JP7112540B2 - ２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法と該方法を実行する装置及び該方法に用いられる自己集合型ケミカルライブラリ - Google Patents

Description

２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法を提案する。本方法では、それぞれ一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有するリガンドが用いられる。リガンドの一部としてのＤＮＡやＲＮＡは、他のリガンドの一部であるＤＮＡやＲＮＡを補完するため、両リガンドの対応部分が一緒になって二元錯体を形成する。ある実施例における当該ＤＮＡやＲＮＡの長さは３～１０ベース、別の実施例にあっては、１０ベース以上である。本発明によれば、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡのハイブリッド化及び分離化をダイナミックに実現でき、第１実施例の場合には室温で、第２実施例の場合には過熱／冷却サイクルを適用することでこれを実現できる。さらに、本発明に係る方法を実行する微小流体装置と、各リガンドの二元錯体を有する自己集合型ケミカルライブラリを提案する。

生物医学的に興味のある種々の標的タンパク質に対して効果的なバインダや阻害薬を見つける際に、ＤＮＡコード化されたケミカルライブラリやＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーライブラリを利用するために必要な要件は、結合力の弱い又は結合力の無い成分と高い結合親和性を持つ分子とを区別するために、選択実験におけるノイズに対する信号の比率を向上させることである。

今日までの従来技術にあっては、公知の標的タンパク質に対する選択条件を最適化するために、通常異なる選択厳格性の下で並行選択実験が実行されている。例えば、複数の固体キャリア物質をそれぞれ異なる量の標的タンパク質でチャージする。さらに、種々の洗浄方法が確立されており、異なるイオン強度の緩衝剤と洗浄剤が用いられる。

並行選択実験を実行するには、標的タンパク質に関する多くの追加実験が必要となるが、これは時間的にも費用的にも負担が大きい。また、標的タンパク質の全ライブラリにおける結合親和性の分布が不明である場合、様々に変化する選択厳格性の下で並行選択実験を設計することは非常に難しい。高い親和性を持つバインダを選択するには、特別な選択条件が適用されなければならない。そのため、高親和性結合分子がライブラリに存在していることが既知である場合に限り、厳格な平行選択実験が実行できるという欠点がある。

他方、第１選択実験（デノボ選択実験）における成分の特徴付けは非常に時間と費用がかかる。加えて、先行する一次選択により得られた知識や情報無しでは、並行選択実験を設計することは難しい。

したがって、本発明の目的は、２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性三元錯体の、簡易かつ経済的であって高感度な特定方法の提供を可能にすることにある。加えて、該方法を実行する装置と、該方法に用いられる自己集合型ケミカルライブラリを提供する。

上記目的は、請求項１に係る方法、請求項１４に係るダイナミック自己集合型ケミカルライブラリ、及び請求項２１に係るライブラリの用途によって達成される。

本発明にあっては、２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の高感度特定方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：
ａ）ケミカルライブラリのリガンドと溶液中の少なくとも１個のレセプタとからなる多数の異なる錯体の相互作用。該ライブラリのリガンドは、当該リガンドと化学共有結合する長さ１０ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有する。また、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの１０ベース以上が、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する。さらに、該リガンドは、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化される。
ｂ）溶液を所定時間培養し、リガンド錯体とレセプタとからなる錯体を生成する。
ｃ）遊離リガンドを形成するために該リガンド錯体を分離する。
ｄ）更なるリガンド錯体を形成するために該リガンド錯体を再ハイブリッド化する。
ｅ）溶液を所定時間培養し、更なるリガンド錯体とレセプタとからなる更なる錯体を生成する。
ｆ）リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる錯体の特定をする。

本方法は、リガンドの第１部位と該リガンドの第２部位とが溶液の中でハイブリッド化されてリガンド錯体を形成する温度（ステップｂ），ｄ），ｅ））で培養されることを特徴とする。

２個のリガンドからなる特定の化合物（ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡを介して結合されたリガンド１及びリガンド２からなる特定の二元リガンド錯体）に対して高い親和性を持つレセプタが存在する場合、当該２個のリガンドと該レセプタとからなる高親和性三元リガンド‐レセプタ錯体が形成される。したがって、二元リガンド対の高親和性リガンド対が枯渇すると共に、三元リガンド対‐レセプタ錯体がリッチになる。

最新技術に係る方法の欠点は、アフィンリガンドをほとんど含まない又は一切含まない特定割合の高親和性リガンドが、ハイブリッド化されて低親和性リガンド錯体に「トラップされる（trapped）」ことである。当該課題は、本発明に係る方法によって解決することができる。即ち、リガンド対が分離される方法ステップにより、リガンド錯体に「トラップ（trapped）」された高親和性リガンドは、ハイブリッド化のために再び「遊離（Free）」され、続くハイブリッド化のステップにおいて、他の遊離高親和性リガンドと共に新たなリガンド錯体を形成する。新たに形成されたリガンド錯体は、リガンド‐レセプタ錯体を形成するのに利用可能となる。その結果、定量的に望ましい状況では、高親和性リガンドがリガンド‐レセプタ錯体に変換され、これによりより多くのリガンド‐レセプタ錯体が生成されると共に、最新技術に係る方法に対して感度を増加させることができる（即ち、信号‐ノイズ比が向上する）。実際、理論的に可能なライブラリ内の高親和性リガンド対の数をＮとした場合、高親和性リガンド対の形成頻度は、理想的には係数Ｎまで増加する（高親和性錯体の定量的形成。高親和性リガンドが低親和性リガンドと結合して「トラップされる（trapped）」ことはない）。

リガンド錯体は、例えば溶液の温度を上昇させることで分離可能である。具体的には、溶液の温度を３５℃から９５℃、好ましくは５０℃から９５℃、より好ましくは７０℃から９５℃、具体的には８０℃から９５℃とする。

リガンド錯体の分離化は、好適には、レセプタから所定距離だけ離れて配置された溶液の一部において実行され、該レセプタは、分離化を誘起する当該状況によってその機能を損なうことのないように配置されるのが望ましい。この実施例の有利な点は、分離化の効果がレセプタの（生化学的な）機能に悪影響を及ぼさない点にある。具体的には、熱及び／又はｐＨに起因する変性（例えば、タンパク質を含む、又はタンパク質からなるレセプタへの変性）からレセプタが保護される。

遊離リガンドは、溶液の温度を低下することで（再）ハイブリッド化することができる。具体的には、溶液の温度を１℃から３０℃、好ましくは５℃から２８℃、より好ましくは１０℃から２５℃、具体的には１５℃から２０℃とする。

本方法のステップｃ）からｅ）は、少なくとも１回又は２回繰り返され、好ましくは少なくとも３回又は４回、より好ましくは少なくとも５回又は６回、具体的には少なくとも７回又は８回繰り返される。該ステップを頻繁に繰り返すほど、より多くの高親和性リガンド錯体がリガンド‐レセプタ錯体へと変換される（感度の向上）。

好適な実施例にあっては、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうち、少なくとも２０ベース、好ましくは少なくとも４０ベース、より好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースが、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する。

さらに、本発明に係る目的を達成する別の解決手段にあっては、加熱・冷却処理を省略することができる。

この点において、２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の高感度な特定方法が提供される。当該方法は、以下のステップを含む：
ｉ）ケミカルライブラリのリガンドと、溶液中の少なくとも１個のレセプタとからなる多数の異なる錯体の相互作用。該ライブラリのリガンドは、当該リガンドと化学共有結合する長さ２ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有する。また、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースのみが、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する。さらに、該リガンドは、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化される。
ｉｉ）溶液を所定時間培養し、リガンド錯体とレセプタとからなる錯体を生成する。
ｉｉｉ）リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる錯体の特定をする。

本方法は、リガンドの第１部位とリガンドの第２部位との間において、リガンド錯体を形成するハイブリッド化と遊離リガンドを形成する分離化との平衡を達成できる温度（例えば室温、即ち１５℃から３０℃）で溶液が培養されることを特徴とする。これにより、ダイナミックなハイブリッド化と分離化を実現できる。

本発明に係る、最初に記載した方法との差異として、リガンドの２つの部位間における補完用ベースの数が小さいため、リガンドの（ハイブリッド化による）結合と分離が室温で実行できることが挙げられる（動的平衡）。また、レセプタの存在により、高親和性リガンド対が該動的平衡状態から「取り出されて（withdrawn）」、リガンド‐レセプタ錯体に変換される。したがって、高親和性リガンド対がケミカルライブラリの一般リガンドプールで枯渇し、高親和性三元リガンド‐レセプタ錯体がリッチになる。また、動的平衡により、全高親和性リガンド対が（定量的に望ましい状況では）、加熱・冷却処理を要することなく、レセプタ錯体に変換される。これにより、リガンド‐レセプタ錯体の濃度が増加すると共に、本検出方法の感度も向上する。一方、欠点としては、補完用ベースの数が小さいためにリガンド対の安定性が低く、最初に記載した方法のリガンド対に比して全体的に低親和性のリガンド対となってしまう点が挙げられる。このため、該平衡状態における三元リガンド‐レセプタ錯体の密度も低くなる。

本変形例では、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの３から９ベースのみ、好ましくは４から８ベースのみ、より好ましくは５から７ベースのみがリガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを補完する。

いずれの方法にあっても、リガンドの第１部位及び／又はリガンドの第２部位のＤＮＡやＲＮＡの長さは、少なくとも２０ベース、好ましくは少なくとも４０ベース、より好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースである。

リガンドの第１部位及び／又は第２部位は、全リガンド量の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、具体的には５０％以上を占める。また、リガンドの第１部位は、好ましくはＬ個の異なるリガンドを有し、リガンドの第２部位は、好ましくはＭ個の異なるリガンドを有する。この結果、Ｌ・Ｍ個の異なる二元リガンド錯体が形成される。Ｌ・Ｍ個の二元リガンド錯体のライブラリとして、少なくとも１．５からＮ倍、好ましくは２からＮ（１／２）倍、具体的には３から１０倍の効率で特定の高親和性リガンド錯体がリッチ化される。

好ましい実施形態にあっては、少なくともステップｂ）、ｅ）、及びｉｉ）のいずれか１つのステップにおいて、温度１℃から５０℃、好ましくは５℃から３７℃、より好ましくは１０℃から２５℃、具体的には１５℃から２０℃で溶液が培養される。上記温度範囲は、多くの種類のレセプタ（具体的には、タンパク質レセプタ）が安定しており、結合しているリガンドの機能を損なうことがないことが利点である。

また、少なくともステップｂ）、ｅ）、及びｉｉ）のいずれか１つのステップにおいて、０．１から４８時間、好ましくは０．２から２４時間、より好ましくは０．５から１２時間、具体的には１から６時間、溶液が培養される。リガンド対とレセプタの結合は熱力学的に有利である一方で緩い動特性を有するため培養時間を十分に長くとることが有利である。

本発明に係る方法において用いられるレセプタは、好ましくは基板に固定される。当該基板は、ガラス、セラミック、バイオポリマ、セファロース、合成ポリマ、ハイドロゲルからなる一群から選択される。具体的には、リガンドを含む溶液が、１サイクル中に上記固定されたレセプタに導入される。本実施例では、リガンド錯体の分離が、レセプタから所定距離だけ離れた場所に配置された溶液の一部で実行される場合に有利である。なぜならば、リガンドの分離化及びハイブリッド化を離間して行う一方で、両者を同時に実行することができるためである（例えば、レセプタから所定距離だけ離れた場所で分離化をし、レセプタの近くでハイブリッド化をする）。

レセプタは、好ましくはタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、セル、及び／又は、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子を含む、又はこれらからなる。

使用されるリガンドは、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなる。

好ましい実施例では、リガンド錯体とレセプタとからなる錯体は、ある解析手法を用いて特定される。当該手法は、好ましくは、質量分光、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィ、クロマトグラフィ、赤外線分光、及びＤＮＡ配列（好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡバーコードのＤＮＡ配列）からなる一群から選択される。

より好ましくは、リガンドの第１部位及び／又は第２部位の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、化学共有結合されたリガンドをコード化する塩基配列（バーコードとしての塩基配列）を備え、該塩基配列は、好ましくはハイブリッド化されて、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに対する相補的塩基配列を形成する。当該バーコードの有利な点は、ＤＮＡやＲＮＡ配列を介して複雑に結合したリガンドを容易に特定できる点にある。即ち、リガンドの塩基配列がバーコードとして機能し得るハイブリッド化された相補的な一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む場合に特に有利である。リガンド‐レセプタ錯体の両リガンド（リガンド１，２）が一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む場合には、これらが結合される（例えば、リガーゼを添加すると、リガンド１，２の特定の組み合わせをコード化する一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが得られる）。したがって、かかる場合、（結合された）バーコードは各リガンドだけでなく、結合されて高親和性リガンド錯体を形成する２つのリガンドもコード化する。

本方法に用いられる一本鎖ＤＮＡは、
ｉ）アデニン、チミン、グアニン、及び／又はシトシンを含む。
また、本方法に用いられる一本鎖ＲＮＡは、
ｉｉ）アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び／又はイノシンを含む。

本方法は（有意な実施例にあっては）、ライブラリ内のリガンドの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが部分的にハイブッリド化されて、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成し、リガンドの第１部位における当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する。また、本方法において、該相補的なベースと連結し（好ましくは、図６に具体的に示すように、Ｙ型を形成し）、リガーゼが添加され、これにより、リガンドの第１部位における当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、リガンドの第２部位における当該更なるＤＮＡ又はＲＮＡとが化学共有結合される。

このように、更なるＤＮＡやＲＮＡとの連結は、結果が各ベースのハイブリッド化である場合、即ち、全錯体が十分に安定している場合に限り生じる。しかしながら、一度錯体の形成が起これば、更なるＤＮＡやＲＮＡの化学共有結合によってこれが格納される（stored）。換言すれば、当該連結の基礎が全錯体の安定した形成である場合には、連結された更なるＤＮＡ又はＲＮＡが蓄積されていく。この場合、本方法の感度を顕著に上昇させることができる。特に、蓄積された連結ＤＮＡ又はＲＮＡが、公知の方法（ＰＣＴ，ＲＴ－ＰＣＲ）を介してさらに増幅されると、本発明の感度が顕著に向上する。この結果、非常に濃度の低いリガンドを用いることも可能となったり、非常に濃度の低いレセプタの場合であっても高親和性リガンドを特定したりすることができる。

上記実施例にあっては、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、
ｉ）その５´端末にリガンドが結合され、当該５´端末において、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの２～１０ベースが、当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置される、又は、
ｉｉ）その３´端末にリガンドが結合されているとき、当該３´端末において、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完すると共に、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される。

上記各相補的ベースの特定の配置により、Ｙ構造の形成を補助し、その結果、リガーゼによる２つの更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの連結の効率が高まる。

さらに、本発明に係る上記方法を実行する微小流体装置が提供される。当該装置は、ａ）固定レセプタを受け取る容器であって、ライブラリのリガンドの注入とリガンド‐レセプタ錯体の隔離とを実現するバルブへのアクセスを有し、流体パイプの流入口及び流出口を備える容器と、
ｂ）容器の入口と出口に接続された流体パイプであって、１か所にバルブ付き排出口を有する流体パイプと、
ｃ）流体パイプの第１領域に設けられた加熱装置と、
ｄ）流体パイプの第１領域とは異なる第２領域に設けられた冷却領域と、
を備える。

本微小流体装置では、溶液中のリガンドの過熱及び固定レセプタと結合したリガンドの選択が、互いに離間した位置で行われ、その結果、レセプタの損傷（例えばタンパク質の変性）を防ぐことができる。容器は、固定レセプタを保護し、固定レセプタが流体パイプに流れるのを防ぐ。そのため、容器は固定レセプタが流体パイプに流れるのを防ぐフィルタを備えていることが好ましい。

好適な実施例では、本装置の冷却領域は冷却装置を備え、及び／又は、該冷却領域はバルブ付き排出口の部位に設けられる。

本装置は、流体パイプを介して液体を送り出すために設けられたポンプを備える。また、本装置の容器は固定レセプタが流体パイプに流れるのを防ぐフィルタを備える。

本微小流体装置は、容器及び／又は流体パイプが、本発明に係るダイナミック自己集合型ケミカルライブラリを備えることを特徴とする。

さらに、リガンドを備えるケミカルライブラリを提供する。該ライブラリは、他のリガンドと化学共有結合されたリガンドであって、ベース長さが２ベース以上の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有するリガンドを備える。また、該ライブラリは、リガンドの第１部位における２～１０ベースの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、該リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完することを特徴とする。

リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうち、３から９ベースのみ、好ましくは４から８ベースのみ、より好ましくは５から７ベースのみがリガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する。

リガンドの第１部位及び／又は該リガンドの第２部位におけるＤＮＡ又はＲＮＡの長さは、少なくとも２０ベースであり、好ましくは少なくとも４０ベース、より好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースである。

好適な実施例では、リガンドの第１部位及び／又は第２部位は、ライブラリ内のリガンドの総量に対して２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、具体的には５０％のリガンドを構成する。第１部位のリガンドＬは、好ましくはＬ個の異なるリガンドを有し、第２部位のリガンドは、好ましくはＬ個の異なるリガンドを有する。これにより、ライブラリにはＬ２個の異なるリガンド錯体が格納される。

ライブラリのリガンドは、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなる。

上記一本鎖の
ｉ）ＤＮＡは、アデニン、チミン、グアニン、及び／又はシトシンを備え、
ｉｉ）ＲＮＡは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び／又はイノシンを備える。

ライブラリは、該ライブラリのリガンドの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡがそれぞれ部分的にハイブリッド化されて、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成することを特徴とする。ここで、該リガンドの第１部位における第１の更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの２～１０ベースが、該リガンドの第２部位における第２の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する。

リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、
ｉ）リガンドの５´端末にリガンドを備え、当該５´端末にリガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完するベースを有し、リガンドの第２部位における第２の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの２～１０ベースが、当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置される、又は、
ｉｉ）リガンドの３´端末にリガンドを備え、当該３´端末にリガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完するベースを有し、リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完する更なる一本鎖ＤＮＡ（９）又はＲＮＡの２～１０ベースが、当該更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される。

最後に、本発明に係る、高親和性三元リガンド‐レセプタ錯体の選択的で高感度な特定を実現する、ケミカルライブラリの用途を提供する。

ケミカルライブラリの多数の異なるリガンドと、少なくとも１つのレセプタとを示す。 他の実施例に係るケミカルライブラリの多数の異なるリガンドと、少なくとも１つのレセプタとを示す。 高親和性リガンド対がレセプタとの錯体としてどのように蓄積されていくかを説明する説明図である。 本発明に係る微小流体装置を示す。 本発明に係る方法の効果を実証する実験結果を示す。 錯体全体が本発明の好適な実施例に適合したＹ型を示す。

本発明の対象を添付の図面を参照してより詳細に説明するが、当該対象をここで図示される特定の実施例に限定する意図はない。

図１は、ケミカルライブラリの多数の異なるリガンド２，３，４，５，６，７と、少なくとも１つのレセプタ１とを示す。リガンド２，３，４，５，６，７は、ベース長さ１０以上の一本鎖ＤＮＡ８，９とそれぞれ化学共有結合される。一本鎖ＤＮＡ８，９は、塩基配列を介して結合された対応するリガンドをそれぞれコード化する。本実施例では、リガンド２，６，７の第１部位における一本鎖ＤＮＡ８の１８ベースが、リガンド３，４，５の第２部位における一本鎖ＤＮＡ９を補完している（一本鎖ＤＮＡ８，９間の破線を参照）。ここでは、（符号２，３のリガンドによって形成される）特定のリガンド対のみが高親和性でレセプタ１と結合する。（符号４，５，６，７のリガンドによって形成される）他のリガンド対は結合力が弱く、レセプタ１とは一切結合しない。２つのリガンド２，３，４，５，６，７の一本鎖ＤＮＡ８，９間における多数の相補的ベースにより、当該リガンド錯体が安定し、検出方法としての使用中、高い感度をもたらすことができる。また、ダイナミックハイブリッド化と分離化を達成するためには、永続的な暖房（分離化）と冷却（再結合又はハイブリッド化）、即ちエネルギ供給が必要となる。

図２は、図１に対応する図面であるが、この実施例では、リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡの６ベースのみが該リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースを補完している点で図１に示す例と相違する（その他の分子や符号については、図１と同一である）。相補的ベースが少ないため、２つのリガンドの結合（ハイブリッド化）を室温（１５℃～３０℃）でダイナミックに実現できるという利点を持つ。即ち、永続的なハイブリッド化と分離化が実現できる。特定のリガンド対の場合、レセプタとの高親和性結合により、これらリガンド対の分離化が妨げられ、その結果、レセプタと高親和性リガンド対とからなる錯体がより長く存在し、「蓄積し（accumulate）」、やがて、平衡状態においてより高い密度で存在する。この実施例にあっては、ダイナミックな結合及びハイブリッド化が室温で実現されるため、図１の実施例に比して、熱エネルギを供給する必要性がないという利点を有する。一方、本実施例では、ベース対の数が少なく（１８ではなく６）リガンド錯体及びリガンドとレセプタとからなる錯体が不安定な状態となるため、図１の実施例に比して感度が低いという点で不利である。その結果、図１の実施例よりも、平衡状態における密度が低くなる。

図３は、反応式によって、高親和性リガンド対がレセプタとの錯体としてどのように「蓄積されていく（accumulate）」かを説明するものである。図１から図２を参照して既に説明した分子に加え、リガンド対は、リガンドと共有結合された一本鎖ＤＮＡを補完する一本鎖ＤＮＡ１０，１１をさらに有する（それ以外は、分子も符号も図１と同一である）。当該追加の一本鎖ＤＮＡ１０，１１は、例えば適切なプライマ及びＰＣＲ反応を介して生成される。下向き矢印１２は、（例えば、該追加の一本鎖ＤＮＡ１０，１１が相互に化学共有結合するように促すリガーゼ酵素を追加することで実現する）連結反応を示す。この例において有利な点は、連結されたＤＮＡフラグメントが、塩基配列を介して特定のリガンド対用にコード化される結果、ＤＮＡ配列により当該リガンド対を容易に特定できることにある。

図４は、本発明に係る微小流体装置を示す。バルブ付き開口１５から容器に充填された固定レセプタが容器１４内に存在する。容器１４は一方側及び反対側が、液体を導入する１つのパイプで接続される。該パイプは加熱領域に配置される。加熱処理は、熱源１３となる赤外線ラジエータにより実行される。さらに、当該装置は冷却領域１７を有する。該領域には、冷却装置を設けても良い。さらに、該冷却領域１７において、パイプにバルブ付き排出口１６が設けられ、分析のために（遊離）リガンドを含む液体を取り出したり供給したりすることができる。加えて、所定の培養時間経過後、高親和性リガンドで充填された固定レセプタが開口１５から取り出される。

図５は、本発明に係る方法の効果を実証する実験結果を示す。リガンドとしては、ｓｓＤＮＡと化学共有結合したイミノビオチン（Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ）を用いた。該Ｉｍ－ｓｓＤＮＡは、均等に、第１部位Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１と第２部位Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ２に分離される。本実験において、Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１及びＩｍ‐ｓｓＤＮＡ２は異なる数のベースを有し、該ベースは互いに補完し合う（例えば、“６‐ｍｅｒ”の場合には、６つの相補的ベースを有する）。また、Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１は蛍光色素Ｃｙ５と化学共有結合されて、遊離Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１や、レセプタを備えないＩｍ‐ｓｓＤＮＡ２とＩｍ‐ｓｓＤＮＡ１とからなる遊離二元錯体の検出及び定量化を可能とすると共に、三元Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１・Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ２・レセプタ錯体の検出を可能とする。なお、レセプタには固定されたストレプトアビジンを用い、溶液にはｐＨ９．２の水性緩衝材を用いた。図は、競合条件、即ち、非アフィンリガンドの一例としてイミノビオチンフリーｓｓＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が存在している状況（ｘ軸の「ワンアーム（one-arm）」、「６‐ｍｅｒ（6-mer）」、「８‐ｍｅｒ（8-mer）」、「２１‐ｍｅｒ（21-mer）」を参照）と、競合するｓｓＤＮＡが存在しない非競合条件（ｘ軸の「２１－ｍｅｒ、非競合（21-mer, no comp.）」を参照）において、リガンド‐レセプタ錯体に対するレセプタと結合していないリガンドの割合（ｙ軸の「結合／非結合（bonded/unbonded）」）を示す。

非競合実験（ｘ軸における「２１－ｍｅｒ：非競合（21-mer, no comp.）」）を除き、溶液中にはイミノビオチンフリーｓｓＤＮＡが３００倍以上存在する。「ワンアーム（one-arm）」（及び「６‐ｍｅｒ（6-mer）」）での実験では、Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１のみが存在し、Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ２は存在しないため、２元リガンド錯体が形成されることはなかった。したがって、「ワンアーム（one-arm）」の実験は、単量体イミノビオチンのストレプトアビジンに対する結合率を示す。また、「６‐ｍｅｒ（6-mer）」実験との直接比較から、二量体イミノビオチン（＝二元リガンド錯体）を用いた当該実験条件下において、結合平衡がリガンド‐レセプタ錯体の方向に移動したことが明確に見て取れる。なお、「８‐ｍｅｒ（8-mer）」実験の場合、８ベース対のハイブリッド化の方がより高い安定性を有するため、当該効果がより顕著に見て取れる。しかしながら、相補的ベースの数がさらに増えると（例えば、「２１‐ｍｅｒ（21-mer）」実験の２１相補的ベースの場合）、得られるリガンド‐レセプタ錯体の量は、「ワンアーム（one-arm）」実験の値と略同じ値にまで低下する。

かかる現象は、Ｃｙ５とラベル化したｓｓＤＮＡ（Ｉｍ－ｓｓＤＮＡ１）が、イミビオチンフリーのｓｓＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を有する低親和性錯体に「トラップされ（trapped）」、Ｃｙ５フリーだがイミビオチンを含むｓｓＤＮＡ（Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ２）とは相補的に結合しえなくなることに起因する。なお、かかる結果は「２１－ｍｅｒ（21-mer）」実験でのみ見られる。なぜなら、形成されたＩｍ‐ｓｓＤＮＡ１・ｓｓＤＮＡ錯体が非常に安定しており、室温では（追加のエネルギ供給がない限り）当該錯体の分離が発生しないためである。一方、相補的ベースの数が６個や８個である場合（「６‐ｍｅｒ（6-mer）」、「８‐ｍｅｒ（8-mer）」の場合）、Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１・ｓｓＤＮＡ錯体の形成が安定せず、ダイナミックであるため、上記現象は発生しない。このため、相補的ベースの数が少ない場合には、ｓｓＤＮＡによって「ブロックされた（blocked）」、イミビオチン結合ｓｓＤＮＡ（Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ１）が再び遊離し、更なるイミビオチン結合ｓｓＤＮＡ（Ｉｍ‐ｓｓＤＮＡ２）と反応して高親和性錯体を形成することができる。この結果、相補的ベースの数が６個又は８個の場合、レセプタ（この例にあってはストレプトアビジン）と高親和性リガンド対（この例にあっては、２つのイミビオチン分子）とからなる錯体の「蓄積（accumulation）」が室温で発生する。これにより、静的な方法に比して本方法が有利なものとなる。なお、２１個のベースを用いても、加熱（分離）と冷却（ハイブリッド化）を交互に加えることによって、すなわちエネルギを供給することで、感度を上昇させることができる。

図６は、錯体全体が本発明の好適な実施例に適合したＹ型を示す。第１の一本鎖ＤＮＡ８と化学共有結合した第１リガンド２は、該第１リガンド２をコード化する部位１８を有する。第２の一本鎖ＤＮＡ９と化学共有結合した第２リガンド３は、該第２リガンド３をコード化する部位１９を有する。第１の一本鎖ＤＮＡ８の６個のベースは、第２の一本鎖ＤＮＡ９の６つのベースを補完し、本方法の実施中、ベース対２０を形成する（第１一本鎖ＤＮＡ８，９の間の線を参照）。さらに、この実施例における第１の一本鎖ＤＮＡ８は、部分的に（３´端末で）第１の追加的一本鎖ＤＮＡ１０とハイブリッド化される。該追加的一本鎖ＤＮＡ１０は、第２の一本鎖ＤＮＡ９の２～１２個のベース（ここでは、５個）を補完する２～１２個のベース（３´端末に位置する５個のベース）の「張出し部（overhand）」を備え、上記補完的ベースと共に、本発明の実施中に上記ベース対２０を形成している（第１の追加的一本鎖ＤＮＡ１０と第２の一本鎖ＤＮＡ９との間の線を参照）。

第２リガンド３が第２の一本鎖ＤＮＡ９を介して対応する第２の追加的ＤＮＡ１１と部分的にハイブリッド化される場合に、錯体全体の形成が実現され（Ｙ型）、第１の追加的ＤＮＡ１０と第２の追加的ＤＮＡ１１とが一体となり、リガーゼ酵素を介して化学共有結合される。本方法においてリガーゼ酵素を追加することにより、追加的一本鎖ＤＮＡ１０，１１の結合物を得ることができ、本方法によって蓄積された高親和性リガンド錯体をコード化できる。その結果、検出感度が向上する。なお、当該蓄積物はＤＮＡであるため、これを（例えばＰＣＲによって）さらに増幅させ、本方法に係る感度をさらに向上させることもできる。さらに、結合されたＤＮＡは両リガンド２，３をコード化する部位１８，１９を有しているため、その結合されたＤＮＡの配列により、当該２つのリガンド２，３に関する迅速な結論を可能とする。

Claims (20)

1. ２個のリガンドと１個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法であって、
   ｉ）ケミカルライブラリのリガンドと、溶液中の少なくとも１個のレセプタとからなる多数の異なる錯体を相互作用させるステップであって、前記ライブラリの該リガンドが前記リガンドと化学共有結合する長さ少なくとも２０ベースの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有し、前記リガンドの第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースのみが前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であると共に、前記リガンドが、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリダイゼーションを介してリガンド錯体を形成するために複合化され、
   ｉｉ）前記溶液を所定時間培養し、リガンド錯体と前記レセプタとからなる錯体を生成するステップと、
   ｉｉｉ）リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる前記錯体を特定するステップと、を備え、
   前記溶液は、前記リガンドの第１部位と前記リガンドの第２部位との間において、リガンド錯体を形成するハイブリダイゼーションと遊離リガンドを形成する分離化との平衡をもたらす１５℃～３０℃の温度で培養され、
   前記リガンドの前記第１部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記リガンドの前記第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、化学共有結合されたリガンドをコード化する塩基配列を含む、ことを特徴とする方法。
2. 前記リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの３から９ベースのみ、好ましくは５から９ベースのみ、より好ましくは６から８ベースのみが前記リガンドの第２部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと相補的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記リガンドの前記第１部位における前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さ及び／又は前記リガンドの前記第２部位における前記ＤＮＡ又はＲＮＡの長さが、少なくとも４０ベース、好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記リガンドの前記第１部位がＬ個の異なるリガンドを有し、前記リガンドの前記第２部位がＭ個の異なるリガンドを有し、よってＬ・Ｍ個の異なるリガンド錯体が形成されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記溶液が、前記ｉｉ）のステップにおいて、１℃から５０℃、好ましくは５℃から３７℃、より好ましくは１０℃から２５℃、具体的には１５℃から２０℃で培養されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記溶液が、前記ｉｉ）のステップにおいて、０．１から４８時間、好ましくは０．２から２４時間、より好ましくは０．５から１２時間、具体的には１から６時間、培養されることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記レセプタが、好ましくはガラス、セラミック、バイオポリマ、セファロース、合成ポリマ、及びハイドロゲルからなる一群から選択される基板上に固定されることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記レセプタが、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、セル、及び／又は、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記リガンドが、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. リガンド錯体と前記レセプタとからなる前記錯体が、質量分光、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィ、赤外線分光、及びＤＮＡ配列、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡバーコードのＤＮＡ配列、からなる一群から選択される分析手法によって特定されることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記化学共有結合されたリガンドをコード化する前記塩基配列は、少なくとも部分的にハイブリダイゼーションして、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ライブラリのリガンドの前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成するために部分的にハイブリダイゼーションされ、
    前記リガンドの第１部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であると共に、前記相補的ベースと連結し、
    前記方法において、Ｙ型を形成し、
    リガーゼを添加して、前記リガンドの前記第１部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、前記リガンドの前記第２部位における前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとを化学共有結合することを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記リガンドの第１部位における一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、ｉ）５´端末に前記リガンドを有しているとき、該５´端末において、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であると共に、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的である前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置される、又はｉｉ）３´端末に前記リガンドを有しているとき、該３´端末において、前記リガンドの第２位部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であるベースを有すると共に、前記リガンドの第２部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的である前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. ベース長さが少なくとも２０ベースの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと化学共有結合した第１のリガンド及び第２のリガンドを備えるケミカルライブラリであって、
    前記第１のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースのみが前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であり、
    前記ケミカルライブラリは、前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドの各々の二元錯体を含み、
    前記第１のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、化学共有結合されたリガンドをコード化する塩基配列を含む、ことを特徴とするライブラリ。
15. 前記第１のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの３から９ベースのみ、好ましくは５から９ベースのみ、より好ましくは６から８ベースのみが前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと相補的であることを特徴とする請求項１４に記載のライブラリ。
16. 前記第１のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの長さ及び／又は前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの長さが、少なくとも４０ベース、好ましくは少なくとも１００ベース、具体的には少なくとも２００ベースであることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のライブラリ。
17. 前記第１のリガンドがＬ個の異なるリガンドを有すると共に、前記第２のリガンドがＭ個の異なるリガンドを有し、よって前記ライブラリがＬ・Ｍ個の異なるリガンド錯体を有することを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載のライブラリ。
18. 前記リガンドが、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量２００ｋＤａ以下、好ましくは１００ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、具体的には３ｋＤａ以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項１４から１７のいずれか１項に記載のライブラリ。
19. 前記ライブラリのリガンドの前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的塩基配列を形成するためにそれぞれ部分的にハイブリダイゼーションされ、
    前記第１のリガンドにおける第１の更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記第２のリガンドにおける前記第２の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であることを特徴とする請求項１４から１８のいずれか１項に記載のライブラリ。
20. 前記第１のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡが、
    ｉ）５´端末に前記第１のリガンドを有しているとき、該５´端末において、前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であると共に、前記第２のリガンドにおける前記第２の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的である前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの３´端末に配置されるか、又は
    ｉｉ）３´端末に前記第１のリガンドを有しているとき、該３´端末において、前記リガンドの第２位部位における前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的であるベースを有すると共に、前記第２のリガンドにおける前記一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのベースと相補的である前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのうちの２から１０ベースが、前記更なる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの５´端末に配置される、ことを特徴とする請求項１９に記載のライブラリ。

Images