JP7625789B2 - Primers for detecting toxin B gene (tcdB) - Google Patents
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Description
本発明は、試料中に含まれるクロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するためのプライマーに関する。更に、本発明は、該プライマーを用いて、試料中に含まれるｔｃｄＢを検出する方法及びその方法に用いるための試薬・キット等に関する。 The present invention relates to a primer for detecting the toxin B gene (tcdB) of Clostridioides difficile contained in a sample. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting tcdB contained in a sample using the primer, and a reagent/kit for use in the method.
クロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、別名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（以下、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとも称する）は、院内感染の原因微生物のひとつであり、簡便、迅速、高感度に検出することが臨床診断上重要である。 Clostridioides difficile (also known as Clostridium difficile) (hereinafter referred to as C. difficile) is one of the microorganisms that cause hospital-acquired infections, and simple, rapid, and highly sensitive detection is important for clinical diagnosis.
具体的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは抗菌薬の投与に関連した下痢症・腸炎の主要な原因菌であることが知られている。例えば、抗菌薬治療により正常な腸内細菌叢が乱れると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのうち有毒株である毒素産生菌が、トキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシン等の毒素を産生し、その毒素によって下痢・腸炎等を引き起こす。したがって、本菌が産生する毒素の検出を行うことがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の検査、診断に重要である。従来、毒素検出はイムノクロマト法を用いて行われていたが、該方法は感度が低いという問題があった。そこで、高感度な核酸増幅法を用いることで、これらの毒素産生に関与する遺伝子を検出する方法が開発されてきた（特許文献１）。 Specifically, C. difficile is known to be a major causative bacterium of diarrhea and enteritis associated with the administration of antibiotics. For example, when the normal intestinal flora is disturbed by antibiotic treatment, toxin-producing bacteria, which are toxic strains of C. difficile, produce toxins such as toxin A, toxin B, and binary toxin, which cause diarrhea and enteritis. Therefore, it is important to detect the toxins produced by this bacterium in the examination and diagnosis of C. difficile infection. Conventionally, toxin detection has been performed using immunochromatography, but this method has a problem of low sensitivity. Therefore, a method has been developed to detect genes involved in the production of these toxins by using a highly sensitive nucleic acid amplification method (Patent Document 1).
しかしながら、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素産生に関与する遺伝子、特にトキシンＡよりも一般に強い毒性を示すとされているトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を、さらに簡便、高感度に検出する方法の開発が望まれている。 However, there is a need to develop a method for detecting genes involved in toxin production by C. difficile, particularly the toxin B gene (tcdB), which is generally considered to be more toxic than toxin A, more simply and with higher sensitivity.
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、簡便でありながら、高感度に試料中に含まれるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢを検出する手法を提供することである。 The present invention was made in response to the problems of the conventional technology. That is, the object of the present invention is to provide a method for detecting tcdB of C. difficile contained in a sample in a simple and highly sensitive manner.
本発明者は鋭意研究の結果、特定のプライマーを用いることで、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。 As a result of extensive research, the inventors discovered that tcdB contained in a sample can be detected with high sensitivity by using specific primers, and arrived at the present invention. That is, the outline of the present invention is as follows.
［項１］ 試料中に含まれ得るクロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するために用いられるプライマーであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含むことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出用プライマー。
［項２］ 以下の（１）または（２）のいずれか１つ以上に該当する、項１に記載のプライマー。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマー。
（２）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマー。
［項３］ 前記（１）に記載のプライマーをフォワードプライマーとして含み、かつ前記（２）に記載のプライマーをリバースプライマーとして含む、ｔｃｄＢ検出用のプライマーセット。
［項４］ 項１若しくは２に記載のプライマー又は項３に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う工程を包含する、ｔｃｄＢ検出方法。
［項５］ 前記核酸増幅反応を行う工程において、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、又はＲＴ－ＰＣＲ法を行う、項４に記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項６］ 前記核酸増幅反応を行う工程においてＰＣＲ法を行う、項４又は５に記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項７］ 蛍光プローブ法または核酸クロマト法により検出する工程を包含する、項４～６のいずれかに記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項８］ 配列番号１５若しくは１６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸プローブをハイブリダイズさせて検出する工程を包含する、項４～７のいずれかに記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項９］ 前記核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブである、項８に記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項１０］ Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ及びそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼを用いる、項４～９のいずれかに記載のｔｃｄＢ検出方法。
［項１１］ 試料中に含まれ得るクロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するために用いられるプローブであって、配列番号１５若しくは配列番号１６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる、ｔｃｄＢ検出用プローブ。
［項１２］ 末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている、項１１に記載のｔｃｄＢ検出用プローブ。
［項１３］ 項１若しくは２に記載のプライマー又は項３に記載のプライマーセットを含む、ｔｃｄＢを検出するために用いられるキット。
［項１４］ 項１１又は１２に記載のｔｃｄＢ検出用プローブを更に含む、項１３に記載のキット。
［項１３］ Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ及びそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼを更に含む、項１３又は１４に記載のキット。
[Item 1] A primer used to detect the toxin B gene (tcdB) of Clostridioides difficile that may be contained in a sample, the primer comprising a base sequence of at least 15 consecutive bases in any of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14, or a base sequence complementary thereto. A primer for detecting tcdB.
[Item 2] The primer according to Item 1, which satisfies any one or more of the following (1) or (2):
(1) A primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or a base sequence complementary thereto.
(2) A primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or a base sequence complementary thereto.
[Item 3] A primer set for detecting tcdB, comprising the primer according to (1) above as a forward primer and the primer according to (2) above as a reverse primer.
[Item 4] A method for detecting tcdB, comprising a step of carrying out a nucleic acid amplification reaction using the primer according to Item 1 or 2, or the primer set according to Item 3.
[Item 5] The method for detecting tcdB according to Item 4, wherein the step of carrying out the nucleic acid amplification reaction involves carrying out a PCR method, a LAMP method, an LCR method, a TMA method, an SDA method, or an RT-PCR method.
[Item 6] The method for detecting tcdB according to Item 4 or 5, wherein a PCR method is carried out in the step of carrying out the nucleic acid amplification reaction.
[Item 7] A method for detecting tcdB according to any one of Items 4 to 6, which comprises a step of detection by a fluorescent probe method or a nucleic acid chromatography method.
[Item 8] A method for detecting tcdB according to any one of Items 4 to 7, comprising a step of hybridizing a nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or 16, or a base sequence complementary thereto, to detect tcdB.
[Item 9] The method for detecting tcdB according to Item 8, wherein the nucleic acid probe is a nucleic acid probe in which at least one of the terminal cytosines is labeled with a fluorescent dye.
[Item 10] The tcdB detection method according to any one of Items 4 to 9, using at least one DNA polymerase selected from the group consisting of Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and mutants thereof.
[Item 11] A probe used to detect the toxin B gene (tcdB) of Clostridioides difficile that may be contained in a sample, the probe comprising a base sequence shown in either SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto. A tcdB detection probe.
[Item 12] The probe for detecting tcdB according to Item 11, wherein at least one of the terminal cytosines is labeled with a fluorescent dye.
[Item 13] A kit used for detecting tcdB, comprising the primer according to Item 1 or 2 or the primer set according to Item 3.
[Item 14] The kit according to Item 13, further comprising the tcdB detection probe according to Item 11 or 12.
[Item 13] The kit according to Item 13 or 14, further comprising at least one DNA polymerase selected from the group consisting of Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and mutants thereof.
本発明により、簡便でありながら、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できるようになる。本発明のプライマー、並びに該プライマーを用いた検出方法、試薬、及びキットを使用することで、ｔｃｄＢの簡便、高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。 The present invention makes it possible to easily and sensitively detect tcdB contained in a sample. By using the primers of the present invention, as well as the detection methods, reagents, and kits that use the primers, it becomes possible to easily and sensitively detect tcdB, making a significant contribution to the field of clinical diagnosis.
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されない。 The present invention will be described in further detail below while showing embodiments of the present invention, but the present invention is not limited to these.
［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するためのプライマー］
本発明の実施態様の一つは、試料中に含まれ得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢを検出するために用いられるプライマーであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含むことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出用プライマーである。
[Primers for detecting Clostridioides difficile toxin B gene (tcdB)]
One embodiment of the present invention is a primer used to detect tcdB of C. difficile that may be contained in a sample, and is characterized in that it contains a base sequence of at least 15 consecutive bases in any of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14, or a base sequence complementary thereto. It is a primer for detecting tcdB.
［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）］
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジオイデス・ディフィシル）は、院内感染の原因微生物のひとつであり、毒素産生菌はその毒素によって抗菌薬に関連した下痢症・腸炎を引き起こす。主要な毒素は、トキシンＡおよびトキシンＢであるが、ほかにもバイナリートキシン等を毒素として産生することもある。
[Clostridioides difficile toxin B gene (tcdB)]
Clostridioides difficile is one of the microorganisms that cause hospital-acquired infections, and toxin-producing bacteria cause antibiotic-associated diarrhea and enteritis by producing toxins. The main toxins are toxin A and toxin B, but the bacteria may also produce other toxins such as binary toxin.
従来、これらの毒素検出法として、イムノクロマト法等が用いられてきたが、感度が低いという問題があった。そこで、高感度な核酸増幅法を用いることで、これら毒素産生に関与する遺伝子を検出するための方法が開発されてきた（特許文献１）。 Conventionally, immunochromatography and other methods have been used to detect these toxins, but they have a problem of low sensitivity. Therefore, a method has been developed to detect genes involved in the production of these toxins by using highly sensitive nucleic acid amplification methods (Patent Document 1).
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素産生に関与する遺伝子は、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ変異、ｃｄｔＡ、ｃｄｔＢ等があるが、特に毒性が強いとされるトキシンＢをコードする遺伝子であるｔｃｄＢの検出が重要である。 The genes involved in toxin production by C. difficile include tcdA, tcdB, tcdC mutation, cdtA, and cdtB, but it is particularly important to detect tcdB, the gene that codes for toxin B, which is considered to be highly toxic.
本発明者は、従来技術よりも簡便にｔｃｄＢを検出するため、鋭意研究の結果、本発明のプライマーを開発した。 The inventors conducted extensive research and developed the primers of the present invention to detect tcdB more easily than with conventional techniques.
本発明の核酸プライマーは、以下の特徴を有する：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。
The nucleic acid primer of the present invention has the following characteristics:
It comprises a base sequence of at least 15 consecutive bases in any of the base sequences shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 or SEQ ID NO:14, or a base sequence complementary thereto.
上記の特徴を有するプライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるものであれば、特に限定されないが、前記塩基配列において連続する少なくとも１７塩基以上の塩基配列からなるものが好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１８塩基以上の塩基配列からなるものがより好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１９塩基以上の塩基配列からなるものが更に好ましく、前記塩基配列の全長配列からなるものが特に好ましい。 The primer having the above characteristics is not particularly limited as long as it is a base sequence of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in any one of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or a base sequence complementary thereto, but is preferably a base sequence of at least 17 consecutive bases in the base sequence, more preferably a base sequence of at least 18 consecutive bases in the base sequence, even more preferably a base sequence of at least 19 consecutive bases in the base sequence, and particularly preferably a full-length sequence of the base sequence.
特定の実施形態では、以下の（１）または（２）のいずれか１つ以上に該当するプライマーをｔｃｄＢプライマーとして使用する：
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマー。
（２）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマー。
特定の好ましい実施形態では、前記（１）に記載の配列番号１～８のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーを少なくとも１つ使用し、かつ、前記（２）に記載の配列番号９～１４のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーを少なくとも１つ使用する。なかでも、前記（１）に記載のプライマーをフォワードプライマーとし、かつ前記（２）に記載のプライマーをリバースプライマーとするｔｃｄＢ検出用プライマーセットとして使用することが好ましい。これらの場合において、前記（１）又は（２）に記載のプライマーはそれぞれ１種類のプライマーを選択して用いても良いし、前記（１）のプライマーとして２種以上のプライマーを組み合わせて使用してもよいし、前記（２）のプライマーとして２種以上のプライマーを組み合わせて使用してもよい。
In certain embodiments, a primer corresponding to any one or more of the following (1) or (2) is used as the tcdB primer:
(1) A primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or a base sequence complementary thereto.
(2) A primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or a base sequence complementary thereto.
In a specific preferred embodiment, at least one primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 described in (1) above is used, and at least one primer consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 9 to 14 described in (2) above is used. Among these, it is preferable to use as a primer set for detecting tcdB, in which the primer described in (1) above is used as a forward primer and the primer described in (2) above is used as a reverse primer. In these cases, one type of primer may be selected and used for each of the primers described in (1) or (2) above, or two or more types of primers may be used in combination as the primer in (1), or two or more types of primers may be used in combination as the primer in (2).
核酸検査法は、従来から周知であり、既に当該技術分野において確立されている。このような核酸検査法では短時間で正確に標的核酸を特異的に増幅する核酸プライマーの設計が重要である。 Nucleic acid testing methods have been well known for a long time and have already been established in the technical field. In such nucleic acid testing methods, it is important to design nucleic acid primers that specifically amplify target nucleic acids accurately in a short period of time.
一つの実施形態において、本発明では上記の特徴を有するプライマー（本発明ではこれを「核酸プライマー」という場合がある）又はプライマーセット（本明細書では、これを「核酸プライマー対」という場合がある）を選択して用いて核酸増幅反応を行う。これにより、正確にｔｃｄＢ遺伝子を特異的に増幅でき、高感度なｔｃｄＢ検出が可能になる。 In one embodiment, the present invention performs a nucleic acid amplification reaction by selecting and using a primer (sometimes referred to as a "nucleic acid primer" in the present invention) or a primer set (sometimes referred to as a "nucleic acid primer pair" in the present specification) having the above characteristics. This allows the tcdB gene to be accurately and specifically amplified, enabling highly sensitive detection of tcdB.
［ｔｃｄＢ検出方法］
本発明の実施態様の一つは、試料中に含まれ得るクロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出する方法であって、前記のいずれかに記載のプライマー又はプライマーセットを少なくとも含む反応液を用いて、以下の工程（１）～（３）を行うことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出方法である。
（１）ｔｃｄＢを含みうる試料を提供する工程。
（２）前記反応液を用いて核酸増幅反応を行う工程。
（３）工程（２）で得られうる増幅産物に、プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定する工程。
[tcdB detection method]
One embodiment of the present invention is a method for detecting the toxin B gene (tcdB) of Clostridioides difficile that may be contained in a sample, the method being characterized by carrying out the following steps (1) to (3) using a reaction solution containing at least any one of the primers or primer sets described above:
(1) Providing a sample that may contain tcdB.
(2) A step of carrying out a nucleic acid amplification reaction using the reaction solution.
(3) A step of hybridizing a probe to the amplification product obtainable in the step (2) and measuring the fluorescence intensity of the reaction solution.
［試料］
本発明において使用できる試料はｔｃｄＢを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、生体試料や食品、環境試料だけでなく、精製核酸等が挙げられる。また、試料は核酸抽出やいくつかの前処理を行ってもよい。試料の核酸抽出や前処理は、当該技術分野で一般的に行われている。前処理としては、ろ過、遠心分離、希釈処理、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶媒処理、懸濁処理、破砕処理、磨砕処理等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。
[sample]
The sample that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it may contain tcdB. Examples include biological samples, food, and environmental samples, as well as purified nucleic acids. The sample may be subjected to nucleic acid extraction or some pretreatment. Nucleic acid extraction and pretreatment of the sample are commonly performed in the art. Pretreatments include filtration, centrifugation, dilution, heating, acid treatment, alkali treatment, organic solvent treatment, suspension, crushing, and grinding, but are not limited to these in the present invention.
生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血液培養液、尿、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。 Examples of biological samples include, but are not limited to, animal and plant tissues, body fluids, excrement, cells, bacteria, viruses, etc. Further examples include blood, blood culture fluid, urine, pus, cerebrospinal fluid, pleural fluid, throat swabs, nasal swabs, sputum, tissue slices, skin, vomit, feces, isolated culture colonies, catheter washings, etc.
食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。 Examples of foods include water, alcoholic beverages, soft drinks, processed foods, vegetables, livestock products, seafood, eggs, dairy products, raw meat, raw fish, prepared foods, etc. When using food as a measurement sample, not only can part or all of the food be used, but the surface of the food can also be wiped. Furthermore, materials used to wipe cooking utensils or doorknobs, or the cleaning fluid used to wash them, can also be used as samples.
環境試料の例として、水、氷、土壌、空気やエアゾール等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川や滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。また、施設の壁面、床面、設備や備品、便器等を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。 Examples of environmental samples include water, ice, soil, air, and aerosols. Examples of water include tap water, seawater, and water collected from rivers, waterfalls, lakes, ponds, etc. Samples can also be used that have been wiped off facility walls, floors, equipment, fixtures, toilets, etc., or the cleaning fluid used to wash these.
本発明には上記のようないずれの試料も用いることができるが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが下痢症・腸炎の主要な原因菌という観点から、生体試料（例えば、動植物組織、体液、排泄物、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー）を用いるのが好ましく、排泄物、吐瀉物、糞便、分理培養コロニーを用いるのがより好ましく、糞便、分離培養コロニーを用いるのが更に好ましい。本発明によれば、このような試料を用いる場合であっても特異的にｔｃｄＢの標的配列を増幅でき、高感度にｔｃｄＢを検出することが可能である。 In the present invention, any of the above samples can be used, but from the viewpoint that C. difficile is the main causative bacterium of diarrhea and enteritis, it is preferable to use a biological sample (e.g., animal or plant tissue, body fluid, excrement, tissue slice, skin, vomit, feces, or isolated culture colony), more preferably excrement, vomit, feces, or isolated culture colony, and even more preferably feces or isolated culture colony. According to the present invention, even when such a sample is used, the target sequence of tcdB can be specifically amplified, and tcdB can be detected with high sensitivity.
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。 There are no particular limitations on the method of collecting and preparing the sample, and any known method can be used depending on the type and purpose of the sample.
［核酸増幅反応］
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明のｔｃｄＢ検出方法に用いる核酸増幅法は、より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、又はＲＴ－ＰＣＲ法であることが好ましく、なかでもＰＣＲ法が好ましいが、これに限定されない。
[Nucleic acid amplification reaction]
The nucleic acid amplification method is a technique for amplifying several copies of a target nucleic acid to a level at which it can be visualized, i.e., to hundreds of millions of copies or more, and is widely used not only in the field of life science research, but also in the fields of clinical diagnosis, food hygiene testing, environmental testing, etc. Examples of such nucleic acid amplification methods include PCR, LAMP, LCR, TMA, SDA, RT-PCR, RT-LAMP, NASBA, TRC, TMA, etc. These techniques have already been established in the technical field, and a method can be selected according to the purpose. From the viewpoint of more reliably obtaining the effects of the present invention, the nucleic acid amplification method used in the tcdB detection method of the present invention is preferably PCR, LAMP, LCR, TMA, SDA, or RT-PCR, and among them, PCR is preferable, but is not limited thereto.
［ＰＣＲ］
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。より簡便で特異性の高い核酸増幅を可能にできるという観点から、本発明では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
[PCR]
PCR is a reaction catalyzed mainly by DNA polymerase, and the target nucleic acid is amplified by repeating three steps, namely (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of a primer to a template single-stranded DNA, and (3) extension of the primer using DNA polymerase, as one cycle. Examples of DNA polymerase include Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and their variants. In view of enabling simpler and more specific nucleic acid amplification, it is preferable to use a DNA polymerase belonging to family B in the present invention.
なお、本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。 In this specification, a DNA polymerase mutant refers to a mutant that has, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and especially preferably 99% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase from which it is derived, and has the activity of amplifying DNA similar to that of the wild-type DNA polymerase. Here, the method of calculating the identity of the amino acid sequence can be performed by any means known in the art. For example, it can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet). As an example, it is possible to calculate the identity of the amino acid sequence by using the default (initial setting) parameters in the homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Furthermore, the mutant that can be used in the present invention is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added (hereinafter, these are also collectively referred to as "mutations") in the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase from which it is derived, and may have the activity of amplifying DNA similar to that of the wild-type DNA polymerase. Here, "one or several" can be, for example, 1 to 80, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5, but is not particularly limited thereto.
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
[DNA polymerases belonging to family B]
The DNA polymerase used in the present invention is preferably, but not limited to, a DNA polymerase belonging to family B. The DNA polymerase belonging to family B is not particularly limited, but is preferably a DNA polymerase derived from Archea.
［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、本発明には、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。
[Archaemic DNA polymerase]
Examples of DNA polymerases derived from archaea belonging to family B include DNA polymerases isolated from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus. The present invention also includes mutants of DNA polymerases derived from archaea belonging to family B that do not lose their activity. Examples of DNA polymerase mutants include, but are not limited to, mutants that are intended to enhance polymerase activity, to lack exonuclease activity, to adjust substrate specificity, and the like.
Examples of DNA polymerases derived from the genus Pyrococcus include, but are not limited to, DNA polymerases isolated from Pyrococcus furiosus, Pyrococcus sp. GB-D, Pyrococcus woesei, Pyrococcus abyssi, and Pyrococcus horikoshii, as well as mutants derived therefrom that have not lost their DNA polymerase activity.
Examples of DNA polymerases derived from the genus Thermococcus include, but are not limited to, DNA polymerases isolated from Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9°N-7), and Thermococcus siculi, and mutants thereof that have not lost their DNA polymerase activity.
PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, and include Pfu (Staragene), KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England Biolabs), Tgo (Roche), and Pwo (Roche), any of which may be used in the present invention.
なかでも、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等）が好ましい。 Among these, KOD DNA polymerase and its mutants (e.g., KOD DNA polymerase lacking 3'→5' exonuclease activity) that have excellent extensibility and thermal stability are preferred.
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、後述の実施例に示すように、簡便でありながら特異的なｔｃｄＢの増幅を可能にし、高感度なｔｃｄＢの検出が可能となる。 Compared to Taq DNA polymerase, a DNA polymerase belonging to family A, KOD DNA polymerase is superior in accuracy, amplification efficiency, extensibility, and crude sample resistance. In the present invention, the use of such KOD DNA polymerase enables simple yet specific amplification of tcdB, as shown in the examples below, and enables highly sensitive detection of tcdB.
本発明のｔｃｄＢ検出方法においては、上記プライマー又はプライマーセットのいずれかを含む反応液で行う核酸増幅工程により得られた増幅産物に、該増幅産物の一部と複合体を形成可能なように設計された核酸プローブ（好ましくは、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブ）をハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定し、ｔｃｄＢを検出する。また、ｔｃｄＢの検出は、蛍光プローブ法に替えて、核酸クロマト法により検出してもよい。核酸クロマト法は当該分野で公知の任意の手法で行うことができ、例えば、上記のようにして得られた増幅産物と複合体形成可能な標識プローブと、メンブレンストリップ上に固定された前記増幅産物と複合体形成可能な核酸オリゴとで、前記増幅産物をハイブリダイズすることにより検出できる。 In the tcdB detection method of the present invention, a nucleic acid probe (preferably a nucleic acid probe in which at least one of the terminal cytosines is labeled with a fluorescent dye) designed to form a complex with a part of the amplified product obtained by the nucleic acid amplification step performed in a reaction solution containing any of the above primers or primer sets is hybridized to the amplified product, and the fluorescence intensity of the reaction solution is measured to detect tcdB. In addition, tcdB may be detected by a nucleic acid chromatography method instead of the fluorescent probe method. The nucleic acid chromatography method can be performed by any method known in the art, and for example, the amplified product can be detected by hybridizing the amplified product obtained as described above with a labeled probe capable of forming a complex with a nucleic acid oligonucleotide immobilized on a membrane strip capable of forming a complex with the amplified product.
上記核酸プライマーのいずれかを含む核酸増幅工程の条件（例えば、温度、ｐＨ、陽イオン濃度、溶液中の有機溶媒の存在等）は、核酸プローブのハイブリダイズ条件等と合わせて至適化すればよく、当業者であれば適宜設定可能である。 The conditions for the nucleic acid amplification process that includes any of the above nucleic acid primers (e.g., temperature, pH, cation concentration, the presence of an organic solvent in the solution, etc.) can be optimized in conjunction with the hybridization conditions of the nucleic acid probe, and can be set appropriately by a person skilled in the art.
また核酸増幅工程をＰＣＲ法で行う場合、熱サイクル条件は特に限定されず、当業者により適宜設定され得る。一例として、核酸増幅反応は、最初の熱変形工程が８０～１００℃で１０秒～１５分、繰り返しの熱変形工程が８０～１００℃で０．５～３００秒、アニーリンクが４０～８０℃で１～３００秒、伸長反応工程が６０～８５℃で１～３００秒程度行い、この繰り返しを３０～７０回繰り返すことが好ましい。 When the nucleic acid amplification step is carried out by PCR, the thermal cycle conditions are not particularly limited and can be appropriately set by a person skilled in the art. As an example, the nucleic acid amplification reaction is preferably carried out such that the initial thermal deformation step is carried out at 80-100°C for 10 seconds to 15 minutes, the repeated thermal deformation steps are carried out at 80-100°C for 0.5-300 seconds, the annealing step is carried out at 40-80°C for 1-300 seconds, and the extension reaction step is carried out at 60-85°C for 1-300 seconds, with this cycle being repeated 30-70 times.
一つの実施形態において、ｔｃｄＢ検出方法として、以下の工程（１）～（５）の工程を包含する方法を例示することができる。
（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢ遺伝子の領域に特異的な少なくとも１つ以上のフォワードプライマーを用意する。
（２）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢ遺伝子の領域に特異的な少なくとも１つ以上のリバースプライマーを用意する。
（３）被検核酸及び前記核酸プライマーのセットを含む反応液を用意し、該反応液によって被検核酸を増幅する。
（４）工程（３）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（５）工程（４）で得られた複合体を検出する工程。
In one embodiment, the method for detecting tcdB can be exemplified by a method including the following steps (1) to (5).
(1) At least one forward primer specific to a region of the tcdB gene of Clostridioides difficile is prepared.
(2) At least one reverse primer specific to a region of the tcdB gene of Clostridioides difficile is provided.
(3) A reaction solution containing a test nucleic acid and the set of nucleic acid primers is prepared, and the test nucleic acid is amplified using the reaction solution.
(4) A step of hybridizing the nucleic acid amplification product obtained in the step (3) with a nucleic acid probe designed to form a complex with a part of the nucleic acid amplification product to form a complex.
(5) detecting the complex obtained in step (4).
（１）及び（２）に記載の上記プライマーのうち、従来と比較して非特異増幅を抑え高感度にｔｃｄＢ遺伝子を検出するためには、（１）のプライマーとして、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号８のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマーを使用することが望ましく、かつ（２）のプライマーとして、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプライマーを使用することが望ましい。 Of the above primers described in (1) and (2), in order to suppress non-specific amplification and detect the tcdB gene with high sensitivity compared to conventional methods, it is preferable to use a primer consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8, or a base sequence complementary thereto, as the primer in (1), and it is preferable to use a primer consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14, or a base sequence complementary thereto, as the primer in (2).
特定の実施形態では、上記方法において、フォワードプライマーとして前記（１）の配列番号４～８のいずれかで示される塩基配列、好ましくは配列番号８で示される塩基配列において連続する２０塩基以上２６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーを使用し、かつ、リバースプライマーとして前記（２）の配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列、好ましくは配列番号１３及び／又は配列番号１４で示される塩基配列において連続する２０塩基以上２６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーを使用することが好ましい。 In a particular embodiment, in the above method, it is preferable to use a nucleic acid primer consisting of a base sequence of 20 to 26 consecutive bases in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4 to 8 in (1), preferably SEQ ID NO: 8, as a forward primer, and to use a nucleic acid primer consisting of a base sequence of 20 to 26 consecutive bases in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 11 to 14 in (2), preferably SEQ ID NO: 13 and/or SEQ ID NO: 14, as a reverse primer.
上記の核酸プライマー対は前記（１）及び（２）に該当すれば特に限定されるものではないが、センス鎖に由来する配列とアンチセンス鎖に由来する配列の組み合わせでなければならない。 The above nucleic acid primer pair is not particularly limited as long as it satisfies (1) and (2) above, but must be a combination of a sequence derived from the sense strand and a sequence derived from the antisense strand.
本発明のプライマー又はプライマーセットを用いて得られた増幅産物は、任意の解析法により検出することができ、例えば、電気泳動法、蛍光融解曲線分析法、各種プローブ法（Ｑプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、モレキュラービーコンプローブ、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、スコーピオンプローブなど）、インターカレーター法（例えば、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ、ＥｖａＧｒｅｅｎなどの市販のインターカレーター色素を使用する方法）、又はこれらを任意に組み合わせた方法等により検出可能である。より高感度な検出が可能であるという観点からは、Ｑプローブを用いる融解曲線分析で検出することが好ましい。 The amplification products obtained using the primers or primer sets of the present invention can be detected by any analytical method, such as electrophoresis, fluorescence melting curve analysis, various probe methods (Q probes, TaqMan probes, molecular beacon probes, FRET hybridization probes, Scorpion probes, etc.), intercalator methods (e.g., methods using commercially available intercalator dyes such as SYBRGREEN and EvaGreen), or any combination of these. From the viewpoint of enabling more sensitive detection, it is preferable to detect by melting curve analysis using a Q probe.
Ｑプローブ（「グアニン消光プローブ」ともいう）は、ＫＵＲＡＴＡらにより開発された蛍光プローブ（蛍光消光プローブ）である（特許第５３５４２１６号公報）。このプローブは、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されているハイブリダイゼーションプローブである。 The Q probe (also called the "guanine quenching probe") is a fluorescent probe (fluorescence quenching probe) developed by KURATA et al. (Patent Publication No. 5354216). This probe is a hybridization probe in which at least one terminal base is labeled with a fluorescent quenching dye that quenches by interaction with guanine.
例えば、Ｑプローブで用いられる蛍光消光色素としては特に限定されないが、フルオレセインまたはその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミンまたはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、カルボキシローダミン、ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、ＢＯＤＩＰＹまたはその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ－５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－５６４、ＢＯＤＩＰＹ－５８１、ＢＯＤＩＰＹ－５９１、ＢＯＤＩＰＹ－６３０、ＢＯＤＩＰＹ－６５０、ＢＯＤＩＰＹ－６６５）等が挙げられる。蛍光消光色素の詳細は、特許第５８１３２６３号公報等に記載があり、本発明も該技術を参照できる。 For example, the fluorescent quenching dyes used in the Q probe are not particularly limited, but include fluorescein or a derivative thereof (e.g., fluorescein isothiocyanate), rhodamine or a derivative thereof (e.g., tetramethylrhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate, carboxyrhodamine, x-rhodamine, sulforhodamine 101 acid chloride), BODIPY or a derivative thereof (e.g., BODIPY-FL, BODIPY-FL/C3, BODIPY-FL/C6, BODIPY-5-FAM, BODIPY-TMR, BODIPY-TR, BODIPY-R6G, BODIPY-564, BODIPY-581, BODIPY-591, BODIPY-630, BODIPY-650, BODIPY-665), and the like. Details of the fluorescent quenching dye are described in Japanese Patent No. 5813263, etc., and the present invention can also refer to this technology.
本発明では、少なくとも一つの末端塩基がシトシンである塩基配列からなり、当該末端塩基のシトシンが蛍光消光色素で標識されているプローブが好ましい。このようなプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。 In the present invention, a probe is preferred that has a base sequence in which at least one terminal base is cytosine, and the terminal base cytosine is labeled with a fluorescent quenching dye. When such a probe hybridizes to an amplification product, it can be quenched by forming a base pair with the guanine base in the amplification product and interacting with it, making it very easy to measure changes in the fluorescence intensity of the reaction solution.
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。即ち、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（シトシン塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。 When the probe hybridizes, even if the cytosine base of the probe and the guanine base in the amplified product do not form a base pair, the fluorescence can be quenched as long as the distance between these bases is close to each other. For example, details are described in Japanese Patent No. 5354216, and this technology can also be referenced in the present invention. In other words, when the probe hybridizes, the fluorescence can be quenched if the guanine base in the amplified product is within a range of, for example, 1 to 3 bases of the cytosine base of the probe (a base that forms a base pair with a cytosine base is counted as 1).
本発明のｔｃｄＢ検出方法が核酸プローブを用いる場合、その核酸プローブの塩基配列は、本発明のプライマー又はプライマーセットを用いた場合に得られる増幅産物の一部と複合体を形成可能な限り特に限定されない。特定の好ましい実施形態では、配列番号１５若しくは１６に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含むプローブであることが好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１７塩基以上の塩基配列を含むプローブであることが好ましい。特に好ましいプローブは、配列番号１５若しくは１６に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなるプローブである。このようなプローブを用いることにより、ｔｃｄＢのより高感度な検出が可能となる。 When the tcdB detection method of the present invention uses a nucleic acid probe, the base sequence of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it can form a complex with a part of the amplification product obtained when the primer or primer set of the present invention is used. In a specific preferred embodiment, the probe is preferably a probe containing a base sequence of at least 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or 16 or a base sequence complementary thereto, and is preferably a probe containing a base sequence of at least 17 or more consecutive bases in the base sequence. A particularly preferred probe is a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or 16 or a base sequence complementary thereto. By using such a probe, more sensitive detection of tcdB is possible.
［ｔｃｄＢを検出するための試薬］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るｔｃｄＢを検出するための試薬が挙げられる。試薬には、前述の特徴を備えた核酸プライマーに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。必要な成分は、実施する核酸増幅反応によって異なっており、それぞれ公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれるｔｃｄＢを検出する場合、オリゴヌクレオチドプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩を少なくとも含むことが好ましい。目的の実験に応じて各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、オリゴヌクレオチドプローブは０．１～１μＭが好ましく、０．２～０．５μＭがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１～１Ｕ／ｕＬが好ましく、０．１～０．５Ｕ／ｕＬがより好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ異なるが、０．１～１０μＭが好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩は０．１～６ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。
[Reagents for detecting tcdB]
Another embodiment of the present invention includes a reagent for detecting tcdB that may be contained in a sample. The reagent contains at least components necessary for nucleic acid amplification in addition to the nucleic acid primer having the above-mentioned characteristics. The necessary components differ depending on the nucleic acid amplification reaction to be performed, and each of the known methods can be used. For example, when detecting tcdB contained in a sample using a PCR reaction, it is preferable to contain at least an oligonucleotide probe, a DNA polymerase, an oligonucleotide primer, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), and a magnesium salt. The concentration of each component can be appropriately adjusted depending on the intended experiment, but for example, the oligonucleotide probe is preferably 0.1 to 1 μM, more preferably 0.2 to 0.5 μM. The DNA polymerase is preferably 0.01 to 1 U/uL, more preferably 0.1 to 0.5 U/uL. The oligonucleotide primers are different, but are preferably 0.1 to 10 μM. The deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) are preferably 0.02 to 1 mM, more preferably 0.1 to 0.5 mM. The magnesium salt is preferably at 0.1 to 6 mM, more preferably at 1 to 5 mM.
さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等が挙げられる。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。 Furthermore, additives known in the art may be added for the purpose of suppressing non-specific amplification or promoting the reaction. Examples of additives for suppressing non-specific amplification include anti-DNA polymerase antibodies and phosphoric acid. Examples of additives for promoting the reaction include bovine serum albumin (BSA), protease inhibitors, single-strand binding protein (SSB), T4 gene 32 protein, tRNA, sulfur- or acetic acid-containing compounds, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, trimethylene glycol, formamide, acetamide, betaine, ectoine, trehalose, dextran, polyvinylpyrrolidone (PVP), gelatin, tetramethylammonium chloride (TMAC), tetramethylammonium hydroxide (TMAH), tetramethylammonium acetate (TMAA), polyethylene glycol, Triton, Tween 20, and Nonidet P40. In the present invention, one or more of these additives may be used in combination, but is not limited to these.
例えば、前記（１）及び（２）に該当する核酸プライマーのセットで増幅した核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。 For example, a nucleic acid amplification product amplified with a set of nucleic acid primers corresponding to (1) and (2) above is hybridized with a nucleic acid probe designed to form a complex with a part of the nucleic acid amplification product to form a complex.
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中及び核酸増幅反応後のいずれかに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
特に、増幅反応と検出反応は連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応前に核酸プローブを添加する場合は、例えば、その３’末端に蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
The timing of adding the nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited, and the nucleic acid probe may be added to the reaction system of the amplification reaction, for example, before, during, or after the aforementioned nucleic acid amplification reaction.
In particular, since the amplification reaction and the detection reaction can be carried out consecutively, it is preferable to add the nucleic acid probe before the amplification reaction. When the nucleic acid probe is added before the nucleic acid amplification reaction, it is preferable to add, for example, a fluorescent dye or a phosphate group to the 3' end of the nucleic acid probe.
前記核酸プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。 The nucleic acid probe may be added to a liquid sample containing the nucleic acid amplification product, or may be mixed with the nucleic acid amplification product in a solvent. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, a solvent containing KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol, etc., and a PCR reaction solution.
［ｔｃｄＢを検出するためのキット］
さらに、本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るｔｃｄＢを検出するための試薬を含むキットが挙げられる。キットの構成は、前記プライマー又はプライマーセットを含む前記ｔｃｄＢ検出試薬を含み、ｔｃｄＢを検出できるよう構成されていれば特に限定されない。本キットはさらに、前記プライマー又はプライマーセットを用いて得られる増幅産物の一部と複合体を形成可能なプローブ（好ましくは、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されているプローブ）を含んでいてもよい。さらに、本キットは、効率よく特異性の高い核酸増幅を行うために、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ及びそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼを更に含むことが好ましい。
[Kit for detecting tcdB]
Further, as another embodiment of the present invention, there is a kit containing a reagent for detecting tcdB that may be contained in a sample. The configuration of the kit is not particularly limited as long as it contains the tcdB detection reagent containing the primer or primer set and is configured to detect tcdB. The kit may further contain a probe (preferably a probe in which at least one of the terminal cytosines is labeled with a fluorescent dye) capable of forming a complex with a part of the amplification product obtained using the primer or primer set. Furthermore, in order to efficiently and specifically amplify nucleic acids, the kit preferably further contains at least one DNA polymerase selected from the group consisting of Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and mutants thereof.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically explained below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１：ｔｃｄＢ遺伝子増幅における非特異増幅の確認
（１－１）方法
非特異増幅を抑えて高感度にｔｃｄＢを検出できる核酸プライマーを設計するために、鋳型を加えず、計１０通りの核酸プライマー対で非特異増幅の有無を確認した。本試験で使用した核酸プライマー対の組み合わせを表１に示す。ここで、各プライマーは、配列番号１～１４、１７～２４に示される塩基配列からなる核酸を常法に従って合成したものを使用した。
（１－２）反応液
ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）の取扱説明書に従った。
１．５μＭ フォワードプライマー（＊）
０．５μＭ リバースプライマー（＊）
（＊）２種類のフォワードプライマー（又はリバースプライマー）を使用する場合は、各々のフォワードプライマー（又はリバースプライマー）を半量ずつとし、その総量が上記所定の量となるようにした。
（１－３）反応
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ（ＴＭ） Ｑを用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
９４℃ ３０秒、
９８℃ １秒－５２℃ １０秒－６３℃ １０秒（サイクル数５０回）
（１－４）結果
図１は、測定で得られた蛍光強度をサイクル数にプロットした図である。鋳型を加えていないにもかかわらず核酸プライマーの組み合わせによっては、サイクル数が増えるにしたがって、非特異増幅による蛍光強度の増加が確認された。一方で、組み合わせＮｏ．１～Ｎｏ．５では非特異増幅が確認されないことが示された。
(1-2) Reaction solution A reaction solution containing the components shown below was prepared using SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.) The preparation of the reaction solution etc. was performed according to the instruction manual for SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.).
1.5 μM forward primer (*)
0.5 μM reverse primer (*)
(*) When two types of forward primers (or reverse primers) were used, half of each forward primer (or reverse primer) was used so that the total amount was the above-mentioned specified amount.
(1-3) Reaction Using Rotor-Gene™ Q, the reaction solution was reacted in the following temperature cycle, and the fluorescence intensity in each cycle was measured.
94℃ 30 seconds,
98°C 1 sec -52°C 10 sec -63°C 10 sec (50 cycles)
(1-4) Results Figure 1 is a plot of the fluorescence intensity obtained by measurement against the number of cycles. Even though no template was added, an increase in fluorescence intensity due to non-specific amplification was confirmed as the number of cycles increased for some combinations of nucleic acid primers. On the other hand, it was shown that no non-specific amplification was confirmed for combinations No. 1 to No. 5.
実施例２：ｔｃｄＢ遺伝子増幅の確認
（２－１）方法
非特異増幅を抑えて高感度にｔｃｄＢを検出できる核酸プライマーを設計するために、鋳型としてｔｃｄＢ遺伝子を１反応あたり１００００コピー加え、計５通りの核酸プライマー対でｔｃｄＢ遺伝子増幅を確認した。核酸プライマー対の組み合わせを表２に示す。ここで、各プライマーは、配列番号１～１４に示される塩基配列からなる核酸を常法に従って合成したものを使用した。
（２－２）反応液
ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）の取扱説明書に従った。
１．０μＭ フォワードプライマー（＊）
１．０μＭ リバースプライマー（＊）
（＊）２種類のフォワードプライマー（又はリバースプライマー）を使用する場合は、各々のフォワードプライマー（又はリバースプライマー）を半量ずつとし、その総量が上記所定の量となるようにした。
（２－３）反応
Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ（ＴＭ） Ｑを用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
９８℃ １２０秒、
９８℃ １０秒－５０℃ １０秒－６８℃ ３０秒（サイクル数４０回）
（２－４）結果
図２は、測定で得られた蛍光強度をサイクル数にプロットした図である。すべての核酸プライマー対でｔｃｄＢ遺伝子の増幅が確認された。
(2-2) Reaction solution A reaction solution containing the components shown below was prepared using SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.) The preparation of the reaction solution etc. was performed according to the instruction manual for SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.).
1.0 μM forward primer (*)
1.0 μM reverse primer (*)
(*) When two types of forward primers (or reverse primers) were used, half of each forward primer (or reverse primer) was used so that the total amount was the above-mentioned specified amount.
(2-3) Reaction Using Rotor-Gene™ Q, the reaction solution was reacted in the following temperature cycle, and the fluorescence intensity in each cycle was measured.
98℃ 120 seconds,
98°C 10 seconds - 50°C 10 seconds - 68°C 30 seconds (40 cycles)
(2-4) Results Figure 2 is a graph in which the fluorescence intensity obtained by the measurement is plotted against the cycle number. Amplification of the tcdB gene was confirmed with all of the nucleic acid primer pairs.
実施例３：ゲノムＤＮＡを用いたｔｃｄＢの検出
（３－１）方法
上記実施例２の表２に示した５つの核酸プライマー対（但し、核酸プライマー対の組み合わせNo.５では、リバースプライマーとして配列番号１４の塩基配列からなる核酸プライマーのみを使用）と３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識した、増幅産物に複合体を形成せしめるように設計した核酸プローブを用いてｔｃｄＢ遺伝子の検出を行った。
測定に使用したゲノムＤＮＡはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ９６８９Ｄ－５）であり、８０００コピー／テストを測定した。
（３－２）反応液
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。
３μＭ フォワードプライマー
１．２μＭ リバースプライマー（０．６μＭ 配列番号１４で示される核酸プライマー（組み合わせＮｏ．５のみ））
０．４μＭ 配列番号１５若しくは配列番号１６に示される塩基配列からなる核酸プローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）
（３－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、核酸増幅を行った。核酸増幅反応後に以下の条件による融解曲線分析を行った。
９７℃ １５秒、
９７℃ １秒－５４℃ ５秒－６３℃ ２秒（サイクル数６０回）
９４℃ ３０秒 ３９℃ ３０秒 ４０－７５℃ ０．０９℃／ｓｅｃ
（３－４）結果
図３に、融解曲線分析の結果を示す。図３より、核酸プライマー対の組合せＮｏ．１～５のいずれを用いた場合でも、融解曲線分析によって試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できることが示された。なかでも、組合せＮｏ．３～５の核酸プライマー対を用いた場合に、高いピークが認められ、特に高感度に検出可能であることが示された。
Example 3 Detection of tcdB Using Genomic DNA (3-1) Method The tcdB gene was detected using five nucleic acid primer pairs shown in Table 2 of Example 2 above (however, in nucleic acid primer pair combination No. 5, only the nucleic acid primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 14 was used as the reverse primer) and a nucleic acid probe labeled at the 3' end with BODIPY-FL and designed to form a complex with the amplification product.
The genomic DNA used in the measurement was Clostridioides difficile genomic DNA (ATCC 9689D-5), and 8,000 copies/test were measured.
(3-2) Reaction Solution A reaction solution containing the components shown below was prepared using Genecube (registered trademark) Test Basic (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
3 μM forward primer 1.2 μM reverse primer (0.6 μM nucleic acid primer represented by SEQ ID NO: 14 (combination No. 5 only))
0.4 μM Nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16 (3' end is labeled with BODIPY-FL)
(3-3) Reaction Using GENECUBE (registered trademark), the reaction solution was reacted in the following temperature cycle to carry out nucleic acid amplification. After the nucleic acid amplification reaction, a melting curve analysis was carried out under the following conditions.
97℃ 15 seconds,
97°C 1 sec -54°C 5 sec -63°C 2 sec (60 cycles)
94℃ 30 seconds 39℃ 30 seconds 40-75℃ 0.09℃/sec
(3-4) Results The results of the melting curve analysis are shown in Figure 3. Figure 3 shows that tcdB contained in a sample can be detected by melting curve analysis when any of the nucleic acid primer pair combinations No. 1 to 5 was used. In particular, when the nucleic acid primer pair combinations No. 3 to 5 were used, a high peak was observed, indicating that detection was possible with particularly high sensitivity.
実施例４：ゲノムＤＮＡを用いた最小検出感度の確認
（４－１）方法
組み合わせＮｏ．５の核酸プライマー対と３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識した、増幅産物に複合体を形成せしめるように設計した核酸プローブを用いてｔｃｄＢ遺伝子の検出を行った。
測定に使用したゲノムＤＮＡはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ９６８９Ｄ－５）であり、３コピー／テスト及び１コピー／テストを測定した。
（４－２）反応液
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。
３μＭ 配列番号８で示される核酸プライマー
１．２μＭ 配列番号１３で示される核酸プライマー
０．６μＭ 配列番号１４で示される核酸プライマー
０．４μＭ 配列番号１５で示される核酸プローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識）
（４－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、核酸増幅を行った。核酸増幅反応後に以下の条件による融解曲線分析を行った。
９７℃ １５秒、
９７℃ １秒－５４℃ ５秒－６３℃ ２秒（サイクル数６０回）
９４℃ ３０秒 ３９℃ ３０秒 ４０－７５℃ ０．０９℃／ｓｅｃ
（４－４）結果
図４に、融解曲線分析の結果を示す。図４より、本発明の核酸プライマーセットを用いることにより、融解曲線分析によって試料中に含まれるｔｃｄＢを高感度に検出できることが示された。この試験結果から、本発明の核酸プライマー対を使用することで、１コピー／テストであっても検出できる場合はあるものの、より正確な測定を可能とする最小検出感度は３コピー／テストであることがわかった。
Example 4: Confirmation of minimum detection sensitivity using genomic DNA (4-1) Method The tcdB gene was detected using a nucleic acid primer pair of combination No. 5 and a nucleic acid probe labeled at the 3' end with BODIPY-FL and designed to form a complex with the amplification product.
The genomic DNA used for the measurement was Clostridioides difficile genomic DNA (ATCC 9689D-5), and 3 copies/test and 1 copy/test were measured.
(4-2) Reaction Solution A reaction solution containing the components shown below was prepared using Genecube (registered trademark) Test Basic (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
3 μM nucleic acid primer represented by SEQ ID NO:8 1.2 μM nucleic acid primer represented by SEQ ID NO:13 0.6 μM nucleic acid primer represented by SEQ ID NO:14 0.4 μM nucleic acid probe represented by SEQ ID NO:15 (3' end labeled with BODIPY-FL)
(4-3) Reaction Using GENECUBE (registered trademark), the reaction solution was reacted in the following temperature cycle to carry out nucleic acid amplification. After the nucleic acid amplification reaction, a melting curve analysis was carried out under the following conditions.
97℃ 15 seconds,
97°C 1 sec -54°C 5 sec -63°C 2 sec (60 cycles)
94℃ 30 seconds 39℃ 30 seconds 40-75℃ 0.09℃/sec
(4-4) Results The results of the melting curve analysis are shown in Figure 4. Figure 4 shows that tcdB contained in a sample can be detected with high sensitivity by melting curve analysis using the nucleic acid primer set of the present invention. These test results show that, although detection is possible even with 1 copy/test by using the nucleic acid primer pair of the present invention, the minimum detection sensitivity that enables more accurate measurement is 3 copies/test.
本発明に記載のプライマー又はプライマーセットを使用した方法、試薬またはキットを使用することで、簡便、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できるようになった。したがって、本発明は研究用途のみならず、院内感染等のおそれがある場合に、その原因菌の毒素遺伝子であるｔｃｄＢを迅速、簡便、高感度に検出することを可能とし、臨床診断や環境検査等にも大きく貢献することができる。 By using a method, reagent, or kit that uses the primer or primer set described in the present invention, it is now possible to detect tcdB contained in a sample easily and with high sensitivity. Therefore, the present invention is not only useful for research purposes, but also makes it possible to quickly, easily, and highly sensitively detect tcdB, the toxin gene of the causative bacterium, in cases where there is a risk of hospital-acquired infection, etc., and can greatly contribute to clinical diagnosis, environmental testing, etc.
Claims (11)
（１）配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー。
（２）配列番号１３若しくは配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー。 A primer set for detecting tcdB, which is used for detecting the toxin B gene (tcdB) of Clostridioides difficile that may be contained in a sample, comprising a primer described in (1) below as a forward primer and a primer described in (2) below as a reverse primer .
(1 ) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:8 .
(2 ) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:13 or SEQ ID NO:14 .
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