JP7315053B2 - Methods for detecting RNA and reagents for detecting RNA - Google Patents
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Description
本発明は、試料中に含まれるＲＮＡを検出する方法およびＲＮＡを検出するための試薬・キット等に関する。更に詳しくは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含んだ反応液を用いてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応及び蛍光強度の測定を行うことで、標的ＲＮＡを検出する方法及びそのための試薬等に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting RNA contained in a sample and reagents, kits, etc. for detecting RNA. More specifically, the present invention relates to a method for detecting target RNA, a reagent for the one-step RT-PCR reaction and fluorescence intensity measurement using a reaction solution containing a DNA polymerase belonging to family B, a reverse transcriptase, and a hybridization oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye whose at least one terminal base is quenched by interaction with guanine, and the like.
試料中に含まれるＲＮＡの検出は、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等で一般的に使用されている。特に、蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含んだ反応液を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施することで種々の定性的及び定量的なＲＮＡ検出が実施され得る。 Detection of RNA contained in a sample is commonly used in life science research, clinical diagnosis, food hygiene inspection, environmental inspection, and the like. In particular, a variety of qualitative and quantitative RNA detection can be performed by performing reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using a reaction solution containing a fluorescent dye-labeled hybridization oligonucleotide or a double-stranded DNA-binding fluorescent compound.
例えば、試料中のＲＮＡウイルスの検出、遺伝子発現解析等を実施するためにＲＴ－ＰＣＲ反応が行われるが、従来技術では、以下の（ａ）～（ｃ）に示すような課題があった。
（ａ）試料中に含まれる核酸増幅阻害物質の影響により、標的ＲＮＡの増幅が抑制されるため、感度が低下する
（ｂ）ＲＴ－ＰＣＲ反応の反応時間が長い
（ｃ）ＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすること及び標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析を高感度に同一反応液中で行うことができない。
For example, an RT-PCR reaction is performed to detect an RNA virus in a sample, perform gene expression analysis, etc. However, the conventional techniques have the following problems (a) to (c).
(a) Amplification of the target RNA is suppressed due to the influence of the nucleic acid amplification inhibitor contained in the sample, resulting in decreased sensitivity. (b) The reaction time of the RT-PCR reaction is long. (c) Real-time monitoring of the progress of the RT-PCR reaction and analysis of the base sequence polymorphism of the target RNA cannot be performed with high sensitivity in the same reaction solution.
上記の課題を解決するために、種々の発明が報告されてきたが、操作が煩雑、高コスト等の問題があった。 Various inventions have been reported to solve the above problems, but they have problems such as complicated operation and high cost.
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、より簡便、高感度に試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出することである。さらには、ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすること及び標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析を高感度に同一反応液中で行うことである。 The present invention has been made against the background of such problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to detect target RNA contained in a sample more simply and with high sensitivity. Furthermore, the real-time monitoring of the progress of the one-step RT-PCR reaction and the highly sensitive analysis of the nucleotide sequence polymorphisms of the target RNA in the same reaction solution.
本発明者らは鋭意研究の結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含んだ反応液を用いることで、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。 As a result of intensive research, the present inventors have found that the above problems can be solved by using a reaction solution containing a DNA polymerase belonging to family B, a reverse transcriptase, and a hybridization oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye whose terminal base at least one is quenched by interaction with guanine, thereby achieving the present invention. That is, the outline of the present invention is as follows.
［項１］
以下の工程（１）～（３）を含む、試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法。
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）で得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する。
［項２］
工程（３）が以下の工程（３ａ）～（３ｃ）の少なくともひとつに該当する、項１に記載の方法。
工程（３ａ）得られた反応液中の増幅産物に、前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。
工程（３ｂ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
工程（３ｃ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、標的ＲＮＡを検出する、または、前記標的ＲＮＡの塩基配列多型を分析する。
［項３］
前記（Ａ）が古細菌ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項１または２に記載の方法。
［項４］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項３に記載の方法。
［項５］
前記（Ｃ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）および２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群のうちいずれかである、項１～４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンである、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］
標的ＲＮＡがＲＮＡウイルスである、項１～６のいずれかに記載の方法。
［項８］
ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスＧ１型及び／又はノロウイルスＧ２型である、項７に記載の方法。
［項９］
標的ＲＮＡがヒト由来ＲＮＡである、項１～６のいずれかに記載の方法。
[項１０]
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３又は４で示される塩基配列を有する、項１～９のいずれかに記載の方法。
［項１１］
工程（２）で増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号５～８のいずれかで示される塩基配列を有する、項１～１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］
以下の（Ａ）～（Ｃ）を少なくとも含む、項１～１１のいずれかに記載の試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法を実施するための試薬。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
［項１３］
項１２に記載の試薬を含むキット。
[Section 1]
A method for detecting target RNA contained in a sample, comprising the following steps (1) to (3).
Step (1) A sample is provided in a reagent solution including at least the following (A) to (C).
(A) a DNA polymerase belonging to family B (B) a reverse transcriptase (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescent quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with the amplification product obtained in step (2);
Step (2) performing a one-step RT-PCR reaction to reverse transcribe the target RNA into cDNA and amplify at least part of the cDNA.
Step (3) The oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained in step (2), and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured.
[Section 2]
Item 1. The method according to item 1, wherein step (3) corresponds to at least one of the following steps (3a) to (3c).
The oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained in step (3a), and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured to monitor the progress of the amplification reaction in step (2) in real time.
Step (3b) After completion of step (2), the oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained, and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured to monitor the progress of the amplification reaction of step (2) at an endpoint.
Step (3c) After step (2) is completed, the oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained, and the temperature dependence of the fluorescence intensity of the reaction solution is measured to detect the target RNA or analyze the nucleotide sequence polymorphism of the target RNA.
[Section 3]
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein (A) is an archaeal DNA polymerase or a mutant thereof.
[Section 4]
Item 4. The method of Item 3, wherein the archaeal DNA polymerase is KOD DNA polymerase or a mutant thereof.
[Section 5]
The fluorescence quenching dye of (C) is 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY-FL), carboxyrhodamine 6G, TAMRA, rhodamine 6G, tetrabromosulfonefluorescein (TBSF) and 2-oxo-6,8-difluoro-7-dihydroxy-2H-1-benzopyran-3-carboxylic acid ( Pacific Blue).
[Section 6]
Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein in the oligonucleotide (C), the terminal base labeled with a fluorescence quenching dye is cytosine.
[Section 7]
Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the target RNA is an RNA virus.
[Item 8]
Item 8. The method according to Item 7, wherein the RNA virus is Norovirus G1 and/or Norovirus G2.
[Item 9]
Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the target RNA is human-derived RNA.
[Item 10]
Item 10. The method according to any one of Items 1 to 9, wherein the oligonucleotide of (C) has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
[Item 11]
Item 11. The method according to any one of items 1 to 10, wherein the oligonucleotide primer used for amplification in step (2) has a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5 to 8.
[Item 12]
Item 12. A reagent for carrying out the method of detecting target RNA contained in a sample according to any one of items 1 to 11, comprising at least the following (A) to (C).
(A) a DNA polymerase belonging to family B (B) a reverse transcriptase (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescent quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with the amplification product obtained in step (2) [Claim 13]
Item 13. A kit comprising the reagent of Item 12.
本発明により、簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出することができるようになった。さらには、ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできるだけでなく、標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析も行うことができるようになった。本発明の方法あるいはキットを使用することで、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野に大きく貢献できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, target RNA can be detected easily and with high sensitivity. Furthermore, it has become possible not only to monitor the progress of the one-step RT-PCR reaction in real time, but also to analyze the base sequence polymorphism of the target RNA. The use of the method or kit of the present invention can greatly contribute to fields such as life science research, clinical diagnosis, food hygiene inspection, and environmental inspection.
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
また、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
Detailed descriptions of the embodiments of the present invention are as follows, but the present invention is not limited thereto. It should be understood that the terms used in this specification have the meanings commonly used in the relevant field unless otherwise specified.
Also, all non-patent documents and patent documents mentioned in this specification are incorporated herein by reference. In the present specification, "~" means "more than or equal to or less than". For example, "X to Y" in the specification means "X or more and Y or less". Also, "and/or" in this specification means either or both. Also, in this specification, it should be understood that the singular terms also include the plural terms unless stated otherwise.
本発明の実施態様の一つは、以下の工程（１）～（３）を含む、試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法である。本発明は、逆転写から検出までを閉鎖系で実施するワンステップ法で行うことを大きな特徴とする。
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）で得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する。
One embodiment of the present invention is a method for detecting target RNA contained in a sample, comprising the following steps (1) to (3). A major feature of the present invention is that the process from reverse transcription to detection is performed by a one-step method in a closed system.
Step (1) A sample is provided in a reagent solution including at least the following (A) to (C).
(A) a DNA polymerase belonging to family B; (B) a reverse transcriptase; (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with the amplification product obtained in step (2);
Step (3) The oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained in step (2), and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured.
［試料］
本発明において使用できる試料は、特に制限されないが、生体試料や食品、環境試料だけでなく、精製核酸等が挙げられる。また、試料は核酸抽出やいくつかの前処理を行ってもよい。試料の核酸抽出や前処理は、当該技術分野で一般的に行われている。前処理としては、ろ過、遠心分離、希釈処理、加熱処理、アルカリ処理、有機溶媒処理、懸濁処理、破砕処理等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。
[sample]
Samples that can be used in the present invention are not particularly limited, but include biological samples, foods, environmental samples, purified nucleic acids, and the like. Also, the sample may undergo nucleic acid extraction and some pretreatments. Nucleic acid extraction and pretreatment of samples are commonly performed in the art. Examples of pretreatment include filtration, centrifugation, dilution treatment, heat treatment, alkali treatment, organic solvent treatment, suspension treatment, and crushing treatment, but the present invention is not limited to these.
生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血液培養液、尿、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。 Examples of biological samples include, but are not limited to, animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, viruses, and the like. Further examples include blood, blood culture fluid, urine, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, pharyngeal swab, nasal swab, sputum, tissue section, skin, vomit, feces, isolated culture colony, catheter cleaning fluid and the like.
食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。 Examples of foods include water, alcoholic beverages, soft drinks, processed foods, vegetables, livestock products, marine products, eggs, dairy products, raw meat, raw fish, side dishes, and the like. Moreover, when food is used as a measurement sample, not only a part or all of the food can be used, but also the surface of the food that has been wiped off can be used. In addition, materials obtained by wiping cooking utensils and doorknobs, or washing liquids used to wash them can also be used as samples.
環境試料の例として、水、氷、土壌、空気やエアゾール等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川や滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。 Examples of environmental samples include water, ice, soil, air and aerosols. The water mentioned here includes, for example, tap water, seawater, or water collected from rivers, waterfalls, lakes, ponds, and the like.
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。 There are no particular restrictions on the sample collection method, preparation method, and the like, and known methods can be used depending on the type of sample and purpose.
［標的ＲＮＡ］
本発明の検出対象となる標的ＲＮＡは特に限定されないが、例えば、ＲＮＡウイルスやヒト由来ＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡウイルスとしては、例えば、ノロウイルス（Ｇ１型、Ｇ２型）、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス等を挙げることができる。好ましくは、本発明は、ノロウイルスＧ１型及び／又はノロウイルスＧ２型を検出するために使用される。
[Target RNA]
The target RNA to be detected in the present invention is not particularly limited, but examples thereof include RNA viruses and human-derived RNA. Examples of RNA viruses include norovirus (G1 type, G2 type), influenza virus, enterovirus, and the like. Preferably, the present invention is used to detect Norovirus type G1 and/or Norovirus type G2.
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、少なくとも以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する工程を含む。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
The target RNA detection method of the present invention includes the step of providing a sample to a reagent solution containing at least the following (A) to (C).
(A) DNA polymerase belonging to family B (B) Reverse transcriptase (C) Oligonucleotide at least one terminal base of which is labeled with a fluorescence quenching dye that is quenched by interaction with guanine, and which can hybridize with the amplification product obtained in the amplification step
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
[DNA polymerase belonging to family B]
The DNA polymerase used in the present invention is a family B DNA polymerase. Although the DNA polymerase belonging to the family B is not particularly limited, DNA polymerases derived from Archea are preferable.
［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。
[DNA polymerase derived from archaea]
Archaea-derived DNA polymerases belonging to Family B include DNA polymerases isolated from bacteria of the genera Pyrococcus and Thermococcus.
DNA polymerases derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus, Pyrococcus sp. DNA polymerases isolated from GB-D, Pyrococcus woesei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
Examples of DNA polymerases derived from the genus Thermococcus include Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9°N-7), a DNA polymerase isolated from Thermococcus siculi, including but not limited to.
PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, Pfu (Stragene), KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England Biolabs), Tgo (Roche). ), Pwo (Roche), and the like.
なかでも、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい（特許文献１）。 Among them, KOD DNA polymerase, which has excellent elongation and thermostability, is preferable (Patent Document 1).
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。
［逆転写酵素］
本発明で用いる逆転写酵素としては、特に制限されないが、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）２－ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やその変異体が使用される。さらには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼも使用され得る。
KOD DNA polymerase is superior to Taq DNA polymerase, which is a DNA polymerase belonging to family A, in fidelity, amplification efficiency, processivity, and crude sample tolerance.
[Reverse transcriptase]
The reverse transcriptase used in the present invention is not particularly limited, but retrovirus- or bacterial-derived reverse transcriptases (e.g., MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)-RT (Reverse Transcriptase), AMV (Avian Myeloblastosis Virus)-RT, RAV (Rous-associated virus) 2-RT, EIAV (Equine Infectious Anemia Virus)-RT, Carboxydothermus hydrogenoformam DNA polymerase, etc.) and variants thereof are used. Furthermore, DNA polymerases with reverse transcription activity such as Tth DNA polymerase and Taq DNA polymerase can also be used.
［蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチド］
本発明では、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを使用する。これらは、工程（３）においてハイブリダイゼーションプローブとしての働きを有する限り、特に制限されない。
[Oligonucleotide labeled with fluorescence quenching dye]
In the present invention, at least one terminal base is labeled with a fluorescence quenching dye that is quenched by interaction with guanine, and an oligonucleotide that can hybridize with the amplification product obtained in the amplification step is used. These are not particularly limited as long as they function as hybridization probes in step (3).
オリゴヌクレオチドプローブを使用した核酸検査法は、従来から実施されており、既に当該技術分野において確立されている（例えば、特許文献２、特許文献４）。このような核酸検査法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ、モレキュラービーコン、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、ＱＰｒｏｂｅなどがあるが、本発明ではＱＰｒｏｂｅを使用することが好ましい。 Nucleic acid testing methods using oligonucleotide probes have been conventionally practiced and have already been established in the technical field (for example, Patent Documents 2 and 4). Oligonucleotide probes used in such nucleic acid testing methods include TaqMan hydrolysis probes, molecular beacons, FRET hybridization probes, QProbes, etc. QProbes are preferably used in the present invention.
ＴａｑＭａｎ加水分解プローブやＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが増幅された標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）を検出するために一般的に用いられている。これらのプローブはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）等の核酸増幅法において、高感度に標的核酸を検出できるとされている。しかしながら、これらのプローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方に、蛍光色素あるいはクエンチャーを標識しなければならないため、合成に手間やコストがかかるという問題がある。 TaqMan hydrolysis probes and FRET hybridization probes are commonly used to detect amplified target nucleic acids (DNA or RNA). These probes are said to be capable of detecting target nucleic acids with high sensitivity in nucleic acid amplification methods such as real-time PCR (including RT-PCR). However, since these probes must be labeled with a fluorescent dye or a quencher at both the 5'-end and 3'-end of the oligonucleotide, there is a problem that the synthesis is troublesome and costly.
ＱＰｒｏｂｅは、ＫＵＲＡＴＡらにより開発された蛍光プローブ（蛍光消光プローブ）である（特許文献２）。このプローブは、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されているハイブリダイゼーションプローブである。 QProbe is a fluorescent probe (fluorescence quenching probe) developed by KURATA et al. (Patent Document 2). This probe is a hybridization probe in which at least one terminal base is labeled with a fluorescence quenching dye that is quenched by interaction with guanine.
蛍光消光色素としては特に限定されないが、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）および２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群のうちのいずれかが好ましい。 Fluorescence quenching dyes include, but are not limited to, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY-FL), carboxyrhodamine 6G, TAMRA, rhodamine 6G, tetrabromosulfonefluorescein (TBSF) and 2-oxo-6,8-difluoro-7-dihydroxy-2H-1-benzopyran-3-carvone Any of the group consisting of acids (Pacific Blue) are preferred.
さらに、蛍光消光色素で標識されている末端塩基（両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンであるオリゴヌクレオチドプローブがより好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
Furthermore, more preferred are oligonucleotide probes in which the terminal base labeled with a fluorescence quenching dye (at least one of the terminal bases if both ends are labeled) is cytosine.
Such an oligonucleotide probe can be quenched by interacting with the guanine base in the amplification product by forming a base pair when hybridized to the amplification product, so that the change in fluorescence intensity of the reaction solution can be measured very easily.
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許文献２に記載があり、本発明も該技術を参照できる。 Even if the cytosine base of the probe and the guanine base in the amplified product do not form a base pair when the probe is hybridized, the fluorescence can be quenched if the bases are close to each other. For example, the details are described in Patent Document 2, and the present invention can also refer to the technology.
また、蛍光消光色素で標識されている末端塩基（両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンでないオリゴヌクレオチドプローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許文献２に記載があり、本発明も該技術を参照できる。 In addition, even if the terminal base labeled with a fluorescence quenching dye (at least one of the terminal bases if both ends are labeled) is not cytosine, the change in fluorescence intensity of the reaction solution can be measured. For example, the details are described in Patent Document 2, and the present invention can also refer to the technology.
ハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチドは、目的とする増幅産物とハイブリダイズし得る限り、任意の塩基配列のものを使用することができる。例えば、ノロウイルスＧ１型を検出する場合には、配列番号３で示される塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとすることが好ましく、ノロウイルスＧ２型を検出する場合には、配列番号４で示される塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブであることが好ましい。 Oligonucleotides of hybridization probes can be of any base sequence as long as they can hybridize with the target amplification product. For example, when detecting norovirus type G1, it is preferable to use a hybridization probe having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3, and when detecting norovirus type G2, it is preferable to use a hybridization probe having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:4.
［ワンステップＲＴ－ＰＣＲ］
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、ワンステップＲＴ－ＰＣＲを行う工程を含む。
[One-step RT-PCR]
The target RNA detection method of the present invention includes a step of performing one-step RT-PCR.
ワンステップＲＴ－ＰＣＲとは、反応系を開放することなく以下の２工程を行う反応である。
（１）標的ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
（２）ｃＤＮＡを鋳型に核酸増幅を行うＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
すなわち、ワンステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写反応とＰＣＲ反応を同じチューブ内で連続して行うため、操作が簡便でコンタミネーションリスクも低減できる。しかしながら、逆転写反応とＰＣＲ反応を独立した工程で行うツーステップＲＴ－ＰＣＲと比較して、従来のワンステップＲＴ－ＰＣＲは感度が低いことが知られている。
One-step RT-PCR is a reaction in which the following two steps are performed without opening the reaction system.
(1) Reverse transcription reaction for converting target RNA into cDNA
(2) PCR reaction for nucleic acid amplification using cDNA as a template (Polymerase Chain Reaction)
That is, in one-step RT-PCR, the reverse transcription reaction and the PCR reaction are continuously performed in the same tube, so the operation is simple and the risk of contamination can be reduced. However, conventional one-step RT-PCR is known to have lower sensitivity than two-step RT-PCR in which reverse transcription and PCR are performed independently.
また、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２つを加えて行う二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、効率を低下させることが報告されている（非特許文献１）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加、あるいは非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、硫黄又は酢酸塩含有分子（特許文献３）などの使用が行われてきた。 In addition, it has been reported that two-enzyme one-step RT-PCR performed by adding two of reverse transcriptase and DNA polymerase is reduced in efficiency due to interference between reverse transcriptase and DNA polymerase (Non-Patent Document 1). To reduce this interference, increasing template RNA, increasing the ratio of DNA polymerase to reverse transcriptase, or using non-homologous tRNA, T4 gene 32 protein, sulfur- or acetate-containing molecules (US Pat.
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。 A PCR reaction is a reaction that is mainly catalyzed by DNA polymerase. A target nucleic acid is amplified by repeating the three steps of (1) DNA denaturation by heat treatment (separation of double-stranded DNA into single-stranded DNA), (2) primer annealing to template single-stranded DNA, and (3) extension of the primer using DNA polymerase.
本発明における大きな特徴として、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、核酸増幅効率の低下を防いだ点が挙げられる。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、増幅効率等の観点から二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲでの使用に適しており、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲを行っても従来報告されてきたような増幅効率の低下は見られなかった。
従来、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）等には、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼやＴｔｈポリメラーゼが使用されてきた。これは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブが使用できることから、ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターしながら標的核酸の検出ができるためである。一方で、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないため、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブを使用できない。そのため、ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターするためには、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎなどのインターカレーター蛍光色素を使用しなければならなかった。しかしながら、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等は、標的核酸以外の増幅核酸（例えば、非特異増幅されたＤＮＡやプライマーダイマー等）も検出するという欠点がある。さらに、ハイブリダイゼーションプローブと異なり、同時に複数の蛍光色素を使用できないため、マルチプレックス解析を行うことができない。
A major feature of the present invention is that the use of a DNA polymerase belonging to family B prevents a decrease in nucleic acid amplification efficiency. DNA polymerases belonging to family B are suitable for use in two-enzyme one-step RT-PCR from the viewpoint of amplification efficiency, etc., and even when two-enzyme one-step RT-PCR was performed using KOD DNA polymerase, there was no decrease in amplification efficiency as reported in the past.
Conventionally, Taq polymerase and Tth polymerase, which are DNA polymerases belonging to family A, have been used for real-time PCR (including RT-PCR) and the like. This is because DNA polymerases belonging to family A have 5' to 3' exonuclease activity and TaqMan® hydrolysis probes can be used, so that the target nucleic acid can be detected while monitoring the progress of the PCR reaction in real time. On the other hand, DNA polymerases belonging to family B cannot use TaqMan hydrolysis probes because they do not have 5′→3′ exonuclease activity. Therefore, an intercalating fluorescent dye such as SYBR® Green had to be used to monitor the progress of the PCR reaction in real time. However, SYBR Green and the like have the drawback of detecting amplified nucleic acids other than the target nucleic acid (for example, non-specifically amplified DNA, primer dimers, etc.). Furthermore, unlike hybridization probes, multiplexed analysis cannot be performed since multiple fluorescent dyes cannot be used simultaneously.
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、前記ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応で得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを前記増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する工程を含む。 The target RNA detection method of the present invention includes a step of hybridizing an oligonucleotide capable of hybridizing with an amplification product in the reaction solution obtained in the one-step RT-PCR reaction to the amplification product, and measuring the fluorescence intensity of the reaction solution.
［ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニター］
前記ワンステップＲＴ－ＰＣＲ工程において、反応液中の増幅産物に、増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることができる。
[Monitor the progress of the one-step RT-PCR reaction in real time]
In the one-step RT-PCR process, the progress of the amplification reaction can be monitored in real time by hybridizing an oligonucleotide capable of hybridizing with the amplification product in the reaction solution and measuring the fluorescence intensity of the reaction solution.
ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸の定量も可能である。 By monitoring the progress of the PCR reaction in real time, the target nucleic acid contained in the sample can be rapidly detected. Furthermore, it is also possible to quantify the target nucleic acid contained in the sample based on the amplification factor.
本発明者らは鋭意研究の結果、蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできることを見出した（実施例１）。蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブとしてＱＰｒｏｂｅ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、高い増幅効率でのワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応が可能となり、さらに反応の進行をリアルタイムでモニターできた。また、本発明の驚くべき特徴として、ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応に続いて後述する融解曲線分析も可能であった。 As a result of intensive research, the present inventors found that the use of a hybridization probe labeled with a fluorescence quenching dye enables real-time monitoring of the progress of a one-step RT-PCR reaction using a DNA polymerase belonging to family B that does not have 5′→3′ exonuclease activity (Example 1). By using QProbe as a hybridization probe labeled with a fluorescence quenching dye and KOD DNA polymerase as a DNA polymerase belonging to family B, a one-step RT-PCR reaction with high amplification efficiency was possible, and the progress of the reaction could be monitored in real time. Also, as a surprising feature of the present invention, the one-step RT-PCR reaction was followed by the melting curve analysis described below.
本発明では、増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドとして、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用い、反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。例えば、核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定し、試料中に標的核酸が含まれている場合、増幅した核酸量に依存してオリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズして蛍光強度が増加（あるいは減少）する。取得した蛍光強度を時間（ＰＣＲ反応ではサイクル数）に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできる（例えば、実施例１）。 In the present invention, an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye is used as an oligonucleotide capable of hybridizing with an amplification product, and the progress of the nucleic acid amplification reaction is monitored in real time by measuring the fluorescence intensity of the reaction solution. For example, at any point in the nucleic acid amplification reaction, the fluorescence intensity of the reaction solution is measured, and if the target nucleic acid is contained in the sample, the oligonucleotide probe hybridizes to the amplified nucleic acid depending on the amount of the amplified nucleic acid, and the fluorescence intensity increases (or decreases). By plotting the acquired fluorescence intensity against time (the number of cycles in the PCR reaction), the progress of the nucleic acid amplification reaction can be monitored in real time (eg, Example 1).
［ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をエンドポイントでモニター］
前記ワンステップＲＴ－ＰＣＲ工程の終了後に、得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることができる。
[Monitor progress of one-step RT-PCR reaction with endpoint]
After completion of the one-step RT-PCR step, the progress of the amplification reaction in step (2) can be monitored at the endpoint by allowing an oligonucleotide that can hybridize with the amplification product in the resulting reaction solution to hybridize to the amplification product and measuring the fluorescence intensity of the reaction solution.
核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸の定量も可能である。
本発明では、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする（例えば、実施例２）。例えば、核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定し、反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の反応強度をコントロール反応液の反応強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターすることが好ましいが、検出工程をより簡便にする等の目的では、エンドポイントでモニターすることが好ましい。
By monitoring the progress of the nucleic acid amplification reaction at the endpoint, the target nucleic acid contained in the sample can be rapidly detected. Furthermore, it is possible to quantify the target nucleic acid by comparing the fluorescence intensity and the like at the endpoint.
In the present invention, the progress of a nucleic acid amplification reaction is monitored at an endpoint by measuring the fluorescence intensity of a reaction solution containing an oligonucleotide probe labeled with a fluorescence quenching dye (eg, Example 2). For example, after the completion of the nucleic acid amplification reaction, the fluorescence intensity of the reaction solution is measured, and the fluorescence intensity of the reaction solution after the reaction is compared with the fluorescence intensity of the reaction solution before the reaction to confirm the presence or absence of amplification of the target nucleic acid. Alternatively, the presence or absence of the target nucleic acid contained in the sample can also be confirmed by comparing the reaction intensity of the reaction solution after the reaction with the reaction intensity of a control reaction solution. A control reaction solution is a reaction solution to which a sample known to be negative or a sample known to be positive is added in place of the sample to be measured.
It is generally preferable to monitor the progress of the nucleic acid amplification reaction in real time, but for the purpose of simplifying the detection process, it is preferable to monitor the progress at the end point.
［蛍光強度の温度依存性を測定］
前記ワンステップＲＴ－ＰＣＲ工程の終了後に、得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、標的核酸を検出することができるし、前記標的ＲＮＡの塩基配列多型を分析することもできる。
[Measurement of temperature dependence of fluorescence intensity]
After the completion of the one-step RT-PCR step, an oligonucleotide capable of hybridizing with the amplification product in the obtained reaction solution is hybridized to the amplification product, and the temperature dependence of the fluorescence intensity of the reaction solution is measured, whereby the target nucleic acid can be detected, and the nucleotide sequence polymorphism of the target RNA can also be analyzed.
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである（例えば、実施例３）。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
Specifically, measuring the temperature dependence of the fluorescence intensity means measuring the fluorescence intensity at each temperature while changing the temperature of the reaction solution from a low temperature to a high temperature (eg, Example 3). A melting temperature (Tm value) peculiar to the oligonucleotide probe to be used can be obtained by first differentiating the obtained fluorescence intensity with respect to temperature. Also, the fluorescence intensity may be converted into a fluorescence quenching rate or the like according to the purpose.
The detection, analysis, etc. of a target nucleic acid using the Tm value is called melting curve analysis. In general, the Tm value refers to the temperature at which the percentage of an oligonucleotide forming a double strand with its complementary strand is equal to the percentage of a single strand without forming a double strand. Since the Tm value is unique to a nucleotide sequence, melting curve analysis can be used as a technique for analyzing nucleotide sequence polymorphisms of target nucleic acids. The term "nucleotide sequence polymorphism" as used herein includes single nucleotide polymorphisms, base substitutions, base deletions, base insertions, and the like.
一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。
オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）を行うことができる（例えば、実施例４）。
As an example, melting curve analysis is also applied to SNP analysis and the like.
If there is a mutation in the nucleotide sequence of the target nucleic acid with respect to the oligonucleotide probe, the Tm value is generally low because the bases are mismatched when the probe is hybridized. Therefore, single nucleotide polymorphism analysis (SNP analysis) can be performed by comparing the Tm values (eg, Example 4).
［試料中に含まれるＲＮＡを検出するための試薬］
本発明の別の実施態様は、以下の（Ａ）～（Ｃ）を少なくとも含む、前記のいずれかの標的ＲＮＡを検出する方法を実施するための試薬である。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
[Reagent for detecting RNA contained in sample]
Another embodiment of the present invention is a reagent for carrying out any of the above methods of detecting target RNA, comprising at least the following (A) to (C).
(A) DNA polymerase belonging to family B (B) Reverse transcriptase (C) Oligonucleotide labeled with a fluorescent quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and that can hybridize with the amplification product obtained in the amplification step
試薬には、上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。 The reagent includes a DNA polymerase belonging to the above family B, a reverse transcriptase, an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine, and capable of hybridizing with the amplification product obtained in the amplification step, and at least the components necessary for nucleic acid amplification.
本発明の試薬に必要な他の成分は、実施する方法の目的等によって異なり、それぞれ公知の成分を用いることができる。例えばワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれるＲＮＡを検出する場合、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩またはマンガン塩が少なくとも含まれる。 Other components necessary for the reagent of the present invention vary depending on the purpose of the method to be carried out, and known components can be used. For example, when detecting RNA contained in a sample using a one-step RT-PCR reaction, at least DNA polymerase, reverse transcriptase, hybridization probes, oligonucleotide primers, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), magnesium salts or manganese salts are included.
本発明の試薬には、さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等が挙げられる（特許文献４）。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。 Additives known in the art may be further added to the reagent of the present invention for the purpose of suppressing non-specific amplification or promoting the reaction. Anti-DNA polymerase antibodies, phosphoric acid and the like are examples of additives intended to suppress non-specific amplification (Patent Document 4). Additives to promote the reaction include bovine serum albumin (BSA), protease inhibitors, single-strand binding protein (SSB), T4 gene 32 protein, tRNA, compounds containing sulfur or acetic acid, dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, trimethylene glycol, formamide, acetamide, betaine, ectoine, trehalose, dextran, polyvinylpyrrolidone (PVP), gelatin, tetramethylammonium chloride (TMAC), hydroxide. Tetramethylammonium (TMAH), tetramethylammonium acetate (TMAA), polyethylene glycol, Triton, Tween 20, Nonidet P40 and the like. In the present invention, one or more of these additives may be used in combination, but the present invention is not limited to these.
本発明の試薬に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸増幅反応において核酸増幅の起点として使用されるオリゴヌクレオチドであり、当該技術分野において一般的に使用されている知見（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献４）にもとづいて適宜設計することができる。また、実施する核酸増幅反応によっては、複数種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用できる。特異性の高いオリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端がターゲット配列に対して相補的であることが重要であり、言い換えれば、３’末端が相補的であれば５’末端が相補的でなくとも有効なプライマーとしてはたらくとされている。このことから、本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーも３’末端がゲノム配列に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。さらに、標的核酸がノロウイルスＲＮＡのように塩基配列多型である場合、縮重プライマーを使用してもよい。例えば、ノロウイルスＲＮＡの検出に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５～８のいずれかで示される塩基配列を有するものが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーとして配列番号５及びリバースプライマーとして配列番号６で示される塩基配列を有するものの組合せ、又は、フォワードプライマーとして配列番号７及びリバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列を有するものの組合せを用いることでより高感度にノロウイルスＲＮＡを検出することが可能であり得る。 The oligonucleotide primer used in the reagent of the present invention is an oligonucleotide used as a starting point for nucleic acid amplification in a nucleic acid amplification reaction, and can be appropriately designed based on knowledge generally used in the art (e.g., Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 4). In addition, multiple types of oligonucleotide primers can be used depending on the nucleic acid amplification reaction to be performed. It is important for a highly specific oligonucleotide primer to have a complementary 3′ end to the target sequence. For this reason, the oligonucleotide primers used in the present invention are also preferably designed so that the 3' end has a sequence complementary to the genomic sequence. Furthermore, degenerate primers may be used when the target nucleic acid is a nucleotide sequence polymorphism such as norovirus RNA. For example, oligonucleotide primers used for detecting norovirus RNA preferably have a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS:5-8. More preferably, it may be possible to detect norovirus RNA with higher sensitivity by using a combination of a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.
［試料中に含まれるＲＮＡを検出するためのキット］
さらに、本発明の別の実施態様として、前記の標的ＲＮＡ検出試薬を含むキットが挙げられる。
[Kit for detecting RNA contained in a sample]
Furthermore, another embodiment of the present invention includes a kit containing the target RNA detection reagent described above.
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて又は変更若しくは置き換えて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to each configuration described above, and various modifications are possible within the scope of the claims, and the technical scope of the present invention also includes embodiments and examples obtained by appropriately combining, modifying, or replacing technical means disclosed in different embodiments and examples.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１：リアルタイムでモニターできるノロウイルスＲＮＡの検出
（１－１）方法
配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号３に示される塩基配列を使用し、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識した。また、ノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号４に示される塩基配列を使用し、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識した。なお、オリゴヌクレオチドプライマーは非特許文献２に記載のプライマーを使用した。
（１－２）反応液
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含むジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。逆転写酵素は市販のＲｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）を使用した。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
１．５μＭ ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号３）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
１．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号４）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）
（１－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
４２℃ １８０秒（逆転写反応）、
９４℃ ３０秒、
９８℃ １秒－６０℃ １０秒－６３℃ １０秒（サイクル数６０回）
（１－４）結果
図１および図２は、測定で得られた蛍光強度（消光率に変換）をサイクル数にプロットした図である。図１がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図２がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図１、図２より、試料中に標的ＲＮＡが存在するとき、オリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズし、蛍光強度が変化していくことが明らかとなった。また、標的ＲＮＡ量にしたがって、蛍光強度が変化するため、標的ＲＮＡの定量も可能であった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできることが示された。
Example 1: Method for detecting norovirus RNA that can be monitored in real time (1-1) A one-step RT-PCR reaction was performed using norovirus G1 type RNA fragments and norovirus G2 type RNA fragments (250 copies/test, 1250 copies/test) artificially synthesized using SEQ ID NOS: 1 and 2 as templates as samples. As a hybridization probe for detecting norovirus G1 type RNA, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used, and the 3' end was labeled with BODIPY-FL. Also, as a hybridization probe for detecting norovirus G2 type RNA, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was used, and the 3' end was labeled with BODIPY-FL. The primers described in Non-Patent Document 2 were used as oligonucleotide primers.
(1-2) Reaction solution A reaction solution containing the components shown below was prepared using GeneCube (registered trademark) Test Basic (Toyobo) containing KOD DNA polymerase. Preparation of the reaction solution, etc. followed the instruction manual of GeneCube (registered trademark) Test Basic. Commercially available Revertra Ace (Toyobo Co., Ltd.) was used as the reverse transcriptase.
Norovirus G1 type RNA detection system 1.5 μM COG1F primer (SEQ ID NO: 5)
0.5 μM COG1R primer (SEQ ID NO: 6)
0.3 μM hybridization probe (SEQ ID NO: 3)
0.05 unit/μL Revertra Ace (Toyobo)
Norovirus G2 type RNA detection system 0.5 μM COG2F primer (SEQ ID NO: 7)
1.5 μM COG2R primer (SEQ ID NO:8)
0.3 μM hybridization probe (SEQ ID NO: 4)
0.05 unit/μL Revertra Ace (Toyobo)
(1-3) Reaction Using GENECUBE (registered trademark), the reaction solution was reacted in the following temperature cycles, and fluorescence intensity was measured in each cycle.
42°C for 180 seconds (reverse transcription reaction),
94°C for 30 seconds,
98°C 1 second - 60°C 10 seconds - 63°C 10 seconds (60 cycles)
(1-4) Results FIGS. 1 and 2 are diagrams in which the fluorescence intensity (converted into quenching ratio) obtained by measurement is plotted against the number of cycles. FIG. 1 shows the results obtained by measurement using the norovirus G1 type RNA detection system, and FIG. 2 shows the results obtained by measurement using the norovirus G2 type RNA detection system. From FIGS. 1 and 2, it was clarified that when target RNA was present in the sample, the oligonucleotide probe hybridized to the amplified nucleic acid and the fluorescence intensity changed. In addition, since the fluorescence intensity changed according to the amount of target RNA, it was possible to quantify the target RNA. Therefore, it was demonstrated that the progress of a nucleic acid amplification reaction can be monitored in real time using (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, and (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with a target nucleic acid.
実施例２：エンドポイントでモニターできるノロウイルスＲＮＡの検出
（２－１）方法
実施例１と同様の反応液、反応条件を用いて、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（５０コピー／テスト、２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行い、各試料の核酸増幅前及び増幅後の蛍光強度を測定した。
（１－２）結果
図３および図４にそれぞれの蛍光強度及び蛍光変化率を示す。蛍光変化率（本実施例では消光率を表す）は、（増幅前蛍光強度－増幅後蛍光強度）／（増幅前蛍光強度）の式より求めた。図３がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図４がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図３、図４より、試料中に含まれる標的ＲＮＡ量にしたがって、蛍光強度が変化することが明らかになり、標的ＲＮＡの定量も可能であった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターできることが示された。
Example 2: Detection of norovirus RNA that can be monitored by endpoint (2-1) Method Using the same reaction solution and reaction conditions as in Example 1, a one-step RT-PCR reaction was performed using norovirus G1 RNA fragments and norovirus G2 RNA fragments (50 copies/test, 250 copies/test, 1250 copies/test) artificially synthesized using SEQ ID NOs: 1 and 2 as templates, and the fluorescence intensity of each sample before and after nucleic acid amplification was measured.
(1-2) Results FIGS. 3 and 4 show fluorescence intensity and fluorescence change rate, respectively. The fluorescence change rate (which represents the quenching rate in this example) was obtained from the formula (fluorescence intensity before amplification−fluorescence intensity after amplification)/(fluorescence intensity before amplification). FIG. 3 shows the results obtained by measurement using the norovirus G1 type RNA detection system, and FIG. 4 shows the results obtained by measurement using the norovirus G2 type RNA detection system. From FIGS. 3 and 4, it became clear that the fluorescence intensity changed according to the amount of target RNA contained in the sample, and it was possible to quantify the target RNA. Therefore, it was demonstrated that (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, and (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with a target nucleic acid can be used to monitor the progress of a nucleic acid amplification reaction at an endpoint.
実施例３：融解曲線分析によるノロウイルスＲＮＡの検出
（３－１）方法
実施例２と同様の反応液、反応条件を用いて、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（５０コピー／テスト、２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。核酸増幅反応後に以下の条件による融解曲線分析を行った。
９４℃ ３０秒、
３９℃ ３０秒、
４０－７５℃ ０．０９℃／秒
（３－２）結果
図５および図６にそれぞれの融解曲線分析の結果を示す。図５がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図６がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図５、図６より、融解曲線分析によって試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出できることが明らかになった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して融解曲線分析を実施できることが示された。
Example 3: Detection of Norovirus RNA by Melting Curve Analysis (3-1) Method Using the same reaction solution and reaction conditions as in Example 2, a one-step RT-PCR reaction was performed using norovirus G1 RNA fragments and norovirus G2 RNA fragments (50 copies/test, 250 copies/test, 1250 copies/test) artificially synthesized using SEQ ID NOS: 1 and 2 as templates as samples. After the nucleic acid amplification reaction, melting curve analysis was performed under the following conditions.
94°C for 30 seconds,
39°C for 30 seconds,
40-75° C. 0.09° C./sec (3-2) Results FIGS. 5 and 6 show the results of each melting curve analysis. FIG. 5 shows the results obtained by measurement using the norovirus G1 type RNA detection system, and FIG. 6 shows the results obtained by measurement using the norovirus G2 type RNA detection system. 5 and 6 demonstrate that the target RNA contained in the sample can be detected by melting curve analysis. Therefore, it was shown that (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, and (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye whose terminal base is quenched by interaction with guanine and capable of hybridizing with a target nucleic acid can be used to perform melting curve analysis.
実施例４：糞便試料に含まれるノロウイルスＲＮＡの検出
（４－１）方法
ノロウイルスＧ１型を含む糞便試料、ノロウイルスＧ２型を含む糞便試料、ノロウイルスを含まない陰性糞便試料を試料として、実施例３と同様に核酸増幅及び融解曲線分析を行った。糞便試料は、ヒト糞便を水で懸濁した試料である。
（４－２）結果
図７および図８に融解曲線分析の結果を示す。図７がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図８がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図７（ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系）より、ノロウイルスＧ１型が含まれる糞便試料では融解曲線分析で蛍光ピークが確認されたが、ほかの試料ではピークが確認されなかった。一方で、図８（ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系）より、ノロウイルスＧ２型が含まれる糞便試料では融解曲線分析で蛍光ピークが確認されたが、ほかの試料ではピークが確認されなかった。また、驚くべきことに、それぞれの陽性糞便試料について、融解曲線分析で得られたＴｍ値が試料によって異なった。この実験結果は、Ｇ１糞便１とＧ１糞便２との間でノロウイルスの遺伝子型が異なること、および、Ｇ２糞便１とＧ２糞便２との間でノロウイルスの遺伝子型が異なることをそれぞれ示唆していると考えられる。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用してＳＮＰ解析によるノロウイルス遺伝子型を区別できることが示された。
Example 4: Detection of Norovirus RNA Contained in Fecal Samples (4-1) Method Nucleic acid amplification and melting curve analysis were performed in the same manner as in Example 3 using a stool sample containing norovirus type G1, a stool sample containing norovirus type G2, and a negative stool sample containing no norovirus as samples. A stool sample is a sample of human stool suspended in water.
(4-2) Results FIGS. 7 and 8 show the results of melting curve analysis. FIG. 7 shows the results obtained by the norovirus G1 type RNA detection system, and FIG. 8 shows the results obtained by the norovirus G2 type RNA detection system. From FIG. 7 (norovirus G1 type RNA detection system), a fluorescence peak was confirmed in the stool sample containing norovirus G1 type by melting curve analysis, but no peak was confirmed in the other samples. On the other hand, from FIG. 8 (norovirus type G2 RNA detection system), a fluorescence peak was confirmed by melting curve analysis in the stool sample containing norovirus type G2, but no peak was confirmed in the other samples. Also, surprisingly, for each positive stool sample, the Tm values obtained by melting curve analysis differed from sample to sample. This experimental result suggests that the norovirus genotype differs between G1 stool 1 and G1 stool 2, and that the norovirus genotype differs between G2 stool 1 and G2 stool 2, respectively. Therefore, (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine, and capable of hybridizing with a target nucleic acid, was shown to be able to distinguish between norovirus genotypes by SNP analysis.
試験例１：従来法（ツーステップＲＴ－ＰＣＲ）との比較
従来法との対比を行うために、従来のツーステップＲＴ－ＰＣＲ法を行った場合（比較例１）と、本発明のワンステップＲＴ－ＰＣＴ法を行った場合との比較を行った。
Test Example 1: Comparison with conventional method (two-step RT-PCR) In order to compare with the conventional method, the case where the conventional two-step RT-PCR method was performed (Comparative Example 1) and the one-step RT-PCT method of the present invention were compared.
（１－１）方法
逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）で標的ＲＮＡから変換したｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ反応を行う従来の標的ＲＮＡ検出法との比較を行った。具体的には、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片およびノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（ＰＣＲ反応での終濃度が２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてツーステップＲＴ－ＰＣＲを行った。
(1-1) Method A comparison was made with a conventional target RNA detection method in which PCR reaction was performed using cDNA converted from target RNA by reverse transcription as a template. Specifically, two-step RT-PCR was performed using a norovirus G1 type RNA fragment and a norovirus G2 type RNA fragment (final concentration in PCR reaction: 250 copies/test, 1250 copies/test) artificially synthesized using SEQ ID NOs: 1 and 2 as templates.
（１－２）逆転写反応
まず、市販の逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡社））を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製、反応条件等はＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔの取扱説明書に従った。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
(1-2) Reverse Transcription Reaction First, a commercially available reverse transcriptase (ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Kit (Toyobo)) was used to prepare a reaction solution containing the components shown below. Preparation of the reaction solution, reaction conditions, etc. followed the instruction manual of ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Kit.
Norovirus G1 type RNA detection system 0.5 μM COG1R primer (SEQ ID NO: 6)
Norovirus G2 type RNA detection system 0.5 μM COG2R primer (SEQ ID NO: 8)
（１－３）ＰＣＲ反応
上記の反応で合成したｃＤＮＡについて、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑＭａｎ加水分解プローブを使用してＰＣＲ反応を行うとともに各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製、反応条件等はＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘの取扱説明書に従うとともに、ＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑを使用した。
なお、ノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出するためのＴａｑＭａｎ加水分解プローブとして、配列番号３に示される塩基配列を使用し、５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ２で標識した。また、ノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出するためのＴａｑＭａｎ加水分解プローブとして、配列番号４に示される塩基配列を使用し、５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ２で標識した。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．３μＭ ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．３μＭ ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．２μＭ ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号３）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
０．３μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．２μＭ ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号４）
(1-3) PCR reaction The cDNA synthesized in the above reaction was subjected to PCR reaction using Taq polymerase, which is a DNA polymerase belonging to family A, and a TaqMan hydrolysis probe, and fluorescence intensity was measured at each cycle.
A reaction solution containing the components shown below was prepared using THUNDERBIRD (registered trademark) Probe qPCR Mix (Toyobo). Preparation of the reaction solution, reaction conditions, etc. followed the instruction manual for THUNDERBIRD (registered trademark) Probe qPCR Mix, and a Rotor-Gene Q PCR device was used.
As a TaqMan hydrolysis probe for detecting norovirus G1 type RNA, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used, labeled with Cy5 at the 5' end and BHQ2 at the 3' end. Also, as a TaqMan hydrolysis probe for detecting norovirus G2 type RNA, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 was used, labeled with Cy5 at the 5' end and BHQ2 at the 3' end.
Norovirus G1 type RNA detection system 0.3 μM COG1F primer (SEQ ID NO: 5)
0.3 μM COG1R primer (SEQ ID NO: 6)
0.2 μM TaqMan hydrolysis probe (SEQ ID NO:3)
Norovirus G2 type RNA detection system 0.3 μM COG2F primer (SEQ ID NO: 7)
0.3 μM COG2R primer (SEQ ID NO: 8)
0.2 μM TaqMan hydrolysis probe (SEQ ID NO:4)
別途、上記実施例１と同様の反応液（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識したハイブリダイゼーションプローブを含む）、反応条件を用いてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行い、その結果を比較した。 Separately, a one-step RT-PCR reaction was performed using the same reaction solution (including KOD DNA polymerase, reverse transcriptase, and hybridization probe labeled with BODIPY-FL at the 3′ end) and reaction conditions as in Example 1 above, and the results were compared.
（１－４）結果
図９が従来法（ツーステップＲＴ－ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１０が従来法（ツーステップＲＴ－ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。また、図１１が本発明によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１２が本発明によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。
図９では低濃度のノロウイルスＧ１型ＲＮＡが検出できなかった一方で、図１１では小さいながらもピークを確認することができた。同様に、図１０では低濃度のノロウイルスＧ２型ＲＮＡの増幅曲線が小さい一方で、図１２では低濃度のノロウイルスＧ２型ＲＮＡでも増幅曲線が大きく出ることを確認できた。
したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用した本発明が、従来のツーステップＲＴ－ＰＣＲ（ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）よりも簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出できることが示された。
(1-4) Results FIG. 9 shows the results of the conventional (two-step RT-PCR) norovirus G1 RNA detection system, and FIG. 10 shows the results of the conventional (two-step RT-PCR) norovirus G2 RNA detection system. 11 shows the results of the norovirus G1 type RNA detection system according to the present invention, and FIG. 12 shows the results of the norovirus G2 type RNA detection system according to the present invention.
In FIG. 9, low-concentration norovirus G1 type RNA could not be detected, while in FIG. 11, a small peak could be confirmed. Similarly, in FIG. 10, it was confirmed that the amplification curve for low-concentration norovirus G2-type RNA is small, while the amplification curve in FIG. 12 is large even for low-concentration norovirus G2-type RNA.
Therefore, it was shown that the present invention using (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, and (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base with a guanine-quenching dye and capable of hybridizing with a target nucleic acid can detect a target RNA more easily and sensitively than conventional two-step RT-PCR (DNA polymerase belonging to family A, reverse transcriptase, TaqMan hydrolysis probe).
試験例２：従来法（二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲ）との比較
従来ツーステップ法で用いられていた試薬をワンステップ法に使用できるように改変された従来の二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲ試薬を用いた場合（比較例２）と、本発明のワンステップＲＴ－ＰＣＴ法で検出する場合との比較を行った。
Test Example 2: Comparison with conventional method (two-enzyme one-step RT-PCR) A conventional two-enzyme one-step RT-PCR reagent modified so that the reagent used in the conventional two-step method can be used in the one-step method (Comparative Example 2) was compared with the case of detection by the one-step RT-PCT method of the present invention.
（２－１）方法
ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブを含む従来の標的ＲＮＡ検出法との比較を行った。
従来法として、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔの取扱説明書に従うとともに、ＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑを使用した。
なお、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブは比較例１と同じものを使用した。
(2-1) Method A comparison was made with a conventional target RNA detection method including Tth polymerase, which is a DNA polymerase belonging to family A, reverse transcriptase, and TaqMan hydrolysis probe.
As a conventional method, THUNDERBIRD (registered trademark) Probe One-step qRT-PCR Kit (Toyobo) was used to prepare a reaction solution containing the components shown below. Preparation of the reaction solution, etc. followed the instruction manual for THUNDERBIRD (registered trademark) Probe One-step qRT-PCR Kit, and the PCR apparatus used was Rotor-Gene Q.
The same TaqMan hydrolysis probe as in Comparative Example 1 was used.
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．５μＭ ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．２μＭ ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号３）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
０．５μＭ ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．２μＭ ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号４）
Norovirus G1 type RNA detection system 0.5 μM COG1F primer (SEQ ID NO: 5)
0.5 μM COG1R primer (SEQ ID NO: 6)
0.2 μM TaqMan hydrolysis probe (SEQ ID NO:3)
Norovirus G2 type RNA detection system 0.5 μM COG2F primer (SEQ ID NO: 7)
0.5 μM COG2R primer (SEQ ID NO: 8)
0.2 μM TaqMan hydrolysis probe (SEQ ID NO:4)
別途、上記実施例１と同様の反応液（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識したハイブリダイゼーションプローブを含む）、反応条件を用いてワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行い、その結果を比較した。 Separately, a one-step RT-PCR reaction was performed using the same reaction solution (including KOD DNA polymerase, reverse transcriptase, and hybridization probe labeled with BODIPY-FL at the 3′ end) and reaction conditions as in Example 1 above, and the results were compared.
（２－２）結果
図１３が従来法（二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１４が従来法（二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。また、図１１が本発明によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１２が本発明によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。
図１３ではノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出できなかった一方で、図１１では検出することができた。同様に、図１４ではノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出できなかったが、図１２では検出することができた。
したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用した本発明が、従来の二酵素系ワンステップＲＴ－ＰＣＲ（ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）よりも簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出できることが示された。
(2-2) Results FIG. 13 shows the results of the norovirus G1 RNA detection system by the conventional method (two-enzyme one-step RT-PCR), and FIG. 14 shows the results of the norovirus G2 RNA detection system by the conventional method (two-enzyme one-step RT-PCR). 11 shows the results of the norovirus G1 type RNA detection system according to the present invention, and FIG. 12 shows the results of the norovirus G2 type RNA detection system according to the present invention.
While norovirus G1 type RNA could not be detected in FIG. 13, it could be detected in FIG. Similarly, norovirus G2 type RNA could not be detected in FIG. 14, but could be detected in FIG.
Therefore, it was shown that the present invention using (A) a DNA polymerase belonging to family B, (B) a reverse transcriptase, and (C) an oligonucleotide labeled with a fluorescence quenching dye that quenches at least one terminal base with a guanine-quenching dye and capable of hybridizing with a target nucleic acid can detect a target RNA more easily and more sensitively than conventional two-enzyme one-step RT-PCR (DNA polymerase belonging to family A, reverse transcriptase, and TaqMan hydrolysis probe).
本発明により、簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出することができるようになった。さらには、ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできるだけでなく、標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析も行うことができるようになった。本発明の方法およびキットを使用することで、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野に大きく貢献できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, target RNA can be detected easily and with high sensitivity. Furthermore, it has become possible not only to monitor the progress of the one-step RT-PCR reaction in real time, but also to analyze the base sequence polymorphism of the target RNA. Use of the method and kit of the present invention can greatly contribute to fields such as life science research, clinical diagnosis, food hygiene inspection, and environmental inspection.
Claims (10)
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする。 A method for detecting target RNA contained in a sample, comprising the following steps (1) to (3).
Step (1) A sample is provided in a reagent solution including at least the following (A) to (C).
(A) DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis (B) Reverse transcriptase (C) An oligonucleotide labeled with a fluorescent quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and capable of hybridizing with the amplification product obtained in step (2) Step (2) Reverse-transcribes the target RNA into cDNA and performs a one-step RT-PCR reaction to amplify at least a portion of the cDNA.
Step (3) After step (2) is completed, the oligonucleotide of (C) is hybridized to the amplified product in the reaction solution obtained, and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured to monitor the progress of the amplification reaction of step (2) at the endpoint .
（Ａ）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド A reagent for carrying out the method of detecting target RNA contained in a sample according to any one of claims 1 to 8 , comprising at least the following (A) to (C).
(A) DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis (B) Reverse transcriptase (C) Oligonucleotide labeled with a fluorescent quenching dye that quenches at least one terminal base by interaction with guanine and that can hybridize with the amplification product obtained in step (2)
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