JP7657002B2 - 核酸増幅方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅方法に関する。

核酸の検出は、医薬品の研究開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなすものである。癌を含む種々の疾患、微生物の感染、分子系統解析に基づいた遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患及び発症リスク診断、マーカーの探索、食品や環境中の安全性評価、犯罪の立証、及び他の多くの技術にとって普遍的技術となっている。

遺伝子である少量の核酸を高感度に検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部又は全部を指数関数的に複製し増幅した産物を分析する手法である。

ＰＣＲ法は、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する強力な技術である。ＰＣＲを用いると、テンプレートＤＮＡの中の標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレートＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を生成することができる。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応が順次繰り返される。このサイクルは、分析に必要な十分なコピー数が得られるまで繰り返し行われる。原理上、ＰＣＲの1回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能である。実際には、サーマルサイクルが続くと、必要な反応試薬の濃度が減少するので、増幅されたＤＮＡ産物の集積が、最終的に止まる。ＰＣＲの一般的詳細については、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ」、Ｄｅｎｎｉｓ Ｌｏ（編集）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）（１９９８年）、及び「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）を参照のこと。

ＰＣＲ法は目的のＤＮＡを選択的に増幅できる強力な手法であるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。そこで、ＰＣＲ法の改良として、目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させるリアルタイムＰＣＲ法が開発され、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。従来のＰＣＲ法では、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することは出来ない。しかし、リアルタイムＰＣＲ法においては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲ法は、定量的ＰＣＲ法とも呼ばれる。

リアルタイムＰＣＲ法による標的ＤＮＡ量の定量性は,臨床において特に有用であり、例えばエイズウイルス（ＨＩＶ）などウイルス感染の治療効果を確認する上で、ウイルス量の推移をモニタリングすること等に利用されている。また、ヘルペスウイルス（ＨＨＶ）のような、多くが幼児期より不顕性感染しているが、体力減衰等により増殖し発症する日和見感染症の診断においても、リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ定量が有効である。

ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法であるが、ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。

ＰＣＲ操作の高速化という課題を解決する方法としては、マイクロブロア等を送液用機構として使用するレシプロカルフロー型の核酸増幅装置の報告がある(特許文献１)。

特許文献１には、核酸増幅装置において、変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯の間の１箇所で試料溶液通過を確認することを手掛かりとして送液制御を行い試料液の停止位置を制御する方法が開示されている。

ＷＯ２０１６／００６６１２

本発明の目的は、マイクロチップを使用し、新たな試料液の送液制御法を利用するリアルタイムＰＣＲ法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リアルタイムＰＣＲを行う際に、空間的に離れた２つの温度帯の微小流路及びこれらの温度帯を結ぶ中間流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光検出を行い、試料液の移動速度を制御要因として加味することにより送液制御の精度が向上することを見いだした。

本発明は、以下の態様を包含する。

項１、 空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
サーマルサイクル毎の蛍光の検出は前記変性温度帯に対応する流路、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路及び前記中間流路の所定の位置で測定できるように設置された蛍光検出器により行われ、
以下の前記試料液の移動工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
（Ａ）前記試料液を前記変性温度帯から前記伸長・アニーリング温度帯へと前記送液用機構により移動させるとき、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出した時から、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出するまでの時間 ｔ１[s]を計測し、
前記中間流路の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ２）から前記伸長・アニーリング温度帯の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ３）までの距離（微小流路の長さ）を Ｌ１[mm]とし、
前記微小流路内での試料液の長さ Ｌｓ１[mm]とすることにより、
前記試料液の移動速度 Ｖ１[mm/s]を ｔ１[s]と Ｌ１[mm]に基づいて算出し、
前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ３[s]を Ｌｓ１[mm]とＶ１[mm/s]に基づいて算出し、
前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから ｔ３[s]後に前記送液用機構を停止させる工程、
（Ｂ）前記試料液を前記伸長・アニーリング温度帯から前記変性温度帯へと前記送液用機構により移動させるとき、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）での前記蛍光検出器が前記試料液を検出した時から、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出するまでの時間 ｔ２[s]を計測し、
前記中間流路の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ２）から前記変性温度帯の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ１）までの距離（微小流路の長さ）を Ｌ２[mm]とし、
前記微小流路内での試料液の長さを Ｌｓ２[mm]とすることにより、
前記試料液の移動速度 Ｖ２[mm/s]を ｔ２[s]と Ｌ２[mm]に基づいて算出し、
前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ４[s]を Ｌｓ２[mm]と Ｖ２[mm/s]に基づいて算出し、
前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから ｔ４[s]後に前記送液用機構を停止させる工程。
Ｖ１＝Ｌ１／ｔ１ （１）
Ｖ２＝Ｌ２／ｔ２ （２）
ｔ３＝Ｌｓ１／Ｖ１－ｔｃ１ （３）
ｔ４＝Ｌｓ２／Ｖ２－ｔｃ２ （４）
（ｔｃ１ 及び ｔｃ２ は、装置固有の一定時間 [s]）
項２、項１の核酸増幅方法において、
式（３）の待機時間ｔ３の替わりに式（３’）の待機時間ｔ３を、式（４）の待機時間ｔ４の替わりに式（４’）の待機時間ｔ４を適用した前記試料液の移動工程を含む核酸増幅方法。
ｔ３＝（Ｌｓ１－Ｌｐ１）／Ｖ１ （３’）
ｔ４＝（Ｌｓ２－Ｌｐ２）／Ｖ２ （４’）
（Ｌｐ１ 及び Ｌｐ２ は、装置固有の長さ [mm]）
項３、項１又は２の核酸増幅方法において、
時間 ｔ１が、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出した時から、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出するまでの時間であり、時間 ｔ３が、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）を前記試料液の先頭部が通過したことを前記蛍光検出器が検出後、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間である工程（A）、
時間 ｔ２が、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）での前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出した時から、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出するまでの時間であり、時間 ｔ４が、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）を前記試料液の先頭部が通過したことを前記蛍光検出器が検出後、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間である工程（B）
の前記試料液の移動工程を含む核酸増幅方法。
項４、試料液が移動する微小流路が形成された核酸増幅用チップと、
前記微小流路中での試料液の移動および停止させる送液用機構と、
前記微小流路に、変性温度帯と、伸長・アニーリング温度帯を提供する温度制御手段と、
少なくとも３台の蛍光検出器と、
を備える核酸増幅装置であって、
前記微小流路は、前記変性温度帯に対応する曲線流路、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路及びこれら曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路を有し、
前記送液用機構は、送液停止時には大気圧開放される機構であり、
前記蛍光検出器は、前記変性温度帯に対応する曲線流路、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路及びこれら曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路の各検出位置で試料液の通過を検出し、
各蛍光検出器からの電気信号を受信することにより送液用機構が制御されることを特徴とする核酸増幅装置。

核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター２個）。 核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター３個）。 ＰＣＲチップの変性温度帯（Ｈｉｇｈ）と伸長・アニーリング温度帯（Ｌｏｗ）の曲線流路及びこれらをつなぐ直線状の中間流路の例を示す図である。 ＰＣＲチップの中間流路の所定の位置Ｐ２から伸長・アニーリング温度帯の所定の位置Ｐ３までの微小流路の長さＬ１を示す図である。 ＰＣＲチップの中間流路の所定の位置Ｐ２から変性温度帯の所定の位置Ｐ１までの微小流路の長さＬ２を示す図である。 ＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯での微小流路中の試料液の長さＬｓ１を示す図である。 ＰＣＲチップの変性温度帯での微小流路中の試料液の長さＬｓ２を示す図である。 ＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯での試料液の停止位置の一態様を示す図である。 ＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯での試料液の停止位置の別の一態様を示す図である。 ＰＣＲチップの変性温度帯での試料液の停止位置の一態様を示す図である。

以下、本発明の核酸増幅方法について詳説する。

本発明の核酸増幅方法は、試料液を微小流路中２つの温度帯間を往復移動させることによりサーマルサイクリングを行う方法である。このような核酸増幅方法を、レシプロカルフロー型の核酸増幅方法と呼ぶ場合もある。

本発明の核酸増幅方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のうち、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることができるリアルタイムＰＣＲである。なお、ＰＣＲにおいては、複数回のサイクルの変性、プライマー対の相対鎖へのアニーリング、ターゲット核酸配列のコピー数の指数関数的な増加をもたらすプライマーの伸長を利用し、核酸の増幅を行う。

リアルタイムＰＣＲを実現するために、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行う。すなわち、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化を経時的に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。ＰＣＲにおいて、遺伝子増幅のされ方、即ち遺伝子産物が対数増殖的に増加するときのサイクル数は、基となる鋳型の量に依存するため、あらかじめ濃度が分かっている外部標準ＤＮＡを鋳型としたときの遺伝子増幅の状況と比較することで、試料中の標的遺伝子の存在量を算出することができる。

本発明の核酸増幅方法は、ＤＮＡを鋳型とするものであっても、ＲＮＡを鋳型とするものであってもよい。ＤＮＡを鋳型とする場合は図１に示すような核酸増幅装置の構成によりＰＣＲが実施され、ＲＮＡを鋳型とする場合（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）は図２に示すような核酸増幅装置の構成により、まず逆転写酵素によりｍＲＮＡから相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成（逆転写）した後にＰＣＲが実施される。

ＰＣＲの各種キット及びプロトコールとして、各種公知のものを使用することができる。本発明の核酸増幅方法がリアルタイムＲＴ－ＰＣＲである場合、逆転写反応及びＰＣＲでのサイクリングを、ワンステップで迅速かつ簡便に行うことができるＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを用いることができる。

本発明の核酸増幅方法はその好ましい態様の１つにおいて、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲである。

本発明の核酸増幅方法は、試料液が微小流路中を移動することにより実施される。本発明の核酸増幅方法を実施するための微小流路は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備える。微小流路は、試料液を導入するための開口部を備えることもできる。試料液を導入するための開口部は、微小流路の上部に設けられていても、分岐点から延びる分岐流路上に設けられてもよい。また、開口部は、任意選択でシールや弁等により密閉可能とすることができる。

微小流路は、（i）熱伝導性が比較的高い、（ii）ＰＣＲに必要な温度範囲において安定である、（iii）電解質溶液や有機溶媒に侵食されにくい、（iv）核酸やタンパク質の吸着性が低いなどの要件の一部又は全部を満たす材料から構成されることが好ましい。具体的には、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの各種樹脂が例示される。また、蛍光検出を実施するとの観点から、光（特に、蛍光検出を行うための励起光及び放射光）の透過性が高い（すなわち、吸収、拡散、反射等が少ない）、透明な材料であることが好ましい。

微小流路は、例えば、ＮＣ加工による切削などの機械加工、射出成形、ナノインプリンティング、ソフトリソグラフィーなどの方法により溝が素材に形成され、シール（好ましくは、例えばポリオレフィン製などの透明シール）により密閉された構造とすることができる。あるいは、三次元プリンティングにより微小流路を形成することもできる。微小流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、くさび形、台形、多角形などとすることができる。また、微小流路の断面は、例えば、幅１０～１０００μｍ程度、深さ１０～１０００μｍ程度とすることができる。また、微小流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、又は、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路の形状は、ループ形状を有する蛇行流路、渦巻き状などの曲線流路の形状とすることができる。変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ中間流路は、直線状又は上記のような曲線流路形状のいずれの形状とすることができる。

変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であってもよい。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれは、対応する温度に維持されており、当該温度帯に移動してきた試料液の温度を当該温度帯の温度に変化させる。

変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変性温度帯の温度は９０～１００℃程度が好ましく、９５℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。

変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯のそれぞれは、一定の温度に維持されていることが好ましい。温度の維持は、熱源により実現することができる。熱源は、例えば、微小流路に内蔵されている又は微小流路が接触している。熱源の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が挙げられる。

本発明の核酸増幅方法において、試料液はプラグ状の形態で微小流路中を移動する。微小流路中を移動する試料液の容量は、特に限定されず、好ましくは５～５０μＬ程度、より好ましくは１５～２０μＬ程度とすることができる。

試料液には、ＰＣＲの反応に必要な成分、リアルタイムＰＣＲを実現するための蛍光検出に必要な成分等が含まれている。例えば、試料液は水を主体とした水性媒体に、鋳型核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよい）ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、標識されていてもよい各種デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標的遺伝子領域に対応するプライマーセットなどのＰＣＲの反応に必要な成分；ＴａｑＭａｎプローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅプローブ、Ｅプローブ（登録商標）などの蛍光プローブ、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮなどの色素などの蛍光検出に必要な成分などが含まれている。また、ｐＨ及び塩濃度を調整するための緩衝液成分が含まれていてもよい。

本発明のＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである場合、試料液には２種類以上含むプライマーセットを含む。一般に、「プライマーセット」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものをいい、通常は一つの標的遺伝子領域に対応して1種のフォワードプライマー及び1種のリバースプライマーを用いる。本発明に係るプライマーセットは、リバースプライマーを１種のみ含む場合であっても、そのリバースプライマーが２種以上のフォワードプライマーとの組み合わせで（プライマー対として）それぞれ別個の遺伝子領域に対応する増幅産物を生成するときは、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用することができる。

蛍光検出に用いる色素（蛍光色素）の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５－ＦＡＭ、６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５－ＨＥＸ、６－ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５－ＲＯＸ、６－ＲＯＸ、５－ＴＡＭＲＡ、６－ＴＡＭＲＡ、５－ＴＥＴ、６－ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。

マルチプレックスＰＣＲに使用する色素として、ＡＢＹ及びＨＥＸからなる群から選択される少なくとも１種が含まれることが好ましく、例えば、ＡＢＹ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせやＨＥＸ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせを挙げることができる。

本発明の核酸増幅方法における試料液の移動は、送液停止時には大気圧開放される送液用機構により実現される。すなわち、シリンジポンプ等の圧力が逃げないように流路内部を閉鎖系とする必要がある機構を用いるのではなく、送液時であっても開放系を形成するように構成される送液用機構を使用する。このような送液用機構を採用することで、送風を停止させると、流路内部の圧力が瞬時に流路外部の圧力と等しくなり、プラグ状試料液へ作用する圧力が失われるため送液はすぐに停止する。

送液停止時には大気圧開放される送液用機構の例としては、マイクロブロア、ファンを挙げることができる。

マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４)。

ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。

本発明の核酸増幅方法において、下記［1］～［4］を１サイクルとして、レシプロカルフロー型の核酸増幅を行う。
［1］送液用機構を動作させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［2］送液用機構を停止させ、試料液を変性温度帯内に一定時間保持させる工程、
［3］送液用機構を動作させ、試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、及び
［4］送液用機構を停止させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に一定時間保持させる工程。

上記サイクルを少なくとも１回以上、好ましくは３０～５０回程度、より好ましくは３５～５０回程度繰り返して行い、サーマルサイクリングを行う。サイクル数は、鋳型核酸の濃度、標的遺伝子の種類などに応じて適宜設定することができる。

本発明の核酸増幅方法において、試料液の移動の速度、特に試料液が前記中間流路を移動する際の速度は、例えば、２５ｍｍ／秒～２．２ｍ／秒程度、より好ましくは４０ｍｍ／秒～１ｍ／秒程度、６０ｍｍ／秒～３００ｍｍ／秒程度とすることができる。

試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２～１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２～６０秒程度とすることができる。

送液用機構は、例えば接続部を介して、微小流路と接続している。

本発明の一つの態様においては、２つの送液用機構が、微小流路の２つの端のそれぞれに１つずつ接続されている。すなわち、伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第１の送液用機構を上記工程［1］において動作させ、変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第２の送液用機構を上記工程［3］において動作させる。

本発明の別の態様においては、１つの送液用機構が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の２つの端に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせる。なお、切替弁については３方弁の場合であれば、送液停止時には大気圧開放されるマイクロブロアやファンに接続され、分岐点で２方向に分かれる空気流路の両端に配置された２つの３方弁を介し、微小流路の２つ端まで分岐した２本の接続流路に対し、交互に送風を行うことで、微小流路内において試料液を往復送液することが可能となる。この場合、３方弁は、一方の弁を閉じて、他方の弁を開いた状態にて送風を行うことにより試料液を送液することが可能となる。また、３方弁は１つである方が望ましいが、接続流路の組み合わせにより２方弁の組み合わせや３方、４方、５方など多方弁で合っても良い。

本発明の別の態様においては、２つの送液用機構（エアーの吐出手段とエアーの吸引手段）が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の１つの端（伸長・アニーリング温度帯側）に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吐出手段）を作動させ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吸入手段）を作動させる。

本発明の核酸増幅方法においては、変性温度帯に対応する流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路、及び直線状もしくは曲線状の中間流路の３つの所定の位置で、サーマルサイクル毎の試料液の蛍光検出を行う。変性温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（例えば、２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ１を挙げることができる。また、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（例えば、２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ３を挙げることができる。直線状の中間流路の所定の位置は、特に制限はなく、図３におけるＰ２を挙げることができる。

蛍光強度の検出は、試料液の移動を検出するものであることとともに、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることも可能である。

本発明の一態様として試料液の送液制御の例を以下に示す（例１）。
［１］伸長・アニーリング温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）及び中間流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、
［２］中間流路の所定の位置で試料液の先頭部が通過したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信する工程、
［３］伸長・アニーリング温度帯の所定の位置で試料液の先頭部が通過したことの電気信号を蛍光検出器から送液制御機構が受信する工程、
［４］ ［２］の中間流路の蛍光検出器から電気信号を受信した時と［３］の伸長・アニーリング温度帯の蛍光検出器から電気信号を受信した時から、試料液が中間流路の所定の位置から伸長・アニーリング温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ１[mm]を移動するのに要した時間 ｔ１[s]を求め、さらに試料液の移動速度Ｖ１[mm/s]を算出する工程（ Ｖ１＝Ｌ１／ｔ１ ）、
［５］試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過し、［４］において算出した移動速度Ｖ１[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ５[s]を、試料液の長さＬｓ１[mm]から算出する工程（ｔ５＝Ｌｓ１／Ｖ１）、
［６］伸長・アニーリング温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者の設定した試料液停止位置等から決定できる装置固有時間 ｔｃ１[s]を考慮して求められる待機時間 ｔ３[s]を算出し（ｔ３＝ｔ５－ｔｃ１）、試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ３[s]後に送液用機構を停止させる工程、
［７］変性温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）及び中間流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を伸長・アニーリング温度帯から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［８］中間流路の所定の位置で試料液の先頭部が通過したことの電気信号を蛍光検出器から送液制御機構が受信する工程、
［９］変性温度帯の所定の位置で試料液の先頭部が通過したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信する工程、
［１０］ ［８］の中間流路の蛍光検出器から電気信号を受信した時と［９］の変性温度帯の蛍光検出器から電気信号を受信した時から、試料液が中間流路の所定の位置から変性温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ２[mm]を移動するのに要した時間 ｔ２[s]を求め、さらに試料液の移動速度Ｖ２[mm/s]を算出する工程（Ｖ２＝Ｌ２／ｔ２）、
［１１］試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置を通過し、［１０］において算出した移動速度Ｖ２[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が変性温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ６[s]を、試料液の長さＬｓ２[mm]より算出する工程（ｔ６＝Ｌｓ２／Ｖ２）、
［１２］変性温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者が設定した試料液の停止位置等から決定される装置固有時間 ｔｃ２[s]を考慮して求められる待機時間 ｔ４[s]を算出し（ｔ４＝ｔ６－ｔｃ２）、試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ４[s]後に送液用機構を停止させる工程。

また、本発明の一態様として試料液の送液制御の変法例を以下に示す（例２）。
例１の試料液の送液制御法において、工程［６］に替えて工程［６－２］を、
工程［１２］に替えて工程［１２－２］を実施する。
［６－２］伸長・アニーリング温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者の設定した試料液停止位置等から決定できる装置固有の長さ Ｌｐ１[mm]を考慮して求められる待機時間 ｔ３[s]を算出し（ｔ３＝ｔ５－Ｌｐ１／Ｖ１）、試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ３[s]後に送液用機構を停止させる工程、
［１２－２］変性温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者が設定した試料液の停止位置等から決定される装置固有の長さ Ｌｐ２[mm]を考慮して求められる待機時間 ｔ４[s]を算出し（ｔ４＝ｔ６－Ｌｐ２／Ｖ２）、試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ４[s]後に送液用機構を停止させる工程。

また、本発明の一態様として試料液の送液制御の変法例を以下に示す（例３）。
例１の試料液の送液制御法において、工程［５］に替えて工程［５－３］を、、工程［６］に替えて工程［６－３］を、工程［１１］に替えて工程［１１－３］を、工程［１２］に替えて工程［１２－３］を実施する。
［５－３］試料液の先頭部が中間流路の所定の位置を通過し、［４］において算出した移動速度Ｖ１[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ７[s]を、中間流路の所定の位置から伸長・アニーリング温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ１[mm]と試料液の長さＬｓ１[mm]から算出する工程（ｔ７＝Ｌ１／Ｖ１＋Ｌｓ１／Ｖ１）、
［６－３］伸長・アニーリング温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者の設定した試料液停止位置等から決定できる装置固有時間 ｔｃ１[s]を考慮して求められる待機時間 ｔ３[s]を算出し（ｔ３＝ｔ７－ｔｃ１）、試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ３[s]後に送液用機構を停止させる工程、
［１１－３］試料液の先頭部が中間流路の所定の位置を通過し、［１０］において算出した移動速度Ｖ２[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が変性温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ８[s]を、中間流路の所定の位置から変性温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ２[mm]と試料液の長さＬｓ２[mm]より算出する工程（ｔ８＝Ｌ２／Ｖ２＋Ｌｓ２／Ｖ２）、
［１２－３］変性温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者が設定した試料液の停止位置等から決定される装置固有時間 ｔｃ２[s]を考慮して求められる待機時間 ｔ４[s]を算出し（ｔ４＝ｔ８－ｔｃ２）、試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ４[s]後に送液用機構を停止させる工程。

また、本発明の一態様として試料液の送液制御の変法例を以下に示す（例４）。
例１の試料液の送液制御法において、工程［５］に替えて工程［５－４］を、、工程［６］に替えて工程［６－４］を、工程［１１］に替えて工程［１１－４］を、工程［１２］に替えて工程［１２－４］を実施する。
［５－４］試料液の先頭部が中間流路の所定の位置を通過し、［４］において算出した移動速度Ｖ１[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ７[s]を、中間流路の所定の位置から伸長・アニーリング温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ１[mm]と試料液の長さＬｓ１[mm]から算出する工程（ｔ７＝Ｌ１／Ｖ１＋Ｌｓ１／Ｖ１）、
［６－４］伸長・アニーリング温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者の設定した試料液停止位置等から決定できる装置固有の長さ時間 Ｌｐ１[mm]を考慮して求められる待機時間 ｔ３[s]を算出し（ｔ３＝ｔ７－Ｌｐ１／Ｖ１）、試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ３[s]後に送液用機構を停止させる工程、
［１１－４］試料液の先頭部が中間流路の所定の位置を通過し、［１０］において算出した移動速度Ｖ２[mm/s]で試料液が移動した場合に、試料液の後尾部が変性温度帯の所定の位置を通過するのに必要な時間 ｔ８[s]を、中間流路の所定の位置から変性温度帯の所定の位置までの微小流路の距離（長さ）Ｌ２[mm]と試料液の長さＬｓ２[mm]より算出する工程（ｔ８＝Ｌ２／Ｖ２＋Ｌｓ２／Ｖ２）、
［１２－４］変性温度帯の所定の位置、測定者又は装置設計者が設定した試料液の停止位置等から決定される装置固有の長さ Ｌｐ２[mm]を考慮して求められる待機時間 ｔ４[s]を算出し（ｔ４＝ｔ８－Ｌｐ２／Ｖ２）、試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置を通過後、待機時間ｔ４[s]後に送液用機構を停止させる工程。

蛍光検出は、光源から微小流路中の試料液に向かって照射された励起光により生じた放射光（蛍光）を、蛍光検出器で検出することにより行うことができる。

本発明の核酸増幅方法は、例えば、以下の核酸増幅装置と核酸増幅用チップの組み合わ
せを用いて実施することができる：
［核酸増幅装置］
変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記変性温度帯及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路をつなぐ中間流路に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記２つの温度帯間の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置。
［核酸増幅用チップ］
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップ。

具体的には、以下の工程１～４により行うことができる：
工程１：上記核酸増幅装置の基板に上記核酸増幅用チップを載置する工程、
工程２：微小流路の一方又は両端部の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程
工程４：前記変性温度帯に対応する流路、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路及びの前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路をつなぐ中間流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。

以下、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップの例を、図を参照しながら説明する。

核酸増幅装置は、図１に示す通り、核酸増幅用チップを載置するための基板（図示せず）、核酸増幅用チップ温調部、送液用機構（例えば、一例としてマイクロブロアを示す）、蛍光検出器、制御機構としての制御用コンピュータ電源用小型バッテリーを備えることができる。

図１において、核酸増幅用チップ用温調部は、カートリッジヒーター２本を、上記核酸増幅用チップの２つの曲線流路部のそれぞれのシール面側と隙間なく接触する様に、１０ｍｍの間隔をおいて平行に配置させた構成としており、２本のヒーターの温度制御のため、各ヒーターにはＫ型熱電対を接合させている。

カートリッジヒーター１は、ＤＮＡ変性反応に必要な温度に制御用コンピュータにより制御されている。カートリッジヒーター２はＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に制御用コンピュータに制御されている。なお、ＤＮＡの変性反応のための温度帯、アニーリング反応及び伸長反応のための温度帯は、例えばＰＩＤ（比例－積分－微分）制御により定温保持することができる。

蛍光検出器は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯の微小流路の直線上の各1点（図３のＰ１，Ｐ３）並びに中間流路上の１点（図３のＰ２）を検出点として蛍光強度を計測するように配置されている。加圧により一方の曲線流路部から送液された試料液の先頭部が、検出点Ｐ１あるいはＰ３に到達後、特定の待機時間経過後に、送液用機構を停止させ、当該試料液を、他方の曲線流路部内に一定時間保持されることができる。

あるいは、加圧により一方の曲線流路部から送液された試料液の先頭部が、検出点Ｐ２に到達後、特定の待機時間経過後に、送液用機構を停止させ、当該試料液を、他方の曲線流路部内に一定時間保持されることができる。

制御用コンピュータは、送液用機構のプログラム制御が可能であり、各微小流路中心の上記検出点の蛍光強度を連続モニタリングしながら、当該試料液が各ヒーター上の曲線流路部へ設定した時間ずつ交互に移動する様、当該送液用機構について交互にスイッチングしサーマルサイクリングを行う。当該制御用コンピュータは、さらに、リアルタイムＰＣＲ法において、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化も同時に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。

図３に微小流路を備えた核酸増幅用チップを示す。図３に示す核酸増幅用チップでは、変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯に対応する２つの曲線流路（蛇行流路）を直線状の中間流路で連結され、検出点Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３において試料液蛍光を検出する。

図４にＰＣＲチップの中間流路の所定の位置Ｐ２から伸長・アニーリング温度帯の所定の位置Ｐ３までの微小流路の長さＬ１を示す。Ｌ１は、ＰＣＲチップの表面に作成された流路の流路幅の中心（中間点）を結ぶＰ２からＰ３の線の長さを示す。図４においてＰ２からＰ３の線は、直線―曲線－直線―曲線―直線の形状を表す。

図５にＰＣＲチップの中間流路の所定の位置Ｐ２から変性温度帯の所定の位置Ｐ１までの微小流路の長さＬ２を示す。Ｌ２は、ＰＣＲチップの表面に作成された流路の流路幅の中心（中間点）を結ぶＰ２からＰ１の線の長さを示し、図５においてＰ２からＰ１の線は、直線―曲線－直線―曲線―直線の形状を表す。

図６にＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯での微小流路中の試料液の長さＬｓ１を示す。Ｌｓ１は、ＰＣＲチップの微小流路に試料液を導入した際に、伸長・アニーリング温度帯のＰ３から流路に沿って空気連通口（右側）方向に延びる線であって、ＰＣＲチップの表面に作成された流路の流路幅の中心（中間点）を結ぶ線の長さを示す。

図７にＰＣＲチップの変性温度帯での微小流路中の試料液の長さＬｓ２を示す。Ｌｓは、ＰＣＲチップの微小流路に試料液を導入した際に、変性温度帯のＰ１から流路に沿って空気連通口（左側）方向に延びる線であって、ＰＣＲチップの表面に作成された流路の流路幅の中心（中間点）を結ぶ線の長さを示す。
変性温度帯に対応する微小流路の断面積と伸長・アニーリング温度帯に対応する微小流路の断面積が一定であり、等しい場合は、Ｌｓ１とＬｓ２は等しくなる。

図８にＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯で試料液が停止する一態様を示す。試料液は、Ｐ３の位置からＬｓ１の１/１０程度の長さを残して停止している。 例えば、装置固有の一定時間 ｔｃ１＝Ｌｓ１×１／１０×１／Ｖ１ と設定し、待機時間 ｔ３を算出し、送液用機構を制御することにより伸長・アニーリング温度帯の目的の位置に停止することが可能となる。
なお、装置固有の一定時間ｔｃ１は、測定者又は装置設計者が設定した伸長・アニーリング帯の微小流路の停止位置、送液用機構による送風量等により決定されるものである。

図９にＰＣＲチップの伸長・アニーリング温度帯で試料液が停止する一態様を示す。試料液は、Ｐ３の位置からＬｓ１の１/３程度の長さを残して停止している。 例えば、装置固有の一定時間 ｔｃ１＝Ｌｓ１×１／３×１／Ｖ１ と設定し、待機時間 ｔ３を算出し、送液用機構を制御することにより伸長・アニーリング温度帯の目的の位置に停止することが可能となる。
なお、装置固有の一定時間ｔｃ１は、測定者又は装置設計者が設定した伸長・アニーリング帯の微小流路の停止位置、送液用機構による送風量等により決定されるものである。

図１０にＰＣＲチップの変性温度帯で試料液が停止する一態様を示す。試料液は、Ｐ１の位置からＬｓ２の１/４程度の長さを残して停止している。 例えば、装置固有の一定時間 ｔｃ２＝Ｌｓ２×１／４×１／Ｖ２ と設定し、待機時間 ｔ４を算出し、送液用機構を制御することにより変性温度帯の目的の位置に停止することが可能となる。
なお、装置固有の一定時間ｔｃ２は、測定者又は装置設計者が変性温度帯の微小流路の停止位置、送液用機構による送風量等により決定されるものである。

本発明の別態様として使用する試料液の量を特定量（例えば、２０μL）に限定した方法を挙げることができる。試料液の先頭部が伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）を通過し、Ｌｃ１[mm]移動したところで停止させるために、送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ３＝Ｌｃ１／Ｖ１と設定することができる。また、試料液の先頭部が変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）を通過し、Ｌｃ２[mm]移動したところで停止させるために、送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ４＝Ｌｃ２／Ｖ２と設定することができる。ここで、０＜Ｌｃ１＜Ｌｓ１であり、０＜Ｌｃ２＜Ｌｓ２である。

Claims (3)

1. 空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
   前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
   前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
   微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
   サーマルサイクル毎の蛍光の検出は前記変性温度帯に対応する流路、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路及び前記中間流路の所定の位置で測定できるように設置された蛍光検出器により行われ、
   以下の前記試料液の移動工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
   （Ａ）前記試料液を前記変性温度帯から前記伸長・アニーリング温度帯へと前記送液用機構により移動させるとき、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出した時から、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出するまでの時間 ｔ１[s]を計測し、
   前記中間流路の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ２）から前記伸長・アニーリング温度帯の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ３）までの距離（微小流路の長さ）を Ｌ１[mm]とし、
   前記微小流路内での試料液の長さ Ｌｓ１[mm]とすることにより、
   前記試料液の移動速度 Ｖ１[mm/s]を ｔ１[s]と Ｌ１[mm]に基づいて式（１）により算出し、
   前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ３[s]を Ｌｓ１[mm]とＶ１[mm/s]に基づいて式（３）により算出し、
   前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから ｔ３[s]後に前記送液用機構を停止させる工程、
   （Ｂ）前記試料液を前記伸長・アニーリング温度帯から前記変性温度帯へと前記送液用機構により移動させるとき、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）での前記蛍光検出器が前記試料液を検出した時から、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）で前記蛍光検出器が前記試料液を検出するまでの時間 ｔ２[s]を計測し、
   前記中間流路の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ２）から前記変性温度帯の蛍光検出を行う所定の位置（Ｐ１）までの距離（微小流路の長さ）を Ｌ２[mm]とし、
   前記微小流路内での試料液の長さを Ｌｓ２[mm]とすることにより、
   前記試料液の移動速度 Ｖ２[mm/s]を ｔ２[s]と Ｌ２[mm]に基づいて式（２）により算出し、
   前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間 ｔ４[s]を Ｌｓ２[mm]と Ｖ２[mm/s]に基づいて式（４）により算出し、
   前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）の前記試料液を前記蛍光検出器が検出してから ｔ４[s]後に前記送液用機構を停止させる工程。
   Ｖ１＝Ｌ１／ｔ１ （１）
   Ｖ２＝Ｌ２／ｔ２ （２）
   ｔ３＝Ｌｓ１／Ｖ１－ｔｃ１ （３）
   ｔ４＝Ｌｓ２／Ｖ２－ｔｃ２ （４）
   （ｔｃ１ 及び ｔｃ２ は、装置固有の一定時間 [s]）
   
2. 請求項１の核酸増幅方法において、
   式（３）の待機時間ｔ３の替わりに式（３’）の待機時間ｔ３を、式（４）の待機時間ｔ４の替わりに式（４’）の待機時間ｔ４を適用した前記試料液の移動工程を含む核酸増幅方法。
   ｔ３＝（Ｌｓ１－Ｌｐ１）／Ｖ１ （３’）
   ｔ４＝（Ｌｓ２－Ｌｐ２）／Ｖ２ （４’）
   （Ｌｐ１ 及び Ｌｐ２ は、装置固有の長さ [mm]）
   
3. 請求項１又は２記載の核酸増幅方法において、
   時間 ｔ１が、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出した時から、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出するまでの時間であり、時間 ｔ３が、前記伸長・アニーリング温度帯の所定の位置（Ｐ３）を前記試料液の先頭部が通過したことを前記蛍光検出器が検出後、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間である工程（A）、
   時間 ｔ２が、前記中間流路の所定の位置（Ｐ２）での前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出した時から、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）で前記蛍光検出器が前記試料液の先頭部の通過を検出するまでの時間であり、時間 ｔ４が、前記変性温度帯の所定の位置（Ｐ１）を前記試料液の先頭部が通過したことを前記蛍光検出器が検出後、前記送液用機構を停止させるまでの待機時間である工程（B）
   の前記試料液の移動工程を含む核酸増幅方法。

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