JP6985795B2 - 標的遺伝子治療のための合成コンビナトリアルａａｖカプシドライブラリー - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１３年９月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／８８３，０６３号（係属中、代理人整理番号３６６８９．３４１）の優先権を主張する。当該仮出願の内容は、その内容の明確な参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
[0002] 本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成番号ＨＬ−０９７０８８及びＧＭ−０８２９４６での政府支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

共同研究契約のある当事者
[0003] 該当なし。

[0004] 本発明は、分子生物学、医学及びウイルス学の分野に関する。より詳細には、本発明は、修飾アデノ随伴ウイルス（AAV）ｃａｐ遺伝子の生産ならびにキメラＡＡＶベクター及びビリオンのコンビナトリアルライブラリーの生産のための、及び特定の実施形態では細胞特異的親和性を提示するビリオンの選択のための、及びまた１つ又は複数の修飾ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含有するヘルパーベクターを生産するための、組成物及び方法に関する。

[0005] 本発明の合成コンビナトリアルＡＡＶカプシドライブラリーは、選択された標的宿主細胞への１つ又は複数の核酸分子の導入に有用である。本明細書において開示されたウイルスベクター及び遺伝子構築物は、様々な遺伝子治療診断及び／又は治療レジメンにも有用である。例示的実施形態では、本発明は、対応する野生型未修飾ＡＡＶよりほぼ２００倍効率的にマウス肝臓に形質導入する新規ＡＡＶ変異体を提供する。

[0006] アデノ随伴ウイルス（AAV）は、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである（Muzyczka及びBerns、2001）。ＡＡＶ由来ベクターは、それらの病原性不在、低い免疫原性、エピソーム局在及び安定した導入遺伝子発現のため、ヒト遺伝子治療用途向けの有望なツールである。しかし、ＡＡＶの臨床使用に対する重大な欠点は、その無差別性及びヒト抗体による中和に対するその感受性である（Jeuneら、2013）。これらの欠点の両方が、カプシドの表面に露出しているアミノ酸残基の性質によって決まる。したがって、有用かつ有効な遺伝子治療ベクターの開発を目的とする主な努力は、カプシド変異体の獲得及び研究に向けられてきた（Wuら、2006）。第一のアプローチは、天然に存在するＡＡＶ分離株の研究であった。今までに、１３の血清型が正式に特性評価されており、何百もの変異体分離株がシークエンシングされている。モザイク（１つより多くの血清型からのカプシドタンパク質で作られたウイルス粒子）（Hauckら、2003；Stachler及びBartlett、2006；Gigoutら、2005）、キメラ（様々な起源のドメインを有するカプシドタンパク質）（Shenら、2007）及び様々な置換又は挿入突然変異体（Wuら、2000）を生じさせることによって、さらなるカプシド変種が研究されている。しかし、最も有意な進歩は、カプシドライブラリーの開発による指向性進化アプローチの結果として生ずると予想される。

[0007] 今までに開発されたカプシドライブラリーを生成するための様々な戦略には、すべて、配列バイアス又は限られた多様性という欠点がある。ランダムディスプレイペプチドライブラリー（Govindasamyら、2006）は、１つの特定のカプシド位置での挿入に限定される。エラープローンＰＣＲを用いて生成されたライブラリーは、突然変異のランダム性のため、正しくフォールディング及び集合して機能性カプシドになることができるタンパク質をコードする遺伝子変異体をごくわずかしか含有しない。ＤＮＡシャッフリング及び付着伸長プロセス（staggered extension process）は、天然に存在する親配列を組み換え、したがって現実的なカプシド変異体を生成する可能性がより高いので、より効率的である。しかし、それらのプロセスは、単一のヌクレオチド位置とは対照的にＤＮＡのブロックを組み換えることしかできず、その結果、配列バイアスが生じる（親の多型性はランダムに分布するのではなく一緒にクラスター化する傾向があると予想される）。

[0008] 本発明は、新規カプシドライブラリーを提供すること、ならびに特定の組織及び／又は器官を有効に標的にすることができるＡＡＶ変異体を開発する方法を提供することにより、当技術分野に固有のこれら及び他の欠点を克服する。ランダムペプチドディスプレイ、エラープローンＰＣＲ又はＤＮＡシャッフリングをはじめとする、ＡＡＶカプシドライブラリーを生成するための様々な戦略が記載されている。本出願に記載する、遺伝子合成に基づく新規アプローチは、カプシド表面に露出している側鎖を有するアミノ酸残基のみの改変を可能にすることはもちろん、天然に存在する変異体に多様性を限定し、このようにしてカプシド構造及び機能との適合性を向上させ、有用な変異体を生成する確率を増加させることも可能にする。

[0009] 加えて、遺伝子合成は、他の方法によって得ることができない特有の組み合わせを生じさせる、天然に存在する配列間のヌクレオチドレベルでバーチャルな組み換えを可能にする。天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質配列の比較は、９つの可変領域（一般にループ１〜９と呼ばれる）を示すが、カプシドの残部は高度に保存される。これらの領域の１つ（ループ２）をコードするＤＮＡ配列は、異なるフレームに別のタンパク質（集合活性化タンパク質（Assembly-Activating Protein）又はAAP）もコードし、そのため修飾は非現実的になるが、ＡＡＰは機能性ウイルス粒子の適切な集合に必要とされる。したがって、本カプシドライブラリー構築は、他の８ループへの変異の導入しか要さない。

[0010] 本発明は、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む天然に存在しない核酸であって、第二のヌクレオチド配列は、（ｉ）第一の血清型のＡＡＶに見られるが第一の血清型とは異なる第二の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）第二の血清型のＡＡＶには見られるが第一の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドとを含み、天然に存在しない核酸は、第一のＡＡＶ末端反復及び第二のＡＡＶ末端反復をさらに含み、第一及び第二のヌクレオチド配列は、第一のＡＡＶ末端反復と第二のＡＡＶ末端反復の間に介在している、天然に存在しない核酸を提供する。第一及び第二のＡＡＶ末端反復は、好ましくは血清型２由来であり、第一の血清型は、好ましくは、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０又は血清型１１である。

[0011] 特定の実施形態において、核酸は、ベクター内に含まれており、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、好ましくは血清型２由来である。

[0012] 関連実施形態において、さらに、核酸は、好ましくはアデノウイルス、ヘルペスウイルス又はそれらの組み合わせからの、１つ又は複数のヘルパー機能を提供する少なくとも１つの分子をコードする第三のヌクレオチド配列をさらに含む。

[0013] 本発明は、少なくとも第一のベクター及び第二のベクターを含むベクターライブラリーであって、第一のベクターは、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む核酸を含み、第二のヌクレオチド配列は、（ｉ）第一の血清型のＡＡＶに見られるが第一の血清型とは異なる第二の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）第二の血清型のＡＡＶには見られるが第一の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドとを含み、核酸は、第一のＡＡＶ ＴＲ及び第二のＡＡＶ ＴＲをさらに含み、第一及び第二のヌクレオチド配列は、第一のＡＡＶ ＴＲと第二のＡＡＶ ＴＲの間に介在しており、第二のベクターは、第一のベクターと少なくとも１ヌクレオチド異なる、ベクターライブラリーも提供する。

[0014] 例示的実施形態では、本発明のベクターライブラリーを少なくとも１つの宿主細胞、例えば哺乳動物又は昆虫宿主細胞に組み込むことができる。

[0015] 本発明は、核酸を含むＡＡＶビリオンであって、核酸は、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列であって、（ｉ）第一の血清型のＡＡＶに見られるが第一の血清型とは異なる第二の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）第二の血清型のＡＡＶには見られるが第一の血清型のＡＡＶには見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドを含む第二のヌクレオチド配列と、（ｃ）第一及び第二のＡＡＶ ＴＲであって、第一及び第二のヌクレオチド配列が、第一のＡＡＶ ＴＲと第二のＡＡＶ ＴＲの間に介在している、ＡＡＶ ＴＲを含む、ＡＡＶビリオンをさらに提供する。

[0016] 特定の実施形態において、ＡＡＶビリオンは、第二のヌクレオチド配列によってコードされた少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を好ましくはさらに含むことになり、特定の用途では、Ｃａｐタンパク質は、好ましくは野生型ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質である。

[0017] 第二のヌクレオチド配列は、第四の血清型のＡＡＶに見られるが第一、第二又は第三の血清型のＡＡＶのＣａｐタンパク質には見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドをさらに任意選択により含むことがあり、及び第五の血清型のＡＡＶに見られるが第一、第二、第三又は第四の血清型のＡＡＶのＣａｐタンパク質には見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドをさらになお含むことがある。

[0018] さらなる実施形態において、本発明のＡＡＶビリオンは、第六の血清型のＡＡＶに見られるが第一、第二、第三、第四又は第五の血清型のＡＡＶのＣａｐタンパク質には見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、第二のヌクレオチド配列を含むことになる。

[0019] 同様に、本発明のＡＡＶビリオンは、第七の血清型のＡＡＶに見られるが第一、第二、第三、第四、第五もしくは第六の血清型のＡＡＶのＣａｐタンパク質には見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドをさらに含むか、又はそれと類似して、第八の血清型のＡＡＶに見られるが第一、第二、第三、第四、第五、第六もしくは第七の血清型のＡＡＶのＣａｐタンパク質には見られないＣａｐタンパク質の部分をコードするポリヌクレオチドを含む、第二のヌクレオチド配列を含むことがある。

[0020] 本開示発明の様々な遺伝子治療用途において、ＡＡＶベクター内に含有される核酸は、１つ又は複数の診断用、治療用及び／又は予防用分子をコードするＤＮＡ配列を好ましくはさらに含むことになる。そのような実施形態において、核酸は、治療用分子の細胞特異的又は組織特異的発現を生じさせる１つ又は複数の発現制御配列を好ましくはさらに含む。特定の実施形態において、発現制御配列は、好ましくはポリペプチド、ペプチド又はＲＮＡである治療用分子をコードする配列に作動可能に連結されている１つ又は複数のプロモーターを含む。

[0021] 本発明の原理の理解を促すために、次に、図面で例証する実施形態又は実施例に言及し、特定の言葉を用いてそれらを説明することにする。しかしながら、それによって本発明の範囲が限定されないことが理解されると予想される。記載する実施形態の任意の変更形態及びさらなる修飾形態、ならびに本明細書に記載の本発明の原理のさらなる応用例は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に思い付くものであると考えられる。

[0022] 以下の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の特定の態様を実証するために含めるものである。本出願は、色彩を付して作成されている少なくとも１つの図面を含む。彩色図面を伴う本特許又は特許出願公開の写しは、請求及び所要の手数料の納付により特許商標庁によって提供されることになる。同じ参照番号によって同じ要素が識別される添付の図面を併用して以下の説明を参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。

[0023]ＣａｐＬｉｂ可変領域（VR）のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸多様性を示す図である。各ＶＲ領域は、黄色でハイライトされている縮重位置（IUPACヌクレオチドコード）を含む、設計され、合成オリゴヌクレオチドによってコードされた、ヌクレオチド配列（小文字）を示す。すべての可能性のあるコドンの組み合わせによってコードされた対応するアミノ酸配列（ヌクレオチド配列の上の大文字）を列に並べて上に示す。青色でハイライトされているアミノ酸を選択してライブラリー配列に含めた。それらは、ライブラリー設計に使用した天然に存在する１５０の変異体の１つ又は複数に見られたが、ハイライトされていないものは、縮重ヌクレオチドによってコードされたさらなるアミノ酸多様性を表すからである。オレンジ色でハイライトされているのは、設計中に形質導入効率を増加させる（Y/F）又はヘパリン結合を除去する（R/A）ために導入したＷＴ ＡＡＶ２配列によってコードされないアミノ酸残基である。ロゴスタイルのアミノ酸残基は、ライブラリーウイルスＤＮＡのＮｅｘｔＧｅｎシークエンシングから演繹された配列のアラインメントを示す。Ｘ軸は、残基位置（VP1ナンバリング）を示し、Ｙ軸は、各アミノ酸のその位置での相対頻度を示す。アミノ酸は、それらの化学的特性に従って彩色されている：極性アミノ酸は緑色であり、塩基性アミノ酸は青色であり、酸性アミノ酸は赤色であり、疎水性アミノ酸は黒色である。 ＣａｐＬｉｂ可変領域（VR）のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸多様性を示す図である。各ＶＲ領域は、黄色でハイライトされている縮重位置（IUPACヌクレオチドコード）を含む、設計され、合成オリゴヌクレオチドによってコードされた、ヌクレオチド配列（小文字）を示す。すべての可能性のあるコドンの組み合わせによってコードされた対応するアミノ酸配列（ヌクレオチド配列の上の大文字）を列に並べて上に示す。青色でハイライトされているアミノ酸を選択してライブラリー配列に含めた。それらは、ライブラリー設計に使用した天然に存在する１５０の変異体の１つ又は複数に見られたが、ハイライトされていないものは、縮重ヌクレオチドによってコードされたさらなるアミノ酸多様性を表すからである。オレンジ色でハイライトされているのは、設計中に形質導入効率を増加させる（Y/F）又はヘパリン結合を除去する（R/A）ために導入したＷＴ ＡＡＶ２配列によってコードされないアミノ酸残基である。ロゴスタイルのアミノ酸残基は、ライブラリーウイルスＤＮＡのＮｅｘｔＧｅｎシークエンシングから演繹された配列のアラインメントを示す。Ｘ軸は、残基位置（VP1ナンバリング）を示し、Ｙ軸は、各アミノ酸のその位置での相対頻度を示す。アミノ酸は、それらの化学的特性に従って彩色されている：極性アミノ酸は緑色であり、塩基性アミノ酸は青色であり、酸性アミノ酸は赤色であり、疎水性アミノ酸は黒色である。 [0024]ＣａｐＬｉｂ設計及び構築工程の略図を示す図である。数字がそれぞれのアミノ酸残基を表すチャートの最上部にＡＡＶ２カプシドが示されている。可変領域（VR）サブライブラリーをパッケージングし、精製した（区別をつけて彩色したVRによって示されている）。これらの個々のサブライブラリーからのＤＮＡを精製し、最終的な組み合わせライブラリーを構築するために使用した。 [0025]ＡＡＶ２カプシド表面の可変領域（VR）を示す図である。８つのＶＲの位置を表示し、単量体の画像の下に記載されているように彩色された、（右に示されている60 VP3単量体から集合させた）ＡＡＶ２カプシド完全カプシド。 ＡＡＶ２カプシド表面の可変領域（VR）を示す図である。ＬｉＡ完全カプシド変異体及びその単量体。突然変異残基及びそれらの位置を色によって及び数字によってそれぞれ示す。 ＡＡＶ２カプシド表面の可変領域（VR）を示す図である。ＬｉＣ完全カプシド変異体及びその単量体。突然変異残基及びそれらの位置を色によって及び数字によってそれぞれ示す。 [0026]パッケージングされたウイルスライブラリーの複雑度の分析を示す図である。８４０の個々のタンパク質配列からコンピュータ計算されたウイルスライブラリーのシャノンエントロピー。Ｘ軸は残基位置（VP1ナンバリング）を示し、Ｙ軸は、コンピュータ計算されたエントロピー値を示す。 パッケージングされたウイルスライブラリーの複雑度の分析を示す図である。明確に異なるカプシド配列及びそれらのコピー数の分布。 パッケージングされたウイルスライブラリーの複雑度の分析を示す図である。分析したタンパク質配列のサンプルにおける突然変異数の分布。 パッケージングされたウイルスライブラリーの複雑度の分析を示す図である。突然変異体ＶＲ数の分布。グラフの右に示されているそれぞれの色によって、突然変異ＶＲの種々の組み合わせが示されている。最もよく遭遇する突然変異体ＶＲの組み合わせも、それぞれのグラフ領域の上にローマ数字によって記されている。 パッケージングされたウイルスライブラリーの複雑度の分析を示す図である。突然変異体残基の予想百分率と実測百分率の比較。Ｘ軸は残基位置（VP1ナンバリング）を示し、それぞれのＶＲ境界がよりよい定位のためにアミノ酸番号の下に示されている。Ｙ軸は、予想された（設計によって導入された）突然変異の百分率（青色）対プラスミドライブラリーのシークエンシングから実験によって演繹された百分率（赤色）対ウイルスライブラリーのシークエンシングから実験によって演繹された百分率（緑色）を示す。各位置でのグラフの高さの類似は、カプシド集合／構造についてのこの位置の相対的中立性を示し、これに対して理論配列（青色）とプラスミド由来配列（赤色）との差は、１つの単一ＶＲライブラリーの中での、又は組み合わせウイルスライブラリー（緑色）内のすべての突然変異ＶＲという状況の中での、この特定の突然変異残基に対する選択圧を示す。シークエンシングされたプラスミドライブラリーのサンプルは、サンプリング表示が少なかったため個々にシークエンシングされたランダムクローンを２１個しか含まなかったので、実測突然変異体数（赤色）は、ｗｔ ＡＡＶ２残基を（残基４４４、５００及び５８８を除いて）常に含む予想頻度（青色）を上回ることもある。 [0027]ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。マウス肝臓における３ラウンドの指向性進化後にライブラリーから選択された変異体の可変領域（VR）のアミノ酸配列。比較のためにｗｔ ＡＡＶ２配列が太字で示されている。 ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。示されているカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶベクターの尾静脈投与後４０日の時点でのマウスの肝臓におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現。 ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。インビボでのルシフェラーゼイメージングによって評定したときの肝臓におけるｒＡＡＶ−Ｌｕｃ発現の経時変化。Ｙ軸は、生物発光レベルを示す（ｎ＝３マウス／群）。 ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。ＡＡＶ８カプシド（赤色）、ＬｉＣカプシド（緑色）又はＡＡＶ２−Ｍ３カプシド（三重AAV2突然変異体Y444F、Y500F及びY730F、青色）のいずれかにパッケージングされたＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸ導入遺伝子カセットの末梢静脈送達（１０１０ｖｇ／マウス、ｎ＝４／群）後３カ月にわたっての血友病Ｂ（C3H/HeJ/F9-/-）マウスにおけるヒトＦ．ＩＸの全身性発現。 ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。ＡＡＶ８カプシド（赤色）又はＬｉＡカプシド（黄色）のいずれかにパッケージングされたＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ−ｈＦ．ＩＸ導入遺伝子カセットの末梢静脈送達（１０^１０ｖｇ／マウス、ｎ＝４／群）後４週間の時点での血友病Ｂ（C3H/HeJ/F9-/-）マウスにおけるヒトＦ．ＩＸの全身性発現。 ネズミ肝臓からの新たな変異体の選択を示す図である。ＡＡＶ２及びＡＡＶ８（Ｘ軸）と比較した、ＢＡＬＢ／ｃオスマウス（ｎ＝３）における末梢静脈送達の２３日後に行ったＬｉＡ及びＬｉＣ変異体（ゲノムＤＮＡ １ｎｇ当たりのウイルスゲノム数として作表、Ｙ軸）の体内分布研究。選択された変異体ＬｉＡ及びＬｉＣの主として肝臓特異的な標的指向化に留意されたい。 [0028]ＣａｐＬｉｂ−３Ａ及びＣａｐＬｉｂ−３Ｂプラスミド及びウイルスライブラリーにおける可変領域ＶＩＩＩ（VR-VIII）のヌクレオチド配列を示す図である。すべての突然変異ＶＲを１つのライブラリーに組み合わせたときの１つのＶＲ（VR-VIII）内の個々のアミノ酸残基に対する選択圧の例証となる生シークエンシングデータが示されている。突然変異誘発及びｗｔ ＡＡＶ２参照配列が下に示されている。 [0029]コンセンサス及び４つより多くのコピーに見られた配列における突然変異領域のアラインメントを示す図である。アミノ酸置換がハイライトされており、コンセンサス（一番上の配列）に存在するものは黄色である。コンセンサスの下の９配列は、４つより多くのコピーに見られたものであり、コピー数が左側に示されている。突然変異の総数が各配列の右に示されている。 [0030]可変位置におけるアミノ酸組成を示す図である。Ｘ軸は、残基位置（VP1ナンバリング）を示し、Ｙ軸は、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。アミノ酸の色分けがグラフの右に示されている。それぞれのＶＲ境界がよりよい定位のためにアミノ酸番号の下に示されている。 [0031]各可変アミノ酸位置での理論複雑度と実験に基づく複雑度の比較を示す図である。Ｘ軸は、残基位置（VP1ナンバリング）を示し、Ｙ軸は、突然変異の総数によって表された、その位置での理論複雑度（青色）及び実験に基づく複雑度（赤色）を示す。それぞれのＶＲ境界がよりよい定位のためにアミノ酸番号の下に示されている。 [0032]インビボ指向性進化の略図を示す図である。ウイルスライブラリーを静脈内注射する（尾静脈）。注射の３日後、肝臓を採取し、コラゲナーゼ／プロテアーゼ処置に付す。エピソームＨｉｒｔ ＤＮＡを全器官から単離し、それを用いてＡＡＶカプシド遺伝子配列を増幅した。新たな、ラウンド１濃縮ライブラリーを調製し、そのサイクルを繰り返した。３サイクル後、個々のクローンをシークエンシングし、分析した。反復変異体を選択し、ｃａｐ遺伝子配列をサブクローニングしてヘルパープラスミドを得た。その後、レポーター遺伝子を組み込んでいるｒＡＡＶベクターをパッケージングし、静脈内投与後にそれらの体内分布を分析した。 [0033]バーコード付きＡＡＶカセットを示す図である。上部 − バーコード付きＡＡＶ導入遺伝子カセットの略図：ＴＲ − ＡＡＶ２末端反復；ＣＢＡ − ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター；ｌｕｃ − ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ；フーリン−２Ａ − フーリン切断部位^４１、続いて口蹄疫ウイルス２Ａリボソームスキップペプチド^４２；ｐＡ − ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化部位。下部 − 利用可能な６ｎｔ識別子（バーコード）のリスト。 [0034]断片３組み立ての略図を示す図である。上の標準足場オリゴヌクレオチド（黒色で示されている）を下の標準アンカー（赤色で示されている）オリゴヌクレオチドにアニールした。縮重位置（IUPACヌクレオチドコード）が黄色背景によってハイライトされている。

[0035] 本発明の例証となる実施形態を下に記載する。明瞭にするために、実際の実施についての特徴のすべては本明細書に記載しない。いずれのそのような実際の実施形態の開発においても、実施ごとに異なる開発者の特定の目標、例えばシステムに関連した及び事業に関連した制約の順守、を達成するために、非常に多くの実施特異的決断をなさねばならないことは当然ながら理解されると予想される。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかることもあるが、本開示の恩恵を受ける当業者にとって日常的な作業であろうことは理解されると予想される。

[0036] 本発明は、１つ又は複数の細胞成分の欠乏の結果として生ずる１つ又は複数の疾患、障害又は機能不全の予防、処置及び／又は改善のための薬物の調製に有用な１つ又は複数の治療薬をコードする改善されたｒＡＡＶベースの遺伝子構築物も提供する。詳細には、本発明は、目的の１つ又は複数の選択された分子、例えば、哺乳動物の疾患、障害、機能不全、欠乏症、欠損、外傷、傷害などの症状の診断、予防、処置及び／又は改善に使用するための１つ又は複数の診断又は治療薬（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、siRNA、RNAi、アンチセンスオリゴ−及びポリ−ヌクレオチド、リボザイム、ならびにそれらの変異体及び／又は活性断片を含む）など、をコードするｒＡＡＶベースの遺伝子構築物のライブラリーを提供する。

[0037] 本発明は、感染性ｒＡＡＶビリオン、ならびに本明細書に記載される新規ＡＡＶベクターをコードする核酸分子及びｒＡＡＶベクター、ならびに哺乳動物細胞の選択された集団に送達するための１つ又は複数の選択された診断及び／又は治療薬をコードする核酸も提供する。

[0038] 好ましくは、本明細書において開示の新規ｒＡＡＶベクター、発現構築物ならびにそれらを含む感染性ビリオン及びウイルス粒子は、野生型未修飾発現構築物、ならびにそれらを含む対応するｒＡＡＶベクター及びビリオンと比較して、目的の様々な細胞、組織及び器官の１つ又は複数を形質導入する上で改善された効率を好ましくは有する。

[0039] 本明細書において提供する改善されたｒＡＡＶベクターは、従来の野生型（すなわち「未修飾」）ｒＡＡＶベクターより高い効率（及び多くの場合、はるかに高い効率）で１つ又は複数の選択された宿主細胞に形質導入することができる。同様に、本明細書に記載されるように調製されたベクターは、様々なＡＡＶ血清型のものであることができ、本明細書に記載される配列の１つ又は複数についての突然変異は、突然変異体を調製した対応する非置換ベクターのものより高効率の形質導入が可能である改善されたウイルスベクターをもたらすことができる。

[0040] 次世代ｒＡＡＶウイルスベクターの開発は、従来の遺伝子治療レジメンに必要とされるウイルス粒子の数を劇的に低減させることができる。様々な哺乳動物細胞に対する改善された形質導入効率を有することに加えて、本明細書に記載されるように調製されたｒＡＡＶベクターは、従来の様式で調製された等価の野生型ウイルスベクターより、安定が高い可能性があり、免疫原性が低い可能性があり、及び／又ははるかに低い費用で、もしくはより高い力価で生産することができる。

[0041] 本発明の実施の際、ウイルスカプシドタンパク質の配列内に通常存在するネイティブアミノ酸を１つ又は複数の非ネイティブアミノ酸によって置換することがあり、これは、対応する野生型タンパク質における特定の残基には通常存在しない１つ又は複数のアミノ酸の置換を含む。

[0042] 本発明は、本明細書に記載の本開示ウイルスベクターの１つ又は複数をコードする、単離され精製されたポリヌクレオチド、ならびにそのようなベクターをコードするポリヌクレオチドも提供する。好ましくは、本発明のベクター構築物は、少なくとも１つの核酸セグメントであって、このベクターを含む適切な宿主細胞においてその核酸セグメントを発現することが可能なプロモーターに作動可能に連結されている診断用又は治療用分子をコードする少なくとも１つの核酸セグメントをさらに含む。

[0043] 本発明の実施の際、突然変異ｒＡＡＶベクターの形質導入効率は、対応する未修飾野生型ベクターのものより高くなり、したがって、選択された哺乳動物宿主細胞では対応する未修飾ｒＡＡＶベクターを含むビリオンのものに比べて少なくとも２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍又は少なくとも約１２倍以上である、哺乳動物細胞における形質導入効率を好ましくは保有することになる。特定の実施形態では、本明細書において提供するｒＡＡＶベクターの形質導入効率は、対応する野生型ベクターを含むビリオンのものより少なくとも約１５倍高く、少なくとも約２０倍高く、少なくとも約２５倍高く、少なくとも約３０倍高く、又は少なくとも約４０、４５もしくは５０倍以上大きくなる。

[0044] 本発明は、核酸セグメントが、目的の選択されたポリヌクレオチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されているプロモーター、エンハンサー、転写後調節配列、ポリアデニル化シグナル又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む、ｒＡＡＶベクターにも関わる。好ましくは、プロモーターは、異種プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又はそれらの任意の組み合わせである。特定の実施形態において、本明細書に記載される新規ｒＡＡＶ発現ベクターの１つ又は複数にクローニングされる核酸セグメントは、好ましくは、１つ又は複数のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを発現又はコードすることになる。

[0045] 本明細書中で述べるように、本発明において有用な治療薬は、１つ又は複数のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、赤血球生成剤（erythropoietic agent）、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経成長因子、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質又はその１つもしくは複数の阻害剤、セロトニン受容体又はその１つもしくは複数の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制因子、診断用分子、化学療法薬、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

[0046] 本発明者らは、特定の遺伝子治療方法でのｒＡＡＶ２ベースのベクターの使用を特に企図しているが、ベクターを調製し、例えばＡＡＶ血清型１（AAV1）、ＡＡＶ血清型３（AAV3）、ＡＡＶ血清型４（AAV4）、ＡＡＶ血清型５（AAV5）、ＡＡＶ血清型６（AAV6）、ＡＡＶ血清型７（AAV7）、ＡＡＶ血清型８（AAV8）、ＡＡＶ血清型９（AAV9）、ＡＡＶ血清型１０（AAV10）、ＡＡＶ血清型１１（AAV11）又はＡＡＶ血清型１２（AAV12）を含む、任意の公知ＡＡＶ血清型のビリオンの中にパッケージングすることもできる。

[0047] 本発明は、本明細書において調製されるようなｒＡＡＶベクターの集団及び複数のｒＡＡＶベクター、ならびにそれらをコードする１つ又は複数の核酸セグメントを含むビリオン、感染性ウイルス粒子及び哺乳動物宿主細胞をさらに提供する。

[0048] 好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、これらに限定されないが、例えば血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４^＋細胞、肝臓細胞、癌細胞、血管細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞を含む、ヒト宿主細胞であるか、肝（すなわち肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち腎臓）細胞、神経細胞、血液細胞、骨髄細胞又はウイルスベースの遺伝子治療が企図される哺乳動物の任意の１つもしくは複数の選択された組織を含む、哺乳動物由来の任意の他の細胞であると予想される。

[0049] 本発明は、本発明のタンパク質、核酸セグメント、ウイルスベクター、宿主細胞又はウイルス粒子のうちの１つ又は複数を１つ又は複数の医薬的に許容される緩衝剤、希釈剤又は賦形剤と共に含む、組成物及び製剤をさらに提供する。そのような組成物を、哺乳動物の疾患、傷害、障害、外傷又は機能不全の１つ又は複数の症状を診断、予防、処置又は改善するための１つ又は複数の診断用又は治療用キットに含めることができる。

[0050] 本発明は、診断又は治療有効量の選択された生体分子を、それを必要としている哺乳動物に提供する方法をさらに含み、この方法は、診断又は治療有効量の選択された生体分子を哺乳動物に提供するために有効な量のｒＡＡＶベクターを有効な時間にわたってそれを必要としている哺乳動物の細胞、組織又は器官に提供することを含む。

[0051] 本発明は、哺乳動物の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態又は外傷の少なくとも１つ又は複数の症状を診断、予防、処置又は改善する方法をさらに提供する。全体的かつ一般的な意味で、この方法は、開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を、哺乳動物の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態又は外傷の１つ又は複数の症状の診断、予防、処置又は改善に十分な量で、十分な時間にわたって、それを必要としている哺乳動物に投与する工程を少なくとも含む。

[0052] 本発明は、哺乳動物細胞の集団に形質導入する方法も提供する。全体的かつ一般的な意味で、この方法は、有効量の本明細書において開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を含む組成物を集団の１つ又は複数の細胞に導入する工程を少なくとも含む。

[0053] さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載の突然変異体ウイルスカプシドタンパク質の１つ又は複数をコードする単離された核酸セグメントも提供し、本明細書中で説明され検定される改善されたベクター配列の１つ又は複数を含む組み換えベクター、ウイルス粒子、感染性ビリオン及び単離された宿主細胞を提供する。

[0054] 加えて、本発明は、組成物ならびに治療用及び／又は診断用キットを提供し、治療用及び／又は診断用キットは、１つもしくは複数のさらなる成分を用いて製剤化される、又はキットの使用のための１つもしくは複数の説明書を用いて調製される、開示されたＡＡＶ組成物の１つ又は複数を含む。

[0055] 本発明は、開示された改善されたｒＡＡＶベクターを製造する方法、ならびに例えばエクスサイチュー、インビトロ及びインビボ適用、方法論、診断手順及び／又は遺伝子治療レジメンをはじめとする様々な方法で使用する方法も実証する。本明細書に記載される改善されたベクターの多くは、耐プロテアソーム分解性でもあるので、有意に増加したインビボ形質導入効率を保有し、そのためウイルスベクターベースのヒト遺伝子治療レジメンに、詳細には、選択された哺乳動物細胞への１つ又は複数の遺伝子構築物のインビボ及び／又はインビトロ送達に、特によく適している。

[0056] 一態様では、本発明は、１つ又は複数の有益な又は治療用の製品をコードする遺伝子材料を哺乳動物細胞及び組織に送達する方法に有用な、ＡＡＶベクター、ビリオン、ウイルス粒子及びそれらの医薬製剤を含む組成物を提供する。詳細には、本発明の組成物及び方法は、１つ又は複数の哺乳動物疾患の症状の処置、予防及び／又は改善にそれらを使用することにより、技術の有意な向上をもたらす。ヒト遺伝子治療は、多数の異なる疾患、障害及び機能不全の処置に使用するための新たな改善されたウイルスベクター構築物を提供することによる本教示からの恩恵に特に浴することになると考えられる。

[0057] 別の態様では、本発明は、選択された哺乳動物細胞への１つ又は複数の治療薬の送達に有用な改善された特性を明示するｒＡＡＶベクター突然変異体のライブラリーであって、そのベクター構築物を導入することができる哺乳動物の１つ又は複数の障害の予防、処置及び／又は改善に特に使用するためのライブラリーに関わる。

[0058] 本発明のｒＡＡＶベクターは、核酸セグメントに各々が作動可能に連結されている１つ又は複数のエンハンサー配列を任意選択によりさらに含むことができる。例示的エンハンサー配列としては、ＣＭＶエンハンサー、合成エンハンサー、肝臓特異的エンハンサー、血管特異的エンハンサー、脳特異的エンハンサー、神経細胞特異的エンハンサー、肺特異的エンハンサー、筋肉特異的エンハンサー、腎臓特異的エンハンサー、膵臓特異的エンハンサー及び膵島細胞特異的エンハンサーからなる群より選択される１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。

[0059] 本発明の実施に有用な例示的プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、インスリンプロモーター、エノラーゼプロモーター、ＢＤＮＦプロモーター、ＮＧＦプロモーター、ＥＧＦプロモーター、成長因子プロモーター、軸索特異的プロモーター、樹状突起特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、海馬特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、エラフィンプロモーター、サイトカインプロモーター、インターフェロンプロモーター、成長因子プロモーター、α１アンチトリプシンプロモーター、脳細胞特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、中枢神経系細胞特異的プロモーター、末梢神経系細胞特異的プロモーター、インターロイキンプロモーター、セルピンプロモーター、ハイブリッドＣＭＶプロモーター、ハイブリッドβアクチンプロモーター、ＥＦ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、Ｔｅｔ誘導性プロモーター、ＶＰ１６−ＬｅｘＡプロモーター又はこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるプロモーターを含むがそれらに限定されない、１つ又は複数の異種、組織特異的、構成的又は誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例示的実施形態において、プロモーターは、哺乳動物又はトリβアクチンプロモーターを含むこともある。

[0060] ベクターをコードする核酸セグメントは、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素、ポリアデニル化シグナル配列又はこれらの任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない、１つもしくは複数の転写後調節配列又は１つもしくは複数のポリアデニル化シグナルをさらに含むこともある。

[0061] 本発明のベクター構築物によって宿主細胞に送達可能な例示的診断又は治療薬としては、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチドからなる群より選択される薬剤、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。

[0062] 例示的実施形態において、開示された方法によって得られるｒＡＡＶベクターは、分子マーカー、アドレナリン作動性アゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、細胞毒、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経性因子、神経性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸アンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ阻害剤、タンパク質分解性タンパク質、タンパク質分解性タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制因子及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの診断用又は治療用タンパク質又はポリペプチドを好ましくはコードすることになる。

[0063] 特定の用途では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、ＩＦＮ、ＩＦＧ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＥＤＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ２、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、プロラクチン、ソマトトロピン、ＸＩＡＰ１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０（I87A）、ウイルスＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸セグメントを含むことがある。

[0064] 別の実施形態では、本発明は、細胞における１つ又は複数の内因性生物学的プロセスの活性を改変する、阻害する、低減させる、妨げる、排除する又は損なわせる１つ又は複数の治療薬をコードする第一の核酸セグメントを少なくとも含む、遺伝子修飾され、形質導入効率が改善されたｒＡＡＶベクターに関わる。特定の実施形態において、そのような治療薬は、１つ又は複数の代謝プロセス、機能不全、障害又は疾患の作用を選択的に阻害する又は低減させるものであってもよい。特定の実施形態では、処置が望まれる哺乳動物への傷害又は外傷が欠損の原因となることがある。他の実施形態では、内因性生体化合物の過剰発現が欠損の原因となることがあるが、それにもかかわらず他の実施形態では、１つ又は複数の内因性生体化合物の過小発現又はさらには欠如が欠損の原因となることもある。

[0065] 本発明の遺伝子修飾ｒＡＡＶベクター及び発現系は、修飾ｒＡＡＶベクターによって発現された目的のヌクレオチド配列の転写を改変する、改善する、調節する、及び／又は転写に影響を及ぼす、１つもしくは複数のエンハンサー、１つもしくは複数の調節要素、１つもしくは複数の転写要素又はこれらの任意の組み合わせを含む、から本質的になる、又はからなる第二の明確に異なる核酸セグメントも任意選択によりさらに含むことがある。

[0066] 例えば、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＣＭＶエンハンサー、合成エンハンサー、細胞特異的エンハンサー、組織特異的エンハンサー又はこれらの任意の組み合わせを含む、から本質的になる、又はからなる第二の核酸セグメントをさらに含むことがある。第二の核酸セグメントは、さらに、１つもしくは複数のイントロン配列、１つもしくは複数の転写後調節要素又はこれらの任意の組み合わせを含む、から本質的になる、又はからなることもある。

[0067] 本発明の改善されたベクター及び発現系は、ｒＡＡＶベクターのそのベクター内の選択された部位への１つ又は複数の選択された遺伝要素、目的の遺伝子、又は治療用もしくは診断用構築物の挿入（クローニング）を助長するために、１つ又は複数のポリリンカー、制限部位及び／又は複数のクローニング領域を含む、から本質的になる、又はからなるポリヌクレオチドを任意選択によりさらに含むこともある。

[0068] 本発明のさらなる態様において、本明細書において開示された改善されカプシド修飾されたｒＡＡＶベクターによって適切な宿主細胞に送達することができる外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは哺乳動物由来であり、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、エピン（epine）、ヤギ又はオオカミ由来の１つ又は複数のポリペプチド又はペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。

[0069] 開示されたカプシド修飾されたウイルスベクターによって宿主細胞に送達することができる外因性ポリヌクレオチドは、特定の実施形態では、１つもしくは複数のタンパク質、１つもしくは複数のポリペプチド、１つもしくは複数のペプチド、１つもしくは複数の酵素、又は１つもしくは複数の抗体（又はその抗原結合断片）をコードすることがあり、あるいは代替的に、１つもしくは複数のｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ分子、又はそれらの任意の組み合わせを発現することがある。併用遺伝子治療が所望される場合、２つ以上の異なる分子を単一のｒＡＡＶ発現系から生成してもよく、又は代替的に、治療薬をコードする１つ又は複数の明確に異なるポリヌクレオチドを各々が含むことができる２つ以上の特有のｒＡＡＶ発現系を選択された宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。

[0070] 他の実施形態において、本発明は、感染性アデノ随伴ウイルス粒子又はビリオンの中に含まれているｒＡＡＶベクター突然変異体、ならびに複数のそのようなビリオン又は感染性粒子も提供する。そのようなベクター及びビリオンは、１つ又は複数の希釈剤、緩衝剤、生理溶液もしくは医薬ビヒクルの中に含まれていることがあり、又は１つもしくは複数の診断、治療及び／もしくは予防レジメンで哺乳動物に投与するために製剤化されることもある。本発明のベクター、ウイルス粒子、ビリオン及び複数のそれらを選択された家畜、外来種、飼いならされた動物及びコンパニオンアニマル（ペットなどを含む）への、ならびに非ヒト霊長類、動物標本又は別様に捕獲された標本などへの獣医学的投与に許容可能である賦形剤配合物で提供することもできる。

[0071] 本発明は、開示されたｒＡＡＶ発現ベクターの少なくとも１つ、又はそのような発現ベクターを含む１つもしくは複数のウイルス粒子もしくはビリオンを含む、宿主細胞にも関わる。そのような宿主細胞は、特に哺乳動物宿主細胞であり、ヒト宿主細胞が特に非常に好ましく、単離されることもあり、細胞又は組織培養されていることもある。遺伝子修飾動物モデルの場合、形質転換宿主細胞が非ヒト動物自体の体内に含まれることさえある。

[0072] 特定の実施形態において、開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を含む、組み換え非ヒト宿主細胞及び／又は単離された組み換えヒト宿主細胞の生成はまた、例えば本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターの大規模な量の生産手段を含む、様々な診断及び実験室的プロトコルに有用であると考えられる。そのようなウイルス生産方法は、特に、遺伝子治療ツールとして有用であるために非常に高力価のウイルスストックを要するものを含む既存の方法論に対する改善であると考えられる。本発明者らは、本方法の１つの非常に有意な利点は、より低い力価のウイルス粒子を哺乳動物形質導入プロトコルにおいて用いることができること、それにもかかわらず適切なレベルの形質転換率をなお保持することができることであるだろうと考えている。

[0073] 開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、感染性ＡＡＶ粒子又は宿主細胞のうちの１つ又は複数を含む組成物、特に、治療に使用するための、及び１つ又は複数の哺乳動物疾患、障害、機能不全又は外傷の処置用の薬物の製造に使用するための、少なくとも第一の医薬的に許容される賦形剤をさらに含む組成物も、本発明の一部を構成する。そのような医薬組成物は、１つもしくは複数の希釈剤、緩衝剤、リポソーム、脂質、脂質複合体を任意選択によりさらに含むことがあり、又はチロシン修飾されたｒＡＡＶベクターがマイクロスフェアもしくはナノ粒子の中に含まれていることもある。

[0074] 例えば、体内の１つ又は複数の器官、組織又は細胞タイプへの直接注射に適している製剤を含めて、筋肉内注射、静脈内注射、あるいはヒト又は他の哺乳動物の器官もしくは組織又は複数の細胞もしくは組織への直接注射に適した医薬製剤が特に好ましいが、本明細書において開示された組成物を哺乳動物の別個の（discreet）身体領域への投与に利用することもできる。そのような注射部位としては、これらに限定されないが、脳、関節もしくは関節包、滑膜もしくは滑膜下組織、腱、靭帯、軟骨、骨、哺乳動物関節の関節周囲の筋肉又は関節窩が挙げられ、同様に、例えば腹腔内、胸腔内、血管内又は脳室内送達によるウイルスベクターの導入などの、器官、例えば心臓、肝臓、肺、膵臓、腸、脳、膀胱、腎臓、又は患者の体内の他の部位への直接投与も挙げられる。

[0075] 本発明の他の態様は、例えば、適切な手段により、例えば筋肉内注射、静脈内注射、関節内注射又は選択された哺乳動物の１つもしくは複数の細胞、組織もしくは器官への直接注射によって、哺乳動物に投与することを意図したベクターの医薬製剤などの、本明細書において開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を含む、から本質的になる、又はからなる組み換えアデノ随伴ウイルスビリオン粒子、組成物及び宿主細胞に関わる。典型的に、そのような組成物は、本明細書において下で説明するような医薬的に許容される賦形剤を用いて製剤化することができ、治療が望まれる選択された器官、組織及び細胞への投与を助長するために１つ又は複数のリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア又はナノ粒子製剤を含むことができる。

[0076] 開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数（及びそのようなベクターを含む１つ又は複数のビリオン、ウイルス粒子、形質転換宿主細胞又は医薬組成物）を含むキットであって、そのようなキットを１つ又は複数の治療、診断及び／又は予防臨床実施形態において使用するための説明書を含むキットも、本発明によって提供される。そのようなキットは、１つ又は複数の試薬、制限酵素、ペプチド、治療薬、医薬化合物、又は宿主細胞へのもしくは動物への組成物の送達手段（例えば、注射器、注射剤など）をさらに含むこともある。例示的キットは、疾患、欠乏症、機能不全及び／もしくは傷害の症状を処置、予防もしくは改善するためのものを含み、又はウイルスベクター自体の大規模生産のための、例えば商業販売用の、もしくは例えばウイルス学者、医療従事者などを含む他者による使用のための成分を含むこともある。

[0077] 本発明の別の重要な態様は、動物、特に脊椎動物の疾患、機能不全、障害、異常状態、欠乏症、傷害又は外傷の少なくとも１つ又は複数の症状を診断、予防、処置又は改善するための薬物の調製における、本明細書に記載の開示されたｒＡＡＶベクター、ビリオン、発現系、組成物及び宿主細胞の使用方法に関わる。そのような方法は、一般に、開示されたベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、組成物又は複数のそれらのうちの１つ又は複数を、罹患動物のそのような疾患、機能不全、障害、異常状態、欠乏症、傷害又は外傷の１つ又は複数の症状の診断、予防、処置又は軽減に十分な量で、十分な時間にわたって、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む。当該方法は、そのような状態を有する疑いがある動物の予防的処置、又は診断後もしくは症状の発症前のいずれかにそのような状態が発現するリスクがある動物へのそのような組成物の投与も包含しうる。

[0078] 上で説明したように、外因性ポリヌクレオチドは、１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれらの組み合わせを好ましくはコードすることになる。実際、外因性ポリヌクレオチドは、２つ以上のそのような分子、又は複数のそのような分子を所望に応じてコードすることができる。併用遺伝子治療が所望される場合、２つ以上の異なる分子を単一のｒＡＡＶ発現系から生成してもよく、又は代替的に少なくとも２つの異なるそのような分子をコードする特有の異種ポリヌクレオチドを各々が含むと予想される２つ以上の特有のｒＡＡＶ発現系を選択された宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。

[0079] 開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、感染性ＡＡＶ粒子、宿主細胞の１つ又は複数を含む組成物、特に、薬物の製造及びそのようなｒＡＡＶベクターの治療的投与を含む方法において使用するために少なくとも第一の医薬的に許容される賦形剤をさらに含む組成物も、本発明の一部を構成する。そのような医薬組成物は、リポソーム、脂質、脂質複合体を任意選択によりさらに含むことがあり、又はｒＡＡＶベクターは、マイクロスフェアもしくはナノ粒子に含まれていることもある。筋肉内注射、静脈内注射、又はヒトの器官もしくは組織への直接注射に適した医薬製剤が特に好ましい。

発病予防、診断又は治療におけるｒＡＡＶベクターの使用
[0080] 本発明は、哺乳動物の疾患、傷害、障害、外傷又は機能不全の１つ又は複数の症状を診断、予防、処置又は改善するためのキットの中に含まれる、開示されたｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を含む組成物を提供する。そのようなキットは、ヒト疾患の診断、発病予防及び／又は治療に有用でありえ、特に、ヒトの癌、糖尿病、自己免疫疾患、腎臓疾患、心血管疾患、膵臓疾患、腸疾患、肝臓疾患、神経疾患、神経筋障害、運動神経欠損症、神経骨格障害、神経学的能力障害、神経感覚機能障害、卒中、虚血、α１アンチトリプシン（AAT）欠乏症、バッテン病、アルツハイマー病、鎌状赤血球症、βサラセミア（thalassamia）、ハンチントン病、パーキンソン病、骨格疾患、外傷、肺疾患の１つ又は複数の症状の処置、予防及び／又は改善に有用でありうる。

[0081] 本発明は、疾患、障害もしくは機能不全の処置、予防及び／もしくは発病予防、ならびに／又はそのような疾患、障害もしくは機能不全の１つもしくは複数の症状の改善を含むがこれらに限定されない、疾患、障害、機能不全、傷害又は外傷の症状の処置、予防又は改善のための薬物の製造における、本明細書において開示された組成物の使用も提供する。

[0082] 本発明は、哺乳動物のそのような疾患、傷害、障害又は機能不全の症状を処置又は改善する方法も提供する。そのような方法は、一般に、本明細書において開示のｒＡＡＶベクターの１つ又は複数を、それを必要としている哺乳動物に、その哺乳動物のそのような疾患、傷害、障害又は機能不全の症状の処置又は改善に十分な量で、十分な時間にわたって投与する工程を少なくとも含む。１つ又は複数の組成物の筋肉内、静脈内、皮下、クモ膜下、腹腔内投与による又は看護を受けている哺乳動物の器官もしくは組織への直接注射によるそのような処置レジメンが、ヒト治療において特に考えられる。

[0083] 本発明は、治療有効量の本発明のｒＡＡＶ組成物を、それを必要としている哺乳動物に、ｒＡＡＶベクター内に含まれている１つ又は複数の核酸セグメントによってコードされた所望の治療薬の治療有効量を患者に与えるのに有効な量で、有効な時間、与える方法も提供する。例示的治療薬としては、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。

医薬組成物
[0084] 本発明の遺伝子構築物は、様々な組成で調製することができ、ヒト又は動物対象への投与のために適切な医薬ビヒクルに配合することもできる。

[0085] 本発明は、開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、ビリオン、ウイルス粒子、哺乳動物細胞又はそれらの組み合わせの１つ又は複数を含む組成物も提供する。特定の実施形態において、本発明は、単独で又は１つもしくは複数の他の治療方法論と併用で細胞又は動物に投与するための、特に、ヒト細胞、組織、及び人間を冒す疾患の治療のための、本明細書において開示された１つ又は複数のｒＡＡＶベクターの医薬製剤を提供する。医薬的に許容される賦形剤及び担体溶液の配合は当業者に周知であり、例えば経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、筋肉内投与及び製剤を含む、様々な処置レジメンでの本明細書に記載される特定の組成物の使用に適した投薬及び処置レジメンの開発も当業者に周知である。

例示的定義
[0086] 別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学用語について一般に理解されている定義は、Ｒｉｅｇｅｒら（1991）、Ｌｅｗｉｎ（1994）で見出すことができる。ウイルス学用語の一般に理解されている定義は、Ｇｒａｎｏｆｆ及びＷｅｂｓｔｅｒ（1999）ならびにＴｉｄｏｎａ及びＤａｒａｉ（2002）で見出すことができる。微生物学の一般に理解されている定義は、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ（2002）で見出すことができる。

[0087] 長年の特許法の慣習に従って、「１つの（a）」及び「１つの（an）」という語は、特許請求の範囲を含めて本出願で用いる場合、「１つ又は複数」を意味する。

[0088] 本明細書において用いる場合の用語「約」及び「おおよそ」は同義であり、一般に、所与の数値の周辺の数値範囲はもちろん、列挙されている数値範囲内のすべての数値を指す（例えば、「約５〜１５」は、別段の断りがない限り、「約５〜約１５」を意味する）と解されるものとする。さらに、本明細書におけるすべての数値範囲はその範囲内の全整数各々を含むと解されるものとする。

[0089] 本明細書において用いる場合、用語「担体」は、該当する動物への投与に医薬的に許容される任意の溶媒、分散媒、塗料、希釈剤、緩衝剤、等張剤、溶液、懸濁液、コロイド、不活性物質など又はそれらの組み合わせを含むことを意図したものである。一般に化合物及び特に化学療法薬のための１つ又は複数の送達ビヒクルの使用は、製薬技術分野の当業者に周知である。いずれの従来の媒体又は薬剤もそれが活性成分と不相溶性である場合を除き、診断用、予防用及び治療用組成物でのその使用が考えられる。１つ又は複数の補助活性成分を、開示された化学療法用組成物の１つもしくは複数に組み込んでもよく、又は開示された化学療法用組成物の１つもしくは複数と共に投与してもよい。

[0090] 本明細書において用いる場合、用語「キメラｒｃＡＡＶ」は、１）ＡＡＶタンパク質をコードする、及び２）対応するネイティブヌクレオチド配列と１又は複数の塩基が異なる、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する複製能力のあるＡＡＶ由来核酸を指す。

[0091] 本明細書において用いる場合、用語「ＤＮＡセグメント」は、単離され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まないＤＮＡ分子を指す。したがって、本明細書において開示された組成物の１つを使用して生体サンプルから得られるＤＮＡセグメントは、単離され、それらが得られる特定の種の全ゲノムＤＮＡから離された、又は精製され、それらが得られる特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない、１つ又は複数のＤＮＡセグメントを指す。ＤＮＡセグメント及びそのようなセグメントのより小さい断片はもちろん、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組み換えベクターも、用語「ＤＮＡセグメント」に含まれる。

[0092] 本明細書において用いる場合の用語「例えば」は、限定を意図せず単に例として用いており、本明細書にはっきりと列挙されている品目のみを指すと解釈すべきではない。

[0093] 本明細書において用いる場合の「有効量」が、生物、その感染症、又は生物もしくはその感染症の症状、あるいはそれらの任意の組み合わせに対して治療効果、予防効果又は別様に有益な効果をもたらすことは、当業者には理解されると予想される。

[0094] 「発現制御配列」という句は、別の遺伝要素の複製又は発現（転写もしくは翻訳）に対して調節効果を発揮することができる任意の遺伝要素（例えば、ポリヌクレオチド配列）を指す。一般的な発現制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化（ポリA）シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位（IRES）、エンハンサーなどが挙げられる。「組織特異的発現制御配列」は、１つだけの組織タイプ又は組織の小さいサブセット内で別の遺伝要素の複製又は発現（転写もしくは翻訳）に対して調節効果を発揮するものである。

[0095] 「ヘルパー機能」という句は、アデノウイルス（Ad）又はヘルペスウイルスなどのウイルスに由来し、宿主細胞におけるＡＡＶ複製を助長する核酸又はポリペプチドによって行われる、機能活性を意図したものである。

[0096] 本明細書において用いる場合、「異種（の）」は、所定の被参照遺伝子配列との関連で定義する。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、天然には被参照構造遺伝子に隣接して存在せず、実験室操作によって配置されるプロモーターと定義する。同様に、異種遺伝子又は核酸セグメントは、天然には被参照プロモーター及び／又はエンハンサー要素に隣接して存在しない遺伝子又はセグメントと定義する。

[0097] 本明細書において用いる場合、用語「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の相補度を指す。「同一性」という語は、第一の核酸又はアミノ酸配列が第二の核酸又はアミノ酸配列とまさに同じ一次配列を有するときの「相同性」という語の代用語でありうる。配列相同性及び配列同一性は、当技術分野において公知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを用いて２つ以上の配列を分析することにより決定することができる。そのような方法を用いて、所与の配列が別の選択された配列と同一又は相同であるか評定することができる。

[0098] 本明細書において用いる場合、「相同（の）」は、ポリヌクレオチドを指すとき、異なる起源から生じるにもかかわらず同じ必須ヌクレオチド配列を有する配列を意味する。典型的に、相同核酸配列は、１つ又は複数の実質的に類似したゲノム配列を保有する近縁遺伝子又は生物に由来する。対照的に、「類似」ポリヌクレオチドは、異なる種又は生物からのポリヌクレオチドと同じ機能を共有するが、類似した機能を遂行する又は類似した生物活性を有する１つ又は複数のタンパク質又はポリペプチドをコードする有意に異なる一次ヌクレオチド配列を有しうるものである。類似ポリヌクレオチドは、多くの場合、（例えば遺伝的に又は系統発生学的に）近縁でない２つ以上の生物に由来しうる。

[0099] ２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連で、用語「同一（の）」又は「同一」パーセントは、下で説明する配列比較アルゴリズム（もしくは当業者が利用できる他のアルゴリズム）の１つを用いて又は目視検査によって測定されるような、最大一致のために比較及びアラインしたときに同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定百分率を有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。

[0100] 本明細書において用いる場合、「処置を必要としている」という句は、患者が処置を必要とする（又は１つもしくは複数の点で処置からの恩恵を受ける）という医師又は獣医などの治療奉仕者によってなされる判断を指す。そのような判断は様々な因子に基づいてなすことができ、そのような因子は、治療奉仕者の専門知識の範囲内であり、本明細書に記載されるものなどの１つ又は複数の化合物又は医薬組成物によって処置可能である疾病状態の結果として患者が病気であるという認識を含みうる。

[0101] 「単離された」又は「生物学的に純粋な」という句は、その物質に通常は随伴する、そのネイティブ状態で見られるような成分が実質的に又は本質的にない、物質を指す。したがって、本発明による単離されたポリヌクレオチドは、それらのポリヌクレオチドにそれらの天然環境又はインサイチュー環境で通常は随伴する物質を好ましくは含有しない。

[0102] 本明細書において用いる場合、用語「キット」は、本発明の診断又は治療方法の１つ又は複数を行うための少なくとも１セットの成分を含む携帯式自己完結型エンクロージャーのバリエーションを記載するために用いることができる。

[0103] 用語「ライブラリー」は、少なくとも一態様では互いに異なる要素の収集物を指す。例えば、ベクターライブラリーは、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも２つのベクターの収集物である。別の例として、「ビリオンライブラリー」は、少なくとも１つのヌクレオチド又は少なくとも１つのカプシドタンパク質が互いに異なる少なくとも２つのビリオンの収集物である。

[0104] 「連結させる」又は「接合させる」は、これらに限定されないが、組み換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、静電結合などを含む、１つ又は複数のタンパク質、ペプチド、核酸又はポリヌクレオチドを機能的に接続するための当技術分野において公知の任意の方法を指す。

[0105] 本明細書において用いる場合、用語「マスター」ライブラリーは、同族キメラカプシドに封入されたキメラｒｃＡＡＶベクターからなるｒＡＡＶビリオン（例えば、縮重Capタンパク質又は別様に修飾されたCapタンパク質を含有するカプシド）のプールを指す。

[0106] 核酸分子又はポリペプチドを指すとき、用語「ネイティブ」は、天然に存在する（例えばWT）核酸又はポリペプチドを指す。

[0107] 本明細書において用いる場合の用語「天然に存在する」は、物体に適用される場合、物体を自然界で見出すことができることを指す。例えば、自然界での源から単離することができる、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列であって、実験室で人間の手によって意図的に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。本明細書において用いる場合、古典的遺伝学に従って選択的に繁殖させることができた齧歯動物の実験室系統は、天然に存在する動物と見なす。

[0108] 本明細書において用いる場合、「核酸」という句は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの２ヌクレオチド以上の鎖を意味する。本明細書において用いる場合の「ｃａｐ核酸」、「ｃａｐ遺伝子」及び「カプシド遺伝子」という句は、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸を意味する。ｃａｐ核酸の例としては、ＡＡＶ血清型１、２及び５からの「野生型」（WT）Ｃａｐをコードする核酸配列；ネイティブ型ｃａｐ ｃＤＮＡ；ｃａｐ ｃＤＮＡを転写することができる配列を有する核酸；ならびに／又は前述の対立遺伝子変異体及びホモログが挙げられる。

[0109] 本明細書において用いる場合、用語「患者」（同義で「宿主」又は「対象」とも呼ぶ）は、本明細書において開示された医薬組成物の１つ又は複数を受けることができる任意の宿主を指す。好ましくは、対象は脊椎動物であり、この脊椎動物は、任意の動物種（及び好ましくは哺乳動物種、例えば人間）を示すことを意図したものである。特定の実施形態において、「患者」は、限定されないが任意の哺乳動物宿主を含む、任意の動物宿主を指す。好ましくは、この用語は任意の哺乳動物宿主を指し、任意の哺乳動物宿主には、ヒト及び非ヒト霊長類、ウシ、イヌ、ヤギ、キャビン（cavines）、カラス、エピン、ウマ、ネコ、ヤギ、ウサギ（lapines）、ウサギ（leporine）、オオカミ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、カエル、ラシーヌ（racines）、キツネなどが含まれるがこれらに限定されず、コンパニオンアニマル、ペット及び獣医師に看護されている任意の動物ばかりでなく、家畜、動物標本、外来種も含む。

[0110] 「医薬的に許容される」という句は、哺乳動物に投与したとき、特にヒトに投与したとき、アレルギー反応又は類似の不適当な反応を好ましくは生じさせない分子エンティティー及び組成物を指す。本明細書において用いる場合、「医薬的に許容される塩」は、親化合物の望ましい生物活性を好ましくは保持し、かついずれの望ましくない毒性効果も付与しない塩を指す。そのような塩の例としては、これらに限定されないが、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）とで形成された酸付加塩；及びこれらに限定されないが、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ（エンボン）酸、アルギン酸、ナフトエ酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸を含む有機酸とで形成された塩；多価金属カチオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとの塩；Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン又はエチレンジアミンから形成された有機カチオンとで形成された塩；及びそれらの組み合わせが挙げられる。

[0111] 本明細書において用いる場合の用語「医薬的に許容される塩」は、医薬的に許容される塩基、無機又は有機酸から誘導された、開示された化合物を指す。適切な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル（salicyclic）酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、トリフルオロ酢酸及びベンゼンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定されない。適切な塩基から誘導された塩は、アルカリ、例えばナトリウム及びアンモニウムをこれらに限定されないが含む。

[0112] 本明細書において用いる場合、用語「プラスミド」又は「ベクター」は、遺伝子材料（すなわち核酸）からなる遺伝子構築物を指す。典型的に、プラスミド又はベクターは、細菌宿主細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、において機能しうる複製起点と、そのプラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための選択可能マーカーとを含有する。本発明のプラスミド及びベクターは、挿入されたコード配列が適切な発現細胞において転写及び翻訳されうるように配列された、本明細書に記載の１つ又は複数の遺伝要素を含むこともある。加えて、プラスミド又はベクターは、１つもしくは複数の天然及び／もしくは人工源から得られる又は１つもしくは複数の天然及び／もしくは人工源に由来するセグメントを含む、１つ又は複数の核酸セグメント、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、アクチベーター、複数のクローニング領域又はこれらの任意の組み合わせを含むこともある。本明細書において用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」はもちろん、複数の「ポリペプチド」も包含することを意図したものであり、２アミノ酸以上の任意の１つ又は複数の鎖を含む。したがって、本明細書において用いる場合、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」及び「連続したアミノ酸配列」をこれらに限定されないが含む用語は、すべて、「ポリペプチド」の定義に包含され、用語「ポリペプチド」をこれらの用語のいずれかの代わりに又はこれらの用語のいずれかと同義で用いることができる。この用語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、翻訳後プロセッシング、又は１つもしくは複数の天然に存在しないアミノ酸を含めることによる修飾を含むがこれらに限定されない、１つ又は複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。ポリヌクレオチド及びポリペプチド構造については従来的命名法が当技術分野に存在する。例えば、アミノ酸を記載するために１文字及び３文字略号が広く用いられている：アラニン（A、Ala）、アルギニン（R、Arg）、アスパラギン（N、Asn）、アスパラギン酸（D、Asp）、システイン（C、Cys）、グルタミン（Q、Gln）、グルタミン酸（E、Glu）、グリシン（G、Gly）、ヒスチジン（H、His）、イソロイシン（I、Ile）、ロイシン（L、Leu）、メチオニン（M、Met）、フェニルアラニン（F、Phe）、プロリン（P、Pro）、セリン（S、Ser）、トレオニン（T、Thr）、トリプトファン（W、Trp）、チロシン（Y、Tyr）、バリン（V、Val）、及びリシン（K、Lys）。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの所望の特性が保持されるという条件で、「Ｄ」異性体型の残基を任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに用いてもよい。

[0113] 本明細書において用いる場合の用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「抑制する」、「抑制すること」及び「抑制」は、本明細書において用いる場合、単独での又は医薬組成物に含有されているような化合物を疾病状態の臨床症状の発症前に投与して、その疾病状態の任意の症状、態様又は特徴を予防することを指す。そのような予防及び抑制が、必ずしも医学的に有用であるとみなされる絶対的必要性はない。

[0114] 本明細書において用いる場合の用語「プロモーター」は、転写を調節する核酸配列の１つ又は複数の領域を指す。

[0115] 「タンパク質」は、本明細書では「ペプチド」及び「ポリペプチド」と同義で用いており、合成生産された、組み換え生産された又はインビトロで生産されたペプチドとポリペプチドも、核酸配列が宿主動物又はヒト対象に投与された後にインビボで発現されたペプチド及びポリペプチドも含む。用語「ポリペプチド」は、長さが２〜約２０アミノ酸残基の短いペプチド、長さが約１０〜約１００アミノ酸残基のオリゴペプチド、及び長さが約１００アミノ酸残基以上のものを含むより長いポリペプチドのものを含めて、任意のアミノ酸鎖長を指すことを好ましくは意図したものである。さらに、この用語は、酵素、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸ポリマーを含む機能性生体分子を含むことを意図したものでもある。本発明のポリペプチド及びタンパク質は、翻訳後修飾される又はされたポリペプチド及びタンパク質も含み、主鎖アミノ酸鎖に付加された任意の糖又は他の誘導体もしくは接合体を含む。

[0116] 用語「偽型の」は、第一の血清型とは異なる第二の血清型の少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含有するＡＡＶカプシドに封入されている（パッケージングされている）、第一のＡＡＶ血清型に由来する核酸又はゲノムを意図したものである。

[0117] 本明細書において用いる場合、用語「ｒｃＡＡＶベクター」は、追加のＡＡＶ遺伝子又は遺伝子産物を一切用いずに細胞内でＤＮＡ複製が可能な、複製能力のあるＡＡＶ由来核酸を指す。

[0118] 用語「組み換え体」は、その物質（例えばポリヌクレオチド又はポリペプチド）がヒトの介入によって人工的に又は合成的に（非天然に）改変されたことを示す。その天然環境もしくは状態の中で、又はその天然環境もしくは状態から除去されたその物質に対して、改変を行うことができる。具体的には、例えばプロモーター配列は、それが人間の手によって操作された核酸セグメントの発現によって生産される場合、「組み換え体」である。例えば、「組み換え核酸」は、例えばクローニング、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の手順の間に、核酸が組み換えられることによって作られるもの、又は化学的もしくは他の突然変異誘発によって作られるものであり、「組み換えポリペプチド」又は「組み換えタンパク質」は、組み換え核酸の発現によって生産されるポリペプチド又はタンパク質であり、「組み換えウイルス」、例えば組み換えＡＡＶウイルスは、組み換え核酸の発現によって生産される。

[0119] 本明細書において用いる場合の用語「調節要素」は、転写を調節する核酸配列の１つ又は複数の領域を指す。例示的調節要素としては、エンハンサー、転写後要素、転写制御配列などが挙げられるが、これらに限定されない。

[0120] 用語「ＲＮＡセグメント」は、特定の種の全細胞ＲＮＡを含まない単離されたＲＮＡ分子を指す。したがって、ＲＮＡセグメントは、単離され、他のＲＮＡから離された、又は精製され、他のＲＮＡを含まない、（ネイティブ起源又は合成起源いずれかの）１つ又は複数のＲＮＡセグメントを指すことができる。ＲＮＡセグメント、及びそのようなセグメントのより小さい断片が、用語「ＲＮＡセグメント」に含まれる。

[0121] 用語「シードライブラリー」は、単一血清型のＡＡＶカプシドに封入されたキメラｒｃＡＡＶベクターからなるＡＡＶビリオンのプールを意味する。

[0122] 本明細書において用いる場合の用語「に実質的に一致する」、「実質的に相同の」又は「実質的同一性」は、選択された核酸又はアミノ酸配列が、選択された参照核酸又はアミノ酸配列と比較して少なくとも約７０又は約７５％の配列同一性を有する、核酸又はアミノ酸配列の特徴を示す。より典型的には、選択された配列及び参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４又はさらに８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４又は９５パーセントの配列同一性を有することになる。さらにより好ましくは、高相同配列は、選択された配列と、それを比較した参照配列との間で、少なくとも約９６、９７、９８又は９９パーセントより大きい配列同一性を共有することが多い。

[0123] 配列同一性百分率は、比較すべき配列の全長にわたって算出されることもあり、又は合計約２５パーセント未満になる小さい欠失もしくは付加の除外もしくは選ばれた参照配列の除外によって算出されることもある。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば遺伝子もしくは隣接配列の一部分、又は染色体の反復部分であることもある。しかし、２つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は、典型的には少なくとも約１８〜２５ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約２６〜３５ヌクレオチド、及びよりいっそう典型的には少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０又はさらには１００ほどのヌクレオチドを含むことになる。

[0124] 高相同断片が所望される場合、２配列間の同一性パーセントの程度は、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（1988）によって記載されたＦＡＳＴＡプログラム分析などの、当業者に周知の配列比較アルゴリズムの１つ又は複数によって容易に決定されて、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、及びより好ましくは約９０％又は９５％以上となる。

[0125] 本明細書において用いる場合、用語「構造遺伝子」は、コードされたペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボザイム、触媒性ＲＮＡ分子、又はアンチセンス分子を生産するように発現されるポリヌクレオチド、例えば遺伝子を一般的に記述することを意図したものである。

[0126] 本明細書において用いる場合の用語「対象」は、開示された組成物の１つ又は複数での処置を施すことができる、ヒト霊長類などの哺乳動物を含む、生物を記述するものである。開示された処置方法からの恩恵を受けることができる哺乳動物種としては、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば類人猿、チンパンジー、サル及びオランウータン；イヌ及びネコを含む飼いならされた動物；ならびに家畜、例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギ；又はこれらに限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が挙げられる。

[0127] 本明細書において用いる場合、用語「末端反復」又は「ＴＲ」は、ＡＡＶの複製及びパッケージングにシスで必要とされる、ＡＡＶに由来する核酸配列を意味する。

[0128] 「転写調節要素」は、単独で又は１つもしくは複数の他の核酸配列と併用で転写を活性化するポリヌクレオチド配列を指す。転写調節要素は、例えば、１つもしくは複数のプロモーター、１つもしくは複数の応答要素、１つもしくは複数の負の調節要素、１つもしくは複数のエンハンサー、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

[0129] 本明細書において用いる場合、「転写因子認識部位」及び「転写因子結合部位」は、直接タンパク質−ＤＮＡ結合の形をとることが多い、１つ又は複数の転写因子の配列特異的相互作用のための部位として同定される、ポリヌクレオチド配列又は配列モチーフを指す。典型的に、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリント法、ゲル移動度シフトアッセイなどによって同定することができ、及び／又は公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、もしくは関連分子生物学及びウイルス学技術分野の当業者に公知の他の方法によって、予測することができる。

[0130] 「転写単位」は、少なくとも第一のシス作用性プロモーター配列に作動可能に連結されており、及び任意選択により、構造遺伝子配列の効率的転写に必要な１つ又は複数の他のシス作用性核酸配列に作動可能に連結されている少なくとも第一の構造遺伝子と、プロモーター及び／又はエンハンサー要素の制御下で作動可能に配置されている構造遺伝子配列の適切な組織特異的かつ発生的転写のために必要とされうるような少なくとも第一の遠位調節要素と、効率的転写及び翻訳に必要である任意のさらなるシス配列（例えばポリアデニル化部位、mRNA安定性制御配列など）とを含む、ポリヌクレオチド配列を指す。

[0131] 本明細書において用いる場合、用語「形質転換細胞」は、宿主細胞への１つ又は複数の外因性ポリヌクレオチドの導入によって核酸補体が改変された宿主細胞を意味することを意図したものである。

[0132] 本明細書において用いる場合、用語「形質転換」は、外因性ポリヌクレオチド配列（例えばウイルスベクター、プラスミド、又は組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）を宿主細胞又はプロトプラストに導入するプロセスであって、その外因性ポリヌクレオチドが少なくとも第一の染色体に組み込まれる又は形質転換宿主細胞内での自律複製が可能であるプロセスを一般的に記述することを意図したものである。トランスフェクション、エレクトロポレーション、及び「裸の」核酸取り込みはすべて、宿主細胞を１つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換させるために用いられる技術の例を表す。

[0133] 本明細書において用いる場合、用語「処置する」、「処置すること」及び「処置」は、疾病状態の臨床症状の発症後の、その臨床状態の任意の症状、態様又は特徴を低減させる又は排除するための、（単独での、又は１つもしくは複数の医薬組成物に含有されているような）１つ又は複数の化合物の投与を指す。そのような処置は、必ずしも医学的に有用であるとみなされる絶対的必要性はない。したがって、用語「処置」、「処置する」、「処置された」又は「処置すること」は、治療を指すこともあり、又は疾患の程度又は重症度の点での、その１つもしくは複数の症状についての、その発現が患者を苦しめる前であろうと、苦しめた後であろうと、改善もしくは低減を指すこともある。

[0134] 本明細書において用いる場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸、例えばプラスミド、を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、連結されている核酸の自律複製及び／又は発現が可能なものである。「ｒＡＡＶベクター」は、少なくとも１つの末端反復（TR）配列を含有する組み換えＡＡＶ由来核酸である。

[0135] 「ビリオン」の使用は、核酸とタンパク質コート（カプシド）とを含有するウイルス粒子を記述することを意図したものである。「ｒＡＡＶビリオン」は、ｒＡＡＶベクターに由来する核酸配列及び／又はタンパク質を含むビリオンである。

[0136] 用語「配列番号Ｘに本質的に記載の配列」は、その配列が、配列番号Ｘの一部に実質的に一致すること、及び配列番号Ｘのヌクレオチド（もしくはアミノ酸）と同一でない又は配列番号Ｘのヌクレオチド（もしくはアミノ酸）の生物学的機能等価物である比較的少数のヌクレオチド（又はポリペプチド配列の場合にはアミノ酸）を有することを意味する。用語「生物学的機能等価物」は、当技術分野において十分に理解されており、さらに本明細書中で詳細に定義されている。したがって、本明細書において提供するヌクレオチド配列の１つ又は複数と同一又は機能的に等価であるヌクレオチドの約８５％〜約９０％、又はより好ましくは約９１％〜約９５％、又はよりいっそう好ましくは約９６％〜約９９％を有する配列は、本発明の実施に有用であると特に考えられる。

[0137] 本発明に適した標準ハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション、続いて、所望の量のバックグラウンドシグナルを除去するための６０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での１時間の逐次洗浄を含む。本発明のより低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、３５％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ又は大腸菌（E. coli）ＤＮＡ中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション、続いて、５５℃で０．８×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの逐次洗浄を含む。所望のストリンジェンシーレベルを得るために条件を容易に調整することができることは、当業者には理解されると予想される。

[0138] 当然、本発明は、本明細書に具体的に記載する特定のヌクレオチド配列の少なくとも１つ又は複数に相補的、本質的に相補的、及び／又は実質的に相補的である核酸セグメントも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準ワトソン・クリック相補性規則に従って塩基対合することが可能であるものである。本明細書において用いる場合、用語「相補的配列」は、上に記載したのと同じヌクレオチド比較によって評定することができるような、又は本明細書において開示された特定の核酸セグメントの１つもしくは複数に、すぐ上で説明したものなどの比較的ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であると定義されるような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。

[0139] 上で説明したように、本発明のプローブ又はプライマーは、いずれの長さのものであってもよい。例えば第一の残基は１であり、第二の残基は２であるなど、配列に数値を割り当てることによって、所与の配列内に含まれるすべてのプローブ又はプライマーを定義するアルゴリズムを提示することができる：

[0140] ｎ〜ｎ＋ｙ（式中、ｎは１から配列の最後の数までの整数であり、ｙはプローブ又はプライマーの長さ引く１であり、ｎ＋ｙは配列の最後の数を超えない）。したがって、２５塩基対プローブ又はプライマー（すなわち「２５−ｍｅｒ」）の場合、プローブ又はプライマーの収集物は、配列の全長にわたって塩基１〜２５、塩基２〜２６、塩基３〜２７、塩基４〜２８などに対応する。同様に、３５塩基対プローブ又はプライマー（すなわち「３５−ｍｅｒ」）の場合、例示的プライマー又はプローブ配列は、これらに限定されないが、配列の全長にわたって塩基１〜３５、塩基２〜３６、塩基３〜３７、塩基４〜３８などに対応する配列を含む。同様に、４０−ｍｅｒの場合、そのようなプローブ又はプライマーは、第一の塩基対〜ｂｐ４０、配列の第二のｂｐ〜ｂｐ４１、第三のｂｐ〜ｂｐ４２などのヌクレオチドに対応することがあり、その一方で５０−ｍｅｒの場合、そのようなプローブ又はプライマーは、ｂｐ１〜ｂｐ５０、ｂｐ２〜ｂｐ５１、ｂｐ３〜ｂｐ５２、ｂｐ４〜ｂｐ５３などにわたるヌクレオチド配列に対応することがある。

[0141] 特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイで所与の標的配列の存在を決定する際に標識ポリヌクレオチドプローブを用いる場合などの、本発明の１つ又は複数の核酸セグメントと適切な検出可能マーカー（すなわち「標識」）との併用は、有利であると予想される。オリゴヌクレオチドプローブを標識するための多種多様な適切な指標化合物及び組成物は当技術分野において公知であり、それらとしては、これらに限定されないが、適切なアッセイで検出することが可能である蛍光、放射性、酵素的又は他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどが挙げられる。特定の実施形態では、放射性試薬又は他の環境的にあまり望ましくない試薬ではなく、１つ又は複数の蛍光標識又は酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼを用いることもある。酵素タグの場合、ヒトの目に見えるサンプルを検出する方法を提供するために用いることができる、又はシンチグラフィー、蛍光定量法、分光光度法などの分析法によって用いて１つもしくは複数の相補的もしくは実質的に相補的な核酸配列を含有するサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定することができる、比色、発色性又は蛍光発生（fluorigenic）指標基質は公知である。２つ以上の標識プローブが同時に又は逐次的に検出される、いわゆる「多重化」アッセイの場合、第一の検出特性又はパラメータ（例えば、放出及び／又は励起スペクトル最大値）を有する第一の標識で第一のオリゴヌクレオチドプローブを標識し、第一の標識とは異なる（すなわち、別個の又は識別できる）第二の検出特性又はパラメータを有する第二の標識で第二のオリゴヌクレオチドプローブも標識することが望ましいことがある。特に遺伝子増幅／検出プロトコルに関連しての、多重化アッセイの使用は、分子遺伝学技術分野の当業者には周知である。

[0142] 本発明に従って、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などは、ＤＮＡ（ゲノムDNA又はゲノム外DNAを含み、これらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（PNA）、ＲＮＡ（rRNA、mRNA及びtRNAを含むがこれらに限定されない）、ヌクレオシド、及び天然源から得られた、化学的に合成された、修飾された、又は別様に全部もしくは一部が人間の手によって調製もしくは合成された適切な核酸セグメントを含むが、これらに限定されない。

[0143] 以下の実施例は、本発明の例証となる実施形態を実証するために記載される。これらの実施例で開示された技術は、本発明の実施の際によく機能することが見出された技術の代表であり、したがって本発明の実施の好ましい方式を構成すると見なすことができることは、当業者には理解されると予想される。しかし、当業者は、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施形態に多くの変更を加え、なお同様の又は類似の結果を得ることができることを、本開示に鑑みて理解しているものと予想される。

実施例１−ＡＡＶベクターライブラリー構築
[0144] 遺伝子治療のための既存のＡＡＶベクターを改善する方法論は、標的組織への優れた形質導入効率を特徴とする、カプシド変異体を誘導するための合理的アプローチ又は指向性進化のいずれかを含む。本発明では、カプシド表面の可変領域のみを修飾するコンビナトリアルカプシドライブラリーを得るために、両方のアプローチを「バーチャルファミリーシャッフリング」の１つの統一設計戦略に統合した。デッドエンド変異体の生成を最小にするために、個々のサブライブラリーを先ず組み立てて、限定された表面露出領域内の適合性アミノ酸残基を予備選択した。その後、成功したファミリーを交配して、約１×１０^８複雑度の組み合わせライブラリーを得た。パッケージングされたウイルスＤＮＡのＮｅｘｔ−Ｇｅｎシークエンシングによって指向性進化を受けやすいカプシド表面エリアを明らかにし、このようにして将来の設計のためのガイダンスを得た。ＡＡＶ２ベースのベクターを得ることによる遺伝子治療用途におけるこのライブラリーの有用性は、ネズミ肝臓において２０倍高い形質導入効率を特徴とし、これは今やＡＡＶ８のものと等価である。

実験方法
[0145] 本発明の実施に有用な実験方法は、現代分子遺伝学の文献において見つけることができ、遺伝子治療分野の当業者には周知である。ＡＡＶベクターの調製及び精製についての詳細な方法及びプロトコルは、米国特許第７，２２０，５７７号（この特許文献の明確な参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれている）で見出すことができる。

[0146] ライブラリー内の改変された位置（X）を示すＡＡＶ２カプシドのＣａｐＬｉｂ−６アミノ酸配列を下に示す：

[0147] ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＸＸＧＸＸＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＸＸＸＸＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＦＬＳＲＴＮＸＸＸＧＸＸＴＸＳＸＬＸＦＳＱＸＸＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＸＸＸＸＸＮＮＮＳＸＦＳＷＸＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＸＤＸＸＸＸＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＸＸＸＸＸＡＡＸＸＸＶＸＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＸＸＸＸＸＸＶＸＸＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＦＬＴＲＮＬ（配列番号１０５）

[0148] このライブラリーをマウスの血流に注射し、３日後に肝臓からカプシドＤＮＡを増幅し、それを使用して新たなウイルスライブラリーを生成した。３ラウンドのそのようなインビボでの選択ラウンド後、下記の変異体を得た：

実施例２−−新規ＡＡＶ変異体を得るためのコンビナトリアルアプローチと合理的アプローチの統合
[0149] ＡＡＶは、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである（Muzyczka及びBerns、2001）。ＡＡＶ由来ベクターは、それらの病原性不在、エピソーム局在及び安定した導入遺伝子発現のため、ヒト遺伝子治療用途向けの有望なツールである（Wuら、2006）。しかし、ＡＡＶの臨床使用に対する重大な欠点は、その無差別性及びヒト抗体による中和に対するその感受性である（Louis-Jeuneら、2013）。これらの欠点の両方が、カプシドの表面に露出しているアミノ酸残基の性質によって決まる。１）ウイルス生物学の知識に基づく合理的アプローチによって結合、進入及び／又は細胞内トラフィッキングを助長するようにカプシド残基の突然変異を誘発する（Wuら、2000；Zhongら、2008；Lochrieら、2005；Aslanidiら、2012；Liら、2012；Gabrielら、2013；Pandyaら、2013；Senら、2013；Aslanidiら、2013）、及び２）指向性進化プロセス、すなわちＡＡＶカプシドへの分子修飾のハイスループット導入法を利用して、自然進化の大いに加速された競争の中で多様性と選択の両方を操作する（Mullerら、2003；Peraboら、2003；Maheshriら、2006；Michelfelderら、2007；Kwon及びSchaffer、2008；Liら、2008；Koerberら、2008；Liら、2009；Yangら、2009；（Koerberら、2009；Maguireら、2010；Grayら、2010；Jangら、2011；Yangら、2011；Asuriら、2012；Dalkaraら、2013；Yang及びXiao、2013）、２つの主要な戦略を一般に用いて、ＡＡＶベクターを改善する。両方の方法論は、優れた形質導入能力を有するベクターの作成に成功しているが、それらの有用性は、ＡＡＶ生活環の理解、及び定向進化プロトコルの技術的限界のために限定的である。

[0150] 本発明に採用した戦略は、両方のアプローチを１つの統一設計に統合した。公知のＡＡＶカプシド構造の詳細な知識（Xieら、2002；Kaludovら、2003；Waltersら、2004；Padronら、2005；Laneら、2005；DiMattiaら、2005；Millerら、2006；Namら、2007；Quesadaら、2007；DiPrimioら、2008；Mitchellら、2009；Ngら、2010；Agbandje-McKennaand Kleinschmidt、2011；DiMattiaら、2012；Govindasamyら、2013）及び１５０の天然に存在する変異体の配列を用いて、インシリコ「バーチャルファミリーシャッフリング」プロセスを行って、その構造の表面の可変領域のみが修飾されるコンビナトリアルカプシドライブラリーを得た。

[0151] 得られたライブラリーの有用性を、４つの突然変異しか有さないＡＡＶ２由来ベクターでネズミ肝臓の形質導入を２０倍増進すること−−合理的突然変異誘発と指向性進化の組み合わせ−−によって実証した。

材料及び方法
[0152] ライブラリー構築。ライブラリーを２工程で造った：先ず、個々のＶＲ系列（１つだけ又は２つの可変領域に突然変異を有する各々）を得て、カプシド集合に適合するアミノ酸の組み合わせについて選択し、次に、構造適合性配列を組み合わせて最終ライブラリーを生成した。以前に記載された（Cocoら、2002）ような縮重ホモ二本鎖遺伝子ファミリー組み換え（Degenerate Homoduplex Gene Family Recombination）（DHGFR）によってＤＮＡ断片を合成した：
記載された（Cost及びCozzarelli、2007）ようなヌクレアーゼによって支援される酵素的ライゲーション（ELAN）によって断片を組み立てた。６つの個々のＶＲ系列についての断片を、野生型領域についてはｐＳｕｂ２０１（Samulskiら、1987）から誘導したＰＣＲ産物の、及び可変領域についてはＤＨＧＦＲ産物（又は適切なDHGFRテンプレートが入手できなかった場合にはＥＬＡＮ産物）から誘導したＰＣＲ産物の、オーバーラップ伸長（Hortonら、1989）によって生成した。組み立てた断片を、等温ＤＮＡアセンブリ（Gibsonら、2009）を用いて、線形化ｐＳｕｂＥａｇＡｐａ（３７６４及び４０４９のApaI部位間に欠失を含有し、位置４３７３にEagI部位、サイレント突然変異、を含み、それ故、ApaI部位とEagI部位間への断片の挿入後、完全長cap遺伝子の再構成を可能にする、pSub201誘導体）に挿入した。各１５ｃｍディッシュにつきライブラリープラスミド１０ｎｇ及びｐＨｅｌｐｅｒ ７０μｇ（１：５０００のモル比）をＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトしたことを除き、以前に記載された（Maheshriら、2006）通りにウイルスライブラリーを生成した。イオジキサノール勾配（Zolotukhinら、1999）を用いてＡＡＶを精製し、ｒｅｐ遺伝子に特異的なプライマー（フォワード：５’−ＧＣＡＡＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１６５）、リバース：５’−ＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴ−３’（配列番号１６６））を使用してｑＰＣＲによって力価測定した。最終ライブラリーを生成するために、可変領域を含有するオーバーラッピング断片を、個々のウイルスライブラリーから単離した精製ＤＮＡから増幅し、オーバーラップ伸長を用いて組み立てた。その産物を上で説明したように線形化ｐＳｕｂＥａｇＡｐａに挿入した。上で説明したように最終ウイルスライブラリーを生成し、精製し、定量した。

[0153] ライブラリーシークエンシング。精製ウイルスＤＮＡを、次のプライマーを使用して増幅した：それぞれフォワード及びリバースとして、
５’−ＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１６７）及び
５’−ＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１６８）。

[0154] 得られた増幅産物をゲル精製した。次いで、それをＵＦ ＩＣＢＲ ＮｅｘｔＧｅｎコアラボラトリーにおいて１つのＳＭＲＴセルを使用してＰａｃＢｉｏ ＲＳ機器で処理した。データを分析するために、Ｐｙｔｈｏｎ ２．７プログラミング言語を用いて専用コードを記述した。そのコードによってＣＣＳリードを含有するオリジナルｆａｓｔｑファイルを通訳し、リードを参照配列にアラインすることによって補正し、補正されたリードをタンパク質配列に翻訳し、その後、その結果を分析した。シークエンシングエラーの高い発生率にもかかわらず、有用なリードを回収することができた。カプシド配列の大部分が保存され、可変領域内の配列のみを必要とするからである。

[0155] この実施例において、可変領域は、１３９９のうちの１８２のヌクレオチドを含んでいた。したがって、ｃａｐｌｉｂによって生成された補正リードは、可変領域にエラーがない（あいまいなヌクレオチドを含めて、参照配列と正確にマッチする）可能性が高いＣＣＳリードから導出されたものであった。明らかに、このアプローチは、可変領域内に挿入又は欠失の可能性があるすべてのリードを排除し、保存領域において起こりうる一切の変異を無視する。

[0156] インビボでの選択。インビボでの選択アプローチの各ラウンドにおいて、８〜１０週齢の２匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにウイルス調製物１×１０^１０〜１×１０^１１ｖｇ（第一ラウンドについてはオリジナルライブラリー、後続のラウンドでは標的濃縮ライブラリー）を尾静脈経由で注射した。３〜４日後、イソフルランでの麻酔後に頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。改良型Ｈｉｒｔ ＤＮＡ抽出（Arad、1998）を用いて採取した肝臓からエピソームＤＮＡを精製し、テンプレートとして使用して、下記プライマーを使用してカプシドＤＮＡ配列を増幅した：
フォワード：５’−ＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１６９）及び
リバース：５’−ＣＡＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１７０）

[0157] ゲル精製後、増幅産物を上で説明したように線形化ｐＳｕｂＥａｇＡｐａに挿入した。次いで肝臓濃縮ライブラリーを上で説明したように生成し、精製し、定量した。第３ラウンドの選択ラウンド後、増幅されたカプシドＤＮＡを線形化ｐＡＣＧ２−ｍ５６、すなわち、ｐＳｕｂＥａｇＡｐａと同じ修飾（ＡｐａＩ部位とＥａｇＩ部位間での増幅カプシド断片のクローニングを可能にする、２つのＡｐａＩ部位間の欠失及びＥａｇＩ部位の導入）を有するｐＡＣＧ−２から誘導したベクター（Liら、1997）、に挿入した。その後、シークエンシングによってランダムクローンを分析した。

[0158] ルシフェラーゼ発現。ｐＡＣＧ２−ｍ５６の選択されたカプシド変異体、すなわち、等モル量のルシフェラーゼ発現性バーコード付きベクターｐＴＲ−ＵＦ５０−ＢＣ（GenBankアクセッション番号ＫＦ９２６４７６）及びｐＨｅｌｐｅｒ、を各変異体について別々のトランスフェクションでＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。したがって、各カプシド変異体を異なる配列識別子（バーコード）に物理的に連結させた。結果として生じた遺伝子導入ＡＡＶを上で説明したように精製し、定量したが、ただしＣＢＡプロモーターに特異的なプライマー：
フォワード：５’−ＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１７１）
リバース：５’−ＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１７２）
をｑＰＣＲに使用した。

[0159] 等モル混合物（qPCR導出力価から算出）をテンプレートとして使用してバーコード領域を増幅し、次いで、それをＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシークエンシング反応に加えた。各変異体に特異的なバーコードを定量することによって、正確な相対力価測定を果たした。ウイルス調製物（バーコード補正力価に従って）１×１０^１１ｖｇを９週齢オスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories）に、各変異体につき３匹に、尾静脈経由で注射した。４０日間、５日ごとに、体重１ｇにつきルシフェリン１５０μｇの腹腔内注射の１０〜１２分後にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステムでルシフェラーゼ発現をモニターした。

[0160] バーコードシークエンシング。バーコード付きＤＮＡのシークエンシングをＵＦ ＩＣＢＲ ＮｅｘｔＧｅｎコアラボラトリーでＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムを使用して行った。下記のバーコード付きプライマーを使用してサンプルを増幅した：
フォワード：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号１７３）及び
リバース：５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＮＮＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１７４）
（ここで、「ＮＮ」は特有の配列を示す）。したがって、各リードは、３つのバーコード、すなわち、テンプレート内に位置する、カプシド変異体を識別する１つのバーコードと、プライマー内に位置する、組織サンプルを識別する２つのバーコードを含有する。ｄｎａ−バーコード、すなわちＰｙｔｈｏｎ２．７で記述された専用スクリプト、によってシークエンシングデータを分析した。

[0161] ｈＦＩＸ発現。ＡＡＶ８又はＬｉＣカプシドを含有するウイルスベクター、及びＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ−ｈＦ９ベクター（Mannoら、2006）を上で説明したように生成した。いずれかの調製物１×１０^１０ｖｇを６〜８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories）に、各ベクターにつき４匹に、尾静脈に注射した。注射したマウスを３か月間追跡し、ヘパリン処理されたマイクロキャピラリーチューブを使用して後眼窩神経叢から月１回採血した。ｈＦＩＸ抗原の血漿レベルを、発表された（Mingozziら、2003；Caoら、2009）ようにＥＬＩＳＡによって測定した。

[0162] 体内分布。バーコード付きカプシド変異体のウイルス調製物の等モル混合物を３匹の９週齢オスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories）にマウス１匹につき２×１０^１１ｖｇの用量で尾静脈注射した。３週間後にマウスを上で説明したように安楽死させた。全ＤＮＡを組織サンプルから単離し、定量した。組織中のＡＡＶゲノムの存在を、上で説明したようなＣＢＡプロモーターに特異的なプライマーを使用するｑＰＣＲによって定量した。各サンプル中の様々なカプシド変異体の相対量をバーコードシークエンシングデータから算出した。

結果
[0163] ライブラリー設計。様々な血清型間のＡＡＶカプシドタンパク質の構造比較によって、より進化的に分岐したエリアが散在する高相同配列が明らかになった。これらのアミノ酸ストレッチは、可変領域Ｉ〜ＩＸ（ＶＲ、「ループ」としても公知）と一般に呼ばれる（Govindasamyら、2006）。ちなみに、ＶＲは、集合カプシドの表面に局在しており、細胞表面受容体及び他の宿主因子との相互作用に関与していると考えられている。それらの位置のため、ＶＲはまた、カプシド集合にあまり重要でないと予測される。したがって、ライブラリー設計の指針は、集合する足場の完全性を維持するために主鎖配列を変更しないまま表面ＶＲのみを修飾することであった。突然変異誘発のすべての候補位置を１５０の天然に存在するＡＡＶ変異体のアラインメントから選択し、その後、ＡＡＶ２カプシドの３Ｄモデル（Xieら、2002）を用いて評価した。

[0164] 表面に明らかに露出している残基だけを修飾に選択した。不一致の残基の出現率を低減させるために、導入された置換の選択を、分析した１５０の相同体からの少なくとも１つにおける所与の位置に出現するものに限定した。合理的設計戦略に加えて、さらに次の４カ所：形質導入効率を増加させるための、表面Ｙ４４４Ｆ及びＹ５００Ｆ（Zhongら、2008）、ならびにＡＡＶ２の一次受容体であるヘパラン硫酸プロテオグリカン（Summerford及びSamulski、1998）への結合を脱標的化する（de-target）ための、表面Ｒ５８５Ｆ及びＲ５８８Ｆ（Opieら、2003）を修飾した。

[0165] ヌクレオチド配列及び結果として生じたアミノ酸多様性を含む、各可変領域の詳細な組成を、添付の図に示す。所望の組成を達成するために、場合によっては、コドン１つにつき１つより多くのヌクレオチドを変化させてさらなるアミノ酸多様性を生じさせる必要があった。すべての置換を組み込んでいるＡＡＶ２カプシド遺伝子断片を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、対応するＷＴ配列が除去されたＡＡＶ２ゲノムを含有するプラスミドベクターに挿入した。

[0166] １×１０^８の推定複雑度を有するプラスミドライブラリーをランダムクローンのシークエンシングによって分析し、このライブラリーは、予想されたヌクレオチド置換、位置及びタイプを含めてライブラリー設計を正確に反映することが判明した。しかし、この非常に代表的なプラスミドライブラリーは、より高い力価のパッケージングされたウイルスを生じさせることができなかった。明らかな説明は、集合活性化タンパク質（AAP）をコードする代替オープンリーディングフレーム（ORF）の存在であった（Sonntagら、2010）。ＡＡＰ ＯＲＦはＶＲ Ｉ及びＩＩのコード領域とオーバーラップするので、それらの突然変異誘発は、ことによるとＡＡＰ構造及び機能に干渉することになり、多くのカプシド変異体の集合を妨げる可能性が高い。しかし、ＡＡＰの破壊は、初期設計からの低いウイルスライブラリー複雑度の唯一の理由ではなかった。置換の一部は３Ｄ構造の関連で不適合性であったので、高い多様性は、ライブラリーを非機能性にさせるようであった。例えば、プラスミドとカプシド封入ウイルスＤＮＡは両方とも、単一ＶＲ−ＩＩＩライブラリーがパッケージングされ、すべての可変位置に設計通りにヌクレオチドが組み込まれると、予想された複雑度を示した（CapLib3A）。しかし、同じＶＲ−ＩＩＩをＶＲ−ＩＶ〜ＶＲ−ＶＩＩＩプラスミドライブラリーと組み合わせると、パッケージングされたビリオンには、プラスミドレベルで予想された多様性を有するにもかかわらず、主としてＷＴ ＡＡＶ２ゲノムを組み込んだ（CapLib3B）。多数の同時置換の存在は、カプシドフォールディング及び／又は集合と不適合性である組み合わせの尤度を増し、その結果、一部の生存可能な変異体が劇的に増加するようであった。

[0167] 選択形質としての構造適合性。単一ＶＲライブラリーは予想された多様性と高い力価両方のウイルスストックを生成するようであったので、個々のＶＲごとにカプシドフォールディングとの適合性について選択することによってできる限り大きい多様性を生じさせる新たな戦略に着手した。そこで、回収したカプシド封入ウイルスＤＮＡを使用して、予備選択した構造適合性変異体を組み合わせることによって最終ライブラリーを作成した。構築された個々のライブラリーの配列分析後、ウイルスＤＮＡは、ＶＲ−ＩＩでの多様性なし（WT配列のみ）（オーバーラッピングAAP ORFのため予想通り）、ＶＲ ＩＩＩ及びＶＩでの低い多様性、ならびにすべての他のＶＲでの高い多様性を明示した。次いで、これらのＶＲ系列からの配列を組み合わせて最終ライブラリーを生成した。得られた配列は、１３６の縮重位置を含み、５９の可変アミノ酸位置をコードし、それらの可変アミノ酸位置の各々に２〜１６の順列があり、その結果、４×１０の理論複雑度（可能性のあるアミノ酸組み合わせの総数）となる（Govindasamyら、2006）。ＶＰ３単量体及び集合カプシドの三次元モデルをレンダリングし、可変アミノ酸位置をＶＲ同一性に従って彩色した。

[0168] コロニー数を外挿し、陽性クローンを補正することによって演繹して、９．２×１０^７の推定複雑度を有するプラスミドライブラリーを生成した。対応する２１のタンパク質配列すべてが特有のものであることが判明した２１クローンのランダムサンプルをシークエンシングすることによってライブラリーの質を評定した。各々と参照ＡＡＶ２配列との差は、２４〜４１のアミノ酸置換であった。置換は、１配列につき５〜７ＶＲ内に分布していた。ＶＲ ＩＩ及びＩＩＩは、すべての場合、ＷＴであった。組み立て手順のため、位置４４４及び５００はＹ／Ｆ多型性を呈示し、１／２１及び８／２１はそれぞれの位置にＷＴ Ｔｙｒ残基を含有した。

[0169] ウイルスライブラリー特性評価。コロニー数の外挿、及びランダムな個々のクローンのシークエンシングは、ライブラリー複雑度を常に過剰推定する。一部の変異体ゲノムは生存可能なカプシドを形成できないからである。よりストリンジェントな条件下でライブラリーの複雑度を評定するために、カプシド封入ウイルスＤＮＡをＮｅｘｔ−Ｇｅｎシークエンシングに付した。ＶＲ間の距離、及びＶＲの小さいサイズのため、短いリードから完全長配列コンティグを正確に再構成することはできないと予想される。それ故、そのより低いスループット及び高いエラー率にもかかわらず、ＰａｃＢｉｏサーキュラーコンセンサスシークエンシング（CCS）プラットフォームを、現行の方法論に最も適した適合性リード長を有するものとして選択した。得られるデータセットを分析するソフトウェアサポートが存在しないので、本発明者らは、シークエンシングデータを処理及び分析するための専用コード（caplib）も開発した。１９，４５５のオリジナルＣＣＳリードから、ｃａｐｌｉｂソフトウェアは、８４０の補正リードのリストを生成し、それらのリードを、上で説明したように分析するタンパク質配列に翻訳した。

[0170] 順序を入れ替えたＶＲの複雑度を例証する適便な方法として、シャノンエントロピー（Shannonら、1948）を８４０の個々のタンパク質配列のアラインメントからコンピュータ計算した。データが明かすように、エントロピーは、ＶＲ Ｉ、ＩＶ及びＶＩＩにおいて最高であり、ＶＲ Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩでは中等度であり、ＶＲ ＩＸでは非常に低く、ＶＲ ＩＩＩでは殆ど存在しなかった。８４０のタンパク質配列の比較によって、１つより多くのコピーに存在した４１配列を含む、６９９の別個の配列を同定した。各配列は、４３以下の突然変異（置換）を有し、平均は１９．１６であった。

[0171] 突然変異誘発されたＶＲの頻度分布及び相互依存性によって、配列の大部分（７５％）が３〜５（平均３．７６）ＶＲに突然変異を有することが明らかになった。配列のほぼ半分（４１４又は４９．３％）は、突然変異体ＶＲの組み合わせ３つのうちの１つ、Ｉ−ＩＶ−Ｖ−ＶＩＩ（１７９）、Ｉ−ＩＶ−Ｖ−ＶＩ−ＶＩＩ（１３４）又はＩ−ＩＶ−ＶＩＩ（１０１）を有する。配列の三分の二（５５７又は６６．３％）は、３つのＶＲ Ｉ、ＩＶ及びＶＩＩに突然変異を有する。４／５（６７７又は８０．６％）より多くが少なくともＶＲ Ｉ及びＩＶに突然変異を有する。

[0172] 各可変アミノ酸位置での突然変異体残基の−プラスミドライブラリーとウイルスライブラリーの両方における−予測及び実測百分率の比較を添付の図に示す。個々のＶＲライブラリーに由来するパッケージングされたウイルスＤＮＡから組み合わせプラスミドライブラリーを構築したので、理論ライブラリーとプラスミドライブラリーの比較は、個々のＶＲにおける突然変異のビリオン集合に対する影響を示す。ＶＲ ＩＶ、ＶＩ及びＶＩＩＩのみにおける突然変異は、カプシド集合に有意に干渉しないようであるが、対照してＶＲ ＩＩＩ及びＩＸにおける突然変異は強く選択される。プラスミドライブラリーとウイルスライブラリーの比較によって、複数の突然変異ＶＲを組み合わせることの効果を評価することが可能になる。突然変異体ＶＲ Ｉ、ＩＶ及びＶは、他のＶＲにおけるさらなる突然変異に十分寛容であり（プラスミドライブラリーからの数とウイルスライブラリーからの数の間に殆ど差は見られず）、ＶＲ ＶＩＩＩは異なり、より小さい程度にＶＲ ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸは寛容であるようである。

[0173] ８４０配列のコンセンサスを、４つより多くのコピーに見られた９つの配列とアラインした（突然変異を有する領域のみを表示する）。すべての場合、ＶＲ ＩＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸは完全にＷＴであり、これは、これらの領域がビリオン集合効率に影響を及ぼす変化に対して最も感受性でありうることを示唆していた。興味深いことに、コンセンサス配列自体が、８４０の分析した配列の中で同定されなかった。

[0174] 各可変位置でのアミノ酸組成を決定した。何らかのレベルの多様性が殆どの位置で見られる（位置３８３のみが単一同一性を有する）が、多くの場合、単一アミノ酸が支配的である。しかし、単一変異体が配列の５０％より多くに存在しない１４の位置をＶＲ Ｉ（位置２６３）、ＩＶ（４５０〜４６１）及びＶＩＩ（５４８〜５５０、５５５及び５５６）で見出すことができる。

[0175] 理論値と比較して可変アミノ酸位置の実測複雑度も算出した。実験に基づく複雑度は、理論複雑度についての１〜１６の範囲及び６．７９の平均と比較して、１と１４の間で変動し、平均は５．９３である。位置３８３だけは１の実測複雑度を有し、これは、８４０配列のうち１４配列のみがＶＲ ＩＩＩにおける突然変異を有するので、おそらくサンプリングバイアスの結果である。８つの可変領域の複雑度もまた同様にコンピュータ計算した（表１参照）。

[0176] 興味深いことに、それらの複雑度は、殆どの場合、予測されたものよりはるかに小さかった。カプシド集合に適合する組み合わせが殆どなかった、又は異なる組み合わせが集合効率の劇的な相違、ＶＲレベルで複雑度を低減させる効果の劇的な相違をもたらしたように見える。しかし、多くの配列は単一コピーとして存在したので、実際のＶＲ複雑度はサンプルにおいて観察されたものよりことによるとはるかに高かったことに留意しなければならない。例示的ライブラリー自体の複雑度に関しては、小さいサンプルサイズにより、信頼できる複雑度の決定ができなかった。しかし、可能性のあるＶＲ組み合わせの総数は、（上で説明したように過小推定される）実測複雑度に基づいて、２．０×１０^１４である。ＶＲにおけるアミノ酸の組み合わせに関して得られた実測最低値の予想最低値に対する比（１８／６９９）を適用すると５．０×１０^１２が得られ、これは、上に記載した９．２×１０^７の限界よりなおはるかに高い数字である。その限界は、実測複雑度とサンプルサイズ間の比（６９９／８４０）に従って調整する必要がある。したがって、７．７×１０^７の下限を、このライブラリーの複雑度について自信をもって推定することができた。

[0177] 肝臓標的指向型ＡＡＶ変異体のインビボでの選択。肝臓は、多くの遺伝性障害を処置するための重要な遺伝子治療標的である（Sands、2011；Sharlandら、2010）。いくつかの血清型は肝臓を優先的に標的にし、最高形質導入効率はネズミ肝臓においてＡＡＶ８によって示され（Gaoら、2002；Nakaiら、2004）、発現レベルはＡＡＶ２のものより２桁高い。しかし、これは霊長類には言えず、ＡＡＶ８の効率は霊長類でのほうが劇的に低い（Hurlbutら、2010）が、それでもＡＡＶ８は、ヒト肝臓指向性遺伝子治療に最良の候補ベクターの１つと見なされている。ＡＡＶ２をライブラリーの基幹として使用したので、本発明者らは、ＡＡＶ８のものに匹敵する効率で肝臓を標的にする新規カプシド変異体を単離できるかを問うた。

[0178] ３ラウンドのインビボでの選択後、４１クローンをシークエンシングし、反復性配列の可変領域のアラインメントを生成した。７つの肝臓選択配列はいずれも８４０の翻訳配列リード中で見つけることができなかった。これは、それらの存在度がオリジナルライブラリーにおける既存普及率の結果ではなく、真の選択の結果である可能性が最も高いことを示している。興味深いことに、ＬｉＣにおけるＫ５０７Ｔ置換はライブラリーの設計に含まれなかった。肝臓選択変異体のモチーフ濃縮の比較を表３に要約する。

[0179] モチーフ中の太字の文字は、（ＡＡＶ２参照と比較した）アミノ酸置換を示す。右側の２列は、ライブラリーシークエンシングサンプル（CapLib）における及びシークエンシングされた肝臓選択変異体におけるモチーフ出現率を示す。

[0180] 最高濃縮度を有するモチーフは、ＶＲ ＩではＳＡＳＧＡＳＮ（配列番号１７５）、ＶＲ ＩＶではＮＳＥＧＧＳＬＴＱＳＳＬＧＦＳ（配列番号１７７）及びＶＲ ＶではＳＥＦＳＷＰＧＡＴＴ（配列番号１７９）であり、これは、変異体ＬｉＡ及びＬｉＣが最も強く選択されたことを示唆している。

[0181] 肝臓選択変異体ＬｉＡ及びＬｉＣの特性評価。変異体カプシドＬｉＡ及びＬｉＣ、ならびに対照ＡＡＶ２及びＡＡＶ８をルシフェラーゼ発現性バーコード付きベクターｐＴＲ−ＵＦ５０−ＢＣでパッケージングした。肝臓におけるルシフェラーゼ発現の動態は、すべての血清型及び変異体について非常に異なった：ＡＡＶ８は急速な初期増加を媒介し、その後、ゆっくりと横ばい状態になった。ＬｉＡは、より低い発現レベルで同様の傾向をたどった。その一方で、ＬｉＣは、着実な増加をもたらし、約３０日後にＡＡＶ８のレベルと合流した。４０日の時点で、ＡＡＶ８及びＬｉＣ媒介ルシフェラーゼ発現は、ＡＡＶ２の発現を２０倍上回った。ルシフェラーゼ発現と一致して、ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴプロモーターによって駆動されるｈＦＩＸ導入遺伝子発現が同じパターンをたどり、ＡＡＶ８及びＬｉＣについては同様の効率、ＬｉＡについては２倍低い効率を示した。

[0182] 注射の４２日後にマウスを安楽死させて、様々な組織及び器官におけるウイルスゲノムの体内分布を検査した。全ＤＮＡをサンプルから単離し、定量し、ｑＰＣＲのためのテンプレートとして使用して、ウイルスゲノムコピー数を決定した。

考察
[0183] より好適な規制環境に付随する、ＡＡＶベクターを伴う臨床試験の最近の進歩は、より高い形質導入効率、より高い標的親和性、及びより低い免疫原性を有するビヒクルを得るための努力を刺激した。今までに最も多くの実績があるアプローチの１つは、新規ＡＡＶ血清型の単離であった。その明白な成功にもかかわらず、１度に１つの、新たな血清型の特性評価は、多くの時間と労力を要する。代替方法論は、特定の用途の要求を満たす新たな変異体をランダムに作ることを目指して高複雑度のコンビナトリアルカプシドライブラリーを生成することであった。しかし、カプシドライブラリーを生成するために利用できる様々な戦略には、配列バイアス又は限られた多様性という欠点がある。最後に、多くの好適な突然変異を組み合わせて相加効果を生じさせることができないのは明らか（Aslanidiら、2013）なので、カプシド構造の理解に基づくアミノ酸残基の合理的な突然変異誘発アプローチには実際的な限界があるだろう。本実施例では、３つの戦略（天然に存在する血清型の利用、指向性進化の適用、及び合理的突然変異誘発）すべてを１つの統一アプローチで開発して、遺伝子治療及び関連方法論で使用するためのＡＡＶベクターの可用性を大いに向上させた。

[0184] １５０の天然に存在するＡＡＶ変異体の既存配列データベースの生物情報学的分析を用いてコンセンサスＡＡＶカプシドテンプレートを作り、それによって９つの可変領域に、血清型の少なくとも１つにおける所与の位置に存在する代替残基を組み込んだ。唯一実行可能なアプローチ−デノボＤＮＡ合成−を用いて、このインシリコ導出アルゴリズムをコンビナトリアルプラスミドＤＮＡライブラリーに変換した。プラスミドライブラリーは初期設計を忠実に反映することが判っているにもかかわらず、３Ｄ構造適応性の新たな選択形質を導入して、個々のＶＲ各々の中の構造的に堅固な変異体を単離しなければならなかった。その後、成功したファミリーを交配して、約１×１０^８複雑度の組み合わせウイルスライブラリーを得、Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎシークエンシングを用いてそれを綿密に特性評価した。

[0185] ＷＴ親と４カプシド残基しか異ならないが２０倍向上した効率を有するネズミ肝臓を標的にするＡＡＶ２変異体（ＬｉＣ）の反復選択によって、このライブラリーの有用性を実証した。分析した両方の肝臓特異的変異体におけるすべての突然変異は、ＡＡＶカプシドの公知抗原部位及び組織形質導入を制御する領域内に位置する。ＶＲ−Ｉにおける残基２６３は、Ａ２０モノクローナル抗体の結合部位内（Lochrieら、2005）、及びＡＡＶ１のＡＤＫ１ｂフットプリント内にある。この領域が形質導入を制御することも公知である（Lochrieら、2005）。Ｑ２６３Ａ突然変異は、ＡＡＶ２．５、すなわちＡＡＶ２に由来する筋肉親和性ベクター（Bowlesら、2011）、における突然変異の１つでもある。ＶＲ−Ｖ残基は、ＡＡＶ１のＡＤＫ１ａフットプリント及びＡＡＶ１の４Ｅ４フットプリント内にある（Gurdaら、2013）。残基４９０〜５００は、ＡＡＶ２のＣ３７Ｂフットプリント及びＡＡＶ１の５Ｈ７フットプリント内にあり（Gurdaら、2013）、ＡＡＶ９における肝臓親和性に影響を及ぼすと報告されている（Pulicherlaら、2011）。

[0186] ライブラリー構築の段階的アプローチはもちろん、カプシド封入ウイルスゲノムのＮｅｘｔ−Ｇｅｎシークエンシングも、全カプシド完全性のための個々のＶＲ各々の構造的要件を理解する上で有用である。例えば、ＶＲ−ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、ＡＡＰ ＯＲＦとオーバーラップしているので肝要であるようであり、突然変異誘発することができない。ＶＲ ＩＩＩ及びＩＸは、低い複雑度値を示しており、これは、カプシド構造にとってのこれらの領域の重要性を示す。これらのＶＲにおける残基は２回軸に最も近く、このことが組み立てに重要であることは証明されている（Naumerら、2012）。その一方で、ＶＲ Ｉ、ＩＶ及びＶＩＩは最も寛容であり、それらの残基の置換は、他のＶＲにおける突然変異に適合する。立体的には、ＶＲ−Ｉは、カプシド上に隆起し、他の単量体と相互作用せず、ＶＲ−ＩＶは、表面から最も遠くに突き出し、このＶＲの基部のみが他のＶＰ単量体と相互作用する。ＶＲ Ｉ、ＩＶ、ＶＩＩ、Ｖ及びＶＩは、突然変異位置の最高含有量を有するが、ＶＲ ＩＩＩ、ＩＸ及び、より小さい程度にだが、ＶＩＩＩは、殆ど不変であり、これは以前の報告（Ngら、2010）と一致する。これらのデータは、特定のＶＲの構造適合性を不可欠な選択形質としてうまく利用することができる、よりいっそう高い複雑度を有する次世代カプシドライブラリーの設計の明確なガイダンスをもたらす。

参考文献
[0187] 下記参考文献は、本明細書に記載されるものを補足する例示的手順又は他の詳細を提供する程度に、下記参考文献の明確な参照によりそれら全体が本明細書に具体的に組み込まれている：
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[0188] 本明細書に記載される実施例及び実施形態が単に例証を目的とするものであること、及び本明細書に記載される実施例及び実施形態に鑑みて様々な修飾形態又は変更形態が当業者に示唆されることになり、本出願の主旨及び権限ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることになることは、理解されるはずである。

[0189] 本明細書に引用するすべての参考文献（出版物、特許出願及び特許を含む）は、各々の参考文献が、参照により組み込まれていると個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。

[0190] 本明細書における値の範囲についての列挙は、本明細書中での別段の指示がない限り、その範囲内に入る別々の値各々に個々に言及する簡単な方法として役立つことを意図したものに過ぎず、別々の値各々が本明細書に個々に列挙されているかのごとく本明細書に組み込まれている。

[0191] 本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中での別段の指示がない限り、又は文脈による別段の明確な否定がない限り、任意の適する順序で行うことができる。

[0192] 本明細書において提供する任意の及びすべての例、又は例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本発明をよりよく例証することを意図したものに過ぎず、別段の指示がない限り本発明の範囲に制限を課さない。本明細書中のいずれの言葉も、いずれかの要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと、そのように明確に述べられていない限り、解釈すべきではない。

[0193] １つ又は複数の要素に関して「含むこと（comprising）」、「有すること（having）」、「含むこと（including）」又は「含有すること（containing）」などの用語を用いる本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書における記載は、別段の記述又は文脈による明確な否定がない限り、その特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から本質的になる」又は「を実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施形態もサポートすることを意図したものである（例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載される組成物は、別段の記述又は文脈による明確な否定がない限り、その要素からなる組成物も記載していると解されるものとする）。

[0194] 本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載される組成物及び方法のすべては、本開示に鑑みて過度の実験なしに作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から説明したが、本発明の概念、主旨及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記載される組成物及び方法にならびに方法の工程及び一連の工程に変化を加えることができることは、当業者には明らかであると予想される。より具体的には、化学的及び／又は生理的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載される薬剤で置換することができ、その上、同じ又は類似の結果が達成されることになることは、明らかであると予想される。当業者には明らかなそのような類似の置換形態及び修飾形態はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨、範囲及び概念内であると考えられる。

Claims (6)

1. 野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質のＶＰ１アミノ酸配列において、４９８位〜５０７位に配列番号１７９のアミノ酸配列を有する、修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質。
2. 野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質のＶＰ１アミノ酸配列において、４９１位〜５０１位に配列番号１７８のアミノ酸配列を有する、修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質。
3. 野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質のＶＰ１アミノ酸配列において、（ｉ）４９１位〜５０１位に配列番号１７８のアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）４４９位〜４６３位に配列番号１７７のアミノ酸配列を有する、修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質。
4. さらにＹ４４４Ｆ置換を有する、請求項３に記載の修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオン。
6. １つ以上の診断用分子、治療用分子又は予防用分子をコードする核酸をさらに含む、請求項５に記載のＡＡＶビリオン。

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