JP6986261B2 - Method for improving expression level and yield of recombinant polypeptide - Google Patents
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Description
本発明は、特定のアミノ酸配列によりタグ化されたポリペプチド及び当該タグ化によるポリペプチドの発現量及び収量の向上方法に関する。 The present invention relates to a polypeptide tagged with a specific amino acid sequence and a method for improving the expression level and yield of the polypeptide by the tagging.
組換ポリペプチドの生産において、当該組換ポリペプチドの発現量、したがってその収量を向上させることは、依然として重要な課題である。この目的のため、一般的には、発現条件（例えば、培地の種類、発現のための培養温度、発現時間、菌株等）を最適化することが行われてきた。例えば、そのように最適化された培地として、ＴＢ培地や２ｘＹＴ培地が用いられている。 In the production of recombinant polypeptides, improving the expression level of the recombinant polypeptide, and thus its yield, remains an important issue. For this purpose, expression conditions (eg, medium type, culture temperature for expression, expression time, strain, etc.) have generally been optimized. For example, TB medium and 2xYT medium are used as such optimized medium.
また、別の方法として、目的タンパク質をＧＳＴやＭＢＰなどの高発現性タンパク質との融合タンパク質として発現させた後、高発現性タンパク質を切断除去することで目的タンパク質を回収することもしばしば行われている。しかしながら、これらの技術も依然として経験的要素に大きく依存するため、その成否の予測は困難であり、少なくとも、所望の発現量を実現し得る条件の検討には多大な時間と労力が必要である。 Alternatively, it is often the case that the target protein is expressed as a fusion protein with a highly expressive protein such as GST or MBP, and then the target protein is recovered by cleaving and removing the highly expressive protein. There is. However, since these techniques still largely depend on empirical factors, it is difficult to predict their success or failure, and at least it takes a lot of time and effort to study the conditions under which the desired expression level can be achieved.
このような課題の解決方法として、近年、大腸菌を利用した発現系又は酵母発現系によって、ＳＫ、ＳＫＸ、ＳＫＸＸ（配列番号：２）、ＡＫＸＸ（配列番号：３）又はＫＫＸＸ（配列番号：４）のアミノ酸配列（但し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）からなるペプチドタグがＮ末端に連結したタグ化タンパク質として目的タンパク質を発現させることが提案されている（特許文献１）。当該特許文献には、それらのペプチドタグをＮ末端に連結することで、マウスＦａｂ抗体及びウサギｓｃＦｖ抗体の発現量が増加したことが示されている。 As a solution to such a problem, in recent years, SK, SKX, SKXX (SEQ ID NO: 2), AKXX (SEQ ID NO: 3) or KKXX (SEQ ID NO: 4) may be used depending on the expression system using Escherichia coli or the yeast expression system. It has been proposed to express a target protein as a tagged protein in which a peptide tag consisting of the amino acid sequence of (where X represents an arbitrary amino acid residue) is linked to the N-terminal (Patent Document 1). The patent document shows that ligation of these peptide tags to the N-terminus increased the expression levels of mouse Fab antibody and rabbit scFv antibody.
一方、本発明者らは、先に、ポリペプチドの末端に１〜２０個の親水性アミノ酸から成るタグを付与することにより当該ポリペプチドの溶解度を向上させ得ることを見出している（特許文献２）。また、本発明者らは、生体分子の末端に任意のアミノ酸配列から成るペプチドが付加されたペプチド付加生体分子の溶解度を熱力学的理論に基づき計算する方法及び当該計算方法を用いて所望の溶解度とするペプチドタグを設計する方法、並びにそのような方法を利用して封入体（大腸菌の組換細胞等内に蓄積する不活性型凝集）形成を防止する方法を見出している（特許文献３）。しかしながら、これらの特許文献のいずれにおいても、組換ポリペプチドの発現量及び収量を増加させることは意図されていない。 On the other hand, the present inventors have previously found that the solubility of a polypeptide can be improved by adding a tag consisting of 1 to 20 hydrophilic amino acids to the end of the polypeptide (Patent Document 2). ). In addition, the present inventors calculate the solubility of a peptide-added biomolecule in which a peptide consisting of an arbitrary amino acid sequence is added to the end of the biomolecule based on thermodynamic theory, and the desired solubility using the calculation method. We have found a method for designing a peptide tag, and a method for preventing the formation of an encapsulater (inactive aggregate that accumulates in recombinant cells of E. coli) using such a method (Patent Document 3). .. However, none of these patent documents is intended to increase the expression level and yield of recombinant polypeptides.
したがって、本発明は、その発現及び収量が向上した組換ポリペプチド並びに組換ポリペプチドの発現及び収量を向上させる方法を提供することを課題とする。 Therefore, it is an object of the present invention to provide a recombinant polypeptide having improved expression and yield, and a method for improving the expression and yield of the recombinant polypeptide.
発明者らは、末端が様々にタグ化されたポリペプチドの様々な性質に関して研究を行ってきたなかで、驚くべきことに、特定のアミノ酸から成るタグが付加されたタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させると、当該ポリペプチドの発現量及び収量が向上することを見出した。更に、そのような発現量及び収量の向上は、アミノ酸配列が全く異なるような種々のポリペプチドに対して本発明のタグを付加した場合でさえも、達成され得ることが見出された。 As we have studied various properties of polypeptides with various end tags, we have surprisingly identified the polypeptide as a tagged polypeptide with a tag consisting of a specific amino acid. It has been found that when expressed, the expression level and yield of the polypeptide are improved. Furthermore, it has been found that such improvements in expression and yield can be achieved even when the tags of the invention are added to various polypeptides having completely different amino acid sequences.
したがって、本発明の第１の局面は、
（１）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドである。
Therefore, the first aspect of the present invention is
(1) It consists of a polypeptide, a spacer peptide composed of 0 to 2 amino acids bound to the end of the polypeptide, and a tag peptide composed of 4 to 12 amino acids bound to the spacer peptide. , The tag peptide is a recombinant polypeptide characterized by being composed of a peptide unit consisting of 1 to 3 Gly, Arg, Arg, Arg (SEQ ID NO: 1).
本発明では、上記ポリペプチドのＣ末端側に、スペーサー・ペプチドが存在するときは当該スペーサー・ペプチドが結合し、該スペーサー・ペプチドに本発明のタグ・ペプチドが結合してもよい。したがって、本発明の好適な一態様は、
（２）前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、上記（１）の組換ポリペプチドである。
In the present invention, when the spacer peptide is present on the C-terminal side of the polypeptide, the spacer peptide may be bound to the spacer peptide, and the tag peptide of the present invention may be bound to the spacer peptide. Therefore, a preferred embodiment of the present invention is
(2) The recombinant polypeptide of (1) above, wherein the spacer peptide and the tag peptide bound to the spacer peptide bind to the C-terminal of the polypeptide.
本発明のタグ化ポリペプチドは、発現量を向上させるべきポリペプチドとタグ・ペプチドの間にスペーサーとして機能するアミノ酸、例えばＧｌｙを１個又は２個程度有してもよく、そのような場合にも組換ポリペプチドの発現及び収量が向上することが見出された。したがって、本発明の好適な１つの態様は、
（３）前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、上記（１）又は（２）の組換ポリペプチドである。
The tagged polypeptide of the present invention may have one or two amino acids, for example, Gly, which function as a spacer between the polypeptide whose expression level should be improved and the tag peptide, in such a case. It was also found that the expression and yield of recombinant polypeptides were improved. Therefore, one preferred aspect of the invention is:
(3) The recombinant polypeptide of (1) or (2) above, wherein the amino acid of the spacer peptide is Gly.
上記のとおり、本発明は、様々なポリペプチドに対して適用可能であり、例えばＴＥＶプロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ及びＧＬｕｃに対しても好適に適用できる。したがって、本発明の１つの態様は、
（４）前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｄｇｅ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、上記（１）〜（３）のいずれかの組換ポリペプチドである。
As described above, the present invention is applicable to various polypeptides, and is also suitably applicable to, for example, TEV protease, anti-EGFR scFv antibody, anti-OKT3 scFv antibody, CAD and GLuc. Therefore, one aspect of the present invention is
(4) The polypeptide is selected from TEV (Tobacco Edge Virus) protease, anti-EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) scFv antibody, anti-OKT3 scFv antibody, CAD (Caspase Activated Dyna) and GLuc. The recombinant polypeptide according to any one of (1) to (3) above, which is a protein.
また、本発明の特定の一態様では、スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成されてよい。すなわち、
（５）前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、上記（１）〜（４）のいずれかの組換ポリペプチドである。
Further, in a specific aspect of the present invention, the spacer peptide may be composed of one amino acid. That is,
(5) The recombinant polypeptide according to any one of (1) to (4) above, wherein the spacer peptide is composed of one amino acid.
また、本発明は、本発明のタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させることにより、当該ポリペプチドの発現量及び収量を向上させることを意図する。したがって、本発明の第２の局面は、
（６）組換ポリペプチドの生産方法であって、
（ａ）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４〜１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは１〜３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇからなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを用意し、
（ｂ）上記（ａ）のベクターにより宿主細胞を形質転換し、
（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転換細胞を、該細胞の生育に適した条件下で培養し、及び
（ｄ）上記（ｃ）の培養物から上記（ａ）の組換ポリペプチドを回収すること、
を含む、前記方法である。
The present invention also intends to improve the expression level and yield of the polypeptide by expressing the polypeptide as the tagged polypeptide of the present invention. Therefore, the second aspect of the present invention is
(6) A method for producing a recombinant polypeptide.
(A) The polypeptide consists of a spacer peptide composed of 0 to 2 amino acids bound to the end of the polypeptide and a tag peptide composed of 4 to 12 amino acids bound to the spacer peptide. A vector containing an expression cassette encoding a recombinant polypeptide characterized in that the tag peptide is composed of a peptide unit consisting of 1 to 3 Gly, Arg, Arg, and Arg is prepared.
(B) The host cell is transformed with the vector of the above (a), and the host cell is transformed.
(C) The transformed cell obtained in the above (b) is cultured under conditions suitable for the growth of the cell, and (d) the recombinant polypeptide of the above (a) is obtained from the culture of the above (c). To collect,
The above-mentioned method.
本発明の生産方法において使用される組換ポリペプチドの態様は、上記（２）〜（５）のいずれも含み得る。したがって、本発明の生産方法の特定の態様は、
（７）前記スペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合したタグ・ペプチドが、ポリペプチドのＣ末端に結合する、上記（６）の組換ポリペプチドの生産方法、
（８）前記スペーサー・ペプチドのアミノ酸がＧｌｙである、上記（６）又は（７）の組換ポリペプチドの生産方法、
（９）前記ポリペプチドが、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｄｇｅ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるタンパク質である、上記（６）〜（８）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法、及び
（１０）前記スペーサー・ペプチドが１個のアミノ酸で構成される、上記（６）〜（９）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法である。
Aspects of the recombinant polypeptide used in the production method of the present invention may include any of the above (2) to (5). Therefore, a particular aspect of the production method of the present invention is:
(7) The method for producing a recombinant polypeptide according to (6) above, wherein the spacer peptide and the tag peptide bound to the spacer peptide bind to the C-terminal of the polypeptide.
(8) The method for producing a recombinant polypeptide according to (6) or (7) above, wherein the amino acid of the spacer peptide is Gly.
(9) The polypeptide is selected from TEV (Tobacco Edge Virus) protease, anti-EGFR (Epidermal Protein Factor Receiver) scFv antibody, anti-OKT3 scFv antibody, CAD (Caspase Activated DFS) and GLuc. The method for producing the recombinant polypeptide according to any one of the above (6) to (8), which is a protein, and (10) the above-mentioned (6) to (9), wherein the spacer peptide is composed of one amino acid. ) Is a method for producing a recombinant polypeptide.
本発明の生産方法は、さまざまな宿主を用いた組換ポリペプチド生産に適用可能であるが、宿主が大腸菌細胞であることが好ましい。したがって、本発明の別の態様は、
（１１）前記宿主が大腸菌である、上記（６）〜（１０）のいずれかの組換ポリペプチドの生産方法である。
The production method of the present invention can be applied to recombinant polypeptide production using various hosts, but it is preferable that the host is Escherichia coli cells. Therefore, another aspect of the present invention is:
(11) The method for producing the recombinant polypeptide according to any one of (6) to (10) above, wherein the host is Escherichia coli.
本発明のタグ化ポリペプチドとしてポリペプチドを発現させることにより、当該ポリペプチドの発現量及び収量を向上することができる。 By expressing the polypeptide as the tagged polypeptide of the present invention, the expression level and yield of the polypeptide can be improved.
＜タグ化ポリペプチド＞
本発明では、遺伝子組換生物による外来ポリペプチドの発現を向上させるために、特定のアミノ酸配列を有するタグによって当該ポリペプチドが修飾される。本明細書において、そのようなタグによって修飾されたポリペプチドをタグ化ポリペプチドと称し、以下に、当該本発明のタグ化ポリペプチドの構造を説明する。なお、本明細書において、特段の断りのない場合には、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載される。
<Tagged polypeptide>
In the present invention, in order to improve the expression of a foreign polypeptide by a recombinant organism, the polypeptide is modified by a tag having a specific amino acid sequence. In the present specification, a polypeptide modified by such a tag is referred to as a tagged polypeptide, and the structure of the tagged polypeptide of the present invention will be described below. In the present specification, unless otherwise specified, the amino acid sequence is described from the N-terminal to the C-terminal.
１．ポリペプチド
本発明において、その発現を向上させるべきポリペプチドの種類については特に制限がない。後述のように、本発明のタグ化により、その由来もアミノ酸配列も異なるポリペプチド（つまり、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｄｇｅ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ、抗ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｓｃＦｖ抗体、抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ抗体、ＣＡＤ（Ｃａｓｐａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ）及びＧＬｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））の遺伝子組換生物内での発現を向上させ得ることが示されている。
1. 1. Polypeptides In the present invention, there are no particular restrictions on the type of polypeptide whose expression should be improved. As described below, due to the tagging of the present invention, polypeptides having different origins and amino acid sequences (that is, TEV (Tobacco Edge Virus) protease, anti-EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) scFv antibody, anti-OKT3 scFv antibody, CAD ( It has been shown that the expression of Caspase Activated DNase) and GLuc (Gaussia Luciferase) in recombinant organisms can be improved.
したがって、本発明のポリペプチドは、細菌、真菌、ウイルス、植物及び動物等に由来するタンパク質及びそれらの断片に相当するポリペプチドであってよいがそれらに限定されない。 Therefore, the polypeptide of the present invention may be, but is not limited to, a polypeptide corresponding to a protein derived from bacteria, fungi, viruses, plants, animals and the like and fragments thereof.
例えば、本発明のポリペプチドの他の例として、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ、ＶＨＨシングルドメイン抗体断片、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等を挙げることができる。 For example, other examples of the polypeptide of the present invention include Factor Xa protease, VHH single domain antibody fragment, Taq Polymerase and the like.
なお、本明細書において、ポリペプチドの用語はタンパク質だけでなく、タンパク質の任意の断片を構成するポリペプチドを含む。 In addition, in this specification, the term of a polypeptide includes not only a protein but also a polypeptide which constitutes an arbitrary fragment of a protein.
２．タグ・ペプチド
上記ポリペプチドの末端に結合される本発明のタグ・ペプチドは、Ｇｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位を少なくとも１個有する。また、本発明のタグ・ペプチドにおいては、該ペプチド単位が連続して繰り返されていてもよい。そのようなペプチド単位の連続した繰り返しの回数に特に制限はなく、例えば、ペプチド単位の繰り返しは７回以下、好ましくは５回以下、より好ましくは３回以下であってよい。
2. 2. Tag Peptide The tag peptide of the present invention bound to the end of the above polypeptide has at least one peptide unit consisting of Gly, Arg, Arg, Arg (SEQ ID NO: 1). Further, in the tag peptide of the present invention, the peptide unit may be continuously repeated. The number of consecutive repetitions of the peptide unit is not particularly limited, and for example, the repetition of the peptide unit may be 7 times or less, preferably 5 times or less, and more preferably 3 times or less.
すなわち、本発明のタグ・ペプチドは、アミノ酸一文字表記により、一般式（ＧＲＲＲ）ｎで表され、式中、好ましくはｎが１〜７、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３であり得る。より具体的に、本発明のもっとも好適なタグ・ペプチドの例は、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：５）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）である。 That is, the tag peptide of the present invention is represented by the general formula (GRRR) n by the amino acid one-letter notation, and in the formula, n is preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3. possible. More specifically, examples of the most suitable tag peptides of the invention are GRRR (SEQ ID NO: 1), GRRRGRRR (SEQ ID NO: 5) and GRRRGRRRGRRR (SEQ ID NO: 6).
３．スペーサー・ペプチド
本発明のタグ化ポリペプチドにおいて、必ずしも必須ではないが、上記ポリペプチドとタグ・ペプチドを、スペーサー・ペプチドを介して結合させることも好適である。そのようなスペーサーとしては１〜２個程度のアミノ酸、好ましくはＧｌｙを挙げることができる。
3. 3. Spacer Peptide In the tagged polypeptide of the present invention, it is also preferable to bind the above-mentioned polypeptide and the tag peptide via a spacer peptide, although it is not always essential. Examples of such a spacer include about 1 to 2 amino acids, preferably Gly.
４．その他のタグ・ペプチド
本発明のタグ化ポリペプチドは、本発明のタグ・ペプチドが結合した末端と反対側の末端に、本発明のタグ・ペプチド以外の公知のタグ・ペプチドを有していてもよい。例えば、本発明によって発現を上昇させるべき元のポリペプチドのＣ末端側に本発明のタグ・ペプチドを結合させた場合、本発明のタグ化ポリペプチドのＮ末端側には、種々の目的のために、本発明のタグ・ペプチド以外のタグ・ペプチドを結合させてよい。例えば、発現した組換ポリペプチドをアフィニティ・クロマトグラフィー等により分離する目的で、公知のＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグやｍｙｃタグをＮ末端側に結合させてもよい。
4. Other Tag Peptides The tagged polypeptide of the present invention may have a known tag peptide other than the tag peptide of the present invention at the end opposite to the end to which the tag peptide of the present invention is bound. good. For example, when the tag peptide of the present invention is bound to the C-terminal side of the original polypeptide whose expression should be increased by the present invention, the N-terminal side of the tagged polypeptide of the present invention may be used for various purposes. A tag peptide other than the tag peptide of the present invention may be bound to the tag peptide. For example, a known His tag, FLAG tag, HA tag or myc tag may be bound to the N-terminal side for the purpose of separating the expressed recombinant polypeptide by affinity chromatography or the like.
＜タグ化ポリペプチドの製造＞
本発明のタグ化ポリペプチドは、当業者に公知の方法により製造することができる。好ましくは、目的のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞の生育に適した条件下で該細胞を生育させることにより本発明のタグ化ポリペプチドを製造することができる。そのような方法は、分子生物学のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、等に記載されている。
<Manufacturing of tagged polypeptide>
The tagged polypeptide of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. Preferably, an appropriate host cell is transformed with an expression vector incorporating a cDNA encoding the tagged polypeptide of interest, and the cell is grown under conditions suitable for the growth of the transformed cell. The tagged polypeptide of the above can be produced. Such methods are described in Molecular Biology Protocols in Molecular Biology, F. et al. Ausubel et al., Publ. Willy InterScience, New York, 1997, or Sambrook et al., "Molecular Cloning: Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, etc. There is.
例えば、本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターを製造するためには、タグ化前のポリペプチドのｃＤＮＡが組込まれた発現プラスミドを鋳型として用いることができる。そして、例えば部位特異的変異法により目的とするタグ・ペプチドのアミノ酸配列（又はスペーサー・ペプチド及びタグ・ペプチドのアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列を、前記ポリペプチドのＯＲＦの５’末端又は３’末端側に対して付加すればよい。そのような方法を実施するためのキットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）等から市販されている。また、所望により、上記のようにして作製した本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを別の発現ベクター内にクローニングしてもよい。 For example, in order to produce an expression vector incorporating a cDNA encoding the tagged polypeptide of the present invention, an expression plasmid incorporating the cDNA of the polypeptide before tagging can be used as a template. Then, for example, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the target tag peptide (or the amino acid sequence of the spacer peptide and the tag peptide) by a site-specific mutation method is used as the 5'end or 3'of the ORF of the polypeptide. It may be added to the terminal side. Kits for carrying out such methods are commercially available from Stratagene (USA) and the like. Further, if desired, the cDNA encoding the tagged polypeptide of the present invention prepared as described above may be cloned into another expression vector.
つまり、本発明に用いることのできる発現ベクターは、用いる宿主細胞の種類に応じて、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターであってよい。例えば、大腸菌のｐＥＴ１５、ｐＥＴ２６、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７等である。酵母細胞のための好適なベクターとしては、２μｍＤＮＡ、ＹＥｐ２、ＹＥｐ１３、ＹＲｐ７、ＹＩｐ５やｐＹＡＣ２が挙げられる。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。 That is, the expression vector that can be used in the present invention is a vector consisting of a plasmid, a virus, a phage, a transposon, an IS element, a fasmid, a cosmid, a linear or circular DNA, or the like, depending on the type of host cell used. It's okay. For example, E. coli pET15, pET26, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR213t pBdCI; bacillus pUB110, pC194 or pBD214; Corynebacterium genus pSA77 or pAJ667 and the like. Suitable vectors for yeast cells include 2 μm DNA, YEp2, YEp13, YRp7, YIp5 and pYAC2. Suitable vectors for animal host cells include pCDM8 and pMT2PC, as well as adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, retroviral vectors, herpesvirus vectors and the like.
上記の発現ベクターを宿主細胞に導入（形質転換）する手法としては、共沈、ヒートショック法、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等の慣用のトランスフェクション法が用い得る。宿主細胞としては、大腸菌や酵母等の細菌やＣＨＯ細胞等の動物細胞が好適であり得る。好ましい宿主細胞の例は、大腸菌細胞である。 As a method for introducing (transforming) the above expression vector into a host cell, a conventional transfection method such as co-precipitation, heat shock method, electroporation, or retrovirus transfection can be used. As the host cell, bacteria such as Escherichia coli and yeast and animal cells such as CHO cells may be suitable. An example of a preferred host cell is an E. coli cell.
上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のタグ化ポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、等電点沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のタグ化ポリペプチドを精製することができる。たとえば、上記のように、本発明のタグ化ポリペプチドは、本発明のタグ・ペプチドとは反対側の末端にＨｉｓタグ等のアフィニティ・タグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。 The tagged polypeptide of the present invention can be produced by incubating a host cell transformed with the vector of the present invention as described above under the optimum culture conditions of the cells. The tagged polypeptide of the invention can then be purified from the culture by combining centrifugation, salting out, isoelectric point precipitation, dialysis and various chromatographies. For example, as described above, the tagged polypeptide of the present invention has an affinity tag such as a His tag added to the end opposite to the tag peptide of the present invention, and the tagged polypeptide is purified by affinity chromatography. You may.
具体的に、上記のようにして形質転換された細胞は、典型的には、炭素源、窒素源、無機塩、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成又は合成培地を用いて培養することができる。例えば、大腸菌宿主のための培地としては、大腸菌が十分に生育できるものであればいずれの培地も使用でき、一般的に用いられているＬＢ培地やＴＢ培地なども使用可能である。また、形質転換に際して、例えばアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子も同時に宿主細胞に導入した場合、それらの抗生物質を培地に添加してもよい。 Specifically, cells transformed as described above are typically natural, semi-synthetic or synthetic media containing trace components such as carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and optionally trace elements or vitamins. Can be cultured using. For example, as the medium for the E. coli host, any medium can be used as long as the E. coli can grow sufficiently, and generally used LB medium, TB medium, and the like can also be used. In addition, when a resistance gene to an antibiotic such as ampicillin or kanamycin is also introduced into a host cell at the time of transformation, those antibiotics may be added to the medium.
培養法は、固体培養でも液体培養でも構わないが、生産されたタグ化ポリペプチドを培養物から分離する際の利便性の観点からは、液体培養が好ましい。 The culture method may be solid culture or liquid culture, but liquid culture is preferable from the viewpoint of convenience in separating the produced tagged polypeptide from the culture.
液体培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。 The liquid culture may be a batch type or a continuous type. Further, in any case, the form may be such that an additional carbon source or the like is replenished at an appropriate time of culturing. In addition, culture should be continued while maintaining suitable temperature, oxygen concentration, pH, etc. Suitable culture temperatures for transformants derived from common microbial host cells are usually in the range of 15 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 37 ° C. If the host microorganism is aerobic, it is necessary to shake (flask culture, etc.) and stir / aerate (jar fermenter culture, etc.) to ensure an appropriate oxygen concentration during fermentation. Those culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
本発明のタグ化ポリペプチドは、上記の培養物の上清中、菌体内、及びその双方に蓄積され得る。菌体内に蓄積したタグ化ポリペプチドは、公知の方法、例えば、超音波破砕、凍結融解、圧力式ホモジナイザー（フレンチプレス）、自己溶菌（Ｔｅｔｓｕｙａ Ｋａｍｉｏｋａ，Ｓｈｉｈｏｒｉ Ｓｏｈｙａ，Ｎａｎ Ｗｕ，Ｔｅｉ Ｍａｋｉ，Ｔｏｍｏｋｉ Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔａｋａｈｉｓａ Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｈａｒｕｋｉ Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｙｕｔａｋａ Ｋｕｒｏｄａ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｅｌｌ Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＶａｎＸ；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４３９（２）：２１２−７（２０１３））や界面活性剤による溶菌などを使用して抽出することができる。 The tagged polypeptide of the present invention can be accumulated in the supernatant of the above culture, in the cells, or both. The tagged polypeptide accumulated in the cells can be obtained by known methods such as ultrasonic crushing, freeze-thaw, pressure homogenizer (French press), autolysis (Tetsuya Kamioka, Shihori Sohya, Nan Wu, Tei Maki, Tomoki Matsu). Takahisa Ikegami, Haruki Nakamura and Yutaka Kuroda ; Extraction of Recombinant Protein from E.coli by Using a Novel Cell Autolysis activity of VanX; Analytical Biochemistry; 439 (2): 212-7 (2013)) or a surfactant by lysis, etc. Can be extracted using.
培養物の上清中又は菌体から抽出した本発明のタグ化ポリペプチドの精製を行うために、上記のような公知のＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグやｍｙｃタグを使用することは有利であり得る。これらのタグを用いたポリペプチドの精製法も当業者によく知られており、そのためのキットも幅広く市販されている。 It is advantageous to use known His tags, FLAG tags, HA tags and myc tags as described above for purifying the tagged polypeptide of the invention in the supernatant of the culture or extracted from the cells. possible. Methods for purifying polypeptides using these tags are also well known to those skilled in the art, and kits for that purpose are widely available on the market.
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［方法］
１．培養
遺伝子組換をした大腸菌は、ＬＢ培地又はＴＢ培地のいずれかで、２５℃〜３７℃で培養した。５ｍＬの培養では、試験管を２５０ｒｐｍで振とうした。２００ｍＬの培養では、５００ｍＬ羽根つき三角フラスコを２５０ｒｐｍで振とうした。いずれの場合も、培養液のＯＤが０．５となった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて発現誘導を行った。サンプリングは、発現誘導から２時間目と４時間目に行った。
[Method]
1. 1. Culture The genetically modified E. coli was cultured in either LB medium or TB medium at 25 ° C to 37 ° C. For 5 mL cultures, the tubes were shaken at 250 rpm. For 200 mL cultures, a 500 mL Erlenmeyer flask with blades was shaken at 250 rpm. In each case, expression was induced by adding IPTG so that the final concentration was 1 mM when the OD of the culture solution reached 0.5. Sampling was performed 2 hours and 4 hours after the induction of expression.
２．タグ化ポリペプチドの回収
サンプルは、培養液の一部（５００μＬ）を回収し、遠心（４℃、１４０００ｒｐｍ（２００００＊ｇ）、１５分）により大腸菌体を沈殿させ、集菌する。集菌した大腸菌体に２５０μＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．７）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて超音波破砕し、懸濁状態の破砕液を全培養物Ａ：Ａｌｌとし、懸濁状態の破砕液を遠心（４℃、１４０００ｒｐｍ（２００００＊ｇ）、１５分）により上清画分Ｓ：Ｓｕｐ、沈殿画分Ｐ：Ｐｐｔに分離した。分離後に沈殿画分にはＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを２５０μＬ加えて懸濁し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。また、上清画分からも沈殿画分と同じ量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。
2. 2. Recovery of tagged polypeptide For the sample, a part (500 μL) of the culture solution is recovered, and the E. coli body is precipitated by centrifugation (4 ° C., 14000 rpm (20,000 * g), 15 minutes) and collected. 250 μL of Lysis Buffer (50 mM TrisHCl (pH 8.7), 250 mM NaCl) was added to the collected Escherichia coli and crushed by ultrasonic waves. Was separated into a supernatant fraction S: Sup and a precipitate fraction P: Ppt by centrifugation (4 ° C., 14,000 rpm (20,000 * g), 15 minutes). After separation, 250 μL of Lysis Buffer was added to the precipitate fraction and suspended, and a part thereof was used for SDS-PAGE. In addition, the same amount as the precipitate fraction was used for SDS-PAGE from the supernatant fraction.
３．ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
上記のサンプルのそれぞれを、１０μＬずつ１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。また、分子量マーカー（Ｍ）も同時にアプライした。泳動したポリペプチドを可視化するために、ＣＢＢ染色を行った。すなわち、泳動後のゲルを固定液（２０％メタノール、７．５％酢酸溶液）に５分間漬け、染色液（０．２５％ＣＢＢ−Ｒ２５０、５０％メタノール、５％酢酸）に５分漬け、脱色液（５％メタノール、７％酢酸）に５分漬けて、ＲＯ水で脱色させた。
3. 3. SDS-PAGE
Each of the above samples was applied to 17.5% SDS-PAGE by 10 μL each. A molecular weight marker (M) was also applied at the same time. CBB staining was performed to visualize the electrophoresed polypeptide. That is, the gel after migration was immersed in a fixing solution (20% methanol, 7.5% acetic acid solution) for 5 minutes, and then immersed in a staining solution (0.25% CBB-R250, 50% methanol, 5% acetic acid solution) for 5 minutes. It was soaked in a decolorizing solution (5% methanol, 7% acetic acid) for 5 minutes and decolorized with RO water.
４．発現ポリペプチド量の解析
上記のようにしてＣＢＢ染色したゲルを、ＵＳＢ接続したカメラを用いて撮影し、その画像データを解析用の画像データとした。その画像データを、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）からダウンロード可能な画像解析ソフトウェア）を用いて、各バンドの強度を数値化した。
4. Analysis of the amount of expressed polypeptide The gel stained with CBB as described above was photographed using a camera connected via USB, and the image data was used as image data for analysis. The image data was quantified by using image analysis software (image analysis software that can be downloaded from ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)).
［実施例１］ ＴＥＶプロテアーゼの発現向上
本発明のタグによりＣ末端をタグ化したＴｏｂａｃｃｏ Ｅｄｇｅ Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（以下、「ＴＥＶ」と略す。）を、次のようにして作製した。なお、本明細書において、「Ｃ０Ｒ」は本発明のタグ・ペプチド及びスペーサー・ペプチドのいずれも有さないポリペプチドを、「Ｃ３Ｒ」は１個のペプチド単位（ＧＲＲＲ）からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、「Ｃ６Ｒ」は２個のペプチド単位からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、また、「Ｃ９Ｒ」は３個のペプチド単位からなるタグ・ペプチドを有するポリペプチドを、それぞれ、表している。
[Example 1] Improvement of expression of TEV protease A Tobacco Edge Virus protease (hereinafter abbreviated as "TEV") having a C-terminal tagged with the tag of the present invention was prepared as follows. In the present specification, "C0R" has a polypeptide having neither the tag peptide nor the spacer peptide of the present invention, and "C3R" has a tag peptide consisting of one peptide unit (GRRR). "C6R" represents a polypeptide having a tag peptide consisting of two peptide units, and "C9R" represents a polypeptide having a tag peptide consisting of three peptide units, respectively. There is.
ＴＥＶのｃＤＮＡは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０４５１７に記載されたＴＥＶ配列を基に合成ＤＮＡを作成しｐＵＣＦａに挿入したもの（ＦＡＳＭＡＣ社から入手）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：９）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＴＥＶテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（商品名：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を用いて付加し、その配列を増幅した。プラスミド配列をＤＮＡ配列決定（ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘ１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名：ＡＢＩ社、米国））により確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターは、前記ＮｄｅＩ部位の上流にＨｉｓタグを含んでおり、したがって、本実施例のタグ化ＴＥＶには、Ｎ末端側にＨｉｓタグも付加されている。この遺伝子組換により作製された発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列を図１のパネルｃ）に示した（配列番号：１０）。 The TEV cDNA was obtained by PCR using a synthetic DNA prepared based on the TEV sequence described in UniProt ID P04517 and inserted into pUCFa (obtained from FASMAC) as a template, and then amplified by PCR and obtained from the pET-15b vector (Novagen). ) Was inserted into the NdeI and XhoI restriction sites. A DNA sequence encoding a tag peptide consisting of one G (as a spacer) and GRRRGRRRGRRR (SEQ ID NO: 9) is subjected to a QuickChange site directed mutagesis method (trade name: Stratagenes) with respect to the sequence corresponding to the C-terminal of the TEV template. The company, USA) was used to add and amplify the sequence. The plasmid sequence was confirmed by DNA sequencing (PRISM 3130x1 Genetic Analyzer (trade name: ABI, USA)). The pET-15b vector contains a His tag upstream of the NdeI site. Therefore, the tagged TEV of this example also has a His tag added to the N-terminal side. The amino acid sequence encoded by the expression plasmid produced by this gene recombination is shown in panel c) of FIG. 1 (SEQ ID NO: 10).
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、ＬＢ培地（５ｍＬ及び２００ｍＬ）並びにＴＢ培地（５ｍＬ及び２００ｍＬ）内で培養して、本発明のタグ化ＴＥＶ（ＴＥＶＣ９Ｒ）を発現させた。対照としては、Ｈｉｓタグのみでタグ化され、本発明のタグ・ペプチドでタグ化されていないＴＥＶを発現させた。 The expression plasmid prepared as described above was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS according to the instructions of the manufacturer of the expression vector. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in LB medium (5 mL and 200 mL) and TB medium (5 mL and 200 mL) according to the above culture method to express the tagged TEV (TEVC9R) of the present invention. As a control, TEVs tagged only with His tags and not tagged with the tag peptides of the invention were expressed.
培養後、上記の方法に従って、発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。図２に、５ｍＬのＬＢ培地内で２５℃、３１℃及び３７℃で発現させた場合（図２ａ）、並びに２００ｍＬのＬＢ培地内で３１℃及び３７℃で発現させた場合（図２ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。 After culturing, the expressed polypeptide was recovered according to the above method, SDS-PAGE was performed, and the amount of the expressed polypeptide was analyzed. FIG. 2 shows the case of expression in 5 mL of LB medium at 25 ° C., 31 ° C. and 37 ° C. (FIG. 2a) and the case of expression in 200 mL of LB medium at 31 ° C. and 37 ° C. (FIG. 2b). The results of SDS-PAGE are shown.
また、５ｍＬのＴＢ培地及びＬＢ培地内での発現ポリペプチド量（いずれも３１℃及び３７℃で培養）の解析結果を表１に示す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＩｍａｇｅＪによる解析結果（ピクセル単位）からｍｇ単位への換算は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにはＴＥＶ１μｇを同時に流しておりそのバンド強度の数値を標準として他のバンド強度の数値を割ることでμｇを算出し、そこから５ｍＬの発現量を算出した。 Table 1 shows the analysis results of the amount of expressed polypeptide in 5 mL of TB medium and LB medium (both cultured at 31 ° C and 37 ° C). For conversion from the analysis result (pixel unit) of SDS-PAGE by ImageJ to mg unit, 1 μg of TEV is simultaneously flowing to SDS-PAGE, and the value of the band intensity is used as the standard to divide the value of other band intensities. Μg was calculated with, and the expression level of 5 mL was calculated from it.
さらに、２００ｍＬのＴＢ培地及びＬＢ培地内で、３１℃又は３７℃にて培養後、精製したポリペプチド量の解析結果を表２に示す。すなわち、２００ｍＬ培養物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに先立って、供給元の指示に従ったＮｉ−ＮＴＡ精製（商品名Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行った。具体的には、上記「２．タグ化ポリペプチドの回収」の項に記載した手法に従って大腸菌を集菌し、菌体を上記手法で破壊した後に、Ｎｉ−ＮＴＡ精製した。また、さらにその後で逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰ（ＹＭＣ社製）、移動相：水／アセトニトリル、検出：２２０ｎｍ）によりポリペプチドの高純度精製収量を測定した。当該逆相ＨＰＬＣクロマトグラムからのｍｇ単位への換算は、ＨＰＬＣ精製後のサンプルを凍結乾燥し粉末にし、それを１ｍＬのミリＱ水に溶解させ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００を用いてＵＶ濃度測定法により濃度を決め、そこからｍｇに換算して行った。なお、表中、「Ｓｕｐ」は上清画分を表し、「Ｐｐｔ」は不溶性画分を表している。また、「Ｎｉ−ＮＴＡ」はＮｉ−ＮＴＡカラム精製後の収量を表し、「ＨＰＬＣ」は逆相ＨＰＬＣ精製後の収量を表している。 Further, Table 2 shows the analysis results of the amount of the polypeptide purified after culturing at 31 ° C. or 37 ° C. in 200 mL of TB medium and LB medium. That is, for the 200 mL culture, Ni-NTA purification (trade name: Ni-NTA superflow Cartridge, manufactured by QIAGEN) was performed according to the instructions of the supplier prior to SDS-PAGE. Specifically, Escherichia coli was collected according to the method described in the above section "2. Recovery of tagged polypeptide", the cells were destroyed by the above method, and then Ni-NTA was purified. Further, after that, the high-purity purification yield of the polypeptide was measured by reverse phase HPLC (column: Protein-RP (manufactured by YMC), mobile phase: water / acetonitrile, detection: 220 nm). To convert the reverse phase HPLC chromatogram to mg, freeze-dry the sample after HPLC purification into a powder, dissolve it in 1 mL of milliQ water, and determine the concentration by the UV concentration measurement method using Nanodrop 2000. , Converted to mg from there. In the table, "Sup" represents a supernatant fraction and "Ppt" represents an insoluble fraction. Further, "Ni-NTA" represents the yield after purification of the Ni-NTA column, and "HPLC" represents the yield after purification of the reverse phase HPLC.
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＴＥＶを発現させた場合、いずれの条件でも発現量の向上が認められた。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、培養液から抽出した未精製のポリペプチド及びさらにＮｉ−ＮＴＡ精製したポリペプチドをサンプルとした場合のいずれでも同様の傾向が認められ、且つ、逆相ＨＰＬＣ精製後の収率も同様又はさらに良好であった。 From the above results, when TEV was expressed as a tagged polypeptide having the tag peptide of the present invention added to the C-terminal, the expression level was improved under any condition. In SDS-PAGE, the same tendency was observed in both cases where an unpurified polypeptide extracted from a culture solution and a polypeptide purified by Ni-NTA were used as samples, and the yield after reverse phase HPLC purification was observed. The rate was similar or even better.
［実施例２］ 抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖの発現向上
実施例１と同様にして、本発明のタグによりＣ末端をタグ化した抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（以下、「抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ Ｃ９Ｒ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、上記タグ化前ｓｃＦｖのｃＤＮＡとして、図４に示したアミノ酸配列の１〜２４６位をコードする合成ＤＮＡをｐＵＣＦａに挿入したプラスミド（ＦＡＳＭＡＣ社から入手した）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターを用いているので、このタグ化抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖにも、Ｎ末端側にＨｉｓタグが付加されている。この発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列を図４に示した。
[Example 2] Improvement of expression of anti-EGFR scFv Similar to Example 1, expression for anti-EGFR scFv (hereinafter abbreviated as “anti-EGFR scFv C9R”) whose C-terminal is tagged with the tag of the present invention. A plasmid was prepared. That is, as the cDNA of the pre-tagged scFv, a plasmid (obtained from FASMAC) in which synthetic
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、２００ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ Ｃ９Ｒを発現させた。なお、培養は３７℃で行った。対照としては、タグ化していない抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを発現させた。 The expression plasmid prepared as described above was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS according to the instructions of the manufacturer of the expression vector. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 200 mL of LB medium according to the above culture method to express the tagged anti-EGFR scFv C9R of the present invention. The culture was carried out at 37 ° C. As a control, untagged anti-EGFR scFv was expressed.
培養後、実施例１の場合に準じて、供給元の指示に従ったＮｉ−ＮＴＡ精製（商品名Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行ってポリペプチドを精製し、精製ポリペプチド量を解析した。結果を表３に示す。 After culturing, Ni-NTA purification (trade name: Ni-NTA superflow Cartridge, manufactured by QIAGEN) was performed according to the instructions of the supplier in accordance with the case of Example 1 to purify the polypeptide, and the amount of the purified polypeptide was adjusted. Analyzed. The results are shown in Table 3.
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとして抗ＥＧＲＦ ｓｃＦｖを発現させた場合、その収量の向上が認められた。 From the above results, when anti-EGRF scFv was expressed as a tagged polypeptide having the tag peptide of the present invention added to the C-terminal, the yield was improved.
なお、実施例１において、培養液から抽出した未精製のポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合の結果と、さらにＮｉ−ＮＴＡ精製したポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合の結果において同一の傾向が認められたことや、実施例２においても精製したポリペプチドの収量が向上していたことから、以後の実験では培養液から抽出した未精製のポリペプチドをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩｍａｇｅＪにより発現量を解析した。 In Example 1, the result when SDS-PAGE was performed using an unpurified polypeptide extracted from the culture solution as a sample, and the case where SDS-PAGE was performed using a Ni-NTA purified polypeptide as a sample. Since the same tendency was observed in the results and the yield of the purified polypeptide was improved in Example 2, in the subsequent experiments, the unpurified polypeptide extracted from the culture solution was used as a sample for SDS-. PAGE was performed and the expression level was analyzed by ImageJ.
［実施例３］ 抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖの発現向上
実施例１と同様にして、本発明によりタグ化した抗ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（以下、「ＯＫＴ３」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、ＯＫＴ３のｃＤＮＡを、合成ＤＮＡとしてｐＵＣＦａに挿入したプラスミド（ＦＡＳＭＡＣ社から入手した）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入した。１つのＧ（スペーサーとして）及びＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：９）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＯＫＴ３テンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＥＴ−１５ｂベクターを用いているので、このタグ化ＯＫＴ３にも、Ｎ末端側にＨｉｓタグが付加されている。この発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
[Example 3] Improving the expression of anti-OKT3 scFv In the same manner as in Example 1, an expression plasmid for anti-OKT3 scFv (hereinafter abbreviated as “OKT3”) tagged according to the present invention was prepared. That is, the cDNA of OKT3 was amplified by PCR using a plasmid (obtained from FASMAC) inserted into pUCFA as synthetic DNA as a template, and inserted into the NdeI and XhoI restriction sites of the pET-15b vector (obtained from Novagen). A DNA sequence encoding a tag peptide consisting of one G (as a spacer) and GRRRGRRRGRRR (SEQ ID NO: 9) was prepared using the QuickChange site directed mutagenesis (Stratagene) for the sequence corresponding to the C-terminus of the OKT3 template. And added. The sequence of the obtained plasmid was confirmed by DNA sequencing in the same manner as in Example 1. Since the pET-15b vector is used, a His tag is added to the N-terminal side of this tagged OKT3 as well. The amino acid sequence encoded by this expression plasmid was as follows.
上記のようにして作製した発現プラスミドを、発現ベクターの製造元の指示に準じて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＯＫＴ３を発現させた。なお、培養は３１℃で行った。対照としては、タグ化していないＯＫＴ３を発現させた。 The expression plasmid prepared as described above was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS according to the instructions of the manufacturer of the expression vector. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 5 mL of LB medium according to the above culture method to express the tagged OKT3 of the present invention. The culture was carried out at 31 ° C. As a control, untagged OKT3 was expressed.
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。解析結果を表４に示す。なお、表中、「Ｐｐｔ」は不溶性画分を表し、「Ｓｕｐ」は上清画分を表している。 After culturing, the polypeptide expressed according to the above method was recovered, SDS-PAGE was performed, and the amount of the expressed polypeptide was analyzed. The analysis results are shown in Table 4. In the table, "Ppt" represents an insoluble fraction and "Sup" represents a supernatant fraction.
上記の結果は、タグ化ＯＫＴ３（ＯＫＴ３ Ｃ９Ｒ）とタグ化していないＯＫＴ３（ＯＫＴ３）を、それぞれ２つのゲル上で泳動させたものであるが、各サンプルと同時に分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）を泳動させているので、２ゲル間をマーカーのバンド強度の数値を標準として比較することができる。つまり、マーカーに含まれるタンパク質量は常に一定であるため、この差がゲル間の差異になるから、各マーカーの強度でそれぞれのバンド強度を割り標準化している。この結果、ＯＫＴ３ Ｃ９ＲはＯＫＴ３よりもおよそ４倍の発現量を示した。 The above results were obtained by running tagged OKT3 (OKT3 C9R) and untagged OKT3 (OKT3) on two gels, respectively, and running a molecular weight marker (marker) at the same time as each sample. Therefore, it is possible to compare between the two gels using the numerical value of the band intensity of the marker as a standard. That is, since the amount of protein contained in the marker is always constant, this difference becomes the difference between gels, and the band intensity of each marker is divided and standardized by the intensity of each marker. As a result, OKT3 C9R showed an expression level about 4 times higher than that of OKT3.
［実施例４］ ＣＡＤの発現向上
本発明によりタグ化したＣａｓｐａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ（以下、「ＣＡＤ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、上記実施例と同様にして、ＣＡＤのｃＤＮＡを合成ＤＮＡとして挿入したプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＡＥＤ４ベクター（“Ｍ．Ｍ．Ｉｓｌａｍ，Ｓ．Ｓｏｈｙａ，Ｋ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙｏｈｄａ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ；Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｏｖｅｒ ｏｎｅ−ｔｈｉｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ａｌａｎｉｎｅｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．；１０５（２００８），１５３３４−１５３３９”及び“Ｍ．Ｍ．Ｉｓｌａｍ，Ｓ．Ｓｏｈｙａ，Ｋ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏ，Ｍ．Ｙｏｈｄａ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ；Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ＢＰＴＩｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；７７（２００９），９６２−９７０”に記載）のＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限部位に挿入した。スペーサー・ペプチドは含めず、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：５）又はＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＡＤテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加し、その配列を増幅した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＡＥＤ４ベクターにはＨｉｓタグ配列が含まれていないので、本実施例ではＮ末端側にＨｉｓタグは付加されない。配列番号：６を付加したＣＡＤ（ＣＡＤＣ９Ｒ）のための発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
[Example 4] Improving the expression of CAD An expression plasmid for Caspase Activated DNase (hereinafter abbreviated as "CAD") tagged according to the present invention was prepared. That is, in the same manner as in the above example, a plasmid in which the cDNA of CAD was inserted as synthetic DNA was amplified by PCR as a template, and the pAED4 vector (“MMIslam, S. Sohya, K. Noguchi, M. Yohda,” Y. Kuroda; Crystal structure of an extended vector of variant of bottles trypsin inhibitor in vector 15339 "and" M.M.Islam, S.Sohya, K.Noguchi, S.Kidokoro, M.Yohda, Y.Kuroda; , 962-970 ”), and inserted into NdeI and NcoI restriction sites. The DNA sequence encoding the tag peptide consisting of GRRR (SEQ ID NO: 1), GRRRGRRR (SEQ ID NO: 5) or GRRRGRRRGRRR (SEQ ID NO: 6), excluding the spacer peptide, corresponds to the C-terminus of the CAD template. The sequence was added to the sequence using a QuikChange site directed peptide (Stratagene) and the sequence was amplified. The sequence of the obtained plasmid was confirmed by DNA sequencing in the same manner as in Example 1. Since the pAED4 vector does not contain a His tag sequence, the His tag is not added to the N-terminal side in this example. The amino acid sequence encoded by the expression plasmid for CAD (CADC9R) with SEQ ID NO: 6 was:
上記のようにして作製した発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＣＡＤ（ＣＡＤＣ３Ｒ、ＣＡＤＣ６Ｒ及びＣＡＤＣ９Ｒ）を発現させた。培養は２５℃で行った。対照としては、タグ化していないＣＡＤ（ＣＡＤＣ０Ｒ）を発現させた。 The expression plasmid prepared as described above was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 5 mL of LB medium according to the above culture method to express the tagged CAD (CADC3R, CADC6R and CADC9R) of the present invention. Culturing was carried out at 25 ° C. As a control, untagged CAD (CADC0R) was expressed.
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。 After culturing, the polypeptide expressed according to the above method was recovered, SDS-PAGE was performed, and the amount of the expressed polypeptide was analyzed.
解析結果は表５のとおりであり、ＣＡＤＣ３Ｒ、ＣＡＤＣ６Ｒ及びＣＡＤＣ９Ｒは、ＣＡＤＣ０Ｒに比べて、それぞれ、およそ３．３倍、４．７倍及び３．５倍の発現量を示した。 The analysis results are shown in Table 5, and the expression levels of CADC3R, CDC6R and CADC9R were approximately 3.3 times, 4.7 times and 3.5 times, respectively, as compared with CADC0R.
さらに、上記の発現プラスミドを別の大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した際の、各タグ化ポリペプチドの発現量も確認した。培養は、５ｍＬのＬＢ培地中、２５℃、３０℃及び３７℃で行った。表６は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体を同じ条件下で培養し、全培養物サンプル内のタグ化ポリペプチド発現量を、各場合のＣＡＤＣ０Ｒ(対照）のＩｍａｇｅＪ解析値を１として、それに対する相対値として示している。 Furthermore, the expression level of each tagged polypeptide when the above expression plasmid was introduced into another Escherichia coli strain JM109 (DE3) pLysS was also confirmed. Culturing was performed at 25 ° C, 30 ° C and 37 ° C in 5 mL of LB medium. In Table 6, BL21 (DE3) pLysS and JM109 (DE3) pLysS transformants were cultured under the same conditions, and the expression level of the tagged polypeptide in the whole culture sample was analyzed by ImageJ of CADC0R (control) in each case. The value is set to 1 and is shown as a relative value to it.
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＣＡＤを発現させた場合、いずれの条件及び宿主でも発現量の向上が認められた。 From the above results, when CAD was expressed as a tagged polypeptide having the tag peptide of the present invention added to the C-terminal, the expression level was improved under any condition and host.
［実施例５］ ＧＬｕｃの発現向上
本発明によりタグ化したＧａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（以下、「ＧＬｕｃ」と略す。）のための発現プラスミドを作製した。すなわち、ＧＬｕｃのｃＤＮＡを合成ＤＮＡをとしてｐＵＣ１９に挿入したプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅し、ｐＡＥＤ４ベクターのＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限部位に挿入した。スペーサー・ペプチドは含めず、ＧＲＲＲ（配列番号：１）、ＧＲＲＲＧＲＲＲ(配列番号：５）又はＧＲＲＲＧＲＲＲＧＲＲＲ（配列番号：６）からなるタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＧＬｕｃテンプレートのＣ末端に対応する配列に対して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて付加し、その配列を増幅した。得られたプラスミドの配列を実施例１と同様の方法でＤＮＡ配列決定して確認した。なお、ｐＡＥＤ４ベクターにはＨｉｓタグ配列が含まれていないので、本実施例でもＮ末端側にＨｉｓタグは付加されない。配列番号：６を付加したＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ９Ｒ）のための発現プラスミドによりコードされるアミノ酸配列は以下のとおりであった。
[Example 5] Improving the expression of GLuc An expression plasmid for Gaussia Luciferase (hereinafter abbreviated as "GLuc") tagged according to the present invention was prepared. That is, a plasmid in which GLuc cDNA was inserted into pUC19 as synthetic DNA was amplified by PCR as a template, and inserted into the NdeI and NcoI restriction sites of the pAED4 vector. The DNA sequence encoding the tag peptide consisting of GRRR (SEQ ID NO: 1), GRRRGRRR (SEQ ID NO: 5) or GRRRGRRRGRRR (SEQ ID NO: 6), excluding the spacer peptide, corresponds to the C-terminus of the GLuc template. The sequence was added to the sequence using a QuikChange site directed peptide (Stratagene) and the sequence was amplified. The sequence of the obtained plasmid was confirmed by DNA sequencing in the same manner as in Example 1. Since the pAED4 vector does not contain the His tag sequence, the His tag is not added to the N-terminal side in this example as well. The amino acid sequence encoded by the expression plasmid for GLuc (GLucC9R) to which SEQ ID NO: 6 was added was as follows.
上記のようにして作製した発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。得られた遺伝子組換大腸菌は、上記の培養方法に従って、５ｍＬのＬＢ培地内で培養して、本発明のタグ化ＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ３Ｒ、ＧＬｕｃＣ６Ｒ及びＧＬｕｃＣ９Ｒ）を発現させた。培養は２５℃で行った。対照としては、タグ化していないＧＬｕｃ（ＧＬｕｃＣ０Ｒ）を発現させた。 The expression plasmid prepared as described above was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 5 mL of LB medium according to the above culture method to express the tagged GLuc (GLucC3R, GLucC6R and GLucC9R) of the present invention. Culturing was carried out at 25 ° C. As a control, untagged GLuc (GLucC0R) was expressed.
培養後、上記の方法に従って発現されたポリペプチドを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、発現ポリペプチド量を解析した。 After culturing, the polypeptide expressed according to the above method was recovered, SDS-PAGE was performed, and the amount of the expressed polypeptide was analyzed.
解析結果は表７のとおりであり、ＧＬｕｃＣ３Ｒ、ＧＬｕｃＣ６Ｒ及びＧＬｕｃＣ９Ｒは、ＧＬｕｃＣ０Ｒに対して、それぞれおよそ１．９倍、２．１倍及び２．７倍の発現量を示した。 The analysis results are shown in Table 7, and the expression levels of GLucC3R, GLucC6R and GLucC9R were approximately 1.9-fold, 2.1-fold and 2.7-fold, respectively, with respect to GLucC0R.
上記の結果から、本発明のタグ・ペプチドをＣ末端に付加したタグ化ポリペプチドとしてＧＬｕｃを発現させた場合、いずれのタグ・ペプチドでも発現量の向上が認められた。 From the above results, when GLuc was expressed as a tagged polypeptide having the tag peptide of the present invention added to the C-terminal, an improvement in the expression level was observed with any of the tag peptides.
本発明のタグ・ペプチドにより効率的な組換タンパク質の生産が可能になるので、本発明は遺伝子組換技術関連産業分野において利用可能である。 Since the tag peptide of the present invention enables efficient production of recombinant proteins, the present invention can be used in the field of gene recombination technology-related industries.
Claims (11)
（ａ）ポリペプチド、該ポリペプチドの末端に結合した０〜２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドは３個のＧｌｙ・Ａｒｇ・Ａｒｇ・Ａｒｇ（配列番号：１）からなるペプチド単位により構成されることを特徴とする組換ポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを用意し、
（ｂ）上記（ａ）のベクターにより宿主細胞を形質転換し、
（ｃ）上記（ｂ）で得られた形質転換細胞を、該細胞の生育に適した条件下で培養し、及び
（ｄ）上記（ｃ）の培養物から上記（ａ）の組換ポリペプチドを回収すること、
を含む、前記方法。 A method for producing recombinant polypeptides,
(A) The polypeptide comprises a spacer peptide composed of 0 to 2 amino acids bound to the end of the polypeptide and a tag peptide composed of 12 amino acids bound to the spacer peptide. A vector containing an expression cassette encoding a recombinant polypeptide characterized in that the tag peptide is composed of a peptide unit consisting of three Gly, Arg, Arg, and Arg (SEQ ID NO: 1) is prepared.
(B) The host cell is transformed with the vector of the above (a), and the host cell is transformed.
(C) The transformed cell obtained in the above (b) is cultured under conditions suitable for the growth of the cell, and (d) the recombinant polypeptide of the above (a) is obtained from the culture of the above (c). To collect,
The method described above.
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