は、下記式で表される非球面式におけるＡＳＰ2iの値である。
ただし、
ΔＺ：非球面深さ（高さｈの非球面上の点から、非球面頂点が接する光軸に垂直な平面に下ろした垂線の長さ）
ｈ：高さ（光軸からの距離）
ｒ：曲率半径
κ：円錐形数
ＡＳＰ2i：２ｉ次の非球面係数
Table 1 below shows data on the aspherical coefficients of the concave surface 14b and the convex surface 14a. The numerical value “E ± n” (n: integer) of the aspherical coefficient in Table 1 means “× 10 ± n ”. The aspherical coefficient is the value of ASP 2i in the aspherical expression represented by the following equation.
However,
ΔZ: Aspherical depth (length of a perpendicular line drawn from a point on the aspherical surface at height h to a plane perpendicular to the optical axis in which the aspherical apex touches)
h: Height (distance from the optical axis)
r: Radius of curvature κ: Number of cones ASP 2i : 2i order aspherical coefficient
図１０に示す構成の位相差顕微鏡において、図１１に示す光路補正レンズ１４を用いてことによって、照明光の直接成分を、図７および図８に示すような分布とすることができた。 By using the optical path correction lens 14 shown in FIG. 11 in the phase contrast microscope having the configuration shown in FIG. 10, the direct components of the illumination light could be distributed as shown in FIGS. 7 and 8.
（実施例２）
実施例２の位相差顕微鏡は、スリット板１２および光路補正レンズ１４の構成が異なる以外は、実施例１の位相差顕微鏡と同様である。
(Example 2)
The phase-contrast microscope of Example 2 is the same as the phase-contrast microscope of Example 1 except that the configurations of the slit plate 12 and the optical path correction lens 14 are different.
実施例２のスリット板１２のスリット幅Ｓｗは０．６０ｍｍ、スリット外径Ｓｄｏは１０．３ｍｍ、およびスリット内径Ｓｄｉは９．７ｍｍである。 The slit width Sw of the slit plate 12 of the second embodiment is 0.60 mm, the slit outer diameter Sdo is 10.3 mm, and the slit inner diameter Sdi is 9.7 mm.
図１２は、実施例２の光路補正レンズ１４の具体的な構成を示す図である。実施例２の光路補正レンズ１４の材料はＰＭＭＡであり、ｄ線（波長５８７．６ｎｍ）に対する屈折率Ｎｄは１．４９１７５６であり、ｄ線（波長５８７．６ｎｍ）に対するアッベ数νｄは５７．４４である。 FIG. 12 is a diagram showing a specific configuration of the optical path correction lens 14 of the second embodiment. The material of the optical path correction lens 14 of Example 2 is PMMA, the refractive index Nd for d-line (wavelength 587.6 nm) is 1.491756, and the Abbe number νd for d-line (wavelength 587.6 nm) is 57.44. Is.
また、凹面１４ｂの直径Ｌｄ１は１４ｍｍであり、凸面１４ａの直径Ｌｄ２は１６ｍｍであり、厚さＬｔは１０ｍｍである。図１２に示すＡＸは光軸であり、光軸ＡＸ上における凸面１４ａの曲率半径は１８．６ｍｍであり、凹面１４ｂの曲率半径は１２ｍｍである。 The concave surface 14b has a diameter Ld1 of 14 mm, the convex surface 14a has a diameter Ld2 of 16 mm, and a thickness Lt of 10 mm. AX shown in FIG. 12 is an optical axis, the radius of curvature of the convex surface 14a on the optical axis AX is 18.6 mm, and the radius of curvature of the concave surface 14b is 12 mm.
また、下表２は、実施例２の光路補正レンズ１４の凹面１４ｂと凸面１４ａの非球面係数に関するデータである。なお、非球面式については、１４次項がないこと以外は、実施例１と同様である。
図１３は、実施例２の光路補正レンズ１４を用いた場合において、観察対象の設置面Ｐの中心から０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．６ｍｍ、および０．８ｍｍの位置を通過した光の、位相板３２の位置での分布を確認した結果である。図１３に示すように、実施例２の場合、スリット板１２のスリット幅Ｓｗを実施例１よりも狭くすることによって、位相板３２の位置での照明光の分布を狭くすることができ、設置面Ｐの中心から０．８ｍｍの範囲までの光束をほぼ位相リング３２ａ内に収めることができた。これにより、視野中心から半径０．８ｍｍの領域で、コントラストが良好な位相差観察が可能であった。 FIG. 13 shows the light passing through the positions of 0.2 mm, 0.4 mm, 0.6 mm, and 0.8 mm from the center of the installation surface P to be observed when the optical path correction lens 14 of the second embodiment is used. This is the result of confirming the distribution at the position of the phase plate 32. As shown in FIG. 13, in the case of the second embodiment, the distribution of the illumination light at the position of the phase plate 32 can be narrowed by making the slit width Sw of the slit plate 12 narrower than that of the first embodiment. The luminous flux from the center of the surface P to the range of 0.8 mm could be contained in the phase ring 32a. As a result, phase difference observation with good contrast was possible in a region with a radius of 0.8 mm from the center of the field of view.
１ 位相差顕微鏡
１１ 白色光源
１２ スリット板
１２ａ スリット
１２ｂ 遮光板
１３ コンデンサレンズ
１４ 光路補正レンズ
１４ａ 凸面
１４ｂ 凹面
３０ 結像光学系
３１ 対物レンズ
３２ 位相板
３２ａ 位相リング
３２ｂ 透明板
３３ 結像レンズ
４０ 撮像部
６０ 培養容器
６１ ステージ
Ｃ 培養液
Ｃｓ 液面
Ｌｄ１ 凹面の直径
Ｌｄ２ 凸面の直径
Ｐ 設置面
Ｐｄｉ 位相リングの内径
Ｐｄｏ 位相リングの外径
Ｐｗ 位相リングの幅
Ｓ 観察対象
Ｓｄｉ スリット内径
Ｓｄｏ スリット外径
Ｓｗ スリット幅
ＷＤ１ 作動距離
ＷＤ２ 作動距離
ＷＤ３ 距離
θｉ 入射角
θｏ 出射角
1 Phase difference microscope 11 White light source 12 Slit plate 12a Slit 12b Shading plate 13 Condenser lens 14 Optical path correction lens 14a Convex surface 14b Concave surface 30 Imaging optical system 31 Objective lens 32 Phase plate 32a Phase ring 32b Transparent plate 33 Imaging lens 40 Imaging unit 60 Culture vessel 61 Stage C Culture solution Cs Liquid level Ld1 Concave diameter Ld2 Convex surface diameter P Installation surface Pdi Phase ring inner diameter Pdo Phase ring outer diameter Pw Phase ring width S Observation target Sdi Slit inner diameter Sdo Slit outer diameter Sw Slit Width WD1 Working distance WD2 Working distance WD3 Distance θi Incident angle θo Emission angle
Claims (4)
前記照明光を前記観察対象に向かって収束させるコンデンサレンズと、
前記液体の液面と前記コンデンサレンズとの間に配置された光路補正レンズと、
前記観察対象に対向して設けられた対物レンズと、
前記観察対象を通過した前記照明光の位相を変化させる位相リングが形成された位相板とを備え、
前記光路補正レンズが、前記観察対象側に凸面を有し、光軸から離れるほど屈折力が増大するメニスカスレンズであって、かつ前記観察対象を通過した照明光の非点収差を発生させることによって、前記観察対象を通過した照明光の直接成分を、前記位相板の位置において前記位相リングの周方向に延びた分布とする位相差顕微鏡。 An illumination light emitting part that emits ring-shaped illumination light to an observation target in a liquid having a concave liquid surface filled in the container.
A condenser lens that converges the illumination light toward the observation target,
An optical path correction lens arranged between the liquid level of the liquid and the condenser lens,
An objective lens provided facing the observation target and
A phase plate having a phase ring for changing the phase of the illumination light that has passed through the observation target is provided.
The optical path correction lens is a meniscus lens having a convex surface on the observation target side and the refractive power increases as the distance from the optical axis increases, and by generating astigmatism of illumination light passing through the observation target. , A phase contrast microscope in which the direct component of the illumination light that has passed through the observation target has a distribution extending in the circumferential direction of the phase ring at the position of the phase plate.
前記光路補正レンズが、前記光路補正レンズへの光線の入射角θｉと、前記光線の前記光路補正レンズからの出射角θｏとが、下式を満たす光学特性を有する請求項１から３いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
１．０３＜θｏ／θｉ＜１．２５
ただし、前記光線は、前記スリットの幅方向の中心位置から出射され、前記観察対象の設置面と前記光路補正レンズの光軸との交点位置に至る光線である The illumination light emitting portion has a slit for forming the ring-shaped illumination light.
Any one of claims 1 to 3 in which the optical path correction lens has an optical characteristic in which an incident angle θi of a light ray on the optical path correction lens and an emission angle θo of the light ray from the optical path correction lens satisfy the following equation. The phase contrast microscope described in the section.
1.03 <θo / θi <1.25
However, the light ray is a light ray emitted from the center position in the width direction of the slit and reaches the intersection position between the installation surface of the observation target and the optical axis of the optical path correction lens.
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