JP6979687B2 - 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は幹細胞の凝集塊の集団の調製方法に関する。

多能性幹細胞を凝集させて胚様体を形成する方法が知られている（特許文献１）。かかる方法では胚様体（EB, embryoid body）に対して酵素を使用して実質的に細胞を個別化する（請求項９）。個別化された細胞は再凝集する（請求項１８）。かかる方法は多能性幹細胞を内皮細胞に分化させるのに適している。

特表２０１２―５１９００５号公報

Kenji Osafune, Leslie Caron, Malgorzata Borowiak, Rita J Martinez, Claire S Fitz-Gerald, Yasunori Sato, Chad A Cowan, Kenneth R Chien & Douglas A Melton, "Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines", Nature Biotechnology, Published online: 17 February 2008, 26, 313-315

上記方法では大量の胚様体を用意するために胚様体を破砕して複数の細胞塊を形成し、かかる細胞塊をそれぞれ成育して新たな胚様体とする。しかしながら、通常、胚様体には既に分化を始めた細胞も含まれる。したがって、上記方法は、多能性幹細胞の凝集塊の未分化の状態を実質的な意味で保ったまま、多能性幹細胞の凝集塊を増やす方法としては適していない。

発明者らは発明の過程で以下の考察に至った。非特許文献１は細胞の培養期間によって分化の進行度合いが異なることを示している（非特許文献１のSupplementary Figure 1.）。分化の進行度合いが異なる細胞をそのまま継代すると、継代後に形成される凝集塊に分化の進行度合いが引き継がれる。このため継代を繰り返すごとに凝集塊間における未分化状態の均質性が低下することが予想される。これは、凝集塊の大きさにより分化、未分化の方向性が変化するからであると考えられる。また、かかる現象が生じる理由として、凝集塊内部まで細胞が生存するために必要な栄養が適切に拡散しないことから、凝集塊の中心部に対して係る栄養が供給されないためと考えられる。またガスや不要物の拡散も行われないことも凝集塊の内部の細胞の生存の妨げとなる。また凝集塊が大きくなりすぎると内部から分化をするのみならず、細胞死を起こす恐れがある。一方で凝集塊が小さいままであると拡大培養の効率が悪い。そこで、発明者らは凝集塊の大きさを一定に保ち、継代するタイミングを揃えることが未分化細胞凝集塊の調製とって重要であると考えた。

本発明は上記を踏まえ、幹細胞の凝集塊の集団の調製において、凝集塊間における未分化状態の均質性を高めることを課題とする。

［１］ 二以上の互いに均等な大きさの区画のそれぞれに二以上の細胞塊を分配し、
各前記区画内で前記二以上の細胞塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の細胞塊を凝集させるとともに、成育して凝集塊を形成する、
幹細胞の凝集塊の集団の調製方法であって、
前記分配される前記細胞塊は互いに分離しているとともに互いに混合されており、
前記細胞塊はそれぞれ幹細胞で構成されている、
幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［２］ 前記形成した凝集塊を分解して細胞塊を生成し、
相異なる前記凝集塊から生成された前記細胞塊を互いに混合し、
二以上の区画のそれぞれに二以上の前記混合された細胞塊を分配し、
各前記区画内で前記二以上の混合された細胞塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の細胞塊を再び凝集させる、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［３］ 前記凝集塊の直径が１ｍｍ以下である時点で前記凝集塊を分解する、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［４］ 前記成育の際、前記凝集塊を２日以上かつ１４日以下の期間、成育する、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［５］ 前記成育の際、前記凝集塊を３日以上かつ７日以下の期間、成育する、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［６］ 前記凝集塊を分解し、前記細胞塊を混合し、接近させ、分配し、再び凝集させることをさらに１回又は２回以上繰り返す、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［７］ 前記幹細胞を平面培養してコロニーを形成し、
前記コロニーを分解して前記細胞塊を生成し、
前記生成した前記細胞塊を互いに混合し、
前記細胞塊を前記分配に用いる、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［８］ 前記コロニーを物理的な破砕により前記分解し、
前記コロニーに対して酵素処理を行わない、
［７］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［９］ 前記コロニーを酵素処理のみにより前記分解し、
前記コロニーに対して物理的な破砕を行わない、
［７］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１０］ 前記コロニーを分解する際、
前記コロニーに対して、酵素処理及び物理的な破砕を行う、
［７］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１１］ 前記区画はプレートの有する孔によって形成され、
前記孔は貫通孔又は凹部であり、
前記孔は前記プレートの有する頂面の側に頂部開口を有し、
前記頂部開口は前記区画間で互いに等しい面積を有し、
前記頂部開口の直径は１．５ｍｍ以下である。
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１２］ 前記区画はプレートの有する貫通孔によって形成され、
前記貫通孔は前記プレートの有する底面の側に底部開口を有し、
底部開口の直径が１ｍｍ以下であり、
前記凝集塊に前記底部開口を通過させることで前記プレートから前記凝集塊を回収する、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１３］ 前記細胞塊は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
前記培養液は液滴を形成しており、
前記液滴は前記底部開口に付着するとともに前記底部開口より垂れ下がるように突出し、
前記区画の底面は前記液滴のメニスカスで形成されている、
［１２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１４］ 前記区画の内接球の直径は５×１０^１μｍ以上かつ１×１０^３μｍ以下であり、
前記内接球は前記区画の有する底面に接する、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１５］ 前記細胞塊は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
前記培養液は前記区画の頂部を介して、貯留区画に配置された培養液とつながっており、
前記貯留区画の前記培養液の中には細胞が配置されない、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１６］ 前記区画はプレートの有する孔によって形成され、
前記孔は貫通孔又は凹部であり、
前記孔は前記プレートの有する頂面の側に頂部開口を有し、
前記分配の際、前記細胞塊の懸濁液で前記頂面を覆う、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１７］ 前記懸濁液には前記頂面の単位面積（１ｃｍ^２）当たり、１個以上かつ５０００個以下の細胞塊が含まれている、
［１６］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１８］ 前記細胞塊は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
前記培養液には細胞外マトリックスが懸濁している、又は溶解している。
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［１９］ 幹細胞から凝集塊を形成し、
前記凝集塊を浮遊培養又は接着培養しながら前記幹細胞を分化させる、
細胞培養方法であって、
前記凝集塊を形成する際、
二以上の互いに均等な大きさの区画のそれぞれに二以上の細胞塊を分配し、
各前記区画内で前記二以上の細胞塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の細胞塊を凝集させるとともに、成育して凝集塊を形成し、
前記分配前において前記細胞塊が互いに分離しているとともに互いに混合されており、
前記細胞塊はそれぞれ幹細胞で構成されている、
細胞培養方法。
［２０］ さらに前記区画内において、前記凝集塊中の細胞を外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のいずれかに分化させる、
［１９］に記載の細胞培養方法。
［２１］ 凝集塊の集団であって、
前記集団より前記凝集塊を１個選択し；
前記選択した凝集塊より10個以上の細胞を選択し；
前記10個以上の細胞に対してNanog、Oct3/4及びTRA-1-60の少なくともいずれか一つの多能性幹細胞マーカーが陽性であるか否か判定することで陽性率を計測し；
かかる陽性率の計測を前記集団に対して３回行ったとき；
３回の陽性率の平均が８０％以上である、
凝集塊の集団。
［２２］ 前記集団より10個の凝集塊を選択し、
前記選択された10個の凝集塊に対してNanog、Oct3/4及びTRA-1-60の少なくともいずれか一つの多能性幹細胞マーカーが、が陽性であるか否か判定したとき、
前記マーカーの陽性率が80％以上である、
［２１］に記載の凝集塊の集団。
［２３］ 試験管内分化誘導系により前記凝集塊から誘導される胚葉体の割合が80％以上であり、
前記胚葉体は三胚葉の組織が混合された細胞凝集塊である、
［２１］に記載の凝集塊の集団。

本発明により、幹細胞の凝集塊の集団の調製において、凝集塊の大きさを均等化することができる。したがって本発明は凝集塊間における未分化状態の均質性を高めることができる。したがって本発明は未分化細胞凝集塊の調製に適する。

凝集塊の集団の調製方法の流れ図である。 培養器を示す断面図である。 細胞塊及びプレートの拡大断面図である。 凝集塊及びプレートの拡大断面図である。 容器及びトレイの分離を示す図である。 容器及び凝集塊の分離を示す図である。 容器及び凝集塊の分離を示す拡大図である。 凝集塊の大きさの分布を示すグラフである。 実施例に係る凝集塊の観察像１である。 実施例に係る凝集塊の観察像２である。 実施例に係る凝集塊の観察像３である。 実施例に係る凝集塊の観察像４である。 ＦＡＣＳの２パラメーターヒストグラムである。 実施例に係る凝集塊から得た細胞の観察像である。 実施例に係る凝集塊の集団の観察像である。 実施例に係る凝集塊の観察像５である。 実施例に係る凝集塊の観察像６である。 ＦＡＣＳの２パラメーターヒストグラムである。 ＦＡＣＳの１パラメーターヒストグラムである。 ＴＲＡ−１−６０の発現強度を表すグラフである。 実施例に係る凝集塊の蛍光観察像である。 実施例に係る凝集塊の蛍光観察像である。 実施例に係る凝集塊の蛍光観察像である。 実施例に係る凝集塊の蛍光観察を数値化したグラフである。

［用語］
本明細書において凝集塊（cell aggregate）の用語は多能性幹細胞で構成されるボール状の細胞塊（block of cells）を表す。凝集塊は球状でもよい。凝集塊は球体でもよい。凝集塊はいわゆるスフェロイドでもよい。スフェロイドをclumpと表す場合がある。凝集塊は浮遊培養によって形成されることが好ましい。凝集塊は未分化の多能性幹細胞を含む細胞塊である。凝集塊はこれを培養した場合に様々な細胞種を生み出す能力を有する細胞塊である。凝集塊は特に100個以上、50,000個以下の細胞からなる細胞塊であることが好ましい。

本明細書において細胞塊（block of cells）とは、細胞が互いに集まって結合しているものである。ただし、以下において細胞塊の用語を用いる場合、特に明示しない限り次のように取り扱う。細胞塊の用語は凝集塊よりも小さい大きさのものを表す。細胞塊の用語は大きさ及び形状においてランダムなものを表す。細胞塊の用語にはコロニー又は凝集塊を分割して形成された塊（aggregate）が含まれる。

本明細書において、集団（population）の用語は、細胞塊又は凝集塊の集合を表す。集団の用語には、一定の体積の液中に保持されている、これらの集合が含まれる。集団は所定の密度を有する。所定の密度は細胞塊又は凝集塊の個数を液の体積で割ったものである。
［概要］

図１は本実施形態に係る多能性幹細胞の凝集塊の集団の調製方法の流れ図を示す。かかる方法ではステップ２１において二以上の互いに均等な大きさの区画（compartments）のそれぞれに二以上の細胞塊（aggregates）を分配する。これにより各区画内で二以上の細胞塊を接近させる。ステップ２２において互いに接近させた二以上の細胞塊を凝集（clumping or assembling）させる。かかる方法により大きさの均等化された凝集塊の集団が得られる結果、未分化状態が均質化された凝集塊の集団が得られる。

その後図１に示すステップ２３−２４を経て凝集塊を得る。ステップ２５でかかる凝集塊を分解することで新たに細胞塊を得る場合がある。さらにステップ２６を経由してステップ２１に戻り、再び細胞塊を分配する場合がある。このように凝集塊内での細胞増殖と、大きくなった凝集塊の破砕と、これらのサイクル化をさらに行う。このため、大きさの均等化された凝集塊が大量に得られる結果、未分化状態が均質化された凝集塊が大量に得られる。

［培養器］

図２は、上記一連のステップを実施するのに好適な培養器２０を示す。培養器２０はプレート３０及び支持体４５を有する容器５０及びトレイ５５を備える。培養器２０で細胞を培養する際、培養器２０は静置されてもよい。

図２に示すプレート３０は孔３１ａ，ｂに代表される孔を備える。図中の孔３１ａ，ｂは貫通孔である。孔３１ａ，ｂは底部開口を有しない凹部でもよい。プレート３０を平面視した時孔３１ａ，ｂに代表される孔は格子を構成している。格子は六角格子、正方格子、及びその他の格子でもよい。図中において孔３１ａ，ｂは培養液３５で満たされている。培養液３５は多能性幹細胞の培養に適するものであればよい。

図２に示す支持体４５は側壁４６及びフランジ４７を備え、側壁４６はプレート３０を及び支持体４５の内腔を取り囲む。プレート３０は支持体４５の内腔の下方に位置する。プレート３０の有する頂面は支持体４５の内腔に面する。側壁４６の下方はプレート３０に接する。側壁４６の下端がプレート３０に接することが好ましい。

図２に示すプレート３０と支持体４５とは一体となって容器５０を形成している。プレート３０と支持体４５とは隙間なく接していることが好ましい。プレート３０と支持体４５とは一体となって容器５０の内腔を取り囲む。プレート３０と支持体４５とは一体に成形されていてもよい。

図２に示す容器５０の内腔は貯留区画３７となっている。貯留区画３７は培養液３５を蓄える。プレート３０の有する頂面及び支持体４５の有する側壁４６の内側面は培養液３５に接している。貯留区画３７は孔３１ａ，ｂの内腔とともに連続する空間を形成している。

図２に示す側壁４６及びプレート３０は一体としてトレイ５５の内腔に挿入可能である。フランジ４７は側壁４６の外側に位置する。トレイ５５は側壁５６及び底部５７を備える。側壁５６はフランジ４７を支持する。フランジ４７は側壁５６の上端に接することが好ましい。トレイ５５はフランジ４７を支持する。トレイ５５は支持体４５を支持する。トレイ５５は容器５０を支持する。底部５７はプレート３０と対向する。底部５７とプレート３０との間には空間５８が設けられている。

図２に示すプレート３０は樹脂成形品であることが好ましい。成形される樹脂はアクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマ塩化ビニル系樹脂、シリコーン樹脂及びシリコン樹脂のいずれかであることが好ましい。これらの樹脂を組み合わせて成形してもよい。プレート３０は金属、ガラスなどの無機物の成形品でもよい。培養器５０の備える他の部材において同様である。

図２に示す孔３１ａ，ｂの表面には改質処理を行うことが好ましい。改質処理はプラズマ処理、コロナ放電及びＵＶオゾン処理の少なくともいずれか一つであることが好ましい。改質処理により上記表面には官能基が形成される。官能基は親水性であることが好ましい。親水性の表面は孔３１ａ，ｂ内への細胞塊の流入をスムーズにする。改質処理は孔３１ａ，ｂの開口部が小さい場合に特に好ましい。改質処理は樹脂が疎水性である場合に特に好ましい。プレート３０の有する頂面及び底面において同様である。

図２に示す孔３１ａ，ｂの表面には所定の物質を被覆してもよい。物質は無機物でもよい。物質は金属でもよい。物質は所定の分子が２、３及び４個以上重合したものでもよい。これらを組み合わせたもので表面を被覆してもよい。被覆後の表面は一定の疎水性を有することが好ましい。一定の疎水性を有する表面により、表面張力の小さい培地を用いた場合でも後述する液滴を形成しやすくなる。プレート３０の有する頂面及び底面において同様である。

図２に示す孔３１ａ，ｂの表面には微細構造を設けてもよい。微細構造はいわゆるナノメートルオーダーであることが好ましい。微細構造の構造単位の大きさは０．１ｎｍ以上、１μｍ以下であることが好ましい。表面に凹凸を設けることで微細構造としてもよい。

［区画］
図３は細胞塊及びプレート３０の拡大図である。細胞塊は所定の区画で培養される。区画３２ａ，ｂに代表される区画はそれぞれ孔３１ａ，ｂに代表される孔で形成される。孔３１ａ，ｂに代表される孔は互いに均等な大きさを有する。本実施形態は、区画３２ａ，ｂが孔３１ａ，ｂだけで構成されていてもよいが、これに限定されない。

図３に示すプレート３０は隔壁２９を有する。各孔は隔壁２９によって互いに分離されている。隔壁２９は、プレート３０の底部から頂部に向かって次第に狭くなっていく。孔３１ａ，ｂはプレート３０の頂部から底部に向かって次第に狭くなっていく。

図３に示す孔３１ａ，ｂはそれぞれプレート３０の有する頂面の側に頂部開口３３ａ，ｂを有する。孔３１ａ，ｂはそれぞれ前記プレートの有する底面の側に底部開口３４ａ，ｂを有する。

図３に示す頂部開口３３ａ，ｂは互いに等しい面積を有することが好ましい。頂部開口３３ａ，ｂに限らず、各孔の有する複数の、好ましくは全ての頂部開口は互いに等しい面積を有することが好ましい。頂部開口が互いに等しい面積を有していることで、一区画当たりの細胞数が平準化される。したがって一区画から一個の凝集塊が形成される場合、凝集塊の大きさを揃えることができる。

図３に示す頂部開口３３ａ，ｂは円形でもよい。頂部開口３３ａ，ｂの直径は２．００ｍｍ、１．５ｍｍ、１．４ｍｍ、１．３ｍｍ、１．２ｍｍ、１．１ｍｍ、１．０ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ及び０．１ｍｍのうちのいずれかの値以下であることが好ましい。

図３に示す頂部開口３３ａ，ｂの直径は１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ及び９０μｍのうちのいずれかの値以上であることが好ましい。

図３に示す頂部開口３３ａ，ｂは三角形、四角形、五角形、六角形、及びその他の多角形並び楕円形でもよい。頂部開口３３ａ，ｂの内接円の直径は上記直径と同様の範囲のものとすることができる。

図３に示す孔３１ａ，ｂが底部開口３４ａ，ｂを有しない場合でも、頂部開口３３ａ，ｂを採用することができる。またその場合でも頂部開口３３ａ，ｂはその効果をもたらすことができる。頂部開口３３ａ，ｂはそれぞれ底部開口３４ａ，ｂよりも大きいことが好ましい。

［細胞塊の分配］

図１に示すステップ２１では図３に示す細胞塊の集団４１を区画３２ａ，ｂに代表される二以上の区画に分配する。集団４１には細胞塊４２ａ−ｃを含む複数の細胞塊が含まれる。集団４１は懸濁液３８に含まれることが好ましい。懸濁液３８中では細胞塊４２ａ−ｃが偏りなく分散している。集団４１では小さい細胞塊４２ａや大きい細胞塊４２ｃが混合されている。懸濁液３８は集団４１とともに、実質的に個別化されたシングルセル（single cell(s)）を含んでいても良い。懸濁液３８における細胞塊を構成する細胞の数と、シングルセルの状態にある細胞の数の合計に対して、シングルセルの状態にある細胞の数の割合が１０％以上、３０％以上、５０％以上、８０％以上、又は９０％以上であっても良い。

分配の際、図３に示す懸濁液３８を、プレート３０の頂面に撒くことが好ましい。懸濁液３８を撒く際には、プレート３０の頂面を覆うことが好ましい。プレート３０の頂面を懸濁液３８で偏りなく覆うことが好ましい。

懸濁液３８を撒く際、懸濁液３８には頂面の単位面積（１ｃｍ^２）当たり、１個以上かつ５０００個以下の細胞塊が含まれていることが好ましい。単位面積当たりの細胞塊の個数は２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，２０００，３０００，４０００及び５０００個のいずれかであることが好ましい。

図３に示す懸濁液３８を撒く方法は、懸濁液３８を各区画に個別に分注する方法よりも効率的である。懸濁液３８は重力に従い沈降し区画３２ａ，ｂに入る。したがって細胞塊４２ａ−ｃを含む懸濁液３８はランダムに各区画に分配される。さらに細胞塊を区画３２ａ，ｂ内に沈降させる。沈降により、分散していた細胞塊が、貯留区画３７を離れ、各区画３２ａ，ｂ内に集結する。これにより細胞塊を互いに接近させる。

図３に示す隔壁２９は、プレート３０の頂部に近づくに従って狭くなることが好ましい。隔壁２９の断面は、プレート３０の頂部近傍において上に凸の形状でもよい。かかる形状は半円でも、三角形でもよい。

図３に示す懸濁液３８を構成する分散媒は区画３２ａ，ｂを満たすとともに、貯留区画３７に配置される。懸濁液３８の分散媒を培養液３５と同一組成の培養液としてもよい。分配後、貯留区画３７中の分散媒に対してさらに好適な培養液を注ぎ足してもよい。分配後、貯留区画３７中の分散媒を好適な培養液に置き換えてもよい。

図３に示す集団４１中で、分配されるこれらの細胞塊は互いに分離している。これらの細胞塊は互いに混合されている。集団４１には細胞塊４２ａよりも小さな細胞塊４２ｂが含まれている。集団４１には細胞塊４２ａよりも大きな細胞塊４２ｃが含まれている。集団４１の中では大きさの異なる細胞塊が互いに混合されている。

細胞塊４２ａ−ｃはそれぞれ多能性幹細胞（a pluripotent cell）で構成されている。多能性幹細胞はＥＳ細胞でもｉＰＳ細胞でもよい。多能性幹細胞の動物種はヒト及びマウスを初めとする哺乳類動物が挙げられるがこれらに限定されない。ｉＰＳ細胞のソースとなる体細胞は線維芽細胞が挙げられるがこれに限定されない。体細胞はソースとなる個体の体内のいずれの組織から取得してもよい。

図３に示すように細胞塊を区画３２ａ，ｂの中に配置された培養液３５の中で培養する。図中ではかかる細胞塊を代表して細胞塊４２ａ，ｂがこれらの区画に分配されている。培養液３５は液滴３６ａ，ｂを形成している。液滴３６ａ，ｂはそれぞれ底部開口３４ａ，ｂに付着するとともに前記底部開口より垂れ下がるように突出する。液滴３６ａ，ｂはプレート３０の底面側に突出する。本実施形態ではいわゆる懸滴型の培養を行う。

図３に示す区画３２ａ，ｂはそれぞれ頂部開口３３ａ，ｂと、孔３１ａ，ｂの内腔面と、液滴３６ａ，ｂの丸みを帯びた界面とから構成されると理解されてもよい。かかる界面はプレート３０の底面側の空間に面する。区画３２ａ，ｂの底面はそれぞれ液滴３６ａ，ｂのかかる界面で形成されている。界面が丸みを帯びているのは培養液３５の表面張力による。すなわち液滴３６ａ，ｂの界面はメニスカスとなっている。

図３に示すように培養液３５は区画３２ａ，ｂを満たす。区画３２ａ，ｂはそれぞれ孔３１ａ，ｂ内に位置する培養液３５と、液滴３６ａ，ｂと、から構成されると理解されてもよい。言い換えれば細胞塊４２ａ，ｂの培養される区画３２ａ，ｂはプレート３０外の液滴３６ａ，ｂまで連続している。

図３に示す区画３２ａ，ｂの大きさは次のようにすることが好ましい。すなわち区画３２ａ，ｂに内接する内接球の直径を所定の範囲とするのがよい。所定の範囲は５×１０^１μｍ以上かつ１×１０^３μｍ以下である。内接球は仮想の立体である。内接球は区画３２ａ，ｂの底面に接することが好ましい。区画３２ａ，ｂの大きさをかかる通りにすることで凝集塊の形成が促進される。

図３に示す液滴３６ａ，ｂの大きさは、液滴が壊れない限りにおいて任意に決定できる。液滴３６ａ，ｂ内でのみ細胞塊４２ａ，ｂが培養されていてもよい。すなわち細胞塊４２ａ，ｂが孔３１ａ，ｂ内で培養されていなくともよい。

図３に示す液滴３６ａ，ｂが形成されなくともよい。区画３２ａ，ｂがそれぞれ孔３１ａ，ｂ内に位置していてもよい。底部開口３４ａ，ｂを設けない場合がこれに相当する。

図３に示す区画３２ａ，ｂは区画３２ａ，ｂの頂部、すなわち頂部開口３３ａ，ｂを介して、貯留区画３７に接続している。区画３２ａ，ｂ内の培養液３５は、区画３２ａ，ｂの頂部を介して、貯留区画３７に配置された培養液３５とつながっている。貯留区画３７の中には細胞塊４２ａ，ｂを初めとする細胞が配置されない。

図３に示すように培養液が区画３２ａ，ｂと貯留区画３７との間で一体となっていることで以下の利点がある。まず区画３２ａ，ｂと貯留区画３７との間で培養液３５の移動が行われる。このため懸滴型の培養でも細胞塊４２ａ，ｂに十分な栄養を供給することができる。

また図３に示す貯留区画３７には細胞が存在しないので後述する成育中の培養液３５の交換が容易である。また区画３２ａ，ｂにだけ培養液を配置した場合に比べて、培養液３５が多く存在することになるため、培養液３５においてｐＨや温度の変化が起りにくい。

図２に戻る。培養器２０は通常インキュベーター内に設置されるが、運搬のため外気中を移動させられる場合がある。インキュベーター内と外気中とでは酸素濃度及び温度が異なる。したがって培養器２０内の培養液３５が外気の酸素濃度及び温度の影響を受けることがある。

従来のハンギングドロップ法では図２に示す貯留区画３７を用いないため、細胞を取り巻く培養液の液滴にその影響が強く伝わる。このため培養液のｐＨや酸素濃度が急激に変化する。かかる急激な変化は細胞の増殖や機能に影響を及ぼす。さらに、培地交換が困難であるため、栄養分の不足や老廃物を除去できず、細胞の増殖や生存に影響を及ぼす。本実施形態の培養器２０はこのような影響を軽減することができる。

図２に示す培養器２０の奏する効果は、貯留区画３７を形成しているプレート３０に依拠する。培養器２０中の培養液３５は外的環境の変化による影響を受けにくい。したがって細胞塊より形成される凝集塊への影響も小さくなる。

［細胞塊同士の接近］

図３に示す集団４１中で互いに分離していた各細胞塊は、各区画３２ａ，ｂ内に分配されることで、互いに接近する。上述の通り、孔３１ａ，ｂはプレート３０の頂部から底部に向かって次第に狭くなっていくため、接近を促進できる。互いに接近させることで、効率的に細胞塊を凝集させることができる。

［細胞塊の凝集］

図１に示すステップ２２では、図３に示す各区画３２ａ，ｂ内でそれぞれ二以上の細胞塊を凝集させる。一例として細胞塊４２ａを含む二以上の細胞塊を区画３２ａ内で凝集させる。他の一例として細胞塊４２ｂを含む二以上の細胞塊を区画３２ｂ内で凝集させる。

図４は凝集塊４０及びプレート３０の拡大断面図である。細胞塊の凝集の結果、凝集塊４０が各区画３２ａ，ｂ内で形成される。

図３に示す細胞塊４２ｃを含む二以上の細胞塊もまたいずれかの区画内で凝集させる。各区画に分配される細胞塊の大きさは実質的に不規則である。したがって各区画においてそれぞれ不規則な大きさを有する細胞塊の集団を凝集させる。例えば細胞塊４２ａ−ｃのいずれも含む細胞塊の集団を区画内で凝集させてもよい。

上述の通り図１に示すステップ２１では、図３に示すように懸濁液３８を撒くことで集団４１を小分けにして各区画に分配する。かかる分配後に、これらの細胞塊を凝集させる。したがって凝集前の細胞塊の大きさの偏りが軽減される。また上述の通り区画ごとの細胞塊の大きさの分布状態が平準化することもできる。このため、図４に示すように凝集によって各区画で形成される凝集塊４０は均質化される。また凝集塊４０の大きさは均一化される。

図３に示す区画３２ａ，ｂに分配される前において、細胞塊は互いに分離している。そして、分配されることでこれらの細胞塊は接近する。したがって細胞塊が凝集を開始する時期は、上記分配の完了時に揃えられる。細胞塊を互いに分離し、かつ互いに混合するには分配前のピペッティングが好適である。他の方法を利用することもできる。

［凝集塊の成育と凝集塊の回収］

図１に示すステップ２３では図２に示す凝集塊４０を成育する。ステップ２３はステップ２５に示す凝集塊の分解の前に行う。図４は形成された凝集塊及びプレート３０を拡大して示したものである。各区画３２ａ，ｂでの成育により凝集塊４０は大きくなる。ステップ２３とステップ２４により凝集塊を形成する。

かかる形成において図１に示すステップ２２，２３は図３に示す区画３２ａ，ｂ内で同時に進行してもよい。細胞塊４２ａ，ｂが成育するうちに凝集して図４に示す凝集塊４０を形成してもよい。細胞塊４２ａ，ｂが互いに速やかに凝集して凝集塊４０が形成された後に凝集塊４０を成育してもよい。

図１に示すステップ２３において、図４に示す凝集塊４０を２日以上かつ１４日以下の期間、成育する。かかる期間は３〜７日であることが好ましい。凝集塊の直径が所定の値以下である時点で、凝集塊の成育をやめて、ステップ２４に示す回収を行うことが好ましい。

図４に示す４０を含めて、凝集塊の直径は凝集塊の外接球の直径を表す。凝集塊の直径の所定の値は底部開口３４ａ，ｂの直径の３／４以下、好ましくは２／３以下であることが好ましい。

凝集塊の直径の所定の値は１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ及び０．１ｍｍのうちのいずれかの値であることが好ましい。上記の通り凝集塊を回収することでより巨大化し、内部で分化が進んでいる恐れのある凝集塊の混入を予防することができる。

図１に示すステップ２４ではまず図５に示すように容器５０及びトレイ５５を分離する。次に図６に示すようにプレート３０の底面をトレイ６０中の回収液６５に浸す。トレイ６０はトレイ５５と同等のものとしてよい。

図６に示すように凝集塊４０にプレート３０の底面を通過させる。凝集塊４０は培養液３５から、回収液６５に移動する。あるいは培養液３５は凝集塊４０とともにトレイ６０内に流れ出す。かかる作業は重力によってもよく、吸引によってもよい。かかるプロセスによりプレート３０から凝集塊４０を分離する。以上により凝集塊４０を回収液６５中に回収する。回収液６５は培地でも緩衝液でもよい。

なお上述したように図５，６に示す、孔３１ａ，ｂが凹部であれば、プレート３０の底面を通過させることはできない。かかる場合、ピペッティングによって凝集塊４０を回収してもよい。凝集塊４０にプレート３０の底面を通過させる方法は凝集塊４０に対する物理的刺激が少ないのが利点である。かかるマイルドな方法は凝集塊の未分化状態を損なう可能性が小さい。

図７は容器及び凝集塊の分離を拡大して示したものである。凝集塊４３ａ−ｃは凝集塊４０を大きさで分類したものである。凝集塊４３ａは凝集塊４３ｂよりも小さい。凝集塊４３ｃは凝集塊４３ｂよりも大きい。

図７に示すように凝集塊４３ａ，ｂの直径は底部開口３４ａの直径よりも小さい。したがって凝集塊４３ａ，ｂは底部開口３４ａを通過する。上記分離により、かかる凝集塊からなる集団４４ａが得られる。

凝集塊４３ｃの直径は底部開口３４ｂの直径よりも大きい。したがって凝集塊４３ｃは底部開口３４ａ，ｂを通過しない。上記分離により、かかる凝集塊からなる集団４４ｂがプレート３０に残される。

図５に示す凝集塊４０の集団は、図６に示すプレート３０の働きによって、図７に示される集団４４ａと集団４４ｂとに分離される。すなわちプレート３０にはフィルター作用がある。

図８は凝集塊の大きさの分布を示すグラフである。横軸は凝集塊の大きさである。縦軸は凝集塊の数を比で表したものある。集団４４ａに含まれる凝集塊４３ａ，ｂの大きさは、閾値３９よりも小さい。集団４４ｂに含まれる凝集塊４３ｃの大きさは、底部開口３４ａ，ｂの閾値３９よりも大きい。

図８に示す閾値３９は底部開口３４ａ，ｂの直径に依拠する。閾値３９は底部開口３４ａ，ｂの直径に等しい。図７に示すようにプレート３０から分離される凝集塊４３ａ，ｂの大きさの大きさは底部開口３４ａ，ｂの直径で制御することができる。プレート３０は閾値３９をもって凝集塊を篩い分ける。

回収した図７に示す凝集塊４３ａ，ｂの直径は１ｍｍ以下であることが好ましいのは上述の通りである。かかる直径を有する凝集塊は例えば成育期間や成育条件を調整することで実現できる。また上述したフィルター作用により、かかる直径を有する凝集塊４３ａ，ｂを選抜できる。プレート３０のフィルター作用にはさらに下記の好ましい効果が期待できる。

正常な細胞よりも増殖が早い細胞が図３に示す細胞塊４２ａ，ｂに含まれる場合、その細胞塊が凝集してなる凝集塊４０（図４）は通常よりも大きくなる場合がある。かかる増殖速度の変化は例えば細胞の核型異常によって起こる。

核型異常を有する細胞は正常な細胞よりも増殖が早いのみならず、生存率も高い。したがって、同じ大きさの細胞塊を、同じ期間、成育しても、核型異常を有する細胞を含む細胞塊は正常な細胞塊よりも大きくなる。またそのような凝集塊の出現頻度も無視できるものではない。

核型異常を有する細胞は凝集塊に含まれないことが好ましい。なぜなら凝集塊は各種試験や医療などに用いられる可能性があることから、凝集塊が通常の機能を発揮していることが好ましいからである。一方で、上述した成育期間や成育条件を調整しても核型異常は一定の確率で起こり得る。

図７に示すプレート３０のフィルター作用により、凝集塊４３ｃを集団４４ａから排除できる。凝集塊４３ｃは例えば上記核型異常により通常より大きくなった凝集塊と見立てることができる。したがってプレート３０のフィルター作用により核型異常を有する凝集塊を集団４４ａから排除できる。

上記効果を得るために、図７に示す底部開口３４ａ，ｂの直径は１．０ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ及び０．１ｍｍのうちのいずれかの値以下であることが好ましい。

図７に示す底部開口３４ａ，ｂは互いに等しい内接円径を有することが好ましい。底部開口３４ａ，ｂに限らず、各孔の有する複数の、好ましくは全ての底部開口は互いに等しい内接円径を有することが好ましい。底部開口が互いに等しい内接円径を有していることで、回収される凝集塊の大きさの上限を揃えることができる。底部開口はさらに互いに等しい面積を有していることが好ましい。

［凝集塊の分解と細胞塊の混合］

図１に示すステップ２５では回収した凝集塊を分解する。凝集塊の直径が１ｍｍ以下である時点で凝集塊の分解を行うことが好ましい。これにより、後述するように凝集塊をさらに増やす際に、凝集塊の中に分化した細胞が混じらないようにすることができる。言い換えれば、凝集塊間で均質な未分化状態を保つことができる。

分解される凝集塊は図７に示したように回収した集団４４ａに含まれている凝集塊である。凝集塊を分解して、複数の細胞塊を生成する。分解は凝集塊の物理的な破砕により行ってもよい。物理的な破砕はピペッティングにより行ってもよい。分解は酵素処理により行ってもよい。酵素処理した凝集塊を物理的に破砕してもよい。物理的に破砕した凝集塊を酵素処理して細胞塊を生成してもよい。

図１に示すステップ２６では上記細胞塊をさらに互いに混合する。混合される細胞塊は相異なる凝集塊から生成されたものである。混合はピペッティングにより行うことができる。ピペッティングにより破砕を行うことで混合も同時に行うことができる。

［工程のサイクル化］

再び図１に示すステップ２１に戻り、混合された細胞塊の集団４１を図３に示すように二以上の区画３２ａ，ｂに代表される区画に分配する。二以上の区画のそれぞれに二以上の混合された細胞塊を分配する。図２に示す培養器は、新しく用意されたものであることが好ましい。

図１に示すステップ２２では、分配された細胞塊を各区画３２ａ，ｂ内で再び接近させる。互いに接近させた二以上の細胞塊を再び凝集させる。すなわち（凝集）−＞（分解）−＞（凝集）の順で各ステップを実行する。混合された細胞塊を各区画に分配した後に細胞塊を再凝集させることにより、凝集塊間で均質化された凝集塊を、均質化されたまま増やすことができる。

図１に示す流れ図では、ステップ２６からステップ２１に戻る回数に制限が無い。したがって増やした凝集塊を分解し、分解して得た細胞塊を混合し、分配し、接近させ、再び凝集させる上記サイクルをさらに１回又は２回以上繰り返してもよい。

上記方法では（凝集）−＞（分解）−＞（凝集）−＞（分解）−＞（凝集）−＞・・・の順で各ステップを繰り返す。これにより凝集塊間で均質化された凝集塊を、均質化されたまま、さらに増やすことができる。

さらに図１に示す矢印２７で表すように、任意のサイクルでステップ２５を省略してもよい。この場合、上述の通り再びステップ２２で凝集させて形成した凝集塊を、ステップ２５を通じて分解しない。したがってステップ２４からステップ２６に移行することで凝集塊を互いに混合する。

図１に示す矢印２７を経由後、ステップ２６からステップ２１に戻る。ステップ２６で混合された凝集塊を、あたかも図３に示す細胞塊４２ａ−ｃのように、二以上の区画３２ａ，ｂにそれぞれ分配する。各区画内で二以上の混合された凝集塊を互いに接近させる。
ステップ２２では互いに接近させた二以上の凝集塊を各区画３２ａ，ｂ内で凝集させる。

上記方法では例えば（凝集）−＞（分解）−＞（凝集）−＞（凝集）の順で各ステップを実行する。かかる方法により、凝集塊間で均質化された凝集塊を、均質化状態の低下を抑止しつつ、大きくすることができる。

一例において、図１に示すステップ２５は全く実施しなくてもよい。ステップ２６にて、形成した相異なる凝集塊を互いに混合する。ステップ２１に戻り、混合された凝集塊を二以上の区画に分配する。各区画内で二以上の混合された凝集塊を互いに接近させる。ステップ２２にて、互いに接近させた二以上の凝集塊を各区画内でさらに凝集させる。

上記方法では（凝集）−＞（凝集）の順で各ステップを実行する。かかる方法により、凝集塊間で均質化された凝集塊を、均質化状態の低下を抑止しつつ、さらに大きくすることができる。

一例において、上述の通り、図１に示すステップ２５を経ずに大きく形成した凝集塊を、改めてステップ２５で分解してもよい。すなわち、上述のとおり、さらにステップ２２にて、凝集塊を凝集させて形成した凝集塊を、ステップ２５で分解する。大きく形成した凝集塊から上述の細胞塊を生成する。

図１に示すステップ２６にて、相異なる凝集塊から生成された細胞塊を互いに混合する。ステップ２１に戻り、混合された細胞塊を二以上の区画に分配する。各区画内で二以上の混合された凝集塊を互いに接近させる。ステップ２２にて、互いに接近させた二以上の細胞塊を各区画内で再び凝集させる。上記方法では例えば（凝集）−＞（凝集）−＞（分解）−＞（凝集）の順で各ステップを実行する。

［最初の細胞塊の調製］

図１に示すステップ２１にて、凝集塊形成の起点となる細胞塊は任意の方法で調製できる。一例として、多能性幹細胞を平面培養してコロニーを形成してもよい。ステップ２５にならい、かかるコロニーを分解して細胞塊を生成する。ステップ２６にならい、かかる細胞塊を互いに混合する。

かかる細胞塊の集団を図３に示す集団４１として、１回目のステップ２１（図１）において分配に用いる。かかる方法により、平面培養された細胞からでも、凝集塊間で均質化された凝集塊を得ることができる。

上記の通りコロニーを分解する際に、ピペッティングを行ってもよい。酵素処理のみでコロニーを分解してもよい。物理的な破砕のみを行ってもよい。酵素処理及び物理的な破砕の両方をおこなってもよい。

［凝集塊の使用］

上記の通り得られた凝集塊を浮遊培養又は接着培養により培養してもよい。かかる培養において凝集塊中の多能性幹細胞を所定の方法に従い分化させてもよい。所定の方法として例えば試験管内分化誘導系を用いることができる。

本実施形態において、凝集塊は集団として得られる。本実施形態では各サイクルにおいて収集される多能性幹細胞の凝集塊の大きさが、工程全体にわたって均等化されている。したがって、かかる集団では、凝集塊間で均質な未分化状態が保たれている。したがって、本実施形態に係る凝集塊は、上述の通り多能性幹細胞を分化させた時、多能性幹細胞間で分化状態を均質なものとするのに適する。

上記集団の未分化状態が保たれていることは多能性幹細胞マーカーの陽性率で特徴づけられる。一例として凝集塊の集団の全凝集塊のうち80%以上が陽性であればよい。陽性率は凝集塊の集団中のうち、多能性幹細胞マーカーが陽性である凝集塊の割合として算出する。

一例として、凝集塊の一の集団中において、多能性幹細胞マーカーが陽性である凝集塊が80%以上であれば、かかる集団の未分化状態が保たれていると判断してもよい。

測定方法は次の方法で行える。まず、集団より凝集塊を10個選択する。選択した凝集塊１つについて100個の細胞を選択する。選択される細胞は100個以上でもよい。当該100個の細胞に対して多能性幹細胞マーカーが陽性であるか否か判定することでひとつの凝集塊の陽性率を計測する。当該判定は、100個の細胞のうち3個以上の細胞について多能性幹細胞マーカーが陽性となれば、その凝集塊は多能性幹細胞マーカーが陽性であると判断する。なお、当該判定において、1000個以上の細胞を選択する場合、その細胞のうち3％以上の細胞が陽性となれば、その凝集塊は多能性幹細胞マーカーが陽性であると判断する。

上記手法により、凝集塊10個中の多能性幹細胞マーカーが陽性な凝集塊の割合（陽性率）を求める。この陽性率の計測を同一の集団に対してさらに2回、すなわち合計で３回行う。３回の陽性率の平均を上記陽性率の平均とする。

多能性幹細胞マーカーは例えばTRA-1-60でもよい。TRA-1-60が陽性であるか否かは、例えばフローサイトメーターを用いて、陰性の細胞集団と比較して陽性の細胞集団が出現するか否かを検討する事で判定できる。また他の方法として、多能性幹細胞マーカーをPCRにより検出してもよい。このとき、多能性幹細胞マーカーとしてNanog及びOct3/4の少なくともいずれか一つを選択してもよい。発現していない分化細胞、例えば繊維芽細胞などをコントロールとしてこれらのマーカー遺伝子の発現を検出する。

凝集塊の集団では、凝集塊間で、その機能においても均質であることが好ましい。機能において均質であることは、生体内分化誘導法、例えばテラトーマの形成能で判定することができる。マウスに凝集塊又は凝集塊中の多能性幹細胞を移植することで、テラトーマがマウス体内に生じるか否かを判定することができる。集団中の凝集塊の内、三胚様に分化したテラトーマを形成する凝集塊の割合は、８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、１００％であることが最も好ましい。かかる場合には、かかる集団は機能において均質であると判定できる。

凝集塊の集団では、凝集塊間で、その分化能の均質性が保たれていることが好ましい。分化能において均質であることは、例えば凝集塊を分化誘導したときに、凝集塊中の細胞が三胚葉の細胞に分化しているか否かで判定できる。

例えば集団より10個の凝集塊を選択する。選択される凝集塊は10個以上でもよい。当該10個の凝集塊それぞれ別個に試験管内で三胚葉のいずれかへの分化を誘導する。他の態様として凝集塊に対して分化を誘導して胚様体を形成する。ここで胚様体とは、受精卵又は胚の様に様々な分化細胞が含まれている細胞凝集塊を表す。各々の凝集塊において、形成された８０％以上の胚様体が三胚葉の内のいずれかの胚葉のマーカーを発現することが好ましい。選択した10個若しくは10個以上の凝集塊の全てが、この要件を満たすことが好ましい。

PCR法を用いて一個ずつの前記胚様体の遺伝子発現量を測定することで判定してもよい。

また他の態様として、試験管内分化誘導系により各々の凝集塊から誘導される胚葉体の割合が80％以上であることが好ましい。選択した10個若しくは10個以上の凝集塊の全てがこの要件を満たすことが好ましい。ここで胚葉体とは三胚葉の組織が混合された細胞凝集塊である。

分化マーカーは外胚葉、内胚葉及び中胚葉の少なくともいずれか一つの分化マーカーであることが好ましい。外胚葉の分化マーカーをPax6、SOX2、PsANCAM及びTUJ1の少なくともいずれか一つとしてもよい。内胚葉の分化マーカーをFOXA2、AFP、サイトカイン8.18及びSOX17の少なくともいずれか一つとしてもよい。中胚葉の分化マーカーをBrachyury及びMSX1の少なくともいずれか一つとしてもよい。

なお、本発明は上記実施形態及び下記の実施例に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば上記実施形態では細胞塊から凝集塊を形成した後に、凝集塊を回収した。しかしながら、二以上の細胞塊を凝集させて大きい細胞塊を形成した後に、かかる大きい細胞塊を回収してもよい。かかる大きい細胞塊は上述の凝集塊の大きさに達していなくてもよい。すなわち上記サイクルを繰り返して最終的に十分な大きさと機能を有する凝集塊を得てもよい。また本発明の一実施形態は多能性幹細胞の細胞培養方法である。係る実施形態では、多能性幹細胞の増殖や多能性幹細胞の生存の維持を目的として上記実施形態と同様に細胞を成育してもよい。

［実施例１］

＜ｉＰＳ細胞の取得＞

多能性幹細胞として 、未分化マーカーのNanog、OCT3/4、TRA1-60またはこれらに類する未分化マーカーが発現しているとともに、かつ三胚葉に分化することが確認されている人工多能性幹細胞細胞（iPS細胞）を用いた。
（細胞培養）

上記iPS細胞を凝集塊形成の起点となる細胞塊とした。まず６ウェルプレート内にて、iPS細胞をフィーダー細胞上で５−７日間培養した。iPS細胞が７０−８０％コンフルエントになったことを確認した後、アスピレーターを利用してウェルから培地を取り除いた。１ウェル当たり500μＬのDissociation Solution for human ES/iPS Cells（CTK液、リプロセル社）を各ウェルに添加した。６ウェルプレートをＣＯ_２インキュベーター（37度、５％ＣＯ_２）中で３分間インキュベートした。

インキュベート後、６ウェルプレートをＣＯ_２インキュベーターから取り出した。ウェルプレート又はウェルを軽くたたくことで、フィーダー細胞をはがした。その後、CTK液をアスピレーターで取り除くとともに、１ウェル当たり１ｍｌのPBSを添加した。

顕微鏡を利用して、６ウェルプレート上のフィーダー細胞がはがれていることを確認した。その後、アスピレーターでディッシュからPBSを取り除いた。その後、１ウェル当たり500μｌのTrypLE Select Enzyme (1x)（商標；Thermo Fisher Scientific製；以下、トリプルセレクト（TrypLE Select）という。）を添加してから、ＣＯ_２インキュベーター中で５分間インキュベートした。

ES細胞又はiPS細胞用の培養培地として以下のとおり培地Ｙを作製した。まず基本となる培地としてHuman ES medium (reprocell社)を用意した。さらに0.2 mlの10 μg/ml basic fibroblast growth factor (bFGF) （Thermofisher PHG0266）を上記培地に添加した。

インキュベート後、６ウェルプレートをＣＯ_２インキュベーターから取り出した。１ウェル当たり500μｌの培地を各ウェルに添加した。ピペットマン（P1000）を利用することで、iPS細胞を１０〜３０回サスペンドした。実施例３以降の実施例でも同様にサスペンドを行った。以上により細胞塊の集団を含有する懸濁液を作製した。係る懸濁液はサスペンドにより生じたiPS細胞のシングルセルも含んでいた。培地交換を行い、最終的に細胞塊の集団を市販のフィーダーフリー培養液に懸濁した。フィーダーフリー培養液を本実施例では培養液Ａ（Medium A）と呼ぶこととする。

凝集塊を形成するためのプレート（以下、特に言及しない限りプレートという。）として株式会社クラレ製の＜Elplasia＞プレートを用いた。＜Elplasia＞プレートのうちMultiple Pore Typeのプレートを用いた。Multiple Pore Typeのプレートは図９に示すように貫通孔で形成されたウェルを複数備える。

図９にはプレートを平面視したときの凝集塊の観察像が示されている。図９に示すように各ウェルの大きさは互いに均等である。貫通孔の頂部開口と底部開口とはいずれも四角形である。具体的には頂部開口と底部開口とはいずれも正方形である。頂部開口と底部開口とを平面視した時、これらの有する角の向きは互いに揃っている。またこれらの有する中心は一致している。

頂部開口の一辺の大きさは６５０μｍである。底部開口の一辺の大きさは５００μｍである。プレートには６８０個のウェルが、７ｃｍ^２の面積を有する底面に対して規則的に配置されている。ウェルによって形成される区画の数Ｎ＝６８０である。具体的にはウェルが四角格子状に配置されている。格子の単位は一辺が５００μｍの正方形である。

各ウェルによって形成される各区画のそれぞれに二以上の細胞塊が分配されるよう、培養液をプレート全面に対して偏りなく播いた。培養液は各ウェルに行き渡った。１個の区画あたり、１×１０^５個の細胞が含まれるように細胞塊を分配した（１区画あたりの細胞数ｎ＝１×１０^５）。頂部開口の大きさが均一であり、またウェルが格子状に均等に配置されているので、各区画に分配された細胞の数は、均等になったものと考えられる。

培養液Ａ中の単位体積当たりの細胞数、すなわち細胞濃度Ｃ[１／ｍｌ]は、数式Ｃ＝Ｎ・ｎ／Ｖに従い決定された。ここでＮは区画の数を、ｎは１区画あたりの細胞数を、Ｖは１プレート当たりに用いられる培養液Ａの体積をそれぞれ表す

各ウェルの底部開口からは培養液Ａの液滴が突出していた（図３）。培養液Ａの有する表面張力によって液滴と大気との界面であるメニスカスが形成されていた。メニスカスに向かって細胞塊が集まるため、ウェル内面とメニスカスとで形成される区画内で細胞塊が互いに接近した。このようにして細胞塊を区画の中に配置された培養液Ａの中で培養した。なお本実施例ではメニスカスも区画の構成要素の一部であることは先に説明した通りである。

図９のMedium AのDay 1及びDay 2に示すように、互いに接近させた細胞塊を凝集させた。Day 1は播種してから１日、Day 2は２日経過したことを表す。他の図においてもDay又はdayに続く数字は最初にプレートに播種した日からの経過日数を表す。このようにように細胞塊を互いに凝集させながら細胞を成育することで多能性幹細胞の凝集塊を得た。

［実施例２］

実施例１ではDissociation Solution for human ES/iPS Cellsを用いて、フィーダー細胞とｉＰＳ細胞とをウェルから剥がした。またTrypLE Select Enzymeを用いてｉＰＳ細胞を処理した。

これに対して実施例２ではｉＰＳ細胞をスクレーパーでかきとるのみとし、酵素処理を行わなかった。ｉＰＳ細胞に対するサスペンドを行う回数は１０回よりも少なくした。その他は実施例１と同様に行った。

実施例２では、凝集塊を形成するためのプレート上に広げられる（spread）懸濁液中に含まれる細胞の８０％が、細胞塊を構成する細胞であった。

［実施例３］

本実施例では一つの区画に分配される細胞数ｎを１×１０^６個としたこと以外は上記実施例１と同様に細胞を培養した。図１０にはプレートを平面視したときの凝集塊の観察像が示されている。図１０の右の列には一区画当たり１×１０^６個の細胞を分配した場合の結果が示されている。左の列には対照として先の実施例と同様に一区画当たり１０^５個の細胞を分配した場合の結果が示されている。図１０には播種後２日目及び４日目の結果が示されている。

一区画に分配される細胞が１×１０^５個から１×１０^６個の範囲で均質な大きさの凝集塊を作製することができることが分かった。

［実施例４］

図１１にはプレートを平面視したときの凝集塊の観察像が示されている。本実施例では図１１に示すように頂部開口及び底部開口の形状を円とした。プレートを平面視した時、これらの中心は一致している。観察像に見られる左右方向のバーの長さは１０００μｍを表す。その他の条件は実施例１と同様にしてｉＰＳ細胞を培養した。

頂部開口の直径の大きさは６５０μｍである。底部開口の直径の大きさは５００μｍである。プレートには６４８個のウェルが、７ｃｍ^２の面積を有する底面に対して規則的に配置されている。

図１１には細胞塊を播種後１、３、５、７日目の状態の凝集塊が示されている。各日において、各区画の間において均一な大きさの凝集塊が得られた。各区画において、概ね１個の凝集塊が得られた。凝集塊が時間経過とともに大きくなる速さは各区画の間において大きな差が見られなかった。このため、各区画の間で、細胞の品質は均一に保たれていることが示唆された。

７日目において、一区画当たりの細胞の数は、2000個以上5000個以下になっていることが期待される。

［実施例５］

特に言及しない限り実施例４と同様に細胞を培養した。培養７日目において得られた凝集塊をプレートから回収した。回収の際、凝集塊が底部開口を通過するようにした。具体的には図６に示すように回収液にプレートの底面を接触させることにより、培養液の界面を無くすことで回収を行った。係る回収法を以下、接触法という。この回収液を１５ｍｌチューブに回収した。

２７０Ｇでチューブを遠心した後、上清を除去した。チューブ内に500μｌのトリプルセレクトを添加するとともに、チューブを３７度インキュベーターで１０分インキュベートした。遠心後、上清を除去するとともに、１ｍｌのMedium Aにチューブ内の細胞を懸濁した。血球計算盤を利用して、懸濁された細胞の数を数えた。細胞数の計算結果を元に２×１０^５個のiPS細胞を２ｍｌのMedium Aに懸濁した。さらに２μlのROCK（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤（ロックインヒビター、ROCK inhibitor）を添加してから、iPS細胞をプレート上に播種した。培養中は１ｍｌのMedium Aに1μｌのロックインヒビターを添加したもので、古い培地を交換した。培地交換は毎日行った。

改めて、同一の形状のプレートに対して、培養液を播いた。培養液は各ウェルに行き渡った。二以上の区画のそれぞれに混合された二以上の細胞塊を分配した。一区画当たりの細胞数は１回目の播種と同様とした。各区画内で細胞塊を互いに接近させた。これにより細胞塊を再び凝集させた。

凝集塊を分解して細胞塊を得て、細胞塊を混合し、接近させ、分配し、再び凝集させる工程を繰り返すことで継代を行った。継代を２回（Ｐ２）、３回（Ｐ３）、４回（Ｐ４）及び５回（Ｐ５）繰り返した。なお継代の回数の数え方はｉＰＳＣコロニーから得た細胞塊を、最初にプレートに播種したときのパッセージを１回（Ｐ１）としている。

継代は７日間ごとに行った。図１２には最初のプレートへの播種から１４、２１、２８及び３５日目に表れた凝集塊の観察像が示されている。観察像に見られる左右方向のバーの長さは１０００μｍを表す。１か月という長期間を経過してもなお各区画の間で均一な大きさの凝集塊が得られた。長期培養後の多能性幹細胞の評価をフローサイトメトリーで行った。

＜フローサイトメトリー及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）＞

培養１０日目及び２０日目において得られた凝集塊を上記接触法にて回収するとともに、１５mlチューブ内に集めた。チューブを２７０Ｇで遠心した後、上清を吸引した。チューブ内に500μｌのトリプルセレクトを添加するとともに、チューブを３７度インキュベーターで１０分インキュベートすることで細胞を個別化した。チューブを１０分間インキュベートした後、チューブ内に５００μｌのMedium Aを添加した。ピペットマンで凝集塊とMedium Aとを１０〜３０回サスペンドすることで、凝集塊を破砕した。チューブに９ｍｌのMedium Aを添加した後、さらにチューブに２７０Ｇで遠心した。

遠心後、チューブ内から上清を吸引した後、沈殿した細胞を１ｍｌのMedium Aに懸濁した。血球計算盤を利用して、懸濁された細胞の数を数えた。細胞数の計算結果を元に細胞を１×１０^６個づつ新たなチューブに分注した。チューブを再度２７０Ｇで遠心した。遠心後、チューブ内の上清を吸引した。50μlのPBSに対してTRA-1-60を検出するための抗体2.5μｌを懸濁した。係る抗体懸濁液をチューブ内に添加した後、チューブを30分間、室温、遮光付きの条件でインキュベートした。

３０分経過後、１ｍｌのPBSをチューブに添加した。チューブを２７０Ｇで遠心した後、チューブ内から上清を除去した。フローサイトメーターCytoflexを利用してiPS細胞のTRA-1-60陽性率を測定した。

図１３にはＦＡＣＳのヒストグラムが４個表されている。ヒストグラムの縦軸はＴＲＡ−１−６０の強度である。横軸は自家蛍光の強度である。

図１３の左上のヒストグラム（Old method）はポジティブコントロールの結果を表す。ポジティブコントロールでは従来法と同様にフィーダー細胞を用いることで分化多能性を維持したまま継代培養を行った。図中には継代２回目の時に行ったフローサイトメトリーの結果が示されている。

左下のヒストグラム（P2）は本実施例における１０日目の時点における細胞から得られた。継代は２回目である。右下のヒストグラム（P4）は本実施例における２０日目の時点における細胞から得られた。継代は４回目である。

ヒストグラム中にプロットされた１個のドット（以下、プロットという。）が１個の細胞を表している。ヒストグラム中の左上のエリア（P4）に位置する赤のプロットの集合部分（色の薄い部分）がiPS細胞の機能を維持している細胞の集団を示す。その他の黒のプロットの部分（色の濃い部分）はiPS細胞マーカーの発現レベルが低い細胞を示す。

右上のヒストグラム（NC）はiPS細胞ではない細胞に基づくネガティブコントロールの結果を示す。iPS細胞の機能を有するエリア（P4）から外れた分布（黒色のプロット）となっている。

図１３の下段に示されるように、区画を有するプレート上で培養することで得たiPS細胞は、１０日目（２継代目）でも、２０日目（３継代目）においても、大部分がTRA-1-60陽性であった。TRA-1-60陽性細胞の強度又は全細胞に占める割合は、ポジティブコントロールと同程度であった。

ＦＡＣＳによる試験の結果は、多能性幹細胞の凝集塊の集団の調製に継代を複数回要する場合でも、本実施例の方法では、凝集塊間における未分化状態の均質性が高い状態で維持できることを示している。またフィーダー細胞を用いない場合であっても、区画を有するプレートを用いることでiPS細胞の未分化状態の維持がなされた。

＜抗体染色＞
培養１０日目において得られたiPS細胞の凝集塊を上記接触法にて回収するとともに、１５mlチューブ内に集めた。上記同様に凝集塊をトリプルセレクトで処理することで細胞を個別化した後、チューブを２７０Ｇで遠心した後、上清を除去した。適当な培地にてiPS細胞を懸濁した後、iPS細胞を６ウェルプレート上で予め培養されたフィーダー細胞上に播種した。

細胞播種から５日〜７日経過後に、フィーダー上のiPS細胞を以下の手順に従って染色した。

1. ６ウェルプレートの各ウェルから培地を除去するとともに、各ウェルに対して１ｍｌのPBSを添加した。

2. PBSを除去するとともに、４％PFA（パラフォルムアルデヒド）を500μｌ添加した。

3. 15分4℃の冷蔵庫内で細胞とPFAとを反応させた。

4. ウェルからPFAを除去するとともに、１ｍｌのPBSを添加した。

5. 5%CCS（Cosmic Calf Serum）及び0.1%トライトンを含むPBSで一次抗体を２００倍希釈した。係る希釈抗体液500μｌをウェルに添加した。一次抗体は抗OCT3/4抗体（C-10、SC-5279、Santacruz）と抗NANOG抗体（abcam、ab21624）であった。

6. 室温で１時間、抗体と細胞とを反応させた。

7. 希釈抗体液を除去するとともに、ウェルを１ｍｌのPBSで洗った。再度PBSでウェルを洗った。

8. 二次抗体を5%CCS（Cosmic Calf Serum）及び0.1%トライトンを含むPBSで1000倍希釈しするとともに、係る希釈抗体液をウェルに添加した。二次抗体はDonkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate及びDonkey anti-goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateであった。Alexa Fluorは商標である。

9. 室温で30分、抗体と細胞とを反応させた。

10. ウェルをPBSで二回洗った。蛍光顕微鏡EVOS（Thermo Fisher Scientific）を利用し、細胞を観察した。

図１４には、抗体染色による細胞の観察像が示されている。観察像に見られる左右方向のバーの長さは４００μｍを表す。左上は明視野の像である。右上はOct3/4に対する染色の結果である。左下はNanogに対する染色の結果である。

染色の結果から、区画を有するプレート上で培養されたiPS細胞は、多能性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4及びNANOGを発現していたこと（OCT3/4及びNANOG陽性）が分かった。この結果から、区画を有するプレート上で培養されたiPS細胞は、分化多能性を維持していることが示された。

＜平面培養との比較＞

本試験では、上述のiPS細胞株Line 1、Line 2、及びLine 3を使用した。

図１５には、回収した凝集塊の集団の観察像が示されている。上段の観察像（KRR Dish）は、区画を有するプレート上で各細胞を継代培養した結果を表す。下段の観察像（Non-adhesion dish）は細胞低接着処理が施された平板ディッシュ上で各細胞を継代培養した結果を表す。いずれの継代培養においてもフィーダー細胞は用いていない。またいずれも継代の回数は、１回である（Ｐ１）。図１５に示す通り、多能性幹細胞の凝集塊の集団の調製において、本実施例の方法は凝集塊の大きさを均等化することに資することが分かった。

iPS細胞は、一般に一定の大きさ以上になると分化してしまう性質を持つ。さらに、培地中の栄養は凝集塊の内部まで拡散しにくい。このため、細胞低接着処理が施された平板ディッシュ上で培養した細胞からなる凝集塊は不均一な大きさであった。またこれらの細胞中では分化や細胞死誘発が誘導されていた。一方、区画を有するプレートで培養された細胞にはこれらの影響はなかった。本実施例に係る培養方法は従来の平面培養法よりも、iPS細胞の培養に適しているといえる。

［実施例６］

本実施例では、上記iPS細胞Line 1及びLine 2を実施例４と同様に培養した。図１６の左にはiPSC Line 1の凝集塊の観察像が示されている。右にはiPSC Line 2の凝集塊の観察像が示されている。継代は１回目である。最初のプレートへの播種から５日目である。本実施例でも実施例４と同様に多能性幹細胞の凝集塊の集団の調製において、凝集塊の大きさを均等化することができた。したがって上記実施例の方法は、細胞株の種類に依拠せずとも、大きさが均等化された凝集塊が得るのに資することが分かった。

［実施例７］

本実施例ではLine 1, 2及び3の代わりに、これらの細胞株と同様に未分化マーカーを発現するとともに、三胚葉に分化する性質を有するiPS細胞のセルラインLine 4を使用した。その他の条件は実施例４と同様にして細胞を培養した。

図１７は本実施例のプレート上に播種されたLine 4の観察像である。図１７の上段は播種直後のLine 4を示す。下段は７日目にプレートから回収したされたLine 4を示す。図１７の左の列に示すようにLine 4を実施例１と同様の方法で培養したところ、Line 4が凝集塊を形成する効率はLine 1, 2及び3に比べて低かった。しかしながら、ラインバイアビリティーは維持されていた。発明者らはMedium Aの組成はLine 4を凝集させるには不十分であると考えた。

Medium Aに細胞外マトリクスを添加した培地を用いて培養を行った。図１７の右の列に示されるように、Line 4は凝集塊を形成した。

本実施例では市販されているマトリゲル（商標）を１０μＬ／ｍＬ以上の濃度になるようにMedium Aに添加した。培地中の細胞外マトリクスの濃度は１０μＬ／ｍＬ以上の範囲であればよいと考えられる。細胞外マトリクスは、マトリゲル、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミンの改変体であるLamin 551のいずれか、またはこれら組み合わせからなるものであればよいと考えられる。他の条件は実施例と同様とした。

上記の結果は、細胞外マトリクスを含まない培地中では凝集塊が形成されない細胞であっても、細胞外マトリクスを添加した培地を用いることで、これを凝集させることが出来ることを示している。

［実施例８］

本実施例ではＴＲＡ−１−６０発現強度を基準として、本実施例に係る区画による培養と、従来の細胞外基質をコートした平面上での培養とを比較した。

＜細胞の準備＞

（w/ feeder）

ポジティブコントロールとして細胞外基質でコートされたディッシュを用いた。係るポジティブコントロールを以下「w/ feeder」と称する。

１．培養容器の準備：ディッシュ上にコートすべき細胞外基質としてマトリゲルを使用した。氷上でDMEM１２ｍｌに対して１８０μｌのマトリゲルを添加して溶液を得た。溶液を、12ディッシュを有する培養プレートを用いた（以下、係る培養容器のことを単にディッシュという。）。各ディッシュに適量注入した。ＣＯ_２インキュベーター中でディッシュを１時間以上放置した。ディッシュの使用直前に、培地を取り除いた。以下、係るディッシュを細胞外基質ディッシュと呼ぶ。

２．実施例１と同様の手順で、フィーダー細胞を用いてiPS細胞を培養した。その後、培養結果物からフィーダー細胞のみ除去した。次に、６ウェルプレートの各ウェルにてiPS細胞を培養した。培養後１ウェル当たり１ｍｌの培地Ｙを各ウェルに注入した。スクレーパーでiPS細胞をウェルから剥離させた。iPS細胞が個別化されてシングルセルになるまで十分にサスペンドした。

３．先に述べたとおり用意しておいた細胞外基質ディッシュに対し、１ディッシュあたり２×１０⁵個のiPS細胞を播種した。細胞外基質ディッシュをＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。培地はMedium A培地に１/1000量のロックインヒビターを添加したものを使用した。

４．播種から１日経過後、インキュベーターから細胞外基質ディッシュを取り出した。以降、上記と同じロックインヒビターを添加したMedium A培地を使用して培地交換を毎日行った。

５．播種から７〜１０日経過後、細胞外基質ディッシュから培地を取り除いた。ディッシュ内に１ｍｌのPBSを添加した。アスピレーターでPBSを除去した。トリプルセレクトをディッシュ内に500μｌ添加した。ディッシュをＣＯ_２インキュベーター中で５分間インキュベートした。

６．インキュベート後、培地Ｙをディッシュ内に500μｌ添加した。ピペットマンを利用してサスペンドすることで、iPS細胞が個別化されてシングルセルとなった。

（w/o feeder）

比較例としてとして平面培養を行った。細胞低接着処理が施された平板ディッシュを用いた。係る比較例を以下「w/o feeder」と称する。

細胞低接着処理が施された平板ディッシュは［実施例５］の＜平面培養との比較＞で示されたものと同様とした。平板ディッシュ上での培養は播種から７〜１０日間経過するまでの行った。継代の回数は１回であった（Ｐ１）。

培養後の細胞懸濁液を１５mlチューブ中に回収した。チューブを２７０Ｇで遠心したた後、上清を吸引により除去した。チューブに500μｌのトリプルセレクトを添加した後、チューブを３７℃のインキュベーターで１０分インキュベートした。インキュベート後、培地Ｙ500μｌをチューブに添加した。ピペットマンを利用してチューブと細胞とをサスペンドすることで、iPS細胞が個別化されてシングルセルとなった。

（KRR）

本実施例に係る区画を有するプレート上でiPS細胞の培養を行った。係る実施例を以下「KRR」と称する。

実施例４と同様の手順で播種から7日〜10日間経過するまでｉＰＳ細胞を本実施例に係る区画を有するプレート上で培養した。実施例５と同様の手順で１５mlチューブにｉＰＳ細胞を回収した。チューブを２７０Ｇで遠心した後、上清を吸引により除去した。500μｌのトリプルセレクトを添加した後、チューブを３７℃のインキュベーターで１０分インキュベートした。インキュベート後、培地Ｙ500μｌをチューブに添加した。ピペットマンを利用してチューブと細胞とをサスペンドすることで、iPS細胞が個別化されてシングルセルとなった。

＜ＦＡＣＳ＞

上記のw/ feeder、w/o feeder及びＫＲＲに係る細胞を準備した後、下記手順にて細胞の分析を行った。

1. 個別化されたシングルセルとなったiPS細胞を、1.5mlチューブ中に回収した。血球計算盤を利用して細胞数を計算した。その後、チューブを２７０Ｇで遠心してから、上清を取り除いた。

2. ５×１０^５個のiPS細胞に対してPBSを50μlを添加した。PBSには予め抗TRA-1-60抗体を２．５μｌを添加した。抗TRA-1-60抗体は蛍光を発するように予め化学処理されている。３０分間、室温かつ遮光された条件下でチューブをインキュベートした。

3. インキュベート後、１ｍｌのPBSをチューブに添加した。チューブを２７０Ｇで遠心した後、チューブから上清を取り除いた。

4. TRA-1-６０陽性細胞の蛍光強度を、フローサイトメーターCytoFlexを利用して解析した。

＜結果＞

細胞外基質ディッシュ上で培養したiPS細胞より、区画を有するプレート上で培養したiPS細胞のほうが未分化マーカーの発現が高く維持できることが以下の通り示された。

図１８はＡＣＳの２パラメーターヒストグラムである。縦軸は自家蛍光（Auto fluorescence）の強度である。横軸はTRA-1-60の蛍光強度である。KRRではW/ feederと同様のパターンが得られた。

図１９はＦＡＣＳの１パラメーターヒストグラムである。横軸はTRA-1-60の蛍光強度である。縦軸のcountは細胞の個数を表す。KRRではW/ feederと同様のパターンが得られた。

図１８及び１９に示された結果から、KRRはw/feederと同等のヒストグラムを示すことが分かった。例えば図面上で最も色の濃いグレーの部分の位置で判定できる。

［実施例９］

区画を有するプレート上で培養した各細胞塊の未分化マーカー発現率の測定を行った。

実施例４と同様の手順で播種後7日〜10日間（Ｐ１）培養した。プレートから凝集塊を回収する際に、凝集塊を１個ずつ回収した。係る凝集塊を以下、シングルクランプ（single clump）又はクランプ（clump）と呼ぶ。合計１０〜１２個のシングルクランプを予め300μｌのトリプルセレクト注入しておいた1.5mｌチューブ内に回収した。

チューブを３７度で10分間インキュベートした。インキュベート後、チューブ内にPBSを７００μｌ添加した。細胞を１０回から３０回サスペンドした。チューブを２７０Ｇで遠心した。その後［実施例５］の＜抗体染色＞の手順８．〜１０．に従って処理を行った。

得られた染色像を解析した結果が、図２０のＴＲＡ−１−６０の発現強度を表すグラフに表されている。１０〜１２個のクランプ中、８割以上のクランプにおいて、TRA-1-60陽性率７０％以上であった。

［実施例１０］

区画を有するプレートで培養した各クランプの有する分化多能性を試験した。

１． 実施例４と同様の方法でiPS細胞を３日間培養した。培地をｂＦＧＦ非含有タイプの培地Ｙで置換した。さらに７日間培養した。培地交換は２日に１度行った。

２． 上記７日間の培養を終了後、区画を有するプレートからiPS細胞塊を回収した。ゼラチンでコートされた１０cmディッシュにｉＰＳ細胞を播種した。その後、さらに７日間培養を行った。培地交換は２日に１度行った。

３． ７日間の培養を終了後、以下の抗体を用いて、以下のプロトコールに従い免疫染色を行った。

４． ディッシュをPBSで洗浄した後、PBSを除去するとともに、４％PFAを含有する500μｌのＰＢＳをディッシュ内に添加した。

５． 15分間、4℃の冷蔵庫中でＰＦＡと細胞とを反応させた。

６． ディッシュからからPFAを除去するとともに、１ｍｌのPBSを添加した

７． 5%CCS及び0.1%トライトンを含むPBSで一次抗体を希釈した。希釈抗体液500μｌをディッシュに添加した。一次抗体はTUJI-1 anti body、FOXA２ monoclonal antibody、及び Brachyury antibodyを２００倍希釈したものを利用した。

８． 室温で１時間、抗体と細胞とを反応させた。

９． ディッシュから希釈抗体液を除去した。細胞を１ｍｌのPBSで洗った。洗浄を、再度行った。

１０． 二次抗体を5%CCS及び0.1%トライトンを含むPBSで1000倍希釈した。二次抗体は以下を使用した。

Donkey anti-rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate

Donkey anti-mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate

Donkey anti-goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate

１１．二次抗体の希釈液と細胞とを室温で30分反応させた。

１２．細胞をPBSで二回洗った。蛍光顕微鏡EVOSを利用して細胞を観察した。

図２１Ａ−Ｃには凝集塊の蛍光観察像が示されている。

図２１ＡはTUJI-1、図２１ＢはFOXA2、図２１ＣはBrachyuryの染色パターンである。図２１Ａ−Ｃにおいて、それぞれの左上はLine1、右上はLine2、左下はLine３である。TUJ-1は外胚葉の分化マーカーである。図２１Ａに示す結果は、凝集塊中の細胞が神経細胞などの外肺葉から発生する細胞への分化誘導能を有していることを示している。FOXA1は内胚葉の分化マーカーである。FOXA1は特に肝組織形成の最も初期の過程に必要とされる分化マーカーである。図２１Ｂに示す結果は、凝集塊中の細胞が肝臓など内胚葉から発生する細胞への分化誘導能を有することを示している。Brachyuryは初期中胚葉の分化マーカーである。図２１Ｂに示す結果は、凝集塊中の細胞が筋肉など中胚葉から発生する細胞への分化誘導能を有していることを示している。

図２１Ｄは、全ての細胞数を基準として、各胚葉体マーカーが発現している細胞の数の割合をそれぞれ棒グラフで表したものである。グラフは、試験管内分化誘導系により凝集塊から誘導される胚葉体の割合が80％以上であることを示している。

［２４］ 前記再び凝集させて形成した前記凝集塊を分解することなく互いに混合し、
二以上の区画にそれぞれ前記混合された凝集塊を分配し、
各前記区画内で二以上の前記混合された凝集塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の凝集塊をさらに凝集させる、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［２５］ 前記凝集塊を形成した後、前記凝集塊を分解する前に、
形成した二以上の前記凝集塊を互いに混合し、
二以上の区画にそれぞれ前記混合された凝集塊を分配し、
各前記区画内で二以上の前記混合された凝集塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の凝集塊をさらに凝集させて、
前記混合された凝集塊よりも大きな凝集塊を形成することを、
１回又は２回以上繰り返す、
［２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［２６］
形成した二以上の前記凝集塊を互いに混合し、
二以上の区画にそれぞれ前記混合された凝集塊を分配し、
各前記区画内で二以上の前記混合された凝集塊を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の凝集塊をさらに凝集させる、
［１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［２７］
生体内分化誘導を行った場合、三胚葉に分化したテラトーマを形成する凝集塊の割合が80％以上である、
［１９］に記載の凝集塊の集団。
［２８］
前記集団より10個の凝集塊を選択し、
試験管内分化誘導系により前記凝集塊から内胚葉に分化誘導した場合に、
前記凝集塊に対してFOXA2及びAFPの少なくともいずれか一つの内胚葉マーカーが陽性であるか否か判定したとき、
前記内胚葉マーカーの陽性率が80％以上である、
［１９］に記載の凝集塊の集団。
［２９］
前記集団より10個の凝集塊を選択し、
試験管内分化誘導系により前記凝集塊から中胚葉に分化誘導した場合に、
前記凝集塊に対してBrachyury及びMSX1の少なくともいずれか一つの中胚葉マーカーが陽性であるか否か判定したとき、
前記中胚葉マーカーの陽性率が80％以上である、
［１９］に記載の凝集塊の集団。
［３０］
前記集団より10個の凝集塊を選択し、
試験管内分化誘導系により前記凝集塊から外胚葉に分化誘導した場合に、
前記凝集塊に対してPax6、SOX2、PsANCAM及びTUJ1の少なくともいずれか一つの外胚葉マーカーが陽性であるか否かを、PCR法を用いて一個ずつの前記胚様体の遺伝子発現量を測定することで判定したとき、
前記外胚葉マーカーの陽性率が80％以上である、
［１９］に記載の凝集塊の集団。
［３１］
二以上の互いに均等な大きさの区画のそれぞれに二以上の凝集前単位を分配し、ここで、前記凝集前単位とは細胞塊及びシングルセルの少なくともいずれかであり、
各前記区画内で前記二以上の前記凝集前単位を互いに接近させ、
前記互いに接近させた二以上の前記凝集前単位を凝集させるとともに、成育して凝集塊を形成する、
幹細胞の凝集塊の集団の調製方法であって、
前記分配される前記凝集前単位は互いに分離しているとともに互いに混合されており、
前記細胞塊はそれぞれ幹細胞で構成されている、
幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［３２］
前記幹細胞は多能性幹細胞である、
［１］又は［３１］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。
［３３］
前記凝集前単位は細胞塊である、
［３１］又は［３２］に記載の幹細胞の凝集塊の集団の調製方法。

この出願は、２０１５年１２月２９日に出願された米国仮出願６２／２７２，５２４を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

２０ 培養器、２１−２６ ステップ、２７ 矢印、２９ 隔壁、３０ プレート、３１ａ，ｂ 孔、３２ａ，ｂ 区画、３３ａ，ｂ 頂部開口、３４ａ，ｂ 底部開口、３５ 培養液、３６ａ，ｂ 液滴、３７ 貯留区画、３８ 懸濁液、３９ 閾値、４０ 凝集塊、４１ 集団、４２ａ−ｃ 細胞塊、４３ａ−ｃ 凝集塊、４４ａ，ｂ 集団、４５ 支持体、４６ 側壁、４７ フランジ、５０ 容器、５５ トレイ、５６ 側壁、５７ 底部、５８ 空間、６０ トレイ、６５ 回収液

Claims (26)

1. 多能性幹細胞に対する分化誘導をする前に行う、幹細胞の凝集塊の集団の調製方法であって、
   （Ａ）二以上の互いに均等な大きさの区画のそれぞれに二以上の凝集前単位を分配し、ここで、前記凝集前単位とはそれぞれ多能性幹細胞で構成された、細胞塊及びシングルセルの少なくともいずれかであり、前記多能性幹細胞はＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であり、また、前記分配される前記凝集前単位は互いに分離しているとともに互いに混合されており、さらに前記区画はプレートの有する貫通孔によって形成され、前記貫通孔は前記プレートの有する底面の側に底部開口を有し、前記底部開口の内接円径が０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以下であり、
   各前記区画内で前記二以上の凝集前単位を互いに接近させ、
   前記互いに接近させた二以上の凝集前単位を凝集させるとともに、３日以上かつ７日以下の期間、成育することで各前記区画内において一個の凝集塊を形成し、
   前記凝集塊に前記底部開口を通過させることで前記プレートから前記凝集塊を回収し；
   （Ｂ）さらに前記形成した凝集塊を分解して凝集前単位を生成し、
   相異なる前記凝集塊から生成された前記凝集前単位を互いに混合し、
   二以上の区画のそれぞれに二以上の前記混合された凝集前単位を分配し、ここで前記区画はプレートの有する貫通孔によって形成され、前記貫通孔は前記プレートの有する底面の側に、その内接円径が０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以下である底部開口を有し、
   各前記区画内で前記二以上の混合された凝集前単位を互いに接近させ、
   前記互いに接近させた二以上の凝集前単位を再び凝集させるとともに、３日以上かつ７日以下の期間、成育することで各前記区画内において一個の凝集塊を形成し；
   ここで（Ａ）及び（Ｂ）において、前記凝集前単位は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
   前記培養液は液滴を形成しており、
   前記液滴は前記底部開口に付着するとともに前記底部開口より垂れ下がるように突出し、
   前記区画の底面は前記液滴のメニスカスで形成されている、
   方法。
2. 前記凝集塊に前記底部開口を通過させることで前記プレートから前記凝集塊を回収する、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記凝集塊の直径が５００μｍ以下である時点で前記凝集塊を分解する、
   請求項１に記載の方法。
4. 前記凝集塊を分解し、前記凝集前単位を混合し、分配し、接近させ、再び凝集させ、成育し、前記凝集塊を回収することをさらに１回又は２回以上繰り返す、
   請求項２に記載の方法。
5. ヒト多能性幹細胞である前記多能性幹細胞を平面培養してコロニーを形成し、
   前記コロニーを分解して前記凝集前単位を生成し、
   前記生成した前記凝集前単位を互いに混合し、
   前記凝集前単位を（Ａ）における分配に用いる、
   請求項１に記載の方法。
6. 前記コロニーを物理的な破砕により前記分解し、
   前記コロニーに対して酵素処理を行わない、
   請求項５に記載の方法。
7. 前記コロニーを酵素処理のみにより前記分解し、
   前記コロニーに対して物理的な破砕を行わない、
   請求項５に記載の方法。
8. 前記コロニーを分解する際、
   前記コロニーに対して、酵素処理及び物理的な破砕を行う、
   請求項５に記載の方法。
9. 前記貫通孔は前記プレートの有する頂面の側に頂部開口を有し、
   前記頂部開口は前記区画間で互いに等しい面積を有し、
   前記頂部開口の直径は１．５ｍｍ以下であり、
   前記頂部開口は前記底部開口よりも大きい、
   請求項１に記載の方法。
10. 前記区画の内接球の直径は５×１０^１μｍ以上かつ１×１０^３μｍ以下であり、
    前記内接球は前記区画の有する底面に接する、
    請求項１に記載の方法。
11. 前記凝集前単位は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
    前記培養液は前記区画の頂部を介して、貯留区画に配置された培養液とつながっており、
    前記貯留区画の前記培養液の中には細胞が配置されない、
    請求項１に記載の方法。
12. 前記貫通孔は前記プレートの有する頂面の側に頂部開口を有し、
    前記分配の際、前記凝集前単位の懸濁液で前記頂面を覆う、
    請求項１に記載の方法。
13. 前記懸濁液には前記頂面の単位面積（１ｃｍ^２）当たり、１個以上かつ５０００個以下の凝集前単位が含まれている、
    請求項１２に記載の方法。
14. 前記凝集前単位は前記区画の中に配置された培養液の中で培養され、
    前記培養液には細胞外マトリックスが懸濁している、又は溶解している、
    請求項１に記載の方法。
15. （Ａ）において前記多能性幹細胞は未分化である、
    請求項１に記載の方法。
16. （Ａ）において前記多能性幹細胞は、Nanog、Oct3/4及びTRA-1-60の少なくともいずれか一つの多能性幹細胞マーカーを発現している、
    請求項１に記載の方法。
17. 凝集塊の集団中の各凝集塊に対してNanog、Oct3/4及びTRA-1-60の少なくともいずれか一つの多能性幹細胞マーカーが陽性であるか否か判定したとき、前記多能性幹細胞マーカーの陽性率が80％以上である、
    請求項１に記載の方法。
18. 試験管内分化誘導系により誘導されることで胚葉体となる凝集塊の割合が、前記凝集塊の集団中80％以上であり、ここで前記胚葉体中では三胚葉の組織が混合している、
    請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも（Ａ）において前記貫通孔は前記プレートの頂部から底部に向かって次第に狭くなっていき、
    前記凝集塊を回収するところ、前記底部開口の直径よりも大きい直径を有する凝集塊に前記底部開口を通過させないことで前記凝集塊をその大きさで篩い分ける、
    請求項１に記載の方法。
20. 前記コロニーを分解して生成されるとともに（Ａ）において分配される前記凝集前単位はシングルセルであり、
    （Ｂ）において凝集塊から生成される前記凝集前単位はシングルセルである、
    請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
21. 多能性幹細胞の増殖又は多能性幹細胞の生存の維持を目的として行う、
    請求項１に記載の方法。
22. 試験管内分化誘導系により分化させることなく、そのまま生体に移植することで生体内分化誘導系にて分化させるための多能性幹細胞の調製を目的として行う、
    請求項１に記載の方法。
23. 請求項１に記載の方法に従い、幹細胞の凝集塊の集団を調製し、さらに
    試験管内分化誘導系により前記凝集塊中の細胞を分化させる、
    細胞培養方法。
24. 前記凝集塊を浮遊培養又は接着培養しながら前記凝集塊中の細胞を分化させる、
    請求項２３に記載の細胞培養方法。
25. 分化誘導を行う際、前記区画内において引き続き前記凝集塊を培養しながら前記凝集塊中の細胞を分化させる、
    請求項２３に記載の細胞培養方法。
26. 前記分化させることにおいて、前記凝集塊中の細胞を多能性幹細胞から外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のいずれかに分化させる、
    請求項２３に記載の細胞培養方法。

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