JP7369426B2 - 反応処理装置および反応処理方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置に関する。

遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲを用いた方法は、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。

ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。

ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブまたは複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。

特開２００９－２３２７００号公報

上記のような流路を備える反応処理容器を用いたＰＣＲでは、試料の定量的な変化を検出するなどの目的のために蛍光検出装置が用いられる場合がある。試料に蛍光色素を添加し、ＰＣＲの間に蛍光検出装置を用いて試料に励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を検出する。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料から発せられる蛍光の強度が増加するので、その蛍光の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。

ＰＣＲでは、増幅対象によっては複数の蛍光色素を混ぜた試薬をもちいることが多く、この場合は蛍光検出装置を複数設置する必要がある。特に板状の反応処理容器内に形成された流路中を移動させながら、試料からの蛍光を検出するような反応処理装置においては、断面積が例えば２ｍｍ^２以下の一本の流路を通過する試料からの蛍光を検出するために、流路の延長方向に複数の蛍光検出装置を配列する必要がある。

例えば、ＰＣＲでＯ－１５７を増幅する場合は、ＶＴ１，ＶＴ２を同時に測定することになり、例えば東洋紡株式会社の検査キット（ＦＩＫ－３６２）は、蛍光色素にＲＯＸ（略緑色光の照射により励起され、略赤色の蛍光を発する蛍光色素であり、以下このような蛍光の特性を「緑励起／赤蛍光」と称する）、Ｃｙ５（赤励起／赤外蛍光）を使用している。この場合、２つの蛍光検出装置が必要となる。

また、ノロウイルスを検出する場合にはＧ１，Ｇ２を同時に測定することになり、例えばタカラバイオ株式会社の検査キット（ＲＲ２５５Ａ）および東洋紡株式会社の検査キット（ＦＩＫ－２５３）は共に、蛍光色素にＦＡＭ（青励起／緑蛍光）、ＲＯＸ（緑励起／赤蛍光）、Ｃｙ５（赤励起／赤外蛍光）を使用している。この場合は３つの蛍光検出装置が必要となる。

このように複数の蛍光検出装置を用いて流路を通過する試料に対して蛍光検出を行う場合、蛍光検出装置間で干渉が生じる可能性がある。以下、例を挙げて説明する。

蛍光色素として、ＦＡＭとＲＯＸを同時に試料に添加して使用する場合、ＲＯＸを励起するために照射する励起光の略緑色に相当する光の波長範囲と、ＦＡＭから発せられる蛍光の略緑色に相当する光の波長範囲が一部重なることがある。その場合、ＲＯＸを励起するために照射した励起光の一部が、ＦＡＭから発せられる蛍光を検出するための光電変換素子などの光検出器に入ると、ノイズになり、高感度の測定をすることができない虞がある。通常、励起光の光量は数十μＷであり、一方、検出対象の蛍光の光量は数ｐＷ以下のオーダである。蛍光検出装置はこのような微弱な光量の蛍光を検出するように構成されているところ、励起光がほんの一部でも該光検出器に到達してしまうと、大きなノイズとなって現れるからである。

また、蛍光色素としてＲＯＸとＣｙ５を同時に試料に添加して使用する場合、Ｃｙ５を励起するために照射する励起光の略赤色の光の波長範囲と、ＲＯＸから発せられる蛍光の略赤色に相当する光の波長範囲が一部重なることがある。この場合も、Ｃｙ５を励起するために照射した励起光の一部が、ＲＯＸから発せられる蛍光を検出するための光検出器に入ると、ノイズになり、高感度の蛍光測定を行うことができない虞がある。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、複数の蛍光検出装置を備える反応処理装置において、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる技術を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、第１励起光を流路に設定された第１蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を検出する第１蛍光検出装置と、第２励起光を流路に設定された第２蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を検出する第２蛍光検出装置と、を備える。第１蛍光の波長範囲と第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、第１励起光および第２励起光は所定のＤｕｔｙ比で点滅発光し、第１励起光と第２励起光の点滅のＤｕｔｙ比をｄとしたときに、第１励起光と第２励起光の点滅の位相差が、２π（ｐ_ｍ－Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］～２π（ｐ_ｍ＋Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］の範囲内、又は２π｛（１－ｐ_ｍ）－Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］～２π｛（１－ｐ_ｍ）＋Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］の範囲内で設定される（ただしｐ_ｍ＝ｄ－ｄ^２及びΔｐ_ｍ＝０．０１×ｐ_ｍである）。

本発明の別の態様も反応処理装置である。この装置は、試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、第１励起光を流路に設定された第１蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を検出する第１蛍光検出装置と、第２励起光を流路に設定された第２蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を検出する第２蛍光検出装置と、を備える。第１蛍光の波長範囲と第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、第１励起光および第２励起光は所定のＤｕｔｙ比で点滅発光し、第１励起光と第２励起光の点滅のＤｕｔｙ比をｄとしたときに、第１励起光と第２励起光の点滅の位相差が、２π（ｐ_ｍ－Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］～２π（ｐ_ｍ＋Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］の範囲内、又は２π｛（１－ｐ_ｍ）－Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］～２π｛（１－ｐ_ｍ）＋Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］の範囲内で設定される（ただしｐ_ｍ＝ｄ－ｄ^２及びΔｐ_ｍ＝（ｄ－ｄ^２）／｛ｋ・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝であり、Ｎ_０'は、第１励起光と第２励起光の点滅の位相差が０ｒａｄのときの第１蛍光検出装置の信号出力のノイズであり、Ｖ^１ _０は、第２蛍光検出装置が作動していない場合の第１蛍光検出装置の信号出力であり、ｋ＝２０である）。

上記態様において、ｋ＝１００／３であってもよい。また、ｋ＝１００であってもよい。

第１蛍光検出装置は、第１励起光を照射するとともに第１蛍光を受光する第１光学ヘッドを備えてもよい。第２蛍光検出装置は、第２励起光を照射するとともに第２蛍光を受光する第２光学ヘッドを備えてもよい。第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドの開口数が０．０７～０．２３の範囲内にある場合、第１蛍光検出領域の中心と第２蛍光検出領域の中心との間の距離は、４ｍｍ以上に設定されてもよい。

流路は、第１温度に維持される第１温度領域と、第１温度よりも高い第２温度に維持される第２温度領域と、第１温度領域と第２温度領域とを接続する接続領域とを備えてもよい。第１蛍光検出装置によって検出された蛍光信号に基づいて、流路内における試料の移動が制御されてもよい。第１蛍光検出領域は、接続領域の略中間点に設定されてもよい。

第１蛍光検出装置は、第１励起光として青色光を照射し、且つ第１蛍光として緑色光を検出してもよい。第２蛍光検出装置は、第２励起光として緑色光を照射し、且つ第２蛍光として赤色光を検出してもよい。

第３励起光を流路に設定された第３蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、第３励起光の照射により試料から生じた第３蛍光を検出する第３蛍光検出装置をさらに備えてもよい。第３蛍光検出装置は、第３励起光として赤色光を照射し、且つ第３蛍光として赤外光を検出してもよい。

第１蛍光検出装置の第１光学ヘッドが中央に配置され、第２蛍光検出装置の第２光学ヘッドおよび第３蛍光検出装置の第３光学ヘッドが第１光学ヘッドの両側に配置されてもよい。

本発明によれば、複数の蛍光検出装置を備える反応処理装置において、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる技術を提供できる。

図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 蛍光検出装置の構成を説明するための図である。 第１蛍光検出装置の第１光学ヘッドと第２蛍光検出装置の第２光学ヘッドが配置された状態を示す図である。 蛍光検出器からの蛍光信号を処理するロックインアンプの回路構成を説明するための図である。 第１変調信号と第２変調信号の位相差を変化させたときの、第１蛍光検出装置に係る第１信号出力の計測結果を示す図である。 ＦＡＭ水溶液からの蛍光信号に基づく信号出力と位相差との関係を示す図である。 第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比がともに５０％であるときの、ノイズと位相差との関係を示す図である。 第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比がともに３０％であるときの、ノイズと位相差との関係を示す図である。 第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比がともに４０％であるときの、ノイズと位相差との関係を示す図である。 図１１（ａ）～（ｄ）は、２つの蛍光検出装置のうち一方を停止させたときのロックインアンプの動作を説明するための図である。 図１２（ａ）～（ｆ）は、２つの蛍光検出装置を両方とも作動させたときのロックインアンプの動作を説明するための図である。 ノイズの信号出力の最小値に対応する位相差に対する許容幅の決め方を説明するための図である。 第２蛍光検出装置を停止させたときの第１蛍光検出装置からの信号出力と時刻との関係を示す図である。 第２蛍光検出装置を動作させたときの第１蛍光検出装置からの信号出力と時刻との関係を示す図である。 本発明の実施例を説明するための図である。 実施例１において、蛍光点間距離を４ｍｍとしたときの第１蛍光検出装置から出力された蛍光信号を示す図である。 実施例１におけるＰＣＲの増幅結果を示す図である。 比較例において第１蛍光検出装置から出力された蛍光信号を示す図である。 比較例におけるＰＣＲの増幅結果を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る反応処理装置を説明するための図である。

以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。

図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図である。

図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、反応処理容器１０は、基板１４と、流路封止フィルム１６とから成る。

基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリプロピレン、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７５ｍｍ、短辺２５ｍｍ、厚み４ｍｍである。

基板１４の下面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている。基板１４の下面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１４における流路１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１７が形成されている。基板１４における流路１２の他端の位置には、第２連通口１８が形成されている。流路１２の両端に形成された一対の第１連通口１７および第２連通口１８は、基板１４の上面１４ｂに露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。

図１（ｂ）に示すように、基板１４の下面１４ａ上には、流路封止フィルム１６が貼られている。実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の下面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の下面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。

流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性や接着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の下面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。

流路１２は、後述する反応処理装置により複数水準の温度の制御が可能な反応領域を備える。複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。

図１（ａ）および図１（ｂ）に示す流路１２の反応領域は、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路を含んでいる。後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、流路１２の紙面右側が比較的高温（約９５℃）の領域（以下、「高温領域」と称する）となり、流路１２の左側がそれより低温（約６０℃）の領域（以下、「低温領域」と称する）となることが予定されている。また流路１２の反応領域は、高温領域と低温領域の間に両者を接続する接続領域を含む。この接続領域は、直線状の流路であってよい。

本実施形態のように高温領域および低温領域を蛇行状の流路とした場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置を小さくできるという利点がある。

サーマルサイクルに供される試料は、第１連通口１７および第２連通口１８のいずれか一方から流路１２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該連通口から適量の試料を直接導入してもよい。あるいは、多孔質のＰＴＦＥやポリエチレンからなるフィルタが内蔵してあるコーン形状のニードルチップを介してコンタミネーションを防止しながらの導入方法であってもよい。このようなニードルチップは一般的に数多くの種類のものが販売され容易に入手でき、ピペットやスポイト、シリンジ等の先端に取り付けて使用することが可能である。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して推すことにより流路の所定の場所まで試料を移動させてもよい。

試料としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光色素、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマー、さらに、場合によってはＴａｑＭａｎ等の蛍光プローブを混合する（ＴａｑＭａｎ／タックマンはロシュ ダイアグノスティックスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの登録商標）。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。

図２は、本発明の実施形態に係る反応処理装置３０を説明するための模式図である。

本実施形態に係る反応処理装置３０は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム３２と、ＣＰＵ３６とを備える。温度制御システム３２は、図２に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における紙面右側の領域を約９５℃（高温領域）、紙面左側の領域を約６０℃（低温領域）に精度よく維持、制御できるように構成されている。

温度制御システム３２は、反応領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域を加熱するための高温用ヒータ６０と、流路１２の低温領域を加熱するための低温用ヒータ６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ３３と、低温用ヒータ６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ３６に送られる。ＣＰＵ３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。

本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、反応処理容器１０の流路１２内に導入された試料２０を流路１２内で移動させるための送液システム３７を備える。送液システム３７は、第１ポンプ３９と、第２ポンプ４０と、第１ポンプ３９を駆動するための第１ポンプドライバ４１と、第２ポンプ４０を駆動するための第２ポンプドライバ４２と、第１チューブ４３と、第２チューブ４４とを備える。

反応処理容器１０の第１連通口１７には、第１チューブ４３の一端が接続される。第１連通口１７と第１チューブ４３の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４５やシールが配置されることが好ましい。第１チューブ４３の他端は、第１ポンプ３９の出力に接続される。同様に、反応処理容器１０の第２連通口１８には、第２チューブ４４の一端が接続される。第２連通口１８と第２チューブ４４の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４６やシールが配置されることが好ましい。第２チューブ４４の他端は、第２ポンプ４０の出力に接続される。

第１ポンプ３９、第２ポンプ４０は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。

ＣＰＵ３６は、第１ポンプドライバ４１、第２ポンプドライバ４２を介して、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧を制御する。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧は、第１連通口１７、第２連通口１８を通じて流路内の試料２０に作用し、推進力となって試料２０を移動させる。より詳細には、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることにより、試料２０のいずれかの端面にかかる圧力が他端にかかる圧力より大きくなるため、試料２０の移動に係る推進力が得られる。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることによって、試料２０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域を通過させることができ、その結果、試料２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域において変性、低温領域においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域は変性温度域、低温領域はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料２０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。

本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、第１蛍光検出装置５０および第２蛍光検出装置５４を備える。上述したように、試料２０には所定の蛍光色素が添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料２０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。

第１蛍光検出装置５０および第２蛍光検出装置５４としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適している。

第１蛍光検出装置５０は、第１光学ヘッド５１と、第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２と、第１光学ヘッド５１と第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２とを接続する光ファイバＦ１２とを備える。同様に、第２蛍光検出装置５４は、第２光学ヘッド５５と、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６と、第２光学ヘッド５５と第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６とを接続する光ファイバＦ２２とを備える。

第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６にはそれぞれ、励起光用光源、波長合分波器、蛍光検出器、これらを制御するためのドライバ等が含まれている。第１光学ヘッド５１、第２光学ヘッド５５はそれぞれ、レンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。第１光学ヘッド５１、第２光学ヘッド５５で集光された蛍光はそれぞれ、光ファイバＦ１２、Ｆ２２を通じて第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６内の波長合分波器により励起光と分けられ、蛍光検出器によって電気信号に変換される。蛍光検出装置の構成の詳細については後述する。

本実施形態に係る反応処理装置３０においては、高温領域と低温領域とを接続する接続領域内の一部の領域１２ａ（「第１蛍光検出領域１２ａ」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出することができるように第１光学ヘッド５１が配置される。また、接続領域内の別の一部の領域１２ｂ（「第２蛍光検出領域１２ｂ」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出することができるように第２光学ヘッド５５が配置される。試料２０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料２０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。

図３は、蛍光検出装置の構成を説明するための図である。図３では、第１蛍光検出装置５０の構成を説明するが、第２蛍光検出装置５４もバンドパスフィルタの中心波長が異なる点を除き、同じ構成である。

図３に示すように、第１蛍光検出装置５０は、第１光学ヘッド５１と、第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２と、第１光学ヘッド５１と第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２とを接続する光ファイバＦ１２とを備える。第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２は、第１励起光源６４と、第１波長合分波器６５と、第１蛍光検出器６６とを備え、これらの機能性要素は光ファイバで接続されており、励起光および蛍光は光ファイバ内を伝搬する。

第１励起光源６４の近傍には、第１励起光源６４から出射された励起光が透過するようにバンドパスフィルタＡ１が配置される。第１波長合分波器６５は、バンドパスフィルタＢ１を有している。第１蛍光検出器６６の近傍には、第１蛍光検出器６６に入射する蛍光が透過するようにバンドパスフィルタＣ１が配置される。これらのバンドパスフィルタの波長特性は、例えばＦＡＭなどの蛍光色素の励起／蛍光に関わる波長特性に応じて設計される。それぞれのバンドパスフィルタは、特定の波長の範囲の光を高い効率で透過（例えば透過率７５％以上）させ、それ以外の波長の光を高い効率で反射させる（例えば反射率が７５％以上；望ましくは８５％以上）分光機能を有する。

本実施形態において第１蛍光検出装置５０は、ＦＡＭを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。

第１励起光源６４は、後に目的の波長の光を分光することができる光源であれば特に限定されず、例えばＬＤやＬＥＤ、白色光源などを用いることができる。第１励起光源６４から出射した励起光は、バンドパスフィルタＡ１によって分光され、中心波長を約４７０ｎｍとする所定の範囲の波長の光（以下「励起光ＯＥ１」と称する）のみが光ファイバＦ１１内を伝搬する。

励起光ＯＥ１は、第１波長合分波器６５に入射し、レンズＬ１によってコリメートされたのちにバンドパスフィルタＢ１に到達する。バンドパスフィルタＢ１は励起光ＯＥ１を反射するように設計されているので、励起光ＯＥ１はレンズＬ１によって再び集光され、光ファイバＦ１２に入射する。励起光ＯＥ１は光ファイバＦ１２内を伝搬し、第１光学ヘッド５１に到達する。第１光学ヘッド５１内には対物レンズＯＢ１が備えられており、励起光ＯＥ１は所定の作動距離で試料２０に励起光として照射される。

励起光ＯＥ１が試料２０に照射されると、試料２０内の蛍光色素が励起され、試料２０から蛍光ＯＦ１が出射される。蛍光ＯＦ１は第１光学ヘッド５１の対物レンズＯＢ１によって集光され、光ファイバＦ１２に入射し、光ファイバＦ１２内を伝搬する。蛍光ＯＦ１は、第１波長合分波器６５に入射し、レンズＬ１によってコリメートされたのちにバンドパスフィルタＢ１に到達する。

一般的に、励起光の照射により生じる蛍光の波長は、励起光の波長よりも長くなる。すなわち、励起光の中心波長をλｅとし、蛍光の中心波長をλｆとすると、λｅ＜λｆである。そこで、蛍光ＯＦ１のみを第１蛍光検出器６６に導くために、バンドパスフィルタＢ１として、波長λｅの光を反射し、波長λｆの光を透過させるようなスペクトル特性を有するものを用いる。バンドパスフィルタＢ１は、蛍光ＯＦ１のうち励起光ＯＥ１の波長と重ならない範囲の波長の光を透過するように設計されている。バンドパスフィルタＢ１を通過した蛍光ＯＦ１は、レンズＬ２によって集光され光ファイバＦ１３に入射する。また、バンドパスフィルタＢ１は、励起光を反射し蛍光を透過させる機能を有するので、それらの中心波長に対応して、λｅを含む波長範囲の光を反射しλｆを含む波長範囲の光を透過させることのできるエッジフィルタをバンドパスフィルタの代わりに使用することができる。

光ファイバＦ１３内を伝搬した蛍光ＯＦ１は、第１蛍光検出器６６に到達する。波長域を厳密に調整するために、蛍光ＯＦ１は第１蛍光検出器６６に入射する前にバンドパスフィルタＣ１を通過してもよい。第１蛍光検出器６６には、バンドパスフィルタＢ１とＣ１を通過した、中心波長を約５３０ｎｍとする所定の範囲の波長の光のみが入射する。第１蛍光検出器６６は、例えばＰＤやＡＰＤ、フォトマル（フォトマルチプライヤー）などの光電変換素子である。第１蛍光検出器６６によって電気的信号に変換された信号は、後述の信号処理がなされる。

図３に示す第１蛍光検出装置５０において、各要素は、光を効率よく伝送や結合をさせたり、バンドパスフィルタの利用効率を向上させるためのレンズを含んでもよい。レンズとしては屈折率分布レンズ、ボールレンズや非球面レンズなどを用いることができる。また、図３に示す第１蛍光検出装置５０において、光ファイバＦ１１、Ｆ１２およびＦ１３はシングルモードファイバまたはマルチモードファイバなどを用いることができる。

上記のように構成された第１蛍光検出装置５０は、中心波長が４７０ｎｍであり波長範囲が約４５０～４９０ｎｍの光を第１励起光ＯＥ１として試料に照射し、試料から発せられた、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍである第１蛍光ＯＦ１を検出する。波長に関する特性は、上記のように各バンドパスフィルタの透過または反射特性の組み合わせによって決定され、それらの変更やカスタマイズも可能であることは当業者が理解できるところである。

一方、本実施形態において第２蛍光検出装置５４は、ＲＯＸを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。第２蛍光検出装置５４は、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍの光を第２励起光ＯＥ２として試料に照射し、中心波長が６１０ｎｍであり波長範囲が約５８０～６４０ｎｍである第２蛍光ＯＦ２を検出する。

図４は、第１蛍光検出装置５０の第１光学ヘッド５１と第２蛍光検出装置５４の第２光学ヘッド５５が配置された状態を示す。第１光学ヘッド５１は、流路１２の第１蛍光検出領域１２ａを通過する試料２０から蛍光を検出できるように配置される。第２光学ヘッド５５は、流路１２の第２蛍光検出領域１２ｂを通過する試料２０から蛍光を検出できるように配置される。また、第１蛍光検出装置５０の第１光学ヘッド５１と、第２蛍光検出装置５４の第２光学ヘッド５５のいずれかが接続領域の中間もしくは低温領域と高温領域との中間付近に配置されてもよい。

図４に示すように、第１光学ヘッド５１は、光ファイバＦ１２内を伝搬した第１励起光ＯＥ１を対物レンズＯＢ１で集光して第１蛍光検出領域１２ａを通過する試料２０に照射し、試料２０から発生した第１蛍光ＯＦ１を対物レンズＯＢ１で集光して光ファイバＦ１２に入射させる。同様に、第２光学ヘッド５５は、光ファイバＦ２２内を伝搬した第２励起光ＯＥ２を対物レンズＯＢ２で集光して第２蛍光検出領域１２ｂを通過する試料２０に照射し、試料２０から発生した第２蛍光ＯＦ２を対物レンズＯＢ２で集光して光ファイバＦ２２に入射させる。

第１光学ヘッド５１、第２光学ヘッド５５の径は例えば１～４ｍｍであり、第１光学ヘッド５１と第２光学ヘッド５５はそれ以上の任意の間隔で配置される。ここでは、第１光学ヘッド５１から第１励起光ＯＥ１が照射される第１蛍光検出領域１２ａの中心と、第２光学ヘッド５５から第２励起光ＯＥ２が照射される第２蛍光検出領域１２ｂの中心との間の距離を「蛍光点間距離ｔｐ」と称する。

対物レンズＯＢ１、ＯＢ２としては、パワーが正のレンズまたはレンズ群、例えば屈折率分布レンズであるセルフォック（登録商標）マイクロレンズを使用することができる。対物レンズＯＢ１、ＯＢ２は、例えば直径が１．８ｍｍ、開口数（ＮＡ）が０．２３、ＷＤが１ｍｍ～３ｍｍのものを使用できる。

本実施形態において、第１蛍光検出装置５０の第１励起光源は、第１変調信号によって変調され、点滅発光する。同様に、第２蛍光検出装置５４の第２励起光源は、第２変調信号によって変調され、点滅発光する。

図５は、蛍光検出器からの蛍光信号を処理するロックインアンプの回路構成を説明するための図である。

本実施形態において、第１蛍光検出装置５０の第１蛍光検出器６６からの第１蛍光信号は、第１ロックインアンプ６８によって処理される。第１ロックインアンプ６８は、ＩＶアンプ７０と、ハイパスフィルタ８０と、反転・非反転アンプ８１と、ローパスフィルタ８２とを備える。第１蛍光検出器６６から出力された第１蛍光信号は、ＩＶアンプ７０で適切に増幅されたのち、ハイパスフィルタ（ＨＰＦ）８０でＤＣ成分を除去される。この信号は、さらに反転・非反転アンプ８１により第１変調信号と同期検波されて直流化される。直流化された信号は、次にローパスフィルタ（ＬＰＦ）８２でノイズを除去され、最終的に第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力が得られる。

第２蛍光検出装置５４の第２蛍光検出器６７からの第２蛍光信号は、第２ロックインアンプ６９によって処理される。第２ロックインアンプ６９の構成は第１ロックインアンプ６８と同様であり、第２蛍光検出器６７からの第２蛍光信号を第２ロックインアンプ６９で処理することにより、最終的に第２蛍光検出装置５４に係る第２信号出力が得られる。

本実施形態では、一本の流路１２を通過する試料２０を検出するために、第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５が並んで配置される。上述したように、第１蛍光検出装置５０は、中心波長が４７０ｎｍであり波長範囲が約４５０～４９０ｎｍの第１励起光ＯＥ１を照射し、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍである第１蛍光ＯＦ１を検出する。また、第２蛍光検出装置５４は、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍの第２励起光ＯＥ２を照射し、中心波長が６１０ｎｍであり波長範囲が約５８０～６４０ｎｍである第２蛍光ＯＦ２を検出する。したがって、第２励起光ＯＥ２の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）と、第１蛍光ＯＦ１の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）は、重複している。この場合、第２光学ヘッド５５から照射された第２励起光ＯＥ２の一部が第１光学ヘッド５１で検出されると、この第２励起光ＯＥ２は第１光学ヘッド５１の後段のバンドパスフィルタＢ１、Ｃ１では除去されず、第１蛍光検出器６６に到達する虞がある。この第２励起光ＯＥ２は第１蛍光検出器６６においてはノイズであり、本来検出すべき第１蛍光ＯＦ１を検出できない虞がある。

第１光学ヘッド５１と第２光学ヘッド５５を十分離間して配置すればこのような問題は生じないが、この場合は反応処理装置３０のサイズが大型化する。本発明者は、このような背反する課題を解決すべく、２つの光学ヘッドを並べて配置した場合に蛍光の検出にどのような影響が生じるかを鋭意検討および調査した。

本発明者は、第１蛍光検出装置５０に係る第１変調信号（第１励起光源の変調信号）と、第２蛍光検出装置５４に係る第２変調信号（第２励起光源の変調信号）の位相差、言い換えると、第１励起光と第２励起光の点滅の位相差が、試料からの蛍光の検出にどのような影響を及ぼすかを実際に調べた。実験の条件を以下に示す。

（１）第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５は、図４に示すように、流路１２中の試料２０からの蛍光を集光できるように並べて配置した。第１蛍光検出領域１２ａの中心と第２蛍光検出領域１２ｂの中心との間の距離である蛍光点間距離ｔｐは４．５ｍｍとした。
（２）パルスジェネレータ等により第１変調周波数（１１０Ｈｚ）の第１変調信号を発生させ、該第１変調信号を用いて第１励起光源からの第１励起光を変調させた。同様に、第２変調周波数（１１０Ｈｚ）の第２変調信号を発生させ、該第２変調信号を用いて第２励起光源からの第２励起光を変調させた。第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比はともに５０％とした。
（３）第１変調信号による変調と第２変調信号による変調との位相差Δφを変化させ、第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力を計測した。
なお、本実施例では、蛍光信号に対して位相差のみの依存性を検出するので、サーマルサイクルは行っていない。

図６は、第１変調信号と第２変調信号の位相差を変化させたときの、第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力の計測結果を示す。図６において、黒丸のプロットは、試料としてＦＡＭ水溶液を用いた場合の計測結果を示す（「ＦＡＭ水溶液」と表示）。反応処理容器１０の流路１２中にＦＡＭ水溶液（濃度３０ｎＭ）を配置し、第１変調信号と第２変調信号の位相差Δφを０°から３６０°まで変化させ、第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力を計測した。また、図６において、白丸のプロットは、反応処理容器１０の流路１２中に何も入れない状態（すなわちブランク状態）において第１信号出力を計測した結果を示す（「ブランク」と表示）。

図６から分かるように、「ＦＡＭ水溶液」と「ブランク」の場合共に、位相差Δφの変化に応じて第１信号出力も変化し、位相差Δφが０°および３６０°（すなわち位相差が無い）ときに第１信号出力が最大となり、位相差Δφが１８０°のときに第１信号出力が最小となる。

試料としてのＦＡＭ水溶液から出射される蛍光信号に基づく信号出力は、図６に示す「ＦＡＭ水溶液」のときの第１信号出力の値から、「ブランク」のときの第１信号出力の値を差し引いたものとなる。この演算により、正味のＦＡＭ水溶液からの蛍光信号に基づく信号出力を求めることができる。この信号出力と位相差Δφ［°］との関係を図７に黒四角のプロット（ＦＡＭ水溶液（ブランク除く）と表示）で示す。

図７から、第１励起光源の第１変調信号と第２励起光源の第２変調信号との位相差Δφの値によって、正味のＦＡＭ水溶液からの蛍光信号に基づく信号強度が変動することがわかる。これは、第２励起光が第１蛍光検出装置５０の蛍光検出に影響を及ぼしていること、さらにその影響度が位相差Δφによって異なることを意味している。

次に、第２励起光源を停止させたうえで、「ブランク」と「ＦＡＭ水溶液」について、第１信号出力の強度を計測して両者の差をとり、正味のＦＡＭ水溶液からの蛍光信号に基づく信号強度を求めた。この場合は第２励起光源を停止しているので位相差Δφの観念はなく、第１信号出力は一定（４．０）であった。この値は、ブランクを除いたＦＡＭ水溶液からの蛍光信号に基づき、且つ他の励起光／蛍光検出系に影響されない値である。この値を図７に実線で示す（「正味信号ｓ」と表示）。

ここで、「ＦＡＭ水溶液（ブランク除く）」の値から、「正味信号ｓ」の値を差し引いたものの絶対値は、ノイズに相当する。このノイズ（Ｎ'）と位相差Δφ［°］との関係を図８に示す。図８から、第２蛍光検出装置５４に係る第２励起光の存在下においても、位相差Δφが９０°及び２７０°のときには、第１蛍光検出装置５０に係る第１蛍光検出器６６から第１ロックインアンプ６８を通じて得られる蛍光信号のノイズが最小となることが分かる。

図９は、第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比がともに３０％のときの、ノイズと位相差との関係を示す。図１０は、第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比がともに４０％のときの、ノイズと位相差との関係を示す。図９と図１０のいずれにおいても、蛍光点間距離ｔｐは４．５ｍｍとした。図９に示すように、Ｄｕｔｙ比が３０％のときのノイズＮ'が最小となる位相差Δφは、約７６°及び約２８４°であった。また図１０に示すように、Ｄｕｔｙ比が４０％のときのノイズＮ'が最小となる位相差Δφは、約８６°及び約２７４°であった。

以上の実験結果から、第１変調信号と第２変調信号のＤｕｔｙ比の違いによって、ノイズＮ'が最小となる最適な位相差が変わることが分かる。このことは、以下の考察から導き出される通り、数式を用いて表すことができる。

図１１（ａ）～（ｄ）は、２つの蛍光検出装置のうち一方を停止させたときのロックインアンプの動作を説明するための図である。ここでは、第１蛍光検出装置５０と第２蛍光検出装置５４のうち第２蛍光検出装置５４を停止させ（第２励起光源を点滅発光させないで）、第１蛍光検出装置５０の第１蛍光検出器６６が受光した信号を第１ロックインアンプ６８で処理する場合を考える。第２蛍光検出装置５４を停止させているので、第１蛍光検出装置５０で検出すべき第１蛍光信号は第２蛍光検出装置５４の第２励起光の影響を受けない。

図５に示す第１ロックインアンプ６８において、ＩＶアンプ７０を通過後の出力をＶ^１ _１とし、ハイパスフィルタ８０を通過後の出力をＶ^１ _２とし、反転・非反転アンプ８１を通過後の出力をＶ^１ _４ａとし、ローパスフィルタ８２を通過後の出力をＶ^１ _４とする。なお、以降の説明も含めてロックインアンプの説明における、Ｖを含む出力に係る記号は、電圧（Ｖｏｌｔ）に準じた任意単位である。

図１１（ａ）は、ＩＶアンプ通過後の出力Ｖ^１ _１を示す。図１１（ｂ）は、ハイパスフィルタ通過後の出力Ｖ^１ _２を示す。図１１（ｃ）は、反転・非反転アンプ通過後の出力Ｖ^１ _４ａを示す。図１１（ｄ）は、ローパスフィルタ通過後の出力Ｖ^１ _４を示す。図１１（ａ）～（ｄ）において、横軸は位相を表し、縦軸は信号出力を表す。いわゆる１周期は３６０°または２πｒａｄである。任意の位相φ［°］はφ×π／１８０［ｒａｄ］の関係がある。ここでは、計算のし易さを考慮して位相を主としてｒａｄ（ラジアン）で表す。

ここでは、簡単のために、ＩＶアンプ通過後の出力Ｖ^１ _１が図１１（ａ）に示すような矩形信号である場合を考える。Ｖ^１ _１は、一定の周波数のもとで、１周期のうち、区間αに対応する位相の領域において出力値１、区間βに対応する位相の領域において出力値が０である矩形信号である。この矩形信号のＤｕｔｙ比はｄ＝α／（α＋β）（０＜ｄ＜１）またはｄ＝α／２πで表される。なお、ここではＩＶアンプ通過後の出力Ｖ^１ _１のＤｕｔｙ比について述べているが、このＤｕｔｙ比は、同一の周波数のもとでオン／オフする第１励起光源６４から出射される第１励起光のＤｕｔｙ比と同じである。

図１１（ａ）に示すような矩形信号がハイパスフィルタ８０を通過すると、直流成分がカットされるので、図１１（ｂ）に示すような出力信号が得られる。図１１（ｂ）に示す信号が反転・非反転アンプ８１を通過すると、上記の区間βに対応する位相の領域に属する出力信号の符号が反転されるので、図１１（ｃ）に示すような出力信号が得られる。さらに図１１（ｃ）に示す信号がローパスフィルタ８２を通過すると、交流成分がカットされるので、図１１（ｄ）に示すような出力信号が得られる。ローパスフィルタ通過後の出力値Ｖ^１ _４は、Ｄｕｔｙ比ｄを用いて以下の（１）式のように表すことができる。
Ｖ^１ _４＝２・ｄ・（１－ｄ） ・・・（１）

図１２（ａ）～（ｆ）は、２つの蛍光検出装置を両方とも作動させたときのロックインアンプの動作を説明するための図である。ここでは、第１蛍光検出装置５０と第２蛍光検出装置５４を作動させ、第１蛍光検出装置５０の第１蛍光検出器６６が受光した信号を第１ロックインアンプ６８で処理する場合を考える。第２蛍光検出装置５４を作動させているので、第１蛍光検出装置５０で検出すべき第１蛍光信号は第２蛍光検出装置５４の第２励起光の影響を受ける。

図１２（ａ）は、第２蛍光検出装置５４に係る第２励起光の影響がない場合の第１ロックインアンプ６８のＩＶアンプ７０通過後の出力Ｖ^１ _１を示す。ここでも、図１１（ａ）と同様に、一定の周波数のもとで、１周期のうち、区間αに対応する位相の領域において出力値１、区間βに対応する位相の領域において出力値が０である矩形信号であり、図１１（ａ）と同じＤｕｔｙ比ｄを有する矩形信号を考える。

図１２（ｂ）は、第２蛍光検出装置５４に係る第２励起光に由来する光が第１蛍光検出器６６で受光され、第１ロックインアンプ６８のＩＶアンプ７０を通過後の信号を示す。この信号は、Ｖ^１ _１と同じ周波数のもとで、１周期のうち、区間αに対応する位相の領域において出力値ａ（０＜ａ＜１）、区間βに対応する位相の領域において出力値が０である矩形信号とした。この信号は、Ｖ^１ _１と同じＤｕｔｙ比ｄを有する。但し、第２励起光に由来する信号は、図１２（ａ）に示す出力信号Ｖ^１ _１よりも２πｐ［ｒａｄ］（ｐはパラメータであり、０＜ｐ＜１とする）だけ遅延しているものとする。上述のΔφ［°］で表される位相差と、２πｐ［ｒａｄ］で表した位相差との間には、Δφ＝３６０×ｐの関係がある。

図１２（ｃ）は、実際にＩＶアンプ７０から出力される出力Ｖ^１ _１を示す。これは、図１２（ａ）に示す出力信号と図１２（ｂ）に示す出力信号の和である。

図１２（ｄ）は、ハイパスフィルタ８０を通過後の出力Ｖ^１ _２を示す。ハイパスフィルタ８０の通過による直流成分のカットに伴うバイアスを（－ｘ）と仮定した。
出力と位相で囲まれた領域の面積のうち、０を境にして正側と負側との領域の面積が等しいことから、以下の（２）式が成り立つ。
（１－ｘ）・ｐ＋（１＋ａ－ｘ）・（ｄ－ｐ）＋（ａ－ｘ）・ｐ＋（－ｘ）・｛１－（ｄ＋ｐ）｝＝０から、
ｘ＝（１＋ａ）・ｄ ・・・（２）

図１２（ｅ）は、反転・非反転アンプ８１を通過後の出力Ｖ^１ _４ａを示す。図１２（ｆ）は、ローパスフィルタ８２を通過後の出力Ｖ^１ _４を示す。図１２（ｄ）に示す信号が反転・非反転アンプ８１を通過すると、第１蛍光検出装置に係る区間βに対応する位相の領域に属する出力信号の符号が反転されるので、図１２（ｅ）に示すような出力信号が得られる。さらに図１２（ｅ）に示す信号がローパスフィルタ８２を通過すると、交流成分がカットされるので、図１２（ｆ）に示すような出力信号が得られる。

（２）式の関係を考慮して、ローパスフィルタ８２を通過後の出力（すなわち第１信号出力）Ｖ^１ _４を表すと以下の（３）式のようになる。
Ｖ^１ _４＝－２・（１＋ａ）・ｄ^２＋２・（１＋ａ）・ｄ－２・ａ・ｐ ・・・（３）

以上の考察から、第１信号出力において、（３）式から（１）式を差し引いた分（の絶対値）が、ノイズとして第１信号出力に重畳することになるので、ノイズ成分Ｖ^１ _Ｎの値は以下の（４）式のように表される。
Ｖ^１ _Ｎ＝｜－２・ａ・（ｄ^２－ｄ＋ｐ）｜ ・・・（４）

（４）式において、ｄ^２－ｄ＋ｐ＝０のとき、Ｖ^１ _Ｎが最小（０）となるので、このときのパラメータｐの値ｐ_ｍは以下の（５）式で表される。
ｐ_ｍ＝ｄ－ｄ^２ ・・・（５）

この（５）式から、Ｄｕｔｙ比が、０．５（５０％）、０．４（４０％）及び０．３（３０％）のときのｐ_ｍの値は、それぞれ０．２５、０．２４および０．２１と算出できる。さらに、これらのｐ_ｍに対応したノイズ成分Ｖ^１ _Ｎを最小にする最適な位相差は、０．５πｒａｄ、０．４８πｒａｄおよび０．４２πｒａｄと求めることができる。また、度（°）を単位とした表記では、Δφ_ｍ＝９０．０°、Δφ_ｍ＝８６．４°およびΔφ_ｍ＝７５．６°と求めることができる。上述の実験結果とほぼ一致しており、実験結果の妥当性が確認された。また、上述の実験結果と照らし合わせると、位相差が２π（１－ｐ_ｍ）［ｒａｄ］およびΔφ_ｍ＝３６０（１－ｐ_ｍ）［°］のときにもノイズ成分Ｖ^１ _Ｎが最小となることが理解できる。

このように、本実施形態に係る反応処理装置３０においては、第１光学ヘッド５１から照射される第１励起光と、第２光学ヘッド５５から照射される第２励起光の点滅の位相差を、（５）式で設定されるｐ_ｍを用いて２πｐ_ｍ［ｒａｄ］又は２π（１－ｐ_ｍ）［ｒａｄ］（度（°）を単位とした表記では３６０ｐ_ｍ［°］又は３６０（１－ｐ_ｍ）［°］）とすることにより、第１蛍光検出装置５０と第２蛍光検出装置５４との間の干渉を抑制することができる。

図１３は、上記のノイズの表記Ｖ^１ _ＮをＮ'とし、ノイズＮ'の信号出力の最小値に対応するｐ_ｍにおける許容幅Δｐ_ｍの決め方を説明するための図である。図１３は、ノイズＮ'の信号出力と位相差２πｐ［ｒａｄ］との関係を表している。

位相差２πｐが０ｒａｄのときのノイズＮ'をＮ_０'とし、ノイズＮ'の許容値をＮ_ｍ'とし、第２蛍光検出装置５４が作動していない場合の第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力をＶ^１ _０としたとき、パラメータｐのｐ_ｍにおける許容幅Δｐ_ｍは上記の（５）式を考慮して、以下の（６）式で表される。
Δｐ_ｍ＝（Ｎ_ｍ'）・（ｄ－ｄ^２）／（Ｎ_０'）＝（Ｎ_ｍ'／Ｖ^１ _０）・（ｄ－ｄ^２）／｛（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝ ・・・（６）

第２蛍光検出装置５４が作動していない場合の第１蛍光検出装置５０に係る第１信号出力Ｖ^１ _０に対するＮ_ｍ'の比は０．０５（５％）であることが求められるので、許容幅Δｐ_ｍは以下の（７）式で求められる値に設定される。
Δｐ_ｍ＝（ｄ－ｄ^２）／｛２０・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝ ・・・（７）

例えば、Ｖ^１ _０＝４であり、Ｎ_０'＝５０程度が求められるとき、蛍光検出装置のＤｕｔｙが０．４であるとすると、ｐ_ｍ＝０．２４であり、位相差２πｐ_ｍ＝０．４８πｒａｄ（８６．４°）である。（７）式からΔｐ_ｍ＝０．０００９６となり、位相差の許容幅は、０．００１９２πｒａｄ（０．３５°）と求められるので、適切な位相差の範囲は、０．４８π±０．００１９２π［ｒａｄ］（８６．４±０．３５［°］）とすることができ、さらに１．５２π±０．００１９２π［ｒａｄ］（２７３．６±０．３５［°］）とすることができる。

また、第１信号出力Ｖ^１ _０に対するＮ_ｍ'の比は、０．０３（３％）であることがより望ましいので、許容幅Δｐ_ｍは以下の（８）式で求められる値に設定される。同様にＶ^１ _０＝４、Ｎ_０'＝５０及びｄ＝０．４であるとすると、Δｐ_ｍ＝０．０００５８となり、位相差の許容幅が０．００１１６πｒａｄ（０．２１°）と求められるので、適切な位相差の範囲は、０．４８π±０．００１１６π［ｒａｄ］（８６．４±０．２１［°］）とすることができ、さらに１．５２π±０．００１１６π［ｒａｄ］（２７３．６±０．２１［°］）とすることができる。
Δｐ_ｍ＝３・（ｄ－ｄ^２）／｛１００・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝ ・・・（８）

加えて、第１信号出力Ｖ^１ _０に対するＮ_ｍ'の比が０．０１（１％）であることがさらに望ましいので、許容幅Δｐ_ｍは以下の（９）式で求められる値に設定される。同様にＶ^１ _０＝４、Ｎ_０'＝５０及びｄ＝０．４であるとすると、Δｐ_ｍ＝０．０００１９となり、位相差の許容幅が０．０００３８πｒａｄ（０．０７°）と求められるので、適切な位相差の範囲は、０．４８π±０．０００３８π［ｒａｄ］（８６．４±０．０７［°］）とすることができ、さらに１．５２π±０．０００３８π［ｒａｄ］（２７３．６±０．０７［°］）とすることができる。
Δｐ_ｍ＝（ｄ－ｄ^２）／｛１００・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝ ・・・（９）

以上の検討結果から、望ましい位相差の範囲は、ｒａｄ（ラジアン）を単位とする表記で２π（ｐ_ｍ－Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］～２π（ｐ_ｍ＋Δｐ_ｍ）［ｒａｄ］または２π｛（１－ｐ_ｍ）－Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］～２π｛（１－ｐ_ｍ）＋Δｐ_ｍ｝［ｒａｄ］であり、度（°）を単位とする表記で３６０（ｐ_ｍ－Δｐ_ｍ）［°］～３６０（ｐ_ｍ＋Δｐ_ｍ）［°］または３６０｛（１－ｐ_ｍ）－Δｐ_ｍ｝［°］～３６０｛（１－ｐ_ｍ）＋Δｐ_ｍ｝［°］と一般的に記載することができる。ただし、ｄをＤｕｔｙ比として、ｐ_ｍ＝ｄ－ｄ^２であり、Δｐ_ｍ＝（ｄ－ｄ^２）／｛２０・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝であり、より望ましくはΔｐ_ｍ＝３・（ｄ－ｄ^２）／｛１００・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝であり、さらに望ましくは Δｐ_ｍ＝（ｄ－ｄ^２）／｛１００・（Ｎ_０'）／Ｖ^１ _０｝である。

一方で、Δｐ_ｍは、ｐ_ｍとの関係から、Δｐ_ｍ＝０．０１×ｐ_ｍとしてもよい。このようにΔｐ_ｍを、一義的にｐ_ｍの１％と設定してもよい。

下記の実験および考察から、ノイズが最小になるように、第１蛍光検出装置５０に係る第１励起光および第２蛍光検出装置５４に係る第２励起光の点滅の位相差を設定したとしても、試料が蛍光検出領域を通過した際に蛍光検出器で検出された蛍光信号をロックインアンプで処理した信号にノイズが生じることが分かる。

図１４および図１５は、図２に示す反応処理装置３０において、試料を流路１２内で移動させて、所定の蛍光検出領域を通過させたときの第１蛍光検出装置５０からの信号出力と時刻との関係を示す。図１４は、第２蛍光検出装置５４を停止させて（すなわち、第２励起光源を点滅させずに）、試料を流路１２内で移動させたときの第１蛍光検出装置５０からの蛍光信号出力を表したものである。一方、図１５は、第２蛍光検出装置５４を作動させて（すなわち、第２励起光源を点滅させて）、試料を流路１２内で移動させたときの第１蛍光検出装置５０からの蛍光信号出力を表したものである。

第１励起光および第２励起光は、いずれも同一周波数（１１０Ｈｚ）且つ同一Ｄｕｔｙ比０．５（５０％）で点滅させ、それらの位相差Δφを０．５πｒａｄ（９０．０°）とした。さらにそれぞれの励起光と蛍光検出器は、流路１２中の試料からの蛍光強度が最大になるように独立して流路に対して配置を定めた。

まず、試料の蛍光検出領域の通過時の蛍光信号の挙動に関して、図１４を参照して説明する。図１４に示す蛍光信号の強度は、時刻とともにベースラインを推移し、ある一定の時刻（１１×１／１０秒）において立ち上がっている。この時刻において試料は第１蛍光検出領域１２ａに侵入したと考えることができる。さらに蛍光信号は時刻とともに略一定値（任意強度で略１４）を推移している。これは、流路１２内で一定の長さを有する試料が、第１蛍光検出領域１２ａを通過している時間に対応していると考えることができる。その後、ある時刻において蛍光信号は再びベースラインに立ち下がる。この時刻（１８×１／１０秒）において試料は第１蛍光検出領域１２ａから脱したと考えることができる。その後、蛍光信号はベースラインを推移している。

上記の説明は、試料が第１蛍光検出領域１２ａを一回だけ通過したときの蛍光信号の挙動である。ＰＣＲの場合には試料は繰り返し流路１２を往復移動し、あらかじめ設定された異なる水準の温度領域に対して繰り返してさらされること（すなわち、サーマルサイクル）により、試料に含まれる特定のＤＮＡ等が増幅される。

蛍光色素を含む試料の場合、所定のＤＮＡ等が増幅するとともに、試料から発せられる蛍光強度も増加する。そしてその増加する蛍光強度を、試料が蛍光検出領域を通過したときに得られる蛍光信号の最大値をモニタすることによって、所定のＤＮＡの増幅に伴うリアルタイムＰＣＲを実現することができる。

次に、試料の蛍光検出領域の通過時の蛍光信号の挙動に関して、図１５を参照して説明する。図１５に示す蛍光信号の挙動は、図１４に示す蛍光信号のそれとは異なる。図１５に示す蛍光信号は、立ち上がりの部分において大きくオーバーシュートしており、その後の時間における略一定の蛍光強度に比して高い蛍光強度となっている。このように蛍光信号に大きなオーバーシュートが生じると、蛍光信号がばらつくことになるため、正確な蛍光信号の強度をモニタすることが難しくなり、リアルタイムＰＣＲに支障をきたす虞がある。

以上のことから、複数の励起光／蛍光の組み合わせにおいて、いずれかの組み合わせに属する励起光に対応する波長範囲と、それ以外の組み合わせに属する蛍光に対応する波長範囲とが重なる場合は、ロックインの位相差を最適化しても、蛍光信号の検出に影響が生じることが示唆される。図１５に示す蛍光信号の挙動は、第１蛍光検出装置５０および第２蛍光検出装置５４に係る励起光の点滅位相差を最適なものにしても存在する可能性がある。

そこで本発明者は、このような蛍光信号のオーバーシュートを低減すべく鋭意考察、実験したところ、蛍光点間距離ｔｐにオーバーシュートの原因があることを突き止めた。具体的には、光学ヘッドの光学系の試料に対するＮＡが所定の範囲内にある場合、蛍光点間距離ｔｐが４ｍｍ以上であるときに、ノイズ値（Ｎｖ）が好適な０．２以下となることを見出した。

図１６は、本発明の実施例を説明するための図である。上述の実施形態と同様に、反応処理容器１０の流路１２中に配置された試料２０からの蛍光を検出できるように、第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５を並べて配置した。第１光学ヘッド５１は対物レンズＯＢ１を備え、第２光学ヘッド５５は対物レンズＯＢ２を備える。流路１２には第１蛍光検出領域１２ａおよび第２蛍光検出領域１２ｂが設定される。第１光学ヘッド５１は第１蛍光検出領域１２ａに位置する試料２０に励起光を照射し、蛍光を受光する。第２光学ヘッド５５は、第２蛍光検出領域１２ｂに位置する試料２０に励起光を照射し、蛍光を受光する。第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５から照射される励起光は、周波数を共に１１０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ比を共に０．５として点滅させた。第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５で受光された蛍光は、後段のロックインアンプ（図５参照）でロックイン処理を行って蛍光信号が出力されるようにした。さらに、第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５から照射される励起光の点滅は、その位相差が０．５πｒａｄ（９０．０°）となるようにそれぞれの位相を調整した。図１６に示すように、第１蛍光検出領域１２ａの中心と第２蛍光検出領域１２ｂの中心の間の距離が蛍光点間距離ｔｐである。

（実施例１）
実施例１では、第１光学ヘッド５１の対物レンズＯＢ１および第２光学ヘッド５５の対物レンズＯＢ２として、開口数（ＮＡ）が０．２３のものを用いた。第１蛍光検出装置は青励起／緑蛍光の組み合わせでＦＡＭに対応したもので、第２蛍光検出装置は緑励起／赤蛍光の組み合わせでＲＯＸに対応したものとした。

図１７は、実施例１において、蛍光点間距離ｔｐ＝４ｍｍとしたときの第１蛍光検出装置５０から出力された蛍光信号を示す。試料はＦＡＭ水溶液を用いた。図１７において、横軸は時刻［×１／１０秒］を表し、縦軸は蛍光強度［任意単位］を表す。図１７に示す蛍光信号においては、ピークが二個を一組として略一定時間毎に現れている。試料は流路１２を繰り返し往復移動する（ただし、試料の第１蛍光検出領域１２ａの通過時間は約０．５秒になるように移動速度を調整した）。従って、図１７の蛍光信号のように、往路と復路における蛍光強度の値が一組として現れる。

（実施例２）
実施例２では、第１光学ヘッド５１の対物レンズＯＢ１および第２光学ヘッド５５の対物レンズＯＢ２として、開口数（ＮＡ）が０．１８のものを用いた。
（実施例３）
実施例３では、第１光学ヘッド５１の対物レンズＯＢ１および第２光学ヘッド５５の対物レンズＯＢ２として、開口数（ＮＡ）が０．１２のものを用いた。
（実施例４）
実施例４では、第１光学ヘッド５１の対物レンズＯＢ１および第２光学ヘッド５５の対物レンズＯＢ２として、開口数（ＮＡ）が０．０７のものを用いた。

実施例１～４において、蛍光点間距離ｔｐを２．５ｍｍ、２．７５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍと変化させ、それぞれの蛍光点間距離ｔｐに関して第１蛍光検出装置５０から出力される蛍光信号を得た。試料の往復移動に応じて得られた蛍光強度のばらつきを評価するために、５０回の試料の往復移動によって得られた各ピークにおける蛍光強度の最大値の標準偏差をノイズ値Ｎｖとして算出して指標とした。

以下の表は、実施例１～４に関して得られた、蛍光点間距離ｔｐ［ｍｍ］とノイズ値Ｎｖとの関係をまとめたものである。

開口数（ＮＡ）が０．２３の実施例１に関しては、蛍光点間距離ｔｐが４ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．２未満となって良好な結果が得られた。開口数（ＮＡ）が０．１８の実施例２に関しては、蛍光点間距離ｔｐが４ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．２未満となって良好な結果が得られた。開口数（ＮＡ）が０．１２の実施例３に関しては、蛍光点間距離ｔｐが３．５ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．３未満となって良好な結果が得られ、蛍光点間距離ｔｐが４ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．２未満となってさらに良好な結果が得られた。開口数（ＮＡ）が０．０７の実施例４に関しては、蛍光点間距離ｔｐが２．５ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．３未満となって良好な結果が得られ、蛍光点間距離ｔｐが２．７５ｍｍ～５ｍｍの場合はノイズ値Ｎｖが０．２未満となってさらに良好な結果が得られた。これらの実験結果から、本発明者は、光学ヘッドの開口数ＮＡが０．０７～０．２３の範囲内にある場合、蛍光点間距離ｔｐが４ｍｍ以上であるときに、ノイズ値Ｎｖが好適な０．２以下となることを見出した。

本実施例の効果を確認するために、図２に示す反応処理装置３０を用いて、下記の表に示す試料について実際にＰＣＲを行い、リアルタイムで蛍光信号を測定した。ベロ毒素ＶＴ１の検出を企図し、KAPA Biosystems社のＰＣＲ酵素であるKAPA3G Plant PCRキットを使用し、以下の表に掲げる要領でＰＣＲ用試料を調整した。

ここでは、対物レンズの開口数ＮＡを０．２３とした実施例１に関してＰＣＲを行った。図１８は、実施例１におけるＰＣＲの増幅結果を示す。図１８において、横軸はサイクル数であり、縦軸は蛍光強度［任意単位］である。上述の反応処理装置３０を用いて、サイクル数に対する第１蛍光検出装置５０で検出される蛍光信号の強度を測定した。試料中の検体が増幅すると、蛍光強度が増加する。図１８に示すように、３０サイクル付近から蛍光強度が急激に立ち上がっている。このような蛍光強度の急激な立ち上がりは、試料中の検体が増幅していることを示しており、実施例１を用いた場合に良好なＰＣＲを行うことができることが分かる。

次に、比較例を示す。比較例では、蛍光点間距離ｔｐを３ｍｍとし、他の条件は実施例１（図１７参照）と同じにした。

図１９は、比較例において第１蛍光検出装置５０から出力された蛍光信号を示す。図１９に示す蛍光信号を図１７に示す実施例１の場合と比較すると、図１９に示す比較例では非常に大きなオーバーシュートが発生していることが分かる。

図２０は、比較例におけるＰＣＲの増幅結果を示す。図２０に示すＰＣＲの増幅結果を図１８に示す実施例１の場合と比較すると、図２０に示す比較例では蛍光強度のばらつきが非常に大きいことが分かる。このように蛍光強度のばらつきが大きい場合、蛍光強度の立ち上がりを検出することが難しくなるので、リアルタイムＰＣＲの精度が低下する虞がある。この比較例との比較から、本実施例の優位性が実証された。

図２１は、本発明の別の実施形態に係る反応処理装置１３０を説明するための図である。図２１に示す反応処理装置１３０は、３つの蛍光検出装置（第１蛍光検出装置１３１、第２蛍光検出装置１３２および第３蛍光検出装置１３３）を備える点が、図２に示す反応処理装置３０と異なる。図２１では、３つの蛍光検出装置および反応処理容器１０の一部のみ図示しており、他の構成の図示は省略されている。

第１蛍光検出装置１３１は、ＦＡＭを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。第１蛍光検出装置１３１は、第１光学ヘッド１３４を備え、中心波長が約４７０ｎｍであり波長範囲が約４５０～４９０ｎｍの第１励起光（青色光）を流路１２の第１蛍光検出領域１２ａに照射し、中心波長が約５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍである第１蛍光（緑色光）を検出する。

第２蛍光検出装置１３２は、ＲＯＸを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。第２蛍光検出装置１３２は、第２光学ヘッド１３５を備え、中心波長が約５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍの第２励起光（緑色光）を流路１２の第２蛍光検出領域１２ｂに照射し、中心波長が約６１０ｎｍであり波長範囲が約５８０～６４０ｎｍである第２蛍光（赤色光）を検出する。

第３蛍光検出装置１３３は、Ｃｙ５を蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。第３蛍光検出装置１３３は、第３光学ヘッド１３６を備え、中心波長が約６３０ｎｍであり波長範囲が約６１０～６５０ｎｍの第３励起光（赤色光）を流路１２の第３蛍光検出領域１２ｃに照射し、中心波長が約６９０ｎｍであり波長範囲が約６６０～７２０ｎｍの第３蛍光（赤外光）を検出する。

本実施形態に係る反応処理装置１３０は、３つの蛍光検出装置の光学ヘッドの配列順序に特徴がある。具体的には、低温領域側から、第２蛍光検出装置１３２に係る第２光学ヘッド１３５、第１蛍光検出装置１３１に係る第１光学ヘッド１３４、第３蛍光検出装置１３３に係る第３光学ヘッド１３６の順序で配列されている。言い換えると、中央に第１光学ヘッド１３４が配置され、第１光学ヘッド１３４の低温領域側に第２光学ヘッド１３５が配置され、第１光学ヘッド１３４の高温領域側に第３光学ヘッド１３６が配置されている。第２蛍光検出装置１３２と第３蛍光検出装置１３３の位置は逆であってもよい。すなわち、第１光学ヘッド１３４の低温領域側に第３光学ヘッド１３６が配置され、第１光学ヘッド１３４の高温領域側に第２光学ヘッド１３５が配置されていてもよい。

上述したように、蛍光検出装置間の干渉は、励起光の波長範囲と蛍光の波長範囲とが重複することによって生じる。従って、複数の光学ヘッドを並べて配置する場合、励起光の波長範囲と蛍光の波長範囲とが重複する光学ヘッド同士が隣接するような配置は避ける。例えば、仮に第２光学ヘッド１３５を中央に配置し、その両側に第１光学ヘッド１３４と第３光学ヘッド１３６を配置した場合、第２光学ヘッド１３５に係る第２励起光の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）と第１光学ヘッド１３４に係る第１蛍光の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）とが重複する。また、第２光学ヘッド１３５に係る第２蛍光の波長範囲（約５８０～６４０ｎｍ）と第３光学ヘッド１３６に係る第３蛍光の波長範囲（約６１０～６５０ｎｍ）とが一部重複する。この場合、第１蛍光検出装置１３１と第２蛍光検出装置１３２の間と、第２蛍光検出装置１３２と第３蛍光検出装置１３３の間で干渉が生じ易い。

一方、本実施形態のように、第１光学ヘッド１３４を中央に配置し、その両側に第２光学ヘッド１３５と第３光学ヘッド１３６を配置した場合、第２光学ヘッド１３５と第３光学ヘッド１３６が隔離されるので、第２蛍光検出装置１３２と第３蛍光検出装置１３３の間の干渉を生じ難くすることができる。

また、第３光学ヘッド１３６を中央に配置し、その両側に第１光学ヘッド１３４と第２光学ヘッド１３５を配置してもよい。この場合も第１光学ヘッド１３４と第２光学ヘッド１３５が隔離されるので、第１蛍光検出装置１３１と第２蛍光検出装置１３２の間の干渉を生じ難くすることができる。

反応処理装置においては、複数の蛍光検出装置のうち、いずれかの蛍光検出装置による蛍光強度の変動を、流路を繰り返し往復移動する試料の動き（試料の移動と停止）を制御するためのパラメータとする場合がある。そのような目的を担う蛍光検出装置の光学ヘッドは、流路における高温領域と低温領域との間の接続領域の略中間点に配置することが望ましい。仮に試料の移動制御に利用される光学ヘッドが流路の接続領域のうち高温または低温領域のいずれかの側に偏って配置された場合、送液やその停止の制御が煩わしくなる虞がある。流路の接続領域の略中間に試料の移動制御に利用される光学ヘッドを配置することにより、試料の送液や停止の制御が容易となる。また、制御の容易性は、精度の向上にもつながる。

一方で、ＰＣＲなどの反応処理に供される試料においては、ＦＡＭをはじめとした波長約４７０ｎｍを中心とした励起光で試料を励起する蛍光色素を添加するケースが多い。波長約４７０ｎｍ付近の光で励起することにより、それに対応する蛍光は必然的に波長約５００～５６０ｎｍ付近の波長の光を含む。これは第１蛍光検出装置１３１の仕様に該当するものであり、結果的にこのような励起光／蛍光の波長特性を有する蛍光検出装置が、反応処理装置に多く使用される。

以上のような事情により、３つの光学ヘッドのうち中央に配置される第１光学ヘッド１３４は、流路１２の接続領域の略中間点Ｃに配置されることが適切である。上記の事情は、２つの蛍光検出装置のみを備える上述の反応処理装置３０においても同様である。すなわち、図２に示す反応処理装置３０において、第１光学ヘッド５１は、流路１２の接続領域の略中間点Ｃに配置されてよい。

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。

１０ 反応処理容器、 １２ 流路、 １４ 基板、 １６ 流路封止フィルム、 １７ 第１連通口、 １８ 第２連通口、 ２０ 試料、 ３０，１３０ 反応処理装置、 ３２ 温度制御システム、 ３３ 高温用ヒータドライバ、 ３５ 低温用ヒータドライバ、 ３６ ＣＰＵ、 ３７ 送液システム、 ３９ 第１ポンプ、 ４０ 第２ポンプ、 ４１ 第１ポンプドライバ、 ４２ 第２ポンプドライバ、 ４３ 第１チューブ、 ４４ 第２チューブ、 ４５，４６ パッキン、 ５０，１３１ 第１蛍光検出装置、 ５１，１３４ 第１光学ヘッド、 ５２ 第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール、 ５４，１３２ 第２蛍光検出装置、 ５５，１３５ 第２光学ヘッド、 ５６ 第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール、 ６０ 高温用ヒータ、 ６２ 低温用ヒータ、 ６４ 第１励起光源、 ６５ 第１波長合分波器、 ６６ 第１蛍光検出器、 ６７ 第２蛍光検出器、 ６８ 第１ロックインアンプ、 ６９ 第２ロックインアンプ、 ７０ ＩＶアンプ、 ８０ ハイパスフィルタ、 ８１ 反転・非反転アンプ、 ８２ ローパスフィルタ、 １３３ 第３蛍光検出装置、 １３６ 第３光学ヘッド。

配列番号１：フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２：リバースＰＣＲプライマー
配列番号３：プローブ

Claims (10)

1. 試料が移動する流路が形成された反応処理容器と、
   第１励起光を前記流路に設定された第１蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、前記第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を検出する第１蛍光検出装置と、
   第２励起光を前記流路に設定された第２蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、前記第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を検出する第２蛍光検出装置と、
   を備える反応処理装置であって、
   前記第１蛍光の波長範囲と前記第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、
   試料が前記第１蛍光検出領域を繰り返し往復的に通過したときに、前記第１蛍光検出装置によって検出される蛍光強度に対応した蛍光信号の最大値の標準偏差をノイズＮｖとしたとき、Ｎｖ＜０．３である、
   ことを特徴とする反応処理装置。
2. 前記第１蛍光検出装置は、前記第１蛍光検出領域中の試料からの蛍光を受光可能な第１光学ヘッドを備え、
   前記第２蛍光検出装置は、前記第２蛍光検出領域中の試料からの蛍光を受光可能な第２光学ヘッドを備え、
   前記第１光学ヘッドと前記第２光学ヘッドは、それぞれ第１対物レンズと第２対物レンズを備え、
   前記第１対物レンズと前記第２対物レンズの開口数ＮＡは、ＮＡ＝０．０７～０．２３である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
3. 前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドの径は、１ｍｍ～４ｍｍであることを特徴とする請求項２に記載の反応処理装置。
4. 前記第１蛍光検出装置は、波長４７０ｎｍの光を含む第１励起光を出射し、波長５３０ｎｍの光を含む第１蛍光を受光することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の反応処理装置。
5. 前記第１蛍光検出領域の中心と前記第２蛍光検出領域の中心との距離は４ｍｍ以上であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の反応処理装置。
6. 前記ノイズＮｖが、Ｎｖ＜０．２であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の反応処理装置。
7. 前記流路は、第１温度に維持される第１温度領域と、前記第１温度よりも高い第２温度に維持される第２温度領域と、前記第１温度領域と前記第２温度領域とを接続する接続領域とを備え、
   前記第１蛍光検出装置によって検出された蛍光信号に基づいて、前記流路内における試料の移動が制御され、
   前記第１蛍光検出領域は、前記接続領域の略中間点に設定されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の反応処理装置。
8. 前記第１蛍光検出装置は、前記第１励起光として青色光を照射し、且つ前記第１蛍光として緑色光を検出し、
   前記第２蛍光検出装置は、前記第２励起光として緑色光を照射し、且つ前記第２蛍光として赤色光を検出することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の反応処理装置。
9. 第３励起光を前記流路に設定された第３蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、前記第３励起光の照射により試料から生じた第３蛍光を検出する第３蛍光検出装置をさらに備え、
   前記第３蛍光検出装置は、前記第３励起光として赤色光を照射し、且つ前記第３蛍光として赤外光を検出することを特徴とする請求項８に記載の反応処理装置。
10. 試料が移動する流路が形成された反応処理容器を準備するステップと、
    前記反応処理容器の前記流路内に試料を導入するステップと、
    前記反応処理容器を反応処理装置にセットするステップと、
    前記流路内の試料からの蛍光を検出するステップと、
    を備える反応処理方法であって、
    前記反応処理装置は、
    第１励起光を前記流路に設定された第１蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、前記第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を検出する第１蛍光検出装置と、
    第２励起光を前記流路に設定された第２蛍光検出領域中の試料に照射するとともに、前記第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を検出する第２蛍光検出装置と、
    を備え、
    前記第１蛍光の波長範囲と前記第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、
    試料が前記第１蛍光検出領域を繰り返し往復的に通過したときに、前記第１蛍光検出装置によって検出される蛍光強度に対応した蛍光信号の最大値の標準偏差をノイズＮｖとしたとき、Ｎｖ＜０．３である、
    ことを特徴とする反応処理方法。

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