JP7467339B2

JP7467339B2 - 強化された免疫エフェクター細胞およびその使用

Info

Publication number: JP7467339B2
Application number: JP2020530313A
Authority: JP
Inventors: バラマール，バーラム; ビョーダール，リャン; グッドリッジ，ジョーデ; リー，トム，トング
Original assignee: フェイトセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2024-04-15
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: KR20250048610A; IL275177B2; IL309585B1; AU2018388413B2; MX2020005701A; JP2024037942A; US20200069734A1; MX2026001705A; IL309585B2; WO2019126748A1; IL309585A; US20210163895A1; BR112020011017A2; US12173274B2; IL316257A; EP3728563A4; EP4083192A1; AU2025210798A1; EP3728563A1; US10927346B2

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１２月２２日に出願された米国仮特許出願連続番号第６２／６０９，８２７号、２０１８年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４９，７８１号、および２０１８年１１月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／７７４，０５２号の優先権を主張し、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より詳細には、本開示は、ｉｎｖｉｖｏで治療に適切な特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処する。

養子細胞療法の分野は現在、患者由来およびドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成することと、恩恵を受ける可能性のある全ての患者に治療を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移植されたリンパ球の有効性と持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要もある。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫および適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞およびＮＫ細胞、または他のリンパ球の可能性を最大限に活用するための重要な機会が残っている。

応答率、細胞の消耗、輸血された細胞の損失（生存率および／または持続性）、標的の喪失または系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境および関連する免疫抑制、動員、輸送、および浸潤など、さまざまな問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。

本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）クローン株から分化した誘導非多能性細胞を生成する方法および組成物を提供することであり、このｉＰＳＣ株はそのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。前述の１つまたはいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡ挿入、欠失、および置換が含まれ、これらの改変は、分化、増殖、継代および／または移植の後、その後の誘導細胞において保持され、機能し続ける。

本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。遺伝子操作された誘導細胞を得るための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、指示された分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、および操作されたモダリティが誘導細胞で意図したとおりに機能することも必要である。さらに、この戦略は、末梢血から得られたＴ細胞またはＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。さらに、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で得られる不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。

本発明のいくつかの態様は、リプログラミングプロセスに続いて、同時に、およびその前に、それぞれ、ゲノム操作の戦略を反映する（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する：

（Ｉ）：ｉＰＳＣを（ｉ）と（ｉｉ）のいずれかまたは両方を任意の順序で遺伝子操作する：（ｉ）１つ以上のコンストラクトをｉＰＳＣに導入して、選択した部位で標的化された組み込みを可能にする；（ｉｉ）（ａ）選択された部位認識が可能な１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位に１つ以上の二本鎖切断をｉＰＳＣに導入する；（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養し、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位での標的化されたインデルを生成できるようにする；それにより、部分的または完全に分化した細胞への分化が可能なゲノム操作されたｉＰＳＣを取得する。

（ＩＩ）：リプログラミングされた非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得する：（ｉ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、ならびに必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させ、非多能性細胞のリプログラミングを開始する；（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）と接触させのリプログラミングされた非多能性細胞に（ａ）と（ｂ）のうちの一方または両方を任意の順序で導入する：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上のコンストラクト；（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位で１つ以上の二本鎖切断を行った後、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して内因性ＤＮＡ修復をして選択された部位で標的化されたインデルの生成を可能にする；したがって、取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣは少なくとも１つの機能標的化されたゲノム編集を含み、前述のゲノム操作されたｉＰＳＣは部分的または完全に分化した細胞に分化することができる。

（ＩＩＩ）：（ｉ）および（ｉｉ）を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得するためにリプログラミングするための非多能性細胞を遺伝子操作する：（ｉ）非多能性細胞に（ａ）と（ｂ）の一方または両方を任意の順序で導入する：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上のコンストラクト；（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位で１つ以上の二本鎖切断を行い、ここでステップ（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養して内因性ＤＮＡ修復をして選択された部位で標的化されたインデルの生成を可能にする；（ｉｉ）ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞を１つ以上のリプログラミング因子、ならびに必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させ、選択された部位で少なくとも１つの機能標的化されたゲノム編集を含む、ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得し、前述のゲノム操作されたｉＰＳＣは部分的に分化した細胞または完全に分化した細胞に分化することができる。

上述の方法の一実施形態では、１つ以上の選択された部位での少なくとも１つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、医薬活性タンパク質およびペプチドを、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣまたはその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成的、誘導性、一過性、組織特異性、または細胞型特異性プロモーターを含む１つ以上の外因性プロモーター；あるいは（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択した部位に含まれる１つ以上の内因性プロモーターへと作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１を含むさまざまなセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。

いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節および調節、あるいはｉＰＳＣまたはその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を抑制するタンパク質に関連する１つ以上の内因性遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。

さらにいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、およびＨ１１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。

さらにいくつかの他の実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたｉＰＳＣの多能性を維持することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの標的化されたゲノム編集を含む取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣは機能的であり、分化能があり、同一の機能のゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。

本発明はまた、以下を提供する。

本出願の一態様は、細胞またはその集団であって、細胞は、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、またはｉＰＳ細胞株細胞、または上記の上記ｉＰＳＣのいずれかを分化させることから得られる誘導細胞であり；上記の細胞のいずれかは、少なくとも１つのＣＤ３８ノックアウトまたは、細胞内ドメインを有さないＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）をコードするポリヌクレオチドを含む。ｉＰＳＣ分化から取得された誘導細胞のいくつかの実施形態では、誘導細胞は、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を含むが、これらに限定されない造血細胞であり；この造血細胞（すなわち、誘導ＣＤ３４細胞、誘導造血内皮細胞、誘導造血幹細胞および前駆細胞、誘導造血多能性前駆細胞、誘導Ｔ細胞前駆細胞、誘導ＮＫ細胞前駆細胞、誘導Ｔ細胞、誘導ＮＫＴ細胞、誘導ＮＫ細胞、または誘導Ｂ細胞）は、末梢血、臍帯血、またはその他のいずれかのドナー組織から取得されたその天然の対応細胞と比較して、より長いテロメアを含む。

ＣＤ３８ノックアウトまたは、細胞内ドメインを有さないＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）をコードするポリヌクレオチドを含む上記ｉＰＳＣおよびその誘導細胞のいくつかの実施形態では、細胞は以下のゲノム編集のうちの１つ以上をさらに含む：（ｉ）Ｂ２Ｍｎｕｌｌまたはｌｏｗ；（ｉｉ）ＣＩＩＴＡｎｕｌｌまたはｌｏｗ；（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現；（ｉｖ）高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、（ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ｖｉ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチド、（ｖｉｉ）表１に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ；（ｖｉｉｉ）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける欠失または発現低下；および（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性もしくは多重特異性またはユニバーサルなエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された発現または増加した発現。

少なくともＣＤ３８ノックアウトまたは細胞内ドメインを有さないＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）をコードするポリヌクレオチド、および必要に応じて上記および本出願全体を通して記載される追加のゲノム編集を含む上記ｉＰＳＣおよびその誘導細胞のいくつかの実施形態において、細胞は、（ｉ）１つのセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、（ｉｉ）または異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた３つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）配列番号１７、１９、または２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Δをコードするポリヌクレオチド、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含む。特定の一実施形態では、セーフハーバー遺伝子座ＴＣＲは、ＴＣＲアルファの定常領域である。

細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、少なくともＣＤ３８ノックアウトまたはＩＬ１５Δ、および上述の追加のゲノム編集のうちの１つ以上を含む、細胞は、誘導ＮＫまたは誘導Ｔ細胞であり、誘導ＮＫまたは誘導Ｔ細胞は、次の特徴のうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない：末梢血、臍帯血、またはその他の任意のドナー組織から得られたその天然の対応ＮＫまたはＴ細胞と比較したときの、（ｉ）持続性および／または生存率の向上、（ｉｉ）天然免疫細胞に対する増加した耐性、（ｉｉｉ）増加した細胞傷害性、（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、（ｖ）増強または獲得したＡＤＣＣ、（ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／または活性化または動員する増強された能力、（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープの救済の向上した能力、減少したフラトリサイド。

細胞またはその集団の一実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトまたはＩＬ１５Δを含む細胞は、高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアントをさらに含む。高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアントのいくつかの実施形態は、以下のうちの少なくともいずれか１つを含む：（ａ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインにおけるＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、（ｂ）ＣＤ６４に由来する完全なまたは部分的な外部ドメイン、（ｃ）非天然（または非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｄ）非天然（または非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｅ）非天然（または非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｆ）非天然の刺激ドメイン、ならびに（ｇ）ＣＤ１６に由来せず、同一または異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン。いくつかの実施形態では、非天然の膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、非天然の刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する。他のいくつかの実施形態では、非天然のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する。ｈｎＣＤ１６バリアントのいくつかの特定の実施形態では、非天然の膜貫通ドメインはＮＫＧ２Ｄに由来し、非天然の刺激ドメインは２Ｂ４に由来し、非天然のシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する。

細胞またはその集団の一実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトまたはＩＬ１５Δを含む細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含み、ＣＡＲは以下のうちのいずれか１つ以上であり得る：（ｉ）Ｔ細胞特異的またはＮＫ細胞特異的；（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ；（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ；（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ；；（ｖ）スプリットＣＡＲ；（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ；（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲ；（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲとの同時発現；（ｉｘ）必要に応じて別個のコンストラクトで、またはバイシストロニックなコンストラクトで、細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドと共発現されたもの；（ｘｉ）必要に応じて別個のコンストラクトで、またはバイシストロニックなコンストラクトで、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの；（ｘｉｉ）ＣＤ１９またはＢＣＭＡに特異的なもの；および／または（ｘｉｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれかに特異的なもの。

チェックポイント阻害剤がＣＡＲと共発現されるいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである。ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、上述のチェックポイント分子のうちのいずれかに特異的な抗体、またはヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーであり得る。いくつかの実施形態では、（ｉ）～（ｉｘ）のうちのいずれか１つのＣＡＲをＴＲＡＣ遺伝子座に挿入することができる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入された（ｉ）～（ｉｘ）のうちのいずれか１つのＣＡＲは、ＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座での（ｉ）～（ｉｘ）のうちのいずれか１つのＣＡＲの挿入は、ＴＣＲノックアウトをもたらす。

細胞またはその集団の一実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトを含む細胞は、細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドをさらに含み、外因性サイトカインまたはその受容体は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含み得るか、または（ｉ）自己切断ペプチドを使用したＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣの融合タンパク質、ここで、共通受容体γＣは天然または改変されている、（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモダイマーのうちの少なくとも１つを含み得、ここで、（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれか１つは、別個のコンストラクトで、またはバイシストロニックなコンストラクトで、ＣＡＲと共発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面の外因性サイトカインまたは受容体の部分的または完全なペプチドは、本明細書で提供される細胞において一過性に発現される。

細胞またはその集団の別の実施形態では、細胞は、細胞表面発現の外因性サイトカインまたは受容体の部分的または完全なペプチドを含み、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそれぞれの受容体の少なくとも１つを含み得る。ＩＬ１５サイトカインまたは受容体を含む細胞またはその集団の実施形態では、細胞は、（ｉ）自己切断ペプチドを使用したＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣの融合タンパク質、ここで、共通受容体γＣは天然または改変されている、（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモダイマーのうちの少なくとも１つを含み得、ここで、（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれか１つは、別個のコンストラクトで、またはバイシストロニックなコンストラクトで、ＣＡＲと共発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面の外因性サイトカインまたは受容体の部分的または完全なペプチドは、本明細書で提供される細胞において一過性に発現される。一実施形態では、細胞またはその集団は、配列番号１７、１９または２１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Δをコードするポリヌクレオチドを含む。細胞またはその集団の一実施形態では、ＩＬ１５Δを含む細胞は、Ｂ２Ｍｎｕｌｌまたはｌｏｗ、ＣＩＩＴＡｎｕｌｌまたはｌｏｗ、ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現、高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチド（サイトカインはＩＬ１５ではない）、表１に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける欠失または発現低下、ならびにＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性もしくは多重特異性またはユニバーサルなエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された発現または増加した発現のうちの１つ以上をさらに含み得る。ＩＬ１５ΔとＣＡＲの両方を含む細胞またはその集団の実施形態では、ＩＬ１５Δは、別個のコンストラクトまたはバイシストロニックコンストラクトにおいてＣＡＲと共発現され得る。

細胞またはその集団の一実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトまたはＩＬ１５Δを含む細胞は、誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞であり、誘導ＮＫ細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員および／または遊走させることができ、ここで、誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低下させることができる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである。他のいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの１つ以上、または（ｂ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つのいずれかを含む。

本出願の別の態様は、上述の、および本出願全体にわたって記載の、任意の細胞またはその集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞（誘導細胞）は、本出願の表１に列挙された遺伝子型のうちのいずれか１つを含み得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ＣＤ３８ノックアウト（ＣＤ３８－／－）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ＩＬ１５Δを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６およびＣＤ３８ノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６およびＩＬ１５Δを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６、ＣＤ３８ノックアウト、およびＩＬ１５Δを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、およびＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣまたはそれからの誘導細胞は、上述の、および本出願全体にわたって記載の、ｈｎＣＤ１６、ＣＤ３８－／－、ＣＡＲ、および細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドを含む。ｈｎＣＤ１６、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９に特異的である。ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、およびＣＡＲを含む細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９に特異的である。ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９に特異的である。ｈｎＣＤ１６、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む細胞の他の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）に特異的である。ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、およびＣＡＲを含む細胞の他の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）に特異的である。ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５Δ、ＣＤ３８－／－、およびＣＡＲを含む細胞の他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）に特異的である。さらにいくつかの他の実施形態では、ＣＡＲは、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および当該技術分野で公知の様々な病原体抗原のうちのいずれかに特異的である。

したがって、本出願のさらなる態様は、本明細書で提供される任意の誘導細胞に加えて、１つ以上の治療薬を含む、治療的使用のための組成物を提供する。治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態では、治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤または放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞と共に使用されるチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストを含む。治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞と共に使用されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの１つ以上を含む。治療的使用のための組成物のいくつかの他の実施形態では、提供される細胞と共に使用されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む。治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態では、治療剤は、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドマイドのうちの１つ以上を含む。

治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態において、提供される細胞と共に使用される抗体は、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、および／または抗ＣＤ３８抗体のうちのいずれか１つを含む。治療的使用のための組成物のいくつかの実施形態では、提供される細胞とともに使用される抗体は、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、およびそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアントまたは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの１つ以上を含む。治療的使用のための組成物のさらにいくつかの他の実施形態では、提供される細胞とともに使用される抗体は、ダラツムマブを含む。

本出願はまた、養子細胞療法に適した対象に組成物を導入することによる、本明細書に記載の細胞または治療用組成物の治療的使用を提供する。いくつかの実施形態では、養子細胞療法に適しておりかつそれを必要とする対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍；がん、またはウイルス感染を有する。

本出願のさらなる態様は、本明細書に記載の誘導細胞を製造する方法であって、ＣＤ３８ノックアウトまたはＩＬ１５Δ、および必要に応じて以下のうちの１つ以上を含むｉＰＳＣを分化させることを含む方法を提供する：（ｉ）Ｂ２Ｍｎｕｌｌまたはｌｏｗ、（ｉｉ）ＣＩＩＴＡｎｕｌｌまたはｌｏｗ、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現、（ｉｖ）高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、（ｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ｖｉ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチド、（ｖｉｉ）表１に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける欠失または発現低下、および（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性もしくは多重特異性またはユニバーサルなエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された発現または増加した発現。

製造方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、クローンｉＰＳＣをゲノム操作してＣＤ３８をノックアウトするかＩＬ１５Δをノックインし、必要に応じてＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡをノックアウトするか、またはＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、高親和性の非切断性ＣＤ１６またはそのバリアント、ＣＡＲ、および／または細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドの発現を導入することを含み、ＣＡＲおよび細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドは、別個のコンストラクトまたはバイシストロニックコンストラクトで共発現される。製造する方法のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノム操作は、標的化された編集を含む。いくつかの実施形態では、標的化された編集は、削除、挿入、またはインデルを含む。いくつかの実施形態では、標的化された編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の他の任意の機能的バリエーションによって実行される。

本出願はさらに、ＣＲＩＳＰＲに媒介されるクローンｉＰＳＣの編集を提供し、それにより、ＣＤ３８ノックアウトもしくはＩＬ１５Δノックイン、または表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つを含む編集されたクローンｉＰＳＣを生成する。ＣＲＩＳＰＲに媒介される編集のいくつかの実施形態では、得られたＣＤ３８ノックアウトは二対立遺伝子である。ＣＲＩＳＰＲに媒介される編集のいくつかの実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトは、第１および第２の標的配列の間の核酸切断であり、標的化配列は、それぞれ、配列番号３および配列番号４を含む。ＣＲＩＳＰＲに媒介される編集のいくつかの実施形態では、得られたＩＬ１５Δノックインは、配列番号１７、１９、または２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Δをコードするポリヌクレオチドを含む。上記のＣＲＩＳＰＲに媒介される編集のいくつかの実施形態では、編集は、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＣＡＲの挿入をさらに含み、および／またはＣＡＲは、ＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動され、および／またはＴＣＲは、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされる。

本出願の追加の態様は、ＣＤ３８発現なしでエフェクター細胞を治療下で対象に投与することを含む、抗ＣＤ３８抗体治療を改善する方法を提供する。抗ＣＤ３８抗体治療のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、あるいはそれらのヒト化またはＦｃ改変変異体または断片、機能的同等物およびそれらのバイオシミラーであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体治療を改善する方法のために提供されるエフェクター細胞は、誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞を含む誘導造血細胞を含み、誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、高親和性の非切断性ＣＤ１６またはそのバリアントを含み、必要に応じて（ｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、ＣＡＲ、および／または細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドの導入された発現であって、ＣＡＲおよび細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドは、別個のコンストラクトまたはバイシストロニックなコンストラクトで共発現される、発現、および／または（ｉｉｉ）表１に列挙される遺伝子型の少なくとも１つ、を含む。抗ＣＤ３８抗体治療を改善する方法のいくつかの実施形態において、方法は、そのような治療下の対象における抗ＣＤ３８抗体誘導性のエフェクター細胞の減少を減少させる。

本出願のさらに別の態様は、ＣＤ３８特異的アンタゴニストを使用することによる同種異系エフェクター細胞に対する同種拒絶反応を低減または防止する方法であって、同種異系エフェクター細胞がＣＤ３８ノックアウトを含み、ＣＤ３８特異的アンタゴニストが同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおける活性化されたＴ細胞およびＢ細胞を抑制することができる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８特異的アンタゴニストは、抗ＣＤ３８抗体、ＣＤ３８特異的エンゲージャー、またはＣＤ３８キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの他の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、あるいはそれらのヒト化またはＦｃ改変バリアントまたは断片、機能的同等物およびバイオシミラーのいずれかである。さらに別の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体はダラツムマブであり、本明細書で提供される方法は、ダラツムマブの新規使用を与える。

本明細書で提供される組成物および方法の様々な目的および利点は、例示および例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。

ｉＰＳＣ由来細胞における細胞表面発現のサイトカインのためのいくつかのコンストラクト設計の図解である。ＩＬ１５は、他の望ましいサイトカインで置き換えることができる例示的な例として使用される。３つのＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣクローンのそれぞれから得られたＣＤ３８^－／－誘導ＮＫ細胞のフローサイトメトリーを用いた表現型プロファイリングを示す。ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞が、野生型ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞と同じ細胞傷害性の能力を示すことを示す。成熟したｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のフローサイトメトリーのグラフ表示であり、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍノックアウト（ＨＬＡ－Ａ２発現の喪失）、ＨＬＡ－Ｇ発現、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５ｒａ（ＬＮＧＦＲ）コンストラクト発現の段階的操作を示す。フローサイトメトリーにより決定されたテロメア長のグラフ表示であり、ｉＰＳＣ由来成熟誘導ＮＫ細胞は、成体末梢血ＮＫ細胞と比較してより長いテロメアを維持している。ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞が、ＣＤ３８抗体であるダラツムマブの存在下で腫瘍細胞株ＲＰＭＩ－８２６６により刺激されると、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）機能を維持することを示す。ＣＤ３８を発現するｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（Ａ）と比較して、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（Ｂ）の生存率が、ＣＤ３８抗体、ダラツムマブの存在下で培養において少なくとも約４８時間維持される。ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞（下のパネル）は、ＣＤ３８抗体であるダラツムマブの存在下で刺激すると、脱顆粒を示さず、ＣＤ３８を発現するｉＮＫ細胞（上のパネル）よりもサイトカイン産生が少ないことを示す。ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞へのｈｎＣＤ１６の導入（Ａ）と、外因性ｈｎＣＤ１６とＣＤ３８ノックアウトの両方を有するｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（Ｂ）を示す。ｈｎＣＤ１６－ＣＤ３８^－／－誘導ＮＫ細胞の表現型と機能分析をｈｎＣＤ１６誘導体ＮＫ細胞と比較して示す。（Ａ）フローサイトメトリーによるＮＫＧ２Ａ発現、（Ｂ）フローサイトメトリーによるＮＫｐ４６発現、（Ｃ）フローサイトメトリーによるＫＩＲ２ＤＬ２／３発現、（Ｄ）フローによるカルシウムフラックス、（Ｅ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）生細胞イメージングによるＨＥＲ２発現卵巣細胞株ＳＫＯＶ３に対するＡＤＣＣ。末梢血ＮＫ細胞と比較した、ＣＤ３８ノックアウトを有するか、または有さない誘導ＮＫ細胞におけるダラツムマブ媒介性ＮＫ細胞フラトリサイドを示す。異なるＮＫ細胞集団に対するダラツムマブの特異的な細胞傷害性は、濃度を上げながらダラツムマブの存在下で示されたｉＮＫ細胞の４時間のインキュベート後に測定された。ＣＤ３８ｎｕｌｌｈｎＣＤ１６誘導ＮＫ細胞により媒介される、増強されたダラツムマブ抗骨髄腫活性を示す。示されているｉＮＫ細胞をＭＭ．１Ｓ骨髄腫標的細胞と１８時間インキュベートした後、腫瘍細胞の生存率をフローサイトメトリーによって、アネキシンＶと生／死生存率マーカーで評価した。ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８^－／－ｉＮＫ細胞が増強された、長期にわたる抗骨髄腫活性およびダラツムマブによる持続性を示すことを示す。（Ａ）ＲＭＰＩ－８２２６腫瘍スフェロイドに対する７日間の細胞傷害性アッセイにわたって、７日間の細胞傷害性アッセイの最後に残っている標的細胞の数によって測定された腫瘍細胞のクリアランス、（Ｂ）ＮＫ細胞フラトリサイドの欠如は、７日間の細胞傷害性アッセイにわたって、ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８^－／－ｉＮＫの生存率を改善した。ＣＤ３８を欠くｉＮＫ細胞が、ダラツムマブの存在下で連続殺傷の可能性が増加した、より耐久性の高いＡＤＣＣを有することを示す。全長のＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合コンストラクト（黒丸；陽性対照）、または細胞質シグナル伝達ドメインを有さない短縮ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合コンストラクト（白丸）で形質導入されたｉＮＫ細胞が、外因性の可溶性ＩＬ２とは無関係に、同じ培養で形質導入されていないか、またはＧＦＰ形質導入された細胞と比較して、生存の利点を有していた。Ａ：外因性ＩＬ２の存在下、Ｂ：外因性ＩＬ２の存在なし。

ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、削除、置換が含まれる。ゲノム操作されたｉＰＳＣでの外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期のクローン増殖後、細胞分化後、ゲノム操作されたｉＰＳＣから派生した細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシング、または低下した遺伝子発現などの問題にしばしば遭遇する。一方、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製と送達に障害をもたらす。本発明は、自殺遺伝子および他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、および／または生存率に関する改善された治療的特性を、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞を含むが、これらに限定されないｉＰＳＣ誘導細胞にもたらす。

定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。

本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１または１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。

代替（例えば、「または」）の使用は、耐対の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。

「および／または」という用語は、代替の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用されるよき、「約」または「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、およそ、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

本明細書で使用されるとき、「実質的に」または「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」または「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」および「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質またはその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、または従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質またはその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分または物質を「含まない」または「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分または物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、または（２）組成物に含まれるが低密度であり機能的に不活性であることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質またはその供給源が存在しないことを指す。

本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられたステップ、もしくは要素、またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、もしくは要素、またはステップもしくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるだろう。特定の実施形態では、「含む」、「有する」、「含む」、および「含む」という用語は、同義的に使用される。

「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」とは、「～からなる」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。

「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性または動作を妨害しないか、またはそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性または動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、または存在し得ないことを示す。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

「ｅｘｖｉｖｏ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「ｅｘｖｉｖｏ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間または約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間もしくは７２時間またはそれ以上を含む、実験装置で培養された生細胞または組織を含む。特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、収集および凍結され得、そしてｅｘｖｉｖｏ処理のために後に解凍され得る。生存する細胞または組織を使用して数日より長く続く組織培養実験または手順は、典型的には「ｉｎｖｉｔｒｏ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語はｅｘｖｉｖｏと互換可能に使用できる。

「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生体内部で起こる活動を指す。

本明細書で使用されるとき、「リプログラミング」または「脱分化」または「増加した分化能」または「増加した発生能」という用語は、細胞の分化能を増加させる方法、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、増加した分化能は、リプログラミングされていない状態の同一の細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。換言すると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態にある同一の細胞よりも分化されていない状態にある細胞である。

本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、特殊化していない（「未コミット」）またはあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞または筋細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化したまたは分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化したり、分化度の低い細胞型に戻ったりすることのできない細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、生体または体細胞の全ての系統を形成する細胞（すなわち、胚そのもの）の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生体を生じさせることができない不完全なまたは部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生体を発生することができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）まで及ぶ発生能の連続体である。

本明細書で使用されるとき、「誘導多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、誘導または変更された、分化した成人、新生児または胎児細胞から生成された、すなわち、３つの全ての胚葉または真皮層：中胚葉、内胚葉、および外胚葉の全ての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。生成されたｉＰＳＣは、天然に存在する細胞を指さない。

本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、全ての３つの主要な胚葉の外胚葉、内胚葉、および中胚葉の誘導体を発生させる。それらは、胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。

本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞に分化するが、３つ全てにではない発生能を有する細胞を指す。したがって、多能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ばれ得る。多能性細胞は当該技術分野で周知であり、多能性細胞の例には、例えば造血幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多能性」は、細胞が特定の系統の多くの型の細胞を形成するが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多能性造血細胞は多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。

多能性は、細胞の多能性特性を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己複製の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０などの多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、（ｖｉ）３つの体細胞系列の細胞からなる胚様体の形成が含まれるが、これらに限定されない。

後期胚盤胞の胚盤葉幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」または「準安定」状態の多能性と、初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」または「グラウンド」状態の多能性の、２つの型の多能性がこれまでに記載されている。両方の多能性状態は上述のような特性を示すが、ナイーブまたはグラウンド状態は、（ｉ）女性細胞におけるＸ染色体の事前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中の向上したクローン性と生存率、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の減少、（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比較して減少した分化マーカーの発現をさらに示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、結果として得られる多能性細胞からサイレンシングまたは除去される細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有すると見られている。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、プライミング状態に留まり、グラウンド状態の特徴が観察される。

本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞の形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または他の飼育動物を指す。

「多能性因子」または「リプログラミング因子」は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、非限定的に、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が含まれる。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子および小分子リプログラミング剤が含まれる。

「培養」または「細胞培養」は、ｉｎｖｉｔｒｏ環境における細胞の維持、増殖および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（いずれの場合も単数の「培地」）、「補充成分」および「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。

「培養する」または「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）細胞培養皿またはフラスコ内で、組織または体外の細胞を維持、増殖（増殖）、および／または分化させることを指す。「培養」または「維持すること」は、細胞の増殖および／または維持に役立つ栄養素、ホルモン、および／または他の因子の供給源として培地を利用することができる。

本明細書で使用されるとき、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に出現し、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、その他の支持組織と結合組織を含む様々な特殊化された細胞型を生じさせる、３つの胚葉のうちの１つを指す。

本明細書で使用される場とき、「二次造血内皮」（ＨＥ）または「多能性幹細胞由来の二次造血内皮」（ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞および前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て二次造血内皮細胞および造血前駆細胞へと順次進行する。

「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、または「造血前駆細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、さらなる造血分化が可能であり、多能性造血幹細胞（血球）、骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書で使用されるとき、「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を含む成熟骨髄性とリンパ性細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞はまた、原始赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットを含む。

本明細書で使用されるとき、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は互換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の同定、ならびに他の免疫細胞の活性化および不活性化を含む免疫系における様々な役割を有する主要なタイプの白血球を指す。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞であることができ、任意の発生段階のものであることができる。追加のタイプのヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加のタイプのメモリーＴ細胞には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指すこともできる。Ｔ細胞は、幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。

「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、それらの表面でＣＤ４を発現し、細胞性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」は、もともとＴリンパ球の分化抗原として定義された５５－ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見出される。ＣＤ４抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、ヘルパー／インデューサーのサブセットを定義する。

「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、そして細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性およびサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用の関連認識要素である。

本明細書で使用されるとき、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用されるとき、「適応ＮＫ細胞」および「メモリーＮＫ細胞」という用語は互換可能であり、表現型的にＣＤ３－およびＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、ならびに必要に応じてＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、およびＥＡＴ－２のうちの１つ以上の発現を欠く、ＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化および抑制性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、ならびに／またはＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、暗いまたは明るい発現であり得る。

本明細書で使用されるとき、「ＮＫＴ細胞」または「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つのタイプのＮＫＴ細胞が認識される。インバリアントまたはＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリー－限定された範囲のβ鎖（ヒトではＶβ１１）に関連する正規のα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的または非インバリアントのタイプＩＩＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の第２の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を提示する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は免疫療法に適していると考えられている。適応またはインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲＶａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、およびＣＤ５６のマーカーのうちの少なくとも１つ以上の発現によって識別できる。

本明細書で使用されるとき、「単離された」などの用語は、その元の環境から分離された、すなわち、単離された細胞の環境は、「分離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない細胞または細胞の集団を指す。この用語は、例えば、組織または生検試料から単離された、その天然環境で見られるようないくつかまたは全ての成分から取り出された細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、細胞培養物または細胞懸濁液から単離された環境で見られるため、少なくとも１つ、いくつか、または全ての成分から取り出された細胞を含む。したがって、単離された細胞は、天然で見られる場合、または非天然の環境で増殖、保管、または存続する場合、他の物質、細胞、または細胞集団を含む少なくとも１つのコンポーネントから部分的または完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、および天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞またはその集団を、環境中の他の物質または細胞から分離することから、または環境から１つ以上の他の細胞集団または亜集団を取り除くことから得ることができる。

本明細書中で使用されるとき、「精製する」などの用語は、純度を増加することをいう。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％に増加させることができる。

本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）の定義された配列またはアミノ酸の定義された配列およびそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードしているということができる。

「コンストラクト」は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達または導入を誘導することができ、標的細胞で複製および／または発現することができる任意の核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、送達されるコンストラクトを含む。ベクターは、直鎖状または環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれることも組み込まれないこともできる。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

「組み込み」とは、コンストラクトの１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組み込み」とは、コンストラクトのヌクレオチドが、予め選択された部位または「組み込み部位」で細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列またはヌクレオチドの欠失を伴うかまたは伴わない、コンストラクトの１つ以上の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を含むプロセスをさらに指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列または１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換をさらに含み得る。

本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子または参照活性が宿主細胞に導入されるか、または宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、または非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照された分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。

本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはｉｎｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然のポリペプチド（すなわち、天然に見られるポリペプチド）またはそれらの断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）またはその断片、改変されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療用のペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択可能なマーカーなどをコードし得る。

本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：シアデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；および、ポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）からなる。ポリヌクレオチドには、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。

本明細書で使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、一般に当該技術分野でポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方の影響を受ける、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結することができる。

本明細書で使用されるとき、「遺伝子インプリント」という用語は、ソース細胞またはｉＰＳＣの優先的な治療属性に寄与し、ソース細胞由来のｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣ由来の造血系統細胞で保持可能な遺伝的またはエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用されるとき、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞由来のｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型にさらに分化し得る。ソース細胞由来のｉＰＳＣ、およびそこから分化した細胞は、文脈に応じて、「誘導」細胞または「誘導」細胞と総称し得る。例えば、本出願全体で使用される誘導エフェクター細胞、または誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然供給源から取得されたそれらの主要な対応物と比較するとき、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリントは、ドナー、疾患、または治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、またはゲノム編集を用いてｉＰＳＣに遺伝子組み換えモダリティを導入することにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。特異的な選択されたドナー、疾患、または治療状況から得られたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子イベントが識別されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞の誘導細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的またはエピジェネティックを含み得る。ドナー、疾患、または治療応答に特異的なソース細胞は、ｉＰＳＣおよび派生した造血系統細胞で保持可能な遺伝子インプリントを含むことができ、これらの遺伝子インプリントには、ウイルス特異的Ｔ細胞またはインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの事前に配置された単一特異性ＴＣＲ、追跡可能な望ましい遺伝的多型、例えば、選択されたドナーの高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異のホモ接合性、所定のＨＬＡ要件、すなわち、集団が増加したハプロタイプを示す選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性には、誘導細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と調整、生存率、および細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性はまた、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境への耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導と免疫調節、腫瘍外効果が低減された改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性にも関連している可能性がある。

本明細書で使用されるとき、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な未改変および／または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強され、改善され、および／または増加した治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と調節、生存率、および細胞傷害性が含まれるが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境への耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導と免疫調節、腫瘍外効果が低減された改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性によっても表れる。

本明細書で使用されるとき、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球と、腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、または多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば細胞傷害性応答を誘発または開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体および細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞、例えば腫瘍細胞との間の二重特異性抗体または多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現するさまざまなエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞タイプに関係なく任意のエフェクター細胞で発現および活性化できることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識できる同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結できる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープとを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端の表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。

本明細書で使用されるとき、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性またはその他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化および組織特異的および／または一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写および転写後の遺伝子調節および／または抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例において、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えばプロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、およびそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。

本明細書で使用されるとき、「薬学的に活性なタンパク質またはペプチド」という用語は、生物に対して生物学的および／または薬学的効果を達成することができるタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的または緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減、緩和、逆転または軽減するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、またはそれが出現した場合にそのような疾患または病態の重症度を軽減するために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、タンパク質またはペプチド全体またはその薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質もしくはペプチドの薬学的に活性な類似体またはタンパク質もしくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的または相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体またはその断片、増殖因子、および／またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節、関与、阻害、活性化、低減、または増大させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、およびＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「標的化モダリティ」は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）固有のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連するときの抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関連するときのエンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、およびｖ）特異的な抗原または表面分子の非存在下でのその他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原および／またはエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用されるとき、「特異的」または「特異性」という用語は、非特異的または非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体またはエンゲージャーの能力を指すために使用できる。

本明細書で使用されるとき、「養子細胞療法」という用語は、輸血の前にｅｘｖｉｖｏで増殖している、遺伝子改変された、または改変されていない、ＴまたはＢ細胞として同定される、自家性または同種異系のリンパ球の輸血に関連する、本明細書で使用される、細胞ベースの免疫療法を指す。

本明細書で使用されるとき、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療および／または医薬組成物の非毒性であるが十分かつ／または有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、ならびに状態の病気および重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療されている対象の疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を改善、軽減、および／または改善するのに十分および／または有効である。

多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤および細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている３次元のクラスターであり、３次元領域内で多数の系統を発生させる。通常は数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、さらに分化を続けるように処理される。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を細胞の３次元多層クラスター内で互いに近接させることによって開始さ、これは典型的には、多能性細胞を液滴として沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させること、または機械的攪拌によるものを含むいくつかの方法の１つによって実現される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体にはさらに分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内の中程度の増殖の分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、および内胚葉の胚葉）を生成する。ＥＢは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化のキューに対する３次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、さまざまな分化状態の異種細胞を生じさせる。さらに、ＥＢは作成と保守が面倒である。さらに、ＥＢによる細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。

対照的に、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」とは異なり、多能性幹細胞由来細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖の間、培養培地は、増殖および多能性を維持するように選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、日常的に機械的または酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養で凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化のキューを必要とする。

本明細書で使用されるとき、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化とは異なる分化方法、すなわち「ＥＢ形成」を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも単層分化は、分化開始のためのＥＢ形成の必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つ全ての胚葉分化と比較して最小限とみなされる。

本明細書で使用されるとき、「解離した」細胞は、他の細胞からまたは表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離または精製された細胞をいう。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法によって動物または組織から解離され得る。代替的に、ｉｎｖｉｔｒｏで凝集する細胞は、例えば、クラスターの懸濁液、単一の細胞または単一の細胞とクラスターの混合物への酵素的または機械的な解離によって、互いに解離され得る。さらに別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（培養面など）との細胞相互作用を破壊すること、または細胞間のＥＣＭを破壊することが含まれる。

本明細書で使用されるとき、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第２の型の細胞と共培養されて、第２の型の細胞が増殖、増殖、または分化できる環境を提供する、１つの型の細胞を表す用語であり、フィーダー細胞は刺激、増殖因子、栄養素を提供し、第２の細胞型を支持する。フィーダー細胞は、それらが支持している細胞とは異なる種に由来してもよい。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞または形質転換白血病細胞は、ナチュラルキラー細胞の増殖および成熟を支持する。フィーダー細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射またはマイトマイシンなどの抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。一般に、さまざまなフィーダー細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。

本明細書で使用されるとき、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境とは、フィーダーまたは間質細胞を本質的に含まない、および／またはフィーダー細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養または培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。前処理された培地には、培地で培養されたフィーダー細胞から分泌された増殖因子およびサイトカインを含む、多くのメディエーター物質が含まれる。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞または間質細胞の両方を含まず、フィーダー細胞の培養によって前処理もされていない。

ｉＰＳＣ、およびそこから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集または改変、または非多能性細胞およびそこからリプログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集または改変の文脈で使用される「機能的」とは、（１）直接的なゲノム編集または改変によって、または最初にゲノム操作された開始細胞からの分化またはリプログラミングを介した「通過」によって達成される、遺伝子レベルでの成功したノックイン、ノックアウト、ノックダウンの遺伝子発現、トランスジェニックまたは制御された遺伝子発現、例えば所望の細胞発生段階における誘導性または一過性の発現など、あるいは（２）（ｉ）直接的なゲノム編集により上記細胞で得られた遺伝子発現の改変、（ｉｉ）最初にゲノム操作された開始細胞からの分化またはリプログラミングを介した「通過」による上記細胞で維持される遺伝子発現改変、（ｉｉｉ）上記細胞の初期発生段階でのみ現れるか、または分化またはリプログラミングを介して上記細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる遺伝子発現改変の結果としての上記細胞の下流の遺伝子調節、あるいは（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆細胞、または脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集または改変に最初に由来する、成熟細胞製品内で提示された増強または新たに達成された細胞機能または属性による、細胞レベルでの除去、付加、または細胞機能／特性の変更を指す。

ＨＬＡクラスＩ欠損、もしくはＨＬＡクラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現のレベルが不足している、またはもはや維持されていない、または低下、減少または低下したレベルが、他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている細胞を指す。

本明細書で使用されるとき、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、走化性、および細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによってさらに改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。

「Ｆｃ受容体」はＦｃＲと略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－ａｌｐｈａ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、ＴおよびＢ細胞）と各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）など、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。

ＣＦｃＲと略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、または非天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通およびシグナル伝達ドメインの一方または両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発による細胞活性化、増殖、および機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、または抗体のＦｃ領域、またはエンゲージャーもしくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的細胞を近傍に近づけるか、または近づけなくとも、分子に結合して細胞機能を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する細胞内領域において選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって生成される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性をさらに向上させるために、ＣＤ６４の細胞外ドメインまたはＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインが含まれるＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解性切断部位が除去されているか、または受容体の細胞外ドメインが非切断性であるように置き換えられて、すなわち、シェディングされないようになり、これにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが取得される。

ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６には、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）とＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームがあると同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、または「高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）」は、ＣＤ１６の天然または非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上のさまざまな細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６ＶおよびＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９位～２１２位）における切断部位（１９５位～１９８位）が変更または削除されたＣＤ１６バリアントは、シェディングしない。切断部位および膜近位領域は、ＷＯ２０１５１４８９２６に詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６のＳ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンである。Ｆ１５８ＶとＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは親和性が高く、非切断性である。別の例示的な高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエクソンの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。

Ｉ．増強された特性を持つ養子細胞療法に有用な細胞および組成物
本明細書で提供されるのは、誘導細胞の治療特性を増強しながら、ｉＰＳＣの分化能およびｉＰＳＣおよびその誘導細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンｉＰＳＣの調節回路を体系的に操作する戦略である。誘導細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム工学を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に適している。本発明以前には、提供された１つまたは複数の遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが改変された活性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力、および／または成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣからの指示された細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現またはその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、および細胞の表現型および／または機能の変化を可能にする分化プロトコールの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない側面に起因する。本出願は、本明細書で提供される１つ以上の選択されたゲノム改変がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさないこと、ならびに操作されたｉＰＳＣに由来する機能エフェクター細胞が、ｉＰＳＣ分化後にエフェクター細胞に保持される、個々のまたは組み合わせたゲノム改変に起因する増強および／または獲得した治療特性を有することを示した。

１．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫およびＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクター機構には、食作用（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）も含まれ得る。

ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞ならびにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞にも発現する。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４^＋幹細胞と、リンパ系、赤血球系、および骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、ならびに形質細胞期まで続く成熟の最終段階で発現する。タイプＩＩ膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３８は、受容体およびヌクレオチド代謝産物の生産に関与する多機能酵素の両方として細胞機能を果たす。酵素として、ＣＤ３８は合成とＮＡＤ^＋からＡＤＰ－リボースへの反応の加水分解を触媒し、これによって、カルシウム依存性である、細胞接着のプロセスに重要である、小胞体とリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲとＮＡＡＤＰを生成する。ＣＤ３８は受容体としてＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞のサイトカイン放出と細胞傷害性を調節する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ^２＋フラックスを調節し、リンパ系および骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介することも報告されている。

悪性腫瘍の治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞を全身的に使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエントの免疫エフェクター細胞機能が損なわれるため、治療応答が不完全になり、効力が低下または排除される。さらに、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄と末梢血の両方でＮＫ細胞の減少が観察されたが、Ｔ細胞やＢ細胞などの他の免疫細胞タイプは、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆｅｔａｌ．，ＢｌｏｏｄＡｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に拘束されることなく、本出願は、ＣＤ３８特異的抗体および／またはＣＤ３８抗原結合ドメインが誘導するフラトリサイドを通じたエフェクター細胞の枯渇または減少を克服することにより、ＣＤ３８標的化がん治療の潜在能力を最大限に活用する戦略を提供する。さらに、ＣＤ３８はＴ細胞やＢ細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、同種異系エフェクター細胞のレシピエントでダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用してこれらのリンパ球の活性化を抑制することにより、これらのエフェクター細胞に対する同種拒絶反応が減少および／または防ぎ、それによってエフェクター細胞の生存率と持続性を増加させる。このように、本出願はまた、レシピエントＴ細胞およびＢ細胞の活性化に対するＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャーまたはＣＤ３８ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用することによる同種拒絶反応の低減または防止を通じてエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増強する戦略を提供する。具体的には、提供される戦略には、ＣＤ３８ノックアウトｉＰＳＣ系統の生成と、操作されたｉＰＳＣ系統の分化誘導によるＣＤ３８ｎｕｌｌ（ＣＤ３８^－／－）誘導エフェクター細胞の取得が含まれる。本出願の前は、ＣＤ３８が上述のように細胞発生生物学と細胞機能で多くの重要な役割を果たすことを考えると、ｉＰＳＣにおいてＣＤ３８を破壊するとｉＰＳＣ分化、誘導細胞表現型、およびエフェクター細胞機能を含む側面が混乱するかどうかは不明であった。

本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８ｎｕｌｌｉＰＳＣ株は、指示された分化をして、決定的な造血内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない機能的な誘導造血細胞を生成することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体を使用してＡＤＣＣを誘導するか、または抗ＣＤ３８ＣＡＲを標的化細胞殺傷に使用する場合、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣおよび／またはその誘導エフェクター細胞は抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３８ＣＡＲによって排除されず、これにより、そのような治療剤の存在下および／または曝露後のｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療剤の存在下で、および／または曝露後の、ｉｎｖｉｖｏでの持続性および／または生存率が増加している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ｎｕｌｌエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ｎｕｌｌエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ｎｕｌｌｉＰＳＣおよび誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６発現、ＣＡＲ発現、サイトカイン／サイトカイン受容体発現、ＨＬＡＩおよび／またはＨＬＡＩＩノックアウト、ならびに提供される追加のモダリティを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つ以上の追加のゲノム編集を含む。

２．ｈｎＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）という２つのアイソフォームとして同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、または「高親和性非切断性ＣＤ１６」は、さまざまなＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上のさまざまな細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６Ｖ（一部の出版物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれます）は、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、遺伝子操作された例示的な非切断性バージョンのＣＤ１６である。Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、ＷＯ２０１５／１４８９２６により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＣＤ１６の外部ドメインがＣＤ６４の外部ドメインの少なくとも一部で本質的に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体は、ＡＤＣＣを実行できるＣＤ１６受容体の望ましい高親和性と切断不可能な機能も実現できる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４またはそのアイソフォームまたは多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、およびＥＣ３エクソンのうちの１つ以上を含む。

したがって、いくつかの実施形態では、高親和性非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）は、Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が除去されている。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、例示的な配列である、それぞれがＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部を含む配列番号７、８、および９のいずれかと比較されるとき、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。配列番号７、８、および９は、それぞれ、配列番号１０～１２を例示することによりコードされる。本明細書および本出願全体で使用されるように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較と２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して実行できる。

したがって、本明細書で提供されるのは、本明細書で企図および説明されている他の編集の中でも特に、高親和性非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）を含むように遺伝子操作されたクローンｉＰＳＣであり、遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入されたｈｎＣＤ１６を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む誘導エフェクター細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む誘導エフェクター細胞はＴ細胞である。ｉＰＳＣまたはその誘導細胞で発現する外因性ｈｎＣＤ１６は、ＡＤＣＣ抗体またはその断片だけでなく、上記ｈｎＣＤ１６のＣＤ１６またはＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーへの結合にも高い親和性を示す。二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーについては、本出願で以下でさらに説明する（セクションＩ．７を参照されたい）。このように、本出願は、以下のセクションＶでさらに詳述する状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量で、誘導エフェクター細胞上で発現するｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインとの高親和性結合を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導エフェクター細胞またはその細胞集団を提供し、上記ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の、またはＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。

いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６の天然のＣＤ１６膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインは、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）が非天然の膜貫通ドメイン、非天然の刺激性ドメイン、および／または非天然のシグナル伝達ドメインを含むように生成されるように、さらに改変または置換される。本明細書で使用される「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。本明細書での例示では、ＣＤ１６またはそのバリアントに基づくＣＦｃＲは、ＣＤ１６に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、外因性のｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然の刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメインを含む。ｈｎＣＤ１６の１つの態様において、提供されるキメラ受容体は、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちのいずれかに両方が由来する膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインを含む。ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の１つの特定の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の細胞外ドメインの全長または部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインはＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の細胞外ドメインの全長または部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインはＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。

上述のようなｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、抗体またはその断片のＦｃ領域に、または、二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーのＦｃ領域に、高い親和性で結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化およびサイトカイン分泌を可能にし、抗体、または上記の、腫瘍抗原結合コンポーネントおよびＦｃ領域を有する、二重特異性、三重特異性、または多重特異的エンゲージャーまたはバインダーが標的とする腫瘍細胞を殺傷する。理論に制限されることなく、ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の非天然の膜貫通、刺激および／またはシグナル伝達ドメインを通じて、または外部ドメインへのエンゲージャーの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺傷能力に寄与し、エフェクター細胞の増殖および／または増殖の可能性を増加させる。抗体とエンゲージャーは、抗原を発現している腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現しているエフェクター細胞を近接させることができ、これも増強された腫瘍細胞の殺傷に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーのための例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、およびＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに適したいくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーには、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、およびＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。

ＮＫ細胞活性化に続いて細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６受容体とは異なり、誘導ＮＫの種々の非切断性バージョンのＣＤ１６は、ＣＤ１６のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。誘導ＮＫ細胞では、非切断性ＣＤ１６は、向上した細胞機能の指標であるＴＮＦαおよびＣＤ１０７ａの発現を増加させる。非切断性ＣＤ１６はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および二重、三重、または多重特異的エンゲージャーの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介性溶解のメカニズムである。誘導ＮＫ細胞に導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＡＤＣＣ抗体のＮＫ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏローディングも可能になる。提示されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態においてＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含み得、または配列番号７、８、もしくは９によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメインを含み得、または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションＶで詳しく説明するように、状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導ＮＫ細胞またはその細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含むＮＫ細胞はＣＤ３８ノックアウトをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６およびＣＤ３８ノックアウトを含む誘導されたＮＫ細胞は、抗ＣＤ３８抗体を予めロードされている。いくつかの実施形態では、予めロードされた抗ＣＤ３８抗体はダラツムマブである。

初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源）由来の成熟Ｔ細胞はＣＤ１６を発現しない。発現した外因性の非切断性ＣＤ１６を含むｉＰＳＣが、Ｔ細胞の発生生物学を損なうことなく、外因性ＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得したＡＤＣＣメカニズムを通じて機能を実行できる機能的なＴ細胞に分化できることは予想外であった。誘導Ｔ細胞で獲得したこのＡＤＣＣは、二重標的化、および／またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法でよく発生する、低下もしくは消失したＣＡＲ－Ｔ標的抗原の発現、もしくはＣＡＲ（キメラ抗原受容体）による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再発する、抗原エスケープを救済するためのアプローチとしてさらに使用できる。上記誘導Ｔ細胞が外因性ＣＤ１６発現を介して獲得したＡＤＣＣを含み、抗体がＣＡＲが標的とする腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用してＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的腫瘍の再発または再発を軽減または防止できる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減および／または防止するこのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用できる。この抗原エスケープの低減および防止戦略で使用できるさまざまなＣＡＲについて、以下で詳しく説明する。

このように、本発明は、外因性ＣＤ１６を含む誘導Ｔ細胞を提供する。さらに提供される実施形態では、本明細書で得られる誘導Ｔ細胞は、ｈｎＣＤ１６の発現に加えて、ＣＤ３８ノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、誘導Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。他のいくつかの実施形態では、誘導Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、配列番号７、８、もしくは９によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメインを含み、または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。説明されているように、そのような誘導Ｔ細胞は、抗体の治療効果を高めるためにＡＤＣＣによって媒介されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得されたメカニズムを有する。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションＶで詳しく説明するように、状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導Ｔ細胞またはその細胞集団を提供する。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６を発現する誘導Ｔ細胞はまた、ＣＤ３８ｎｕｌｌであり、その結果、細胞は、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する治療薬の存在下にあるときに排除されることを回避できる。一実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する上記治療薬は抗ＣＤ３８抗体である。別の実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する上記治療薬は、ＣＤ３８結合領域、例えば抗ＣＤ３８ｓｃＦＶを含むＣＡＲである。

３．ＣＡＲの発現
遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその誘導エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で知られている任意のＣＡＲの設計であり得る。ＣＡＲ、すなわちキメラ抗原受容体は、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを含む外部ドメインを一般に含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドもしくはリーダー配列および／またはスペーサーをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患または病原体に関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍または固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、上記ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞のいずれかを活性化するのに適している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ特異的シグナル伝達コンポーネントを含むＮＫ細胞特異的である。特定の実施形態では、上記Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来し、誘導Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、上記ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。

特定の実施形態では、上記抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ＩｇＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはその抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）_２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、および抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれる。ＣＡＲによって標的化され得る抗原の非限定的な例には、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および当該技術分野で公知の様々な病原体抗原が含まれる。病原体の非限定的な例には、疾患を引き起こす可能性のある、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および原生動物が含まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドの天然または改変された膜貫通領域の全長または少なくとも一部を含む。

いくつかの実施形態では、内部ドメインドメイン（または細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの全長または少なくとも一部を含む。一実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ペプチドは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、前記内部ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。上記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、もしくはＮＫＧ２Ｄ、またはそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長または少なくとも一部を含むことができる。

一実施形態では、本出願において提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン、および配列番号１３に対して少なくとも約８５％約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζの天然または改変ＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施形態において、ＣＤ２８に由来する共刺激ドメインおよびＣＤ３ζの天然または改変ＩＴＡＭ１を含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８に由来するヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを含み、ｓｃＦｖはヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号１４に対してと少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、本出願において提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメイン、２Ｂ４に由来する共刺激ドメイン、および配列番号１５に対して少なくとも約８５％約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表される天然または改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメイン、２Ｂ４に由来する共刺激ドメイン、および天然または改変されたＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む上記ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジをさらに含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のものである。

非限定的なＣＡＲ戦略には、細胞内ドメインのペアの二量体化によるヘテロ二量体の条件付き活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９５８７０２０号を参照されたい）、ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、および内部ドメインの相同組換えであるスプリットＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）、抗原結合ドメインとシグナル伝達ドメインにそれぞれ接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有リンクを可能にする多重鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）、二重特異性抗原結合ドメインを有する（例えば、米国特許第９４４７１９４号を参照されたい）、または同じかもしくは異なる抗原もしくはエピトープを認識する抗原結合ドメインのペアを有する（例えば、米国特許第８４０９５７７号を参照されたい）ＣＡＲ、またはタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２を参照されたい）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）、切り替え可能なＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）、および、当該技術分野で知られている他の設計がさらに含まれる。

したがって、本明細書で提供されるのは、ゲノム操作されたｉＰＳＣの分化から得られた誘導細胞を含み、ｉＰＳＣと誘導細胞の両方は、ＣＤ３８ノックアウトおよび／またはｈｎＣＤ１６を含むがこれらに限定されない追加の改変されたモダリティとともに１つ以上のＣＡＲを含む。特定の一実施形態では、ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、および選択された腫瘍またはウイルス抗原を標的化するＣＡＲを含み、ここで、誘導細胞はＮＫまたはＴ細胞であり、そして誘導細胞は、ｈｎＣＤ１６結合を介して、同じ腫瘍の二重標的化を達成しながら腫瘍抗原エスケープを回避または低減するために、ＣＡＲによって標的化されたものとは異なる腫瘍抗原を標的とする、ＡＤＣＣ抗体または二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーの１つ以上とともに使用され得る。さらなる実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその誘導Ｔ細胞は、ＴＣＲ定常領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＣＲノックアウトをもたらし、ＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモーターの制御下に置く。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣに由来する誘導ＴＣＲｎｕｌｌＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖおよび／またはＳ１９７Ｐ）に天然な、またはＣＤ６４に由来する外部ドメイン、ならびに天然または非天然の膜貫通、刺激、およびシグナル伝達ドメインを有するｈｎＣＤ１６をさらに含む。別の実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその誘導ＮＫ細胞は、ＣＡＲをＮＫＧ２Ａ遺伝子座またはＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入し、ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、ＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄプロモーターの制御下に置く。

４．外因的に導入されたサイトカインおよび／またはサイトカインシグナル伝達
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらの対応する受容体のうちの１つ以上の部分的または完全なペプチドが細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴ってまたは伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖、増殖、増殖、および／またはエフェクター機能を維持または改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカインおよび／またはそのそれぞれの天然または改変された受容体は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。

図１は、ＩＬ１５を例として使用したいくつかの構成設計を示す。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対して天然であり得るか、または、他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変または置換されている。

設計１：ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。

設計２：ＩＬ１５Ｒαはリンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のｃｉｓ提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を確保する。

設計３：短縮された細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、シス提示および／またはその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される他の潜在的なシグナル伝達経路を排除する。ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインは、受容体がＩＬ１５応答細胞で発現し、応答細胞が増殖して機能するために重要であると考えられている。そのような短縮化コンストラクトは、配列番号１７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号１８によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの一実施形態では、コンストラクトは、配列番号１７の最後の４アミノ酸「ＫＳＲＱ」を含まず、配列番号２１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。

当業者は、上述のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に適したそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの適切なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび／またはリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、またはリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることを理解する。

設計４：設計３のコンストラクトはエフェクター細胞の生存と増殖の促進に機能することが示されているため、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、このような設計でＩＬ１５を備えたエフェクター細胞の自律機能に悪影響を与えずに省略できることを示しており、設計４は、設計３の別の機能する代替案を提供するコンストラクトであり、Ｓｕｓｈｉドメインを除いて、本質的にＩＬ１５Ｒα全体が削除され、一方の端でＩＬ１５と、もう一方の膜貫通ドメイン融合し（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）と、必要に応じて、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインの間のリンカーを含む。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計４などのコンストラクトでは、ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、ｃｉｓ提示を含む、ＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達が排除される。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含むコンポーネントは、配列番号１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２０によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。

設計５：天然または改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合およびトランス提示を維持する。

設計６：天然または改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達および膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖またはＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマまたはＩＬ２ＲＧとしても知られている。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、およびＩＬ２１受容体を含むがこれらに限定されない多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。

設計７：ＩＬ１５の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。

いくつかの実施形態では、サイトカインＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８およびＩＬ２１、および／またはそれらの受容体の１つ以上は、図１の設計の１つ以上を使用してｉＰＳＣ、およびｉＰＳＣ分化時のその誘導細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２またはＩＬ１５の細胞表面発現およびシグナル伝達は、設計１～７のいずれか１つに示されるコンストラクトを介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１の細胞表面発現およびシグナル伝達は、共通受容体またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に示されるコンストラクトを介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ７の細胞表面発現およびシグナル伝達は、共通受容体またはＩＬ４受容体などのサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に示されるコンストラクトを介する。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、対応するサイトカイン受容体に対して天然であり得るか、または、他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変または置換されている。

ＣＡＲと外因性サイトカインおよび／またはサイトカイン受容体シグナル伝達の両方を含むｉＰＳＣおよびそれからの誘導細胞では、ＣＡＲとＩＬは別々のコンストラクトで発現されるか、ＣＡＲとＩＬの両方を含むバイシストロニックなコンストラクトで共発現される。いくつかのさらなる実施形態では、図１のコンストラクト設計のいずれかによって表される形態のＩＬ１５は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現コンストラクトの５’または３’末端のいずれかに連結され得る。そのため、ＩＬ１５とＣＡＲは単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。一実施形態では、ＣＡＲー２ＡーＩＬ１５またはＩＬ１５ー２ＡーＣＡＲコンストラクトは、図１の設計３のＩＬ１５を含む。別の実施形態では、ＣＡＲー２ＡーＩＬ１５またはＩＬ１５ー２ＡーＣＡＲコンストラクトは、図１の設計３のＩＬ１５を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＲー２ＡーＩＬ１５またはＩＬ１５ー２ＡーＣＡＲコンストラクトは、図１の設計７のＩＬ１５を含む。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲが発現すると、自己切断２Ａペプチドにより、発現されたＣＡＲとＩＬ１５が解離し、解離したＩＬ１５を細胞表面に提示することができるようになる。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲのバイシストロニックな設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のＯＲＦの発現のための誘導可能なプロモーターなどの、組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、およびブタテチョウイルス１（ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）、ならびにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）および脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含むピコルナウイルス科のメンバーで見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－１、およびＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」と呼ばれることもある。

ＩＬ１５について本明細書に開示されるバイシストロニックなＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲの実施形態は、本明細書で提供される他の任意のサイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１の発現も企図される。いくつかの実施形態では、ＩＬ２の細胞表面発現およびシグナル伝達は、設計１～７のいずれかに示されるコンストラクトを介する。他のいくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１の細胞表面発現およびシグナル伝達は、共通受容体および／またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用する、設計５、６、または７に示されるコンストラクトを介する。

５．ＨＬＡ－Ｉ－およびＨＬＡ－ＩＩ－の欠損
同種拒絶の問題を回避するために、複数のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書で提供されるのは、ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩのタンパク質の両方の発現が排除または実質的に減少したｉＰＳＣ細胞株である。ＨＬＡクラスＩ欠損症は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的削除、またはベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、およびタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の削除もしくは発現レベルの低下によって達成できる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＨＬＡクラスＩヘテロダイマーの細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをエンコードする。Ｂ２Ｍｎｕｌｌ細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または減少によって達成できる。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベーターであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を通じて機能する。ＣＩＩＴＡｎｕｌｌ細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。ここで提供されるのは、Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡの両方がノックアウトされたｉＰＳＣ系統とその誘導細胞であり、得られた誘導エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）マッチングの必要性を排除して宿主の（同種異系）Ｔ細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。

一部の細胞型では、クラスＩ発現の欠如がＮＫ細胞による溶解を引き起こす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを必要に応じてノックインして、操作されたｉＰＳＣに由来するＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識と死滅を回避できる。一実施形態では、ＨＬＡーＩおよびＨＬＡーＩＩ欠損ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、ｉＰＳＣの分化能ならびに誘導Ｔ細胞および誘導ＮＫ細胞を含む誘導エフェクター細胞の機能に悪影響を及ぼさずに、ＣＤ３８ノックアウト、および必要に応じてｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、およびＩＬの１つ以上をさらに含む。

６．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ系統と誘導細胞
上記に照らして、本出願は、ＣＤ３８^－／－（本明細書では「ＣＤ３８ｎｕｌｌ」またはＣＤ３８ノックアウトとも呼ばれる）ｉＰＳＣ、細胞株細胞、またはその集団、およびＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣの分化から得られるＣＤ３８ノックアウトを含む誘導された機能性誘導細胞を提供する。いくつかの実施形態において、機能性誘導細胞は造血細胞であり、決定的な造血内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、機能的誘導造血細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および調節細胞などのエフェクター細胞を含む。

本明細書でさらに提供されるのは、ＣＤ３８ノックアウト、および高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣは、指示された分化により機能的造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体を使用してｈｎＣＤ１６媒介増強ＡＤＣＣを誘導する場合、ｉＰＳＣおよび／またはその誘導エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除、すなわち、ＣＤ３８発現エフェクター細胞の減少または枯渇を引き起こすことなく、それによってｉＰＳＣとそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させ、ＣＤ３８発現（腫瘍）細胞を標的化することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、抗ＣＤ３８抗体またはＣＡＲ結合ＣＤ３８であり得る抗ＣＤ３８治療剤の存在下で、増加したｉｎｖｉｖｏでの持続性および／または生存率を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＴ細胞を含む。ＣＤ３８ｎｕｌｌおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＴ細胞は、抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３８ＣＡＲの存在下で細胞枯渇の減少を経験し、ＡＤＣＣを獲得しし、Ｔ細胞を介した腫瘍殺傷のさらなるメカニズムをもたらす。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＮＫ細胞を含む。ＣＤ３８ｎｕｌｌとｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、細胞傷害性が増強されており、抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３８ＣＡＲの存在下でＮＫ細胞のフラトリサイドが減少している。

ＣＤ３８ノックアウト、および標的特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣが本明細書で提供され、ｉＰＳＣは、指示された分化により機能的誘導エフェクター細胞を産生することができる。一実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣおよびその誘導体エフェクター細胞に含まれるＣＡＲは、腫瘍細胞表面タンパク質ＣＤ３８を標的化するが、ＣＤ３８－ＣＡＲは、ＣＤ３８ノックアウトを有するｉＰＳＣおよび／またはその誘導エフェクター細胞の排除をもたらさない。一部の実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣおよびその誘導エフェクター細胞に含まれるＣＡＲは、ＣＤ３８を標的化しない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現、ＣＤ３８ｎｕｌｌ誘導エフェクター細胞を抗ＣＤ３８抗体とともに使用して、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それによりｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させることができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、組み合わせ治療において、増加したｉｎｖｉｖｏでの持続性および／または生存率を有する。

さらに、ＣＤ３８ノックアウト、ならびに、細胞の生存率、持続製、および／または増殖に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にする少なくとも１つの外因性サイトカインおよび／またはその受容体（ＩＬ）をコードするポリヌクレオチドを含み、ｉＰＳＣ株は分化を指示して、生存率、持続性、増殖、およびエフェクター細胞機能が改善された機能的誘導造血細胞を産生することができる。外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のいずれか１つまたは２つまたはそれ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達のための、サイトカインおよび／またはそのそれぞれの受容体の導入された部分的または完全なペプチドは、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣまたはその誘導細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ７シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣまたはその誘導細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１０シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣまたはその誘導細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１５シグナル伝達を可能にする。上記ＣＤ３８^－／－ＩＬｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１のコンストラクト３によるものである。上記ＣＤ３８^－／－ＩＬｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１のコンストラクト４によるものである。上述の実施形態の上記ＣＤ３８^－／－ＩＬｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで追加的に供給される可溶性サイトカインに接触することなく、細胞増殖、増殖、増殖、および／またはエフェクター機能を自律的に維持または改善することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８^－／－ＩＬｉＰＳＣおよびその誘導エフェクター細胞を抗ＣＤ３８抗体とともに使用して、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それにより相乗的にｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させることができる。

ＣＤ３８ノックアウト、Ｂ２Ｍノックアウト、およびＣＩＩＴＡノックアウト、ならびに必要に応じて、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣも提供され、ｉＰＳＣは分化を指示して、機能的な誘導造血細胞を産生することができる。上記ＣＤ３８^－／－Ｂ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－ｉＰＳＣおよびその誘導エフェクター細胞は、ＨＬＡ－ＩとＨＬＡ－ＩＩの両方が欠損しており、抗ＣＤ３８抗体とともに使用して、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それにより相乗的にｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させることができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、増加したｉｎｖｉｖｏでの持続性および／または生存率を有する。

上述の観点から、本明細書で提供されるのは、ＣＤ３８ノックアウト、ならびに必要に応じて、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、外因性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを含むｉＰＳＣを含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが任意に導入され、ｉＰＳＣは、分化を指示して機能的な誘導造血細胞を産生することができる。本出願にはまた、ＣＤ３８ノックアウト、ならびに必要に応じて、ｈｎＣＤ１６、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、ＣＡＲ、および外因性サイトカイン／受容体のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを含む機能的なｉＰＳＣ誘導造血細胞も含まれ、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが必要に応じて導入され、誘導造血細胞には、決定的な造血性内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血細胞幹細胞および前駆細胞、造血系多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で提供される別の態様は、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの短縮化融合タンパク質を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞を含み、融合タンパク質は細胞内ドメインを含まない。図１では「ＩＬ１５Ｒα（ΔＩＣＤ）融合」および「ＩＬ５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ」として示されているが、これらの実施形態は、表１および本出願全体でさらにまとめてＩＬ１５Δと略される。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１７、１９または２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。さらに他のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ誘導細胞には、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、外来性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ以上がさらに含まれ、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが必要に応じて導入され、ｉＰＳＣは、指示された分化をして機能的な誘導造血細胞を産生することができ、誘導造血細胞には、決定的な造血性内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血細胞幹細胞および前駆細胞、造血系多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。

したがって、本出願は、表１の以下の遺伝子型のいずれか１つを含むｉＰＳＣおよびその機能的誘導造血細胞を提供する。ＩＬ１５Δとして指定されていない限り、これはＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの短縮化融合タンパク質であるが細胞内ドメインを有さないものとして詳細に説明されるが、表１で提供される「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のうちの１つを表す。さらに、ｉＰＳＣとその機能的誘導造血細胞がＣＡＲとＩＬの両方を含む遺伝子型を有する場合、ＣＡＲとＩＬは２Ａ配列を含むバイシストロニックな発現カセットに含まれる。対照的に、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲおよびＩＬは、ｉＰＳＣおよびその機能的誘導造血細胞に含まれる別々の発現カセット中にある。特定の実施形態では、ＣＡＲとＩＬの両方を発現するｉＰＳＣおよびその機能的誘導エフェクター細胞に含まれるのは、図１のコンストラクト３または４におけるＩＬ１５であり、ＩＬ１５コンストラクトは、ＣＡＲとともに、またはそれと別個に発現カセットに含まれる。

７．さらなる改変
いくつかの実施形態では、表１の遺伝子型のいずれか１つを含むｉＰＳＣおよびその誘導エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低下をさらに含み得るか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つでの導入された発現もしくは増加した発現をさらに含み得る。

二重特異性または多重特異性エンゲージャーは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、少なくとも１つのｓｃＦｖがエフェクター細胞表面分子に結合し、少なくとも別の１つが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識またはカップリングに使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子または表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、および本明細書に開示されるキメラＦｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、セクションＩ．２に記載されるような、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖおよび必要に応じてＳ１９７Ｐを含む）またはＣＤ６４細胞外ドメイン、および天然または非天然の膜貫通、刺激および／またはシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の細胞外ドメインの全長または部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインはＦ１７６Ｖおよび必要に応じてＳ１９７Ｐを含む。二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ１９である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０またはＣＤ６４－ＣＤ３０である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡまたはＣＤ６４－ＢＣＭＡである。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ３－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体はさらに、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカーとしての改変ＩＬ１５（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、または三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる）を含む。一実施形態では、ＴｒｉＫＥはＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭまたはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３またはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。

いくつかの実施形態では、二重特異性または多重特異性結合体の表面トリガー受容体は、時には細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子型を含むｉＰＳＣをさらに操作し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含むその他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。

８．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、または指標に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む追加の治療剤をこれらのエフェクター細胞と共に組み合わせ療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に適した抗体は、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、パーツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セルツキシマブ）、抗ＧＤ２（ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（アベルマブ）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）；およびそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＴ細胞を含む。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、少なくともＣＤ３８ｎｕｌｌを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞と、抗ＣＤ３８抗体とを含む。一実施形態では、組み合わせは、ＣＤ３８ｎｕｌｌおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞と、抗ＣＤ３８抗体であるダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２のうちの１つとを含む。一実施形態では、組み合わせは、ＣＤ３８ｎｕｌｌおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞と、ダラツムマブとを含む。いくつかのさらなる実施形態では、ダラツムマブとの組み合わせに含まれるｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｎｕｌｌ、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５、ならびにＣＤ３８またはＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的化するＣＡＲを含み、ここで、ＩＬ１５はＣＡＲと共発現または別々に発現され、ＩＬ１５は、図１のコンストラクト１～７に提示される形態のうちのいずれか１つである。いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ１５は、それがＣＡＲと共にまたは別々に発現される場合、コンストラクト３、４、または７の形態である。

９．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制または下方制御できる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子の発現または遺伝子産物を減少させたり、チェックポイント分子の活性を低下させたりして、阻害性チェックポイントをブロックし、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１またはＣＴＬＡ４を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、ＣＩとの組合せ療法で提供されるようにゲノム操作された機能的誘導細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。組み合わせ療法の一実施形態では、誘導細胞はＮＫ細胞である。組み合わせ療法の別の実施形態では、誘導細胞はＴ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書で提供される誘導ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのＴ細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された誘導ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、前記ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を軽減できることを示している。

一実施形態では、チェックポイント阻害剤の組み合わせ療法のための誘導ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、およびｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、ＣＡＲ発現、ならびに外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、誘導ＮＫ細胞は、表１に列挙された遺伝子型のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の誘導ＮＫ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低下をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つでの導入された発現もしくは増加した発現をさらに含む。

別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の組み合わせ療法のための誘導Ｔ細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、およびｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、ＣＡＲ発現、ならびに外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが必要に応じて含まれる。いくつかの実施形態では、誘導Ｔ細胞は、表１に列挙された遺伝子型のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の誘導Ｔ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低下をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つでの導入された発現もしくは増加した発現をさらに含む。

上記誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、ならびに必要に応じて、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、ＣＡＲ発現、および外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドが必要に応じて導入される。いくつかの実施形態では、上記のｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低下をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つでの導入された発現もしくは増加した発現をさらに含む。

本明細書で提供される誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞との組み合わせ療法に適したチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ－３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ－３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、ならびに抑制性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ＩｇＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、および抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用でき、または感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは２つまたは３つまたはそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（抗ＫＩＲ）、ＩＰＨ４３（抗ＭＩＣＡ）、ＩＰＨ３３（抗ＴＬＲ３）、リリムマブ（抗ＫＩＲ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ）、ニボルマブ（抗－ＰＤ１ｍＡｂ）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ１ｍＡｂ）、およびそれらの誘導体、機能的同等物、またはそれらのバイオシミラーの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＭｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイント拮抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、およびｍｉＲ－２９ｃを含むがこれらに限定されない。

提供される誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞との組み合わせ療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的とする少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、誘導細胞は表１に列挙される遺伝子型を有する。提供される誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞との組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、またはそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ、またはそれ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイントインヒビターおよび表１に列挙された遺伝子型を有する誘導細胞を含む組み合わせ療法のいくつかの実施形態において、上記チェックポイントインヒビターは、抗体、またはヒト化もしくはＦｃ改変バリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーであり、上記チェックポイント阻害剤は、上記抗体、またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、誘導細胞により産生される。いくつかの実施形態では、抗体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、またはチェックポイントを阻害するその断片もしくはバリアントは、別個のコンストラクトまたはＣＡＲと抗体またはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロニックなコンストラクトのいずれかでＣＡＲと共発現される。いくつかのさらなる実施形態では、抗体またはその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩまたはＣＩ－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現コンストラクトの５’または３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、チェックポイント阻害剤とＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。チェックポイント阻害剤が送達され、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することができる誘導エフェクター細胞によってペイロードとして発現および分泌されると、それは、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を打ち消し、ＣＡＲなどのモダリティを活性化するか、または受容体活性化を活性化することによって、エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を有する誘導細胞においてＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらのヒト化、またはＦｃ改変バリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化、またはＦｃ改変バリアント、断片またはそれらの機能的同等物またはバイオシミラーである。他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、またはそのヒト化、またはＦｃ改変バリアント、断片またはそれらの機能的同等物またはバイオシミラーである。他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、またはそのヒト化、またはＦｃ改変バリアント、断片またはそれらの機能的同等物またはバイオシミラーである。

本明細書で提供される誘導細胞およびチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態では、上記抗体は、誘導細胞によって、または誘導細胞内で産生されず、表１に列挙されている遺伝子型を持つ誘導細胞の投与の前、それと同時、またはその後にさらに投与される。いくつかの実施形態では、提供される誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞との組み合わせ療法における１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時または逐次的である。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらのヒト化、またはＦｃ改変バリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーのうちの１つ以上である。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変バリアント、断片およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変バリアント、断片およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞または誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変バリアント、断片およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。

ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座における標的化ゲノム編集の方法
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集、またはゲノム編集、または遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにＤＮＡが挿入、欠失、および／または置換される一種の遺伝子工学である。標的化ゲノム編集（「標的化ゲノム編集」または「標的化遺伝子編集」と互換可能である）は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、置換を可能にします。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の削除を伴うかまたは伴わない、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変えたり、細胞の形質転換を促進したりする可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）などの事前に選択された遺伝子座に外来性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、および信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。

標的化編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、またはヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって実現できる。ヌクレアーゼに依存しない標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって導かれる。

代替的に、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入により、より高い頻度で標的化編集を実現できる。このようなヌクレアーゼ依存の標的化編集は、ＤＳＢに応答して発生する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復メカニズムを利用する。外因性の遺伝物質を含むドナーベクターがない場合、ＮＨＥＪは少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または削除（インデル）をしばしば引き起こす。対照的に、一対のホモロジーアームと隣接する外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在する場合、相同組換えによる相同指向性修復（ＨＤＲ）中に外因性遺伝物質がゲノムに導入され得、「標的化組み込み」がもたらされる。

特異的な標的化ＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）システムが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）システムも、標的化組み込みのための有望なツールである。

ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な方法でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例には、Ｃ_２Ｈ_２ジンクフィンガー、Ｃ_３Ｈジンクフィンガー、およびＣ_４ジンクフィンガーが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、天然に存在しないドメインであり、その設計／構成は主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計と結合データの情報を格納するデータベースの情報を処理するための置換ルールとコンピューター化アルゴリズムの適用に起因する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、その生産が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる天然では見られないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号および米国特許第７，９７２，８５４号で詳細に説明されており、それらの完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染時にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、反復可変残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置に多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されている。当該技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへのＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。

本発明の方法で使用される標的ヌクレアーゼの別の例は、標的化Ｓｐｏ１１ヌクレアーゼ、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／５５５，８５７号を参照されたい。

本発明に適した標的化ヌクレアーゼのさらなる例には、個別にまたは組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、およびＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。

標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するおよび組換えヌクレアーゼ、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリー由来のＣＲＩＳＰＲ関連のヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼなどが含まれる。

例示的な例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は２つの主要なコンポーネント：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。共発現すると、２つの成分が複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭ近位のシーディング領域（ｓｅｅｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を選択した配列を標的に導くことができる。これら２つのコンポーネントは、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳動物細胞に送達できる。

ＤＩＣＥを介した挿入は、例えば、ｐｈｉＣ３１とＢｘｂ１などのリコンビナーゼのペアを使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位に厳しく制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的化ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位のゲノムに導入する必要がある。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたい。

本発明の１つの態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供する。一実施形態では、コンストラクトは、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームをさらに含み、標的組み込みの方法は、コンストラクトを細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入してＺＦＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入してＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットおよび所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入してＣａｓ９を介した挿入を可能にすることと、を含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含むコンストラクトを細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、ＤＩＣＥを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含む。

標的化組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞または生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座、またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質または非コードＲＮＡの望ましいレベルを生成するために十分な導入遺伝子発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換しやすくしたり、細胞機能を変化させたりするものであってはならない。組換え部位が有望なセーフハーバー遺伝子座となるためには、理想的には次を含むがこれらに限定されない条件を満たしている必要がある：配列注釈により判断されるように、調節エレメントまたは遺伝子の破壊がない；遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域であるか、または反対方向に転写される２つの遺伝子間の収束位置である；ベクターにコード化された転写活性化因子と隣接する遺伝子、特に癌関連遺伝子およびマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つ；ユビキタスな転写活性を示す広範な空間的および時間的発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるように、明らかにユビキタスな転写活性を有する。この後者の特徴は幹細胞で特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングと他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす。外因性挿入に適した領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素と保存された配列を欠き、ホモロジーアームの増幅用のプライマーを簡単に設計できるはずである。

ヒトゲノム編集、または具体的には標的化組み込みに適したサイトには、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、およびマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログはまた、本明細書に開示される標的化組み込みの組成物および方法を使用して挿入するための適切な部位であり得る。さらに、コラーゲンとＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化組み込みのためのセーフハーバーとしても使用できる。しかしながら、選択した各部位の検証は、特定の組み込みイベントのために特に幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列と配置、コンストラクトの設計などの挿入戦略の最適化がしばしば必要である。

標的化されたインデルのために、編集部位はしばしばその発現および／または機能が破壊されることが意図されている内因性遺伝子に含まれている。一実施形態では、標的化されたインデルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節および改変に関連する。他のいくつかの実施形態では、標的化インデルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節および調節、あるいは幹細胞および／または前駆細胞、ならびにそれらから誘導した細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を抑制するタンパク質に関連する。

したがって、本発明の一態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、または本明細書で提供されるような、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、もしくはタパシン遺伝子座などの継続的または一時的な遺伝子発現について安全かつ十分に調節されていることがわかっているもしくは証明された事前に選択された遺伝子座における標的化組み込みの方法を提供する。一実施形態では、標的化組み込みの方法のためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい組み込み部位を含む。一実施形態では、細胞への標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な相同アームのペアおよび１つまたは複数の外因性配列を含むコンストラクトを細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。

他の実施形態では、細胞への標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入することと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。さらに別の実施形態では、細胞への標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットおよび所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入してＣａｓ９を介した挿入を可能にすることと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含むコンストラクトを細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、ＤＩＣＥを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。

さらに、本明細書で提供されるように、セーフハーバーでの標的化組み込みのための上述の方法は、目的のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、および幹細胞および／または前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、１つ以上のマーカー遺伝子をさらに含む。一実施形態では、本発明のコンストラクト中の外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導細胞死に適した自殺遺伝子系には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくは７）とＡＰ１９０３、チミジンキナーゼ（ＴＫ）とガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）と５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、一部の自殺遺伝子系は細胞型に特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０によるＴリンパ球の遺伝子改変は、ｍＡｂリツキシマブの投与時にそれらを排除することができる。さらに、セツキシマブによって認識されるエピトープを含む改変されたＥＧＦＲは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、およびＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化組み込みの方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化組み込みのためのコンストラクトに含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは誘導性または構成的であり得、そして時間特異的、組織特異的または細胞型特異的であり得る。本発明の方法に適した構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、およびユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。

本明細書の方法によって組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位において、宿主ゲノム中の内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＡＡＶＳ１遺伝子座における１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態において、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨ１１遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態において、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるコラーゲン遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨＴＲＰ遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置での正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。

いくつかの実施形態では、標的化組み込みの方法のためのコンストラクトに含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、同じプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含み、部分間の物理的分離を高め、酵素機構へのアクセスを最大にする。リンカー配列のリンカーペプチドは、関連する機能に応じて、部分（外因性ポリヌクレオチド、および／またはそこからコードされるタンパク質またはペプチド）間の物理的分離をより柔軟またはより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、プロテアーゼにより切断可能であり得るか、または化学的に切断可能であり、別個の部分を生じ得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、およびトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるものであるか、または外因的に導入される。代替的に、リンカー中の切断部位は、選択された化学物質、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または低ｐＨへの曝露時に切断され得る部位であり得る。任意のリンカー配列は、切断部位の提供以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であってもよい。さらに、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない翻訳後改変を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体配座に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主になっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０または９０パーセント以上が、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシングおよびエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から生成されることを可能にする。適切なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。さらに、リンカー配列の適切なサイズおよび配列はまた、従来のコンピューターモデリング技術によって決定され得る。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。

標的化組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入する方法は、それ自体既知の細胞への遺伝子導入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、コンストラクトは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡ１ー１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達および／または発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作に使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、または置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。さらに、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、相同性指向性遺伝子標的化をはるかに高い割合で仲介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６またはＡＡＶ２ベクターを使用して、ｉＰＳＣのゲノム中の標的部位に挿入、欠失、または置換を導入する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得および維持する方法
本発明は、１つ以上の所望の部位での１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得および維持する方法を提供し、標的化編集は、増殖されたゲノム操作されたｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷で機能的であり続ける。標的化編集は、ｉＰＳＣとそこから誘導した細胞のゲノムに、挿入、欠失、および／または置換を導入、すなわち、選択した部位での標的化組み込みおよび／またはインデルを導入する。患者由来の末梢血由来の一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、ここで提供されるようにｉＰＳＣを編集および分化させることによりゲノム操作された誘導細胞を取得することの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない：設計されたエフェクター細胞の無制限のソース；特に複数の設計されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない；得られたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っている；主に本明細書で提供される操作されたｉＰＳＣでのクローン選択が可能であることに起因して、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、および対立遺伝子変異、無作為変異、発現多様性がないという点で均一である。

特定の実施形態では、１つ以上の選択された部位に１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（ＦＭＭ）として表２に示される細胞培養培地で長期間単一細胞として維持、継代、および増殖され、ここで、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化編集と機能改変を保持する。培地の成分は、表２に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭで培養されたｉＰＳＣは、未分化で、基礎的またはナイーブなプロファイル、培養物の洗浄や選択を必要としないゲノム安定性を維持し続けることが示されており、３つ全ての体細胞系統、胚様体または単層（胚様体の形成なし）を介したｉｎｖｉｔｒｏ分化、および奇形腫形成によるｉｎｖｉｖｏ分化を容易に生じさせる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／９４７，９７９号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化組み込みおよび／またはインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で維持され、継代され、増殖され、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、または本質的に含まず、ここで、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。

本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化編集を通じて、あるいは最初に標的化編集によりゲノム操作非多能性細胞を生成し、次に選択／分離されたゲノム操作非多能性細胞をリプログラミングして非多能性細胞と同じ標的化編集を含むｉＰＳＣを取得することを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、標的化組み込みおよび／または標的化インデルを細胞に導入することによって同時にリプログラミングを受けているゲノム操作非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞はリプログラミングに十分な条件下にあり、リプログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子および小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作およびリプログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子および必要に応じて小分子と接触させることによりリプログラミングを開始する前に、または本質的に同時に、非標的多能性細胞に標的化組み込みおよび／または標的化インデルを導入することができる。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作およびリプログラミングするために、標的化組み込みおよび／またはインデルはまた、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子および小分子と接触させることによりリプログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入され得、ここで、リプログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１およびＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、コンストラクトを担持するベクターが導入される。

いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つのリプログラミング因子、および必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表２）と接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表２）を使用してさらに維持および増殖される。

ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化組み込みおよび／またはインデルを導入してｉＰＳＣをゲノム操作し、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化組み込みおよび／またはインデルを含むゲノム操作非多能性細胞を取得することと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、および必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化組み込みおよび／またはインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、および必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）１つ以上の標的化組み込みおよび／またはインデルを、ゲノム操作のためのリプログラミング非多能性細胞に導入することと、（ｃ）選択された部位で標的化組み込みおよび／またはインデルを含む、クローンゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することと、を含む。

リプログラミング因子は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１８８０１およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７１３６に開示されているような、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１つ以上のリプログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。リプログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドはエピソームベクターによって導入される。他の種々の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／５７１，１０５号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同じかまたは異なる選択された部位での標的化組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含む複数のコンストラクトで導入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、または標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはｉＰＳＣもしくはその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織特異的または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、または特定の分化した細胞型で発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣから分化した細胞で発現する。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモーターにより駆動され、例えば、ＣＡＧにより駆動されるキャパーゼ－９である。異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含むこれらのコンストラクトは、同時または連続的に非多能性細胞に導入することができる。複数のコンストラクトの標的化組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上のリプログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時にリプログラミングを開始でき、これにより、同じ細胞のプールに複数の標的化組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得できる。このように、この堅牢な方法により、同時のリプログラミングと操作戦略により、選択された１つ以上の標的部位に組み込まれた複数のモダリティを持つクローンゲノム操作ｈｉＰＳＣを誘導できる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのｉｎｖｉｖｏ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、所望の部位で標的化組み込みおよび／またはインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または幹細胞および／または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、免疫応答の調節および媒介に関連する内因性遺伝子の１つ以上のインデルをさらに含む。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ベーター２ーミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化編集をさらに含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、造血細胞系統または他の特定の細胞型をｉｎｖｉｔｒｏで誘導するために使用され、誘導された非多能性細胞は、選択された部位で標的化編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されず、ここで、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化された編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。

ｉＰＳＣ由来の造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法および組成物には、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４１２２に記載されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダーを含まない、および／または間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｈｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する決定的な造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化できる細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞にコミットした前駆細胞、および多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した種々の系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって生成される細胞は、多能性幹細胞または前駆細胞から、最終分化細胞まで、および全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。

単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化および拡大する方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、および必要に応じてｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＷＮＴ経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する増殖中胚葉細胞を得る。その後のｂＦＧＦとの接触、および必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤、および／またはＷＮＴ経路活性化因子との接触により、決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なＨＥ細胞に分化する。

本明細書で提供される造血系統の細胞を得るための方法はＥＢ媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、ＥＢ形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均一な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、および集団内の細胞の均一な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。

提供されている単層分化プラットフォームは、造血幹細胞およびＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせて、種々の治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を使用した単層培養は、ｉｎｖｉｔｒｏ分化、ｅｘｖｉｖｏ改変、およびｉｎｖｉｖｏ長期造血自己複製、再構成および生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、ｉＰＳＣ由来の造血系統細胞には、決定的な造血内皮、造血多能性前駆細胞、造血幹細胞および前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ならびに好中球が含まれるがこれらに限定されない。

多能性幹細胞の決定的な造血系統の細胞への分化を指示する方法であって、（ｉ）多能性幹細胞をＢＭＰ活性化因子および必要に応じてｂＦＧＦを含む組成物と接触させ、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化および増殖を開始することと、（ｉｉ）中胚葉細胞をＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含み、必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、中胚葉細胞から決定的なＨＥポテンシャルを有する中胚葉細胞の分化および増殖を開始することと、（ｉｉｉ）決定的なＨＥポテンシャルを有する中胚葉細胞をＲＯＣＫ阻害剤；ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカイン、ならびに必要に応じてＷｎｔ経路活性化因子を含み、必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、決定的な造血内皮のポテンシャルを有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞から決定的な造血内皮の分化および増殖を開始することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、多能性幹細胞を播種および増殖させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、またはナイーブｉＰＳＣ、または１つ以上の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の決定的な造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られた決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカイン、ならびに必要に応じてＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血性内皮のプレＴ細胞前駆細胞への分化を開始することと、必要に応じて（ｉｉ）プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない組成物と接触させ、プレＴ細胞前駆細胞からＴ細胞前駆細胞またはＴ細胞への分化を開始することと、をさらに含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。

多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上述の方法のさらにいくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカイン、ならびに必要に応じてＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血性内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞への分化を開始することと、必要に応じて（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない組成物と接触させ、プレＮＫ細胞前駆細胞からＮＫ細胞前駆細胞またはＮＫＮＫ細胞への分化を開始することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ前駆細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、必要に応じて、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋およびＣＤ１６＋によってさらに規定される。

したがって、上述の分化方法を使用して、以下のｉＰＳＣ由来の造血細胞のうちの１つ以上の集団を得ることができる（ｉ）ｉＭＰＣ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培地を使用した、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培地を使用した、決定的な造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培地を使用した、決定的なＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用した多能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２、およびｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ以上の培地を使用したＴ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用したＴ細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培地を使用したＮＫ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、および／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、およびＥＰＯからなる群から選択される１つ以上の増殖因子とサイトカイン、ならびに必要に応じてＷｎｔ経路活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子およびサイトカインを含む。
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２はＲＯＣＫ阻害剤、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択された１つ以上の増殖因子およびサイトカイン、ならびに必要に応じて、ＢＭＰ活性化因子を含む。
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択された１つ以上の増殖因子とサイトカインを含む。
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択された１つ以上の増殖因子およびサイトカイン、ならびに必要に応じて、ＢＭＰ活性化因子を含む。
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択された１つ以上の増殖因子およびサイトカインを含む。

いくつかの実施形態では、上述の方法から得られたゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む１つ以上の望ましい組み込み部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または幹細胞および／または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、およびＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答調節および媒介に関連する１つ以上の内在性遺伝子に含まれる１つ以上のインデルをさらに含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にインデルを含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている。

さらに、第１の運命のゲノム操作造血細胞から第２の運命のゲノム操作造血細胞を得るための適用可能な脱分化方法および組成物は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている国際公開番号ＷＯ２０１１／１５９７２６に示されているものを含む。その中で提供される方法および組成物は、リプログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的にリプログラミングすることを可能にし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化した機能的モダリティを持つ誘導免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態において、開示される方法および組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来免疫細胞に保持可能な１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、細胞ベースの養子療法に適している。一実施形態では、遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のプロＴ細胞またはＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のプロＮＫ細胞またはＮＫ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来の免疫調節細胞または骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作免疫細胞は、改善された治療の可能性のために、ｅｘｖｉｖｏでさらに改変される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞の数または比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数または比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作免疫細胞の単離された集団または亜集団は、適応ＮＫ細胞の数または比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する、遺伝子操作ＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団または亜集団は、同種異系である。他のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する、遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＭＤＳＣの単離された集団または亜集団は自家性である。

いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含み、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、上記ｉＰＳＣ由来の分化造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間またはその後に多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失、または置換によって得られる１つ以上の遺伝子改変モダリティ、または（ｉｉ）ドナー特異的、疾患特異的、または治療反応特異的であるソース特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞がソース特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣが、ｉＰＳＣ由来の造血系細胞にも含まれる治療属性ソースの治療属性を保持する。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変モダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ｉＰＳＣまたはその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と調節、および／または生存率を促進するタンパク質の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む。他のいくつかの実施形態では、表１に列挙された遺伝子型を含む遺伝子改変ｉＰＳＣおよびその誘導細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ以上の欠失または発現低下、ならびに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーとのカップリングのための表面トリガー受容体の導入または増加した発現を含む追加の遺伝子改変モダリティをさらに含む。

さらにいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも２つの組み合わせに関するソース特異的免疫細胞の治療属性を含む：（ｉ）１つ以上の抗原標的化受容体の発現、（ｉｉ）改変されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍の微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞の動員および免疫調節、（ｉｖ）腫瘍外効果が低減された改善された標的特異性、（ｖ）改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、または抗原エスケープレスキュー救済。

いくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を含むｉＰＳＣ誘導造血細胞、および上記細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、もしくはＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカインおよび／またはその受容体、またはそれらの任意の改変タンパク質を発現し、少なくともＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの他の実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導造血エフェクター細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的誘導エフェクター細胞は、液体腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的誘導エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ誘導造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。

本発明の免疫細胞を養子細胞療法に適した対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。いくつかの実施形態では、提供されるｉＰＳＣ誘導造血細胞は、同種異系養子細胞療法のためのものである。さらに、本発明は、いくつかの実施形態において、養子細胞療法に適した対象に組成物を導入することによる上述の治療組成物の治療的使用を提供し、ここで、対象は自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染症を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性および慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸、直腸、喉頭、および食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。種々の自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス－関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に開示されている実施形態の誘導造血系統細胞を使用する治療は、症状に基づいて、または再発防止のために行うことができる。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用されるとき、「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、または疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療剤または組成物は、疾患または傷害の発症前、発症中または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を抑制、改善、および／または改善することができる疾患、状態、および／または損傷を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害またはがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害またはがんを有するかまたはする危険性がある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するかまたは発症する危険性がある対象、ウイルス感染またはウイルス感染に関連する疾患を有するかまたは有する危険性がある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。

本明細書に開示された実施形態の誘導造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価するとき、応答は、臨床的利益率、死亡までの生存率、病理学的完全奏功、病理学的応答の版定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、およびＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準によって測定できる。

開示されるような誘導造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、間、および／または後に対象に投与することができる。したがって、組み合わせ療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、および／または使用後のｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与または調製を含み得る。上述のように、１以上の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤または放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来の免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から、時間、日、または週単位によって時間的に分離することができる。追加的または代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤またはモダリティと組み合わせることができる。

組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞および抗体またはその断片である追加の治療薬を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来の造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に適した抗体は、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ）、抗ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セルツキシマブ）、抗ＧＤ２（例えば、ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ）、抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）、およびそれらのヒト化またはＦｃ改変バリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制または下方制御できる細胞分子、しばしば細胞表面分子を指す。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントの遺伝子発現または遺伝子産物を減少させるか、またはチェックポイント分子の活性を低下させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供されるＮＫ細胞またはＴ細胞を含む誘導エフェクター細胞との組み合わせ療法に適したチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ－３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ－３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、ならびに抑制性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。

提供される誘導エフェクター細胞を含む組み合わせ療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも１つの阻害剤をさらに含む。提供される誘導エフェクター細胞との組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、またはそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ、またはそれ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み合わせ療法のためのエフェクター細胞は、提供されるような誘導ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み合わせ療法のためのエフェクター細胞は、誘導Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組み合わせ療法のための誘導ＮＫ細胞またはＴ細胞は、本明細書で提供されるように機能的に増強されている。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、またはそれ以上のチェックポイント阻害剤は、誘導エフェクター細胞の投与と同時、前、または後に組み合わせ療法で投与することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、または一度に１つ（逐次的に）投与される。

いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ＩｇＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、および抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用でき、または感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは２つまたは３つまたはそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。

誘導エフェクター細胞と１つ以上のチェックインヒビターを含む組み合わせ療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉腫、パジェット細網症、セザリー症候群、肉芽腫性弛緩性皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍、扁平上皮癌、横紋筋肉腫、ルイス肺がん（ＬＬＣ）、非小細胞肺癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、胃癌、前立腺小細胞神経内分泌癌（ＳＣＮＣ）、肝臓癌、膠芽腫、肝臓癌、口腔扁平上皮癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、肝内胆管細胞癌、肝細胞癌、骨癌、転移、および鼻咽頭癌を含むがこれらに限定されない液体がんおよび固形がんの治療に適用できる。

本明細書で提供されるような誘導エフェクター細胞以外のいくつかの実施形態では、治療的使用のための組み合わせは、化学療法剤または放射性部分を含む１つ以上の追加の治療薬を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、または急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、または幹癌細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止または低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性または細胞傷害性の薬物または薬剤と呼ばれることもあり、当該技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、およびインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、およびテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、およびグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、ならびにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、およびゾレドロネートが含まれる。他の適切な薬剤は、化学療法剤または放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＮｉｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）またはＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。

サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためにｉＰＳＣ由来の治療用免疫細胞と共に使用され得る。

治療組成物に含まれるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に適した組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される媒体、例えば、細胞培養培地）、または他の薬学的に許容される成分をさらに含むことができる。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈｅｄ．１９８５を参照されたい）。

一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＴ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＨＳＣを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、または気管投与方法によって個別に、または他の適切な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を与えることができる。

これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約５％もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、または約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、前記ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。

本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物および／または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、増殖、および／または健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および／またはフィーダーを含まない培地である。種々の実施形態では、無血清培地は動物成分を含まず、必要に応じて無タンパク質であり得る。必要に応じて、培地は、薬学的に受容可能な組換えタンパク質を含み得る。動物成分を含まない培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、または微生物の供給源から得られる。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上述の培地の例は例示であり、本発明での使用に適した培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの適切な培地があることを理解するであろう。

分離された多能性幹細胞由来の造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、または間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来の造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞治療を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製Ｔ細胞またはＮＫ細胞を有する治療組成物を提供する。

一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、抗ＣＤ３８治療用タンパク質またはペプチド、および表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞の集団を含み、ここで、誘導ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｎｕｌｌを含む。別の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、抗ＣＤ３８治療用タンパク質またはペプチド、および表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＴ細胞の集団を含み、ここで、誘導Ｔ細胞は、ＣＤ３８ｎｕｌｌを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表１に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、誘導ＮＫ細胞またはＴ細胞はＣＤ３８ｎｕｌｌおよびｈｎＣＤ１６を含む。さらに他のいくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、および表１に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、ここで、誘導ＮＫ細胞またはＴ細胞は、ＣＤ３８ｎｕｌｌ、ｈｎＣＤ１６、およびＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＤ１２３を標的化するＣＡＲを含む。さらにいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表１に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、誘導ＮＫ細胞またはＴ細胞はＣＤ３８ｎｕｌｌ、ｈｎＣＤ１６、およびＣＡＲならびに１つ以上の外因性のサイトカインを含む。

当業者が理解するように、本明細書の方法および組成物に基づくｉＰＳＣに由来する自己と同種異系の造血系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、誘導造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全または部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、誘導造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、ここで、誘導造血系統細胞は、ＨＬＡＩｎｕｌｌおよびＨＬＡＩＩｎｕｌｌを有するＮＫ細胞またはＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、治療組成物中の誘導造血系統細胞の数は、用量あたり、少なくとも０．１×１０^５細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、または少なくとも５×１０^９細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の誘導造血系統細胞の数は、用量あたり約０．１×１０ ^５細胞～約１×１０^６細胞、用量あたり約０．５×１０^６細胞～約１×１０^７細胞、用量あたり約０．５×１０^７細胞～約１×１０^８細胞、用量あたり約０．５×１０^８細胞～約１×１０^９細胞、用量あたり約１×１０^９細胞～約５×１０^９細胞、用量あたり約０．５×１０^９細胞～約８×１０^９細胞、用量あたり約３×１０^９細胞～約３×１０^１０細胞、またはその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０^８細胞／用量は１．６７×１０^６細胞／ｋｇに変換される。

一実施形態では、治療組成物中の誘導造血系統細胞の数は、血液の部分的または単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも０．１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０^６細胞／体ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０^６細胞／ｋｇ体重、１×１０^８細胞／ｋｇ体重、５×１０^８細胞／ｋｇ体重、または１×１０^９細胞／ｋｇ体重である。

一実施形態では、ある用量の誘導造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇ、または約１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、または６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

いくつかの実施形態では、誘導造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、誘導造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごとの１回の投与、またはその間の任意の日数の任意の回数の投与である。

本発明の誘導造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に適しており、そしてすぐに投与され得る（すなわち、さらなる処理なしに投与され得る）。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植または投与の前に、いずれかのさらなる処理または操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤の投与前に増殖および／または改変される、誘導造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作された誘導造血系統細胞については、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載されている方法を使用して活性化および増殖させることができる。

特定の実施形態では、誘導造血系統細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）または別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合される。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞または抗体、または、本発明の実施形態におけるＴリンパ球の活性化および増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）についての米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号および同第２００６００３４８１０号に開示されるような薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋され得る。

投与量、頻度、およびプロトコールのいくつかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量、頻度およびプロトコールを決定する。

次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。

実施例１－材料および方法
種々のプロモーターの制御下で自殺系を効果的に選択し、種々のセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一細胞の継代と高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリーソーティングを可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一または複数の遺伝子改変によるクローンｈｉＰＳＣの導出を可能にした。

小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：ｈｉＰＳＣは、培養のコンフルエンシーが７５％～９０％に達すると、単一細胞として日常的に継代された。単細胞解離の場合、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃において３～５分間処理した後、ピペッティングして単細胞解離を確実にした。次いで、単細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面に播種した。継代は通常１：６～１：８で、３７℃で２～４時間マトリゲルで前もってコーティングされた組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーターで維持された。

ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化編集のためのＣＲＩＳＰＲ：ＲＯＳＡ２６標的化挿入を例として使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが２．５μｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５μｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）の混合物およびＡＡＶＳ１標的化挿入用の５μｇドナーコンストラクトでトランスフェクトされた。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、５μｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）とＲＯＳＡ２６標的化挿入用の５μｇドナーコンストラクトの混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクションは、パラメータ１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用するＮｅｏｎトランスフェクションシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。トランスフェクション後の２日目または３日目に、プラスミドに人工プロモーター－ドライバーＧＦＰおよび／またはＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間０．１μｇ／ｍｌの濃度で、７日後に０．２μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加して、標的細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は１０日目に新鮮なマトリゲルコーティングされたウェルに継代された。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリーで分析した。

ゲノム編集されたｉＰＳＣの一括ソーティングおよびクローンソーティング：ＺＦＮまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化編集を含むｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後にＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣの一括ソーティングおよびクローンソーティングされた。単一細胞解離標的化ｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新規に作製した、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのコンジュゲート一次抗体を細胞溶液に加え、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体は、１００万細胞あたり１００μＬの染色緩衝液中に７μＬで使用した。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭチアゾビブを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーでのソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリーによるソーティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。一括ソーティングでは、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞にゲートをかけ、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌの標準チューブにソーティングした。クローンソーティングでは、１００μＭノズルを使用して、１ウェルあたり３イベントの濃度で、ソーティングされた細胞を９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬフィブロネクチンと１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）が補充された２００μＬのＦＭＭがあらかじめ充填されており、あらかじめ５×マトリゲルで一晩コーティングされていた。５×マトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に追加し、４℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェルあたり５０μＬで９６ウェルプレートに加え、３７℃で一晩インキュベートする。５×うマトリゲルは、各ウェルに培地を加える直前に吸引される。ソーティングが完了したら、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離してからインキュベーションした。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。ウェルは、ソーティング後１０日目に追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーはソーティング後７～１０日の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで３７℃において約１０分間解離させた。長期間のアキュターゼ処理の必要性は、長期間培養で遊ばなかったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離しているのが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、あらかじめ５×マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、インキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１対１の継代は、増殖前の初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処理と、予めＦＭＭの１×マトリゲルでコーティングされた大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシーでの１：４～１：８の増殖で日常的に行われた。各クローン細胞株をＧＦＰ蛍光レベルおよびＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析した。１００％に近いＧＦＰ＋およびＴＲＡ１－８１＋のクローン株を、さらなるＰＣＲスクリーニングおよび分析のために選択した。フローサイトメトリー分析はＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実行され、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して分析された。

実施例２－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したゲノム編集を使用したｉＰＳＣでのＣＤ３８ノックアウト
Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＳｐＣａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ３ＮＬＳ、１００μｇ、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｔｒａｃｒＲＮＡはＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）で購入し、ｉＰＳＣ標的化編集に使用した。Ｃａｓ９ニッカーゼを使用してｉＰＳＣでＣＤ３８の二対立遺伝子ノックアウトを実施するために、ｇＮＡ（すなわち、ｇＤ／ＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチド）設計ためのスクリーニングおよび同定された標的化配列ペア（１Ａと１Ｂ、２Ａと２Ｂ、３Ａと３Ｂ）が表３に列挙される。

その後、ゲノム操作されたｉＰＳＣが特性評価され、二対立遺伝子ＣＤ３８ノックアウトが確認された。

実施例３－ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣおよび誘導細胞の検証
ＣＤ３８は特定の細胞段階で発現することが知られており、エフェクター細胞で重要な役割を果たす。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４^＋幹細胞と、リンパ系、赤血球系、および骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞などのエフェクター細胞の成熟の最終段階でも発現する。したがって、本出願以前には、ＣＤ３８発現プロファイルおよび機能性を考えると、指示された分化条件にさらされた場合にＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣが適切に発達するかどうか、および生成されたエフェクター細胞が機能するかどうかが不明であり、懸念があった。ＣＤ３８の二対立遺伝子ノックアウトを含むＣＤ３８ｎｕｌｌｉＰＳＣは、驚くべきことに、誘導細胞に分化する能力を維持していた。図の１つでは、ＣＤ３８遺伝子とｈｎＣＤ１６の二対立遺伝子破壊をもたらすように遺伝子編集された３つの操作されたｉＰＳＣクローンが、誘導ＮＫ細胞に分化し、それらの表現型が分析された。図２のフロープロファイルは、各クローンがＣＤ５６＋であり、ＣＤ３８陰性であることを示す。

ＣＤ３８発現がノックアウトされたときにｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞の細胞傷害性が保持されるかどうかを判定するために、野生型ｉＰＳＣクローンと、ＣＤ３８遺伝子の対立遺伝子破壊を遺伝子編集した３つの操作されたｉＰＳＣクローンをＮＫ細胞に分化させ、腫瘍細胞株ＲＰＭＩ－８２６６を標的化し、殺傷するそれらの能力について比較した。図３の長期殺傷アッセイによって示されるように、４８時間にわたって、操作されたＣＤ３８^－／－ＮＫ細胞は、野生型対照と同様の方法で標的細胞を排除し、標的細胞の認識および殺傷の際にＣＤ３８が必須でないことを示している。したがって、ｉＰＳＣにおけるＣＤ３８の完全な喪失は、造血細胞の誘導または誘導エフェクター細胞の細胞傷害性に影響を及ぼさないことが本明細書で示された。

ダラツムマブ（ダーザレックス）は抗がん剤である。多発性骨髄腫細胞で過剰発現しているＣＤ３８に結合する。ダラツムマブを介した多発性骨髄腫の細胞殺傷は、ＡＤＣＣに一部依存し、ＮＫエフェクター細胞に大きく依存している。しかしながら、ＣＤ３８はＮＫ細胞でも発現し、その結果、ダラツムマブはＮＫ細胞に対するＡＤＣＣ（フラトリサイド）を誘導し、ダラツムマブの有効性を著しく低下させる可能性がある。ここで、図６では、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ダラツムマブの存在下で腫瘍細胞株ＲＰＭＩ－８２６６によって刺激されたときにＡＤＣＣ機能を維持していることが示されている。ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞（図７Ｂ）の生存率は、ＣＤ３８を発現するｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞（図７Ａ）と比較して、ダラツムマブの存在下での培養において少なくとも約４８時間維持されることが図７にさらに示されている。さらに、図７に示すように、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ダラツムマブの存在下で刺激すると、脱顆粒を示さず、ＣＤ３８を発現するｉＮＫ細胞よりもサイトカイン産生が少ないことを示す。

ＣＤ３８ｎｕｌｌ以外で、誘導多能性幹細胞はまた、高親和性の非切断性ＣＤ１６の発現、Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトによるＨＬＡ－Ｉの喪失、ＣＩＩＴＡのノックアウトによるＨＬＡ－ＩＩの喪失、非古典的ＨＬＡ分子ＨＬＡ－Ｇの過剰発現、および連結されたＩＬ１５／ＩＬ１５受容体アルファコンストラクトの発現を得るために連続的に操作された。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、ｉＰＳＣを所望の表現型についてソーティングした。操作されたｉＰＳＣは、ｉｎｖｉｔｒｏまたは誘導細胞生成のために維持できる。図４は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞におけるｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍノックアウト、ＨＬＡ－Ｇ発現、およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα発現を示した。図７は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞におけるＣＤ３８ノックアウトと組み合わせたｈｎＣＤ１６の導入を示す。これらのデータは、これらの遺伝的に操作されたモダリティが、造血分化の間、ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞の所望の細胞運命への指示された発達を混乱させることなく維持されることを示している。

テロメアの短縮は、細胞の老化と共に起こり、幹細胞の機能不全と細胞の老化に関連する。ここでは、成熟ｉＮＫ細胞が、成人末梢ボールドＮＫ細胞と比較して長いテロメアを維持していることが示されている。テロメア長は、ｉＰＳＣ、成人末梢血ＮＫ細胞、およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のフローサイトメトリーによって、Ｇ_０／１細胞のＤＮＡインデックスを補正した対照（１００％）として１３０１Ｔ細胞白血病株を使用して決定された。図５に示すように、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、成人の末梢血ＮＫ細胞（ｐ＝．１０５、ＡＮＯＶＡ）と比較して、テロメアの長さを有意に長く維持し、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞の増殖、生存率、持続性の可能性が高いことを示す。

実施例４－ＣＤ３８Ｎｕｌｌ誘導ＮＫ細胞の機能プロファイリング
ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６、およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の発現を含むｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞の表現型、ならびにカルシウムフラックスを評価し、ｈｎＣＤ１６ｉＮＫの表現型はＣＤ３８ノックアウト後も維持される（図１０Ａ～１０Ｄ）。ＣＤ３８ノックアウトを有するｈｎＣＤ１６ｉＮＫのＡＤＣＣ機能は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージングによりＨＥＲ２発現卵巣細胞株ＳＫＯＶ３に対して調べられ、ＣＤ３８ノックアウトはｈｎＣＤ１６ｉＮＫのＡＤＣＣ機能に影響を与えない（図１０Ｅ）。次いで、様々なＮＫ細胞集団に対するダラツムマブの特異的細胞傷害性：末梢血ＮＫ細胞（ＣＤ１６シェディングを伴う）、ｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞（高い親和の非切断性ＣＤ１６を有する）、非改変ｉＮＫ細胞（低いＣＤ１６発現を有する）およびｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞は、それぞれの細胞集団を異なる濃度のダラツムマブとともに４時間インキュベートした後に測定された。図１１に示すように、ＣＤ３８欠損は、ＣＤ３８ノックアウトなしの他の細胞集団と比較して、ダラツムマブの濃度の増加により媒介されるフラトリサイドからｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞を保護した。したがって、ＣＤ３８の喪失は、ＣＤ３８特異的抗体の存在下でのダラツムマブ媒介ＮＫ細胞フラトリサイドを防ぐ。

ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞の細胞傷害性をｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞と比較して評価するために、各細胞集団をＭＭ．１Ｓ骨髄腫標的細胞と１８時間インキュベートし、その後、腫瘍細胞の生存率をフローサイトメトリーによって、アネキシンＶと生／死生存率マーカーで評価した。図１２に示されるように、ｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞は、ダラツムマブで強力な抗骨髄腫活性を媒介し、ＣＤ３８喪失によりさらに増強される。さらに、ＲＭＰＩ－８２２６腫瘍スフェロイドに対する７日間にわたる細胞傷害性アッセイで、ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞は、ＣＤ３８特異的抗体の存在下で、および同じ条件下でのｈｎＣＤ１６ｉＮＫおよび非改変ｉＮＫ細胞と比較して、アッセイの終了時に残存する標的細胞の数によって測定されるとき、優れた腫瘍細胞クリアランスを示した（図１３Ａ）。さらに、ＮＫ細胞フラトリサイドの欠如は、図１３Ｂに示される７日間にわたる細胞傷害性アッセイのこれらの細胞の改善された持続性によって示されるように、ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞の生存率を改善した。したがって、ｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞は、ダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体により、長期の抗骨髄腫活性と持続性の増強を示す。図１４に示されるように、ＣＤ３８を欠くｈｎＤ１６ｉＮＫ細胞はまた、ＣＤ３８特異的抗体の存在下で増加した連続殺傷能力を有するより耐久性のあるＡＤＣＣを実証する。このアッセイでは、ｈｎＣＤ１６またはｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞をＭＭ．１Ｓ骨髄腫標的細胞とダラツムマブで４８時間インキュベートし（刺激ラウンド１）、ＭＭ．１Ｓ細胞数をＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標）イメージングで定量化した。４８時間後、エフェクター細胞を取り除き、ダラツムマブによる２ラウンド目の刺激と標的細胞殺傷のために新しい標的細胞に移した（刺激ラウンド２）。（図１４）

上記に照らして、ＣＤ３８の標的化ノックアウトは誘導体ＮＫ細胞の表現型にも一般的な細胞機能にも影響を与えず、結果として得られるＣＤ３８欠損誘導ＮＫ細胞はＣＤ３８特異的抗体、ダラツムマブ、例えば媒介性フラトリサイドから保護されることが見出された。ｈｎＣＤ１６とＣＤ３８－／－の相乗効果により、ダラツムマブなどのモノクローナル抗体を含むＣＤ３８特異的アンタゴニストと組み合わせて、誘導ＮＫ細胞の強化された抗骨髄腫活性と耐久性のあるＡＤＣＣが提供される。これらの発見に基づいて、既製のｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞とダラツムマブの組み合わせによる、ＣＤ３８標的薬剤のＮＫ細胞枯渇効果を克服し、骨髄腫患者の転帰を改善するための臨床戦略が提案されている。

実施例５－同種異系エフェクター細胞を同種拒絶反応から保護するためのＣＤ３８特異的アンタゴニストの使用
強化されたＣＤ１６の有効性とＣＤ３８の除去を伴う操作されたｉＮＫ細胞は、ＣＤ３８標的化抗体誘導性フラトリサイドに耐性があり、ダラツムマブと組み合わせて抗骨髄腫活性をより強力に媒介する。ＣＤ３８が欠落している同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおいて、モノクローナル抗体を含むＣＤ３８特異的アンタゴニストを用いてこれらのリンパ球の活性化を抑制することにより、Ｔ細胞またはＢ細胞などの活性化リンパ球でＣＤ３８が上方制御されるという事実により、これらのエフェクター細胞に対する同種拒絶反応が減少および／または防止され、それによりエフェクター細胞の生存率および持続性が増加する。この戦略の実現可能性を示すために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ、すなわちエフェクター細胞産物と同種異系ＰＢＭＣの共インキュベーション）を実行して、ＣＤ３８ノックアウトに関連して、および抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（例えば、ダラツムマブ）の存在下または非存在下で、同種異系環境での本発明の誘導エフェクター細胞の寿命を試験する。

ｈｎＣＤ１６＋ｉＮＫ細胞集団（ＣＤ３８ＫＯを有するおよび有さない）は、アッセイの直前に細胞内色素（ＣｅｌｌｔｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（商標）または類似のＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標）互換試薬）で標識されている。異なる濃度のｈｎＣＤ１６＋およびｈｎＣＤ１６ＣＤ３８－／－ｉＮＫ細胞を、無作為の健康なドナー（ｎ＝３～４、プールされていない）からの固定数のＰＢＭＣとともに、ダラツムマブの存在下または非存在下で（有効濃度で、アッセイ前に滴定される）インキュベートする。各集団のｉＮＫ細胞の生存率は、長期培養においてＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標）によって経時的にモニターされる。生存率はフローサイトメトリーによってもモニターされ、染色パネルはさらにＰＢＭＣサブポピュレーションのＣＤ３８アップレギュレーションを追跡し、ダラツムマブを介したＡＤＣＣに基づくｉＮＫ細胞によるＰＢＭＣサブポピュレーションのクリアランスを追跡する。対照としてのｉＮＫ細胞の総クリアランスは、Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ（ＭＣＬ－１阻害剤、ＮＫ細胞の特異的除去用）を使用して達成される。

抗ＣＤ３８の存在下での野生型ｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞と比較したｈｎＣＤ１６ＣＤ３８ＫＯｉＮＫ細胞の寿命の延長、およびＰＢＭＣ試料からのＣＤ３８＋サブポピュレーション（末梢ＮＫ細胞、活性化Ｂ細胞およびＴ細胞）の関連するクリアランスは、活性化末梢ＴまたはＢ細胞の上方制御されたＣＤ３８を標的化することによる活性化末梢ＴまたはＢ細胞の抑制におけるＣＤ３８特異的アンタゴニストの能力を示し、これにより、本明細書に提供されるような、ｈｎＣＤ１６およびＣＤ３８－／－を含むエフェクター細胞のレシピエントにおけるこれらの活性化末梢Ｔ細胞またはＢ細胞によって、同種異系エフェクター細胞に対する同種拒絶反応を低減する。ＣＤ３８特異的アンタゴニストは、ＣＤ３８特異的抗体、ＣＤ３８特異的エンゲージャー、またはＣＤ３８キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

さらに、ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを欠く外因性短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質の発現は、可溶性外因性ＩＬ２の添加に関係なく、ｉｎｖｉｔｒｏでｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の生存率を支持することが示された。細胞内ドメインを有さないＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、シグナリングドメインを持たない短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合（または、本出願では「ＩＬ１５Δ」と呼ばれる）コンストラクトを生成した。本明細書で提供される例示的なＩＬ１５Δには、図１の設計３または４などの構造を有するものが含まれる。図１５に示すように、ｉＮＫ細胞は、ＧＦＰ（四角形；陰性対照）、全長ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合コンストラクト（黒丸；陽性対照；図１の設計２）、または短縮化ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合コンストラクト（白丸；図１の設計３）のいずれかを発現するレンチウイルス過剰発現ベクターによって形質導入された。ＩＬ１５コンストラクトもＧＦＰも外因性ＩＬ２の存在下では濃縮を示さず（図１５Ａ）、形質導入細胞が非形質導入細胞と同等の率で生存したことを示している。外因性ＩＬ２が存在しない場合、いずれかのＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合コンストラクトで形質導入された細胞は経時的に濃縮されたが、ＧＦＰ形質導入細胞はそうではなく、ＩＬ２がない場合、いずれかのＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａコンストラクトで形質導入された細胞は、同じ培養下での非形質導入細胞と比較して生存の利点を有していた（図１５Ｂ）。さらに、ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインは、受容体がＩＬ１５応答細胞で発現し、応答して細胞が増殖して機能するために重要であると見なされているため、細胞内ドメインが短縮化されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合コンストラクトが、形質導入されたｉＮＫ細胞で安定して発現するだけでなく、図１５Ｂに示すように、全長のＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合コンストラクトよりも高い増殖率でｉＮＫ細胞を支持することもあることは、驚くべきことである。したがって、本明細書で提供されるＩＬ１５Δは、膜結合形態でＩＬ１５を発現および維持することができ、全長ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質を置き換えて、細胞内でＩＬ１５のトランス提示を提供することができる。根本的なメカニズムを完全に理解していないが、ＩＬ１５Ｒの細胞内ドメインを削除すると、おそらくその細胞内ドメインを介して正常なＩＬ１５Ｒによって媒介されるシス提示および／またはその他の潜在的なシグナル伝達経路を完全に排除することにより、応答細胞に生存率、増殖、持続性のさらなる活力、フィットネス、または特定の利点が与えられたようである。

当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、および製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換および修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。

本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許および刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、限定または複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴またはその一部のいずれかの同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態および必要に応じた特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正および変形は、当業者によってしばしば想到され得、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。

Claims

細胞またはその集団であって、前記細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）または該細胞を分化させて得られた誘導細胞であり、前記細胞が、ＣＤ３８ノックアウトを有し、前記細胞が、高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）をコードするポリヌクレオチドを有し、前記ｉＰＳＣは誘導細胞に分化可能であり、該誘導細胞はＴ細胞又はＮＫ細胞であり、前記誘導細胞は前記ｈｎＣＤ１６を発現し、かつ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、細胞またはその集団。
前記細胞が、
（ｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損、
（ｉｉ）ＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現、
（ｉｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
（ｖ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチド、
（ｖｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、
（ｖｉｉ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異的もしくは多重特異的またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
前記誘導細胞が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織から得られたその天然の対応細胞と比較して、
（ｉ）向上した持続性および／または生存率、
（ｉｉ）免疫拒絶に対する増加した耐性、
（ｉｉｉ）増加した細胞傷害性、
（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、
（ｖ）増強または獲得したＡＤＣＣ、
（ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／または活性化もしくは動員する増強された能力、
（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強した能力、
（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープの救済の改善された能力、
（ｉｘ）減少したフラトリサイド、および
（ｘ）遺伝子操作されたエフェクター細胞の拡大源として機能する、
を含む特徴のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の細胞またはその集団。
前記ｈｎＣＤ１６が、
（ｉ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインのＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、
（ｉｉ）ＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメイン、又は
（ｉｉｉ）同一のまたは異なるポリペプチドに由来する、非天然（若しくは非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、刺激ドメイン、及び／若しくはシグナル伝達ドメイン、
を含む、請求項２に記載の細胞またはその集団。
（ａ）前記非天然の膜貫通ドメインが、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来するか、
（ｂ）前記非天然刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来するか、
（ｃ）前記非天然シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来するか、あるいは
（ｄ）前記非天然の膜貫通ドメインがＮＫＧ２Ｄに由来し、前記非天然の刺激ドメインが２Ｂ４に由来し、前記非天然のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する、請求項４に記載の細胞またはその集団。
前記細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項２記載の細胞またはその集団。
前記ＣＡＲが、
（ｉ）Ｔ細胞特異的もしくはＮＫ細胞特異的、
（ｉｉ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドと共発現されたもの、
（ｉｉｉ）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、β－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、ＣＤ３８若しくはＲＵＮＸ１ａを含む遺伝子座の１つに挿入され、又は
（ｉｖ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域遺伝子座若しくはＣＤ３８遺伝子座に挿入され、該ＴＣＲ若しくはＣＤ３８が前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項２に記載の細胞またはその集団。
前記細胞が、細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドをさらに含む、請求項２に記載の細胞またはその集団。
前記サイトカインまたはその受容体の部分的若しくは完全なペプチドが、（ｉ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、又は（ｉｉ）一過性に発現する、請求項８に記載の細胞またはその集団。
前記細胞が、
（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの共発現、
（ｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの部分若しくは完全ペプチドと融合したＩＬ１５の部分又は完全ペプチド、
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断された、ＩＬ１５Ｒαの部分若しくは完全ペプチドと融合したＩＬ１５の部分又は完全ペプチド、
（ｉｖ）ＩＬ１５ＲαのＳｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５の部分若しくは完全ペプチド、
（ｖ）ＩＬ１５Ｒβの部分若しくは完全ペプチドと融合した、ＩＬ１５の部分若しくは完全ペプチド、
（ｖｉ）共通受容体γＣの部分若しくは完全ペプチドと融合した、ＩＬ１５の部分若しくは完全ペプチドであって、前記共通受容体γＣは天然若しくは改変されている、ペプチド、又は
（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβの部分若しくは完全ペプチドのホモ二量体、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の細胞またはその集団。
（ａ）前記誘導細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下におけるＴ細胞又はＮＫ細胞、（ｂ）前記ＮＫ細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員および／または遊走させることができ、（ｃ）前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低下させることができる、請求項３に記載の細胞またはその集団。
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が、前記１つ以上のチェックポイント阻害剤を発現する、請求項１１に記載の細胞またはその集団。
前記１つ以上のチェックポイント阻害剤が、
（ｉ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲを包含する１つ以上のチェックポイント分子のアンタゴニストであり；又は
（ｉｉ）
（ａ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、若しくはそれらの抗原結合性断片のうちの１つ以上、若しくは
（ｂ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、
を含む、請求項１０に記載の細胞またはその集団。
前記誘導細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１に記載の細胞またはその集団。
前記細胞が、ＩＬ１５と切断ＩＬ１５αとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該融合タンパク質が、配列番号１７、１９、または２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
請求項１に記載の細胞またはその集団を含む組成物。
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
前記治療薬が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤または放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項１７に記載の組成物。
（ｉ）前記チェックポイント阻害剤が、
（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、
（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの抗原結合性断片のうちの１つ以上、
（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含み、又は
（ｉｉ）前記治療薬が、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドマイドのうちの１つ以上を含む、又は
（ｉｉｉ）前記抗体が、
（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、および／または抗ＣＤ３８抗体、
（ｂ）ダラツムマブ、イサツキシマブ若しくはＭＯＲ２０２、又はそれらの断片、を含み、前記誘導細胞が、ＣＤ３８ノックアウトを含む免疫エフェクター細胞を含む、請求項１８に記載の組成物。
請求項１６記載の組成物から成り、前記細胞又は細胞集団が自家性または同種異系である、自己免疫疾患、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、またはウイルス感染の治療剤。
ｉＰＳＣのＣＤ３８発現を破壊すること、該ｉＰＳＣに、ｈｎＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドを導入すること、及びＣＤ３８発現がないｉＰＳＣを選択することを含む、請求項１記載の細胞またはその集団の製造方法。
ＣＤ３８発現の破壊と同時に、又は逐次的に、標的化された編集を行うことをさらに含み、それによって、
（ｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損、
（ｉｉ）ＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現、
（ｉｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
（ｖ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチド、
（ｖｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、
（ｖｉｉ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異的もしくは多重特異的またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上をさらに含む、
多能性細胞を得る、請求項２１記載の方法。
前記ＣＤ３８発現がないｉＰＳＣを造血系統細胞に分化させることをさらに含み、該造血系統細胞は、ＣＤ３８を発現しないＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項２１記載の方法。
ＣＤ３８特異的アンタゴニストを含む、同種異系エフェクター細胞に対する同種拒絶反応を低減または防止する剤であって、前記同種異系エフェクター細胞がＣＤ３８ノックアウト及び高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ＣＤ３８特異的アンタゴニストが同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおける活性化されたＴ細胞およびＢ細胞を抑制することができ、前記ＣＤ３８特異的アンタゴニストが、抗ＣＤ３８抗体、ＣＤ３８特異的エンゲージャー、またはＣＤ３８キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、抗ＣＤ３８抗体の断片のいずれかであり、
前記同種異系エフェクター細胞は請求項１のｉＰＳＣから分化したＴ細胞又はＮＫ細胞であり、前記同種異系エフェクター細胞は前記ｈｎＣＤ１６を発現し、かつ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、剤。