JP7540709B2 - Promoters for filamentous fungi and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は糸状菌用プロモーターおよびその利用に関する。 The present invention relates to a promoter for filamentous fungi and its use.
従来遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主として、糸状菌を採用する技術が知られている。この技術においては、タンパク質を高発現させるために、種々の有用なプロモーターが探求されている。例えば、特許文献１には、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）のプロモーターが開示されている。また、特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーターが開示されている。
Conventionally, a technique is known in which filamentous fungi are used as hosts for protein production by genetic recombination. In this technique, various useful promoters are sought for high protein expression. For example,
しかし、上記のような従来技術には、タンパク質の発現効率をさらに高める余地が残されていた。 However, the conventional techniques described above still leave room for further improvement in protein expression efficiency.
そこで、本発明の一態様は、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターを提供することを目的とする。 Therefore, one aspect of the present invention aims to provide a promoter for filamentous fungi that has higher protein expression efficiency than conventional techniques.
本発明者らは鋭意検討した結果、ｇｐｄＡプロモーター由来配列中の特定の配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列中の特定の配列をこの順番で配置したプロモーターが、従来使用されている強力なプロモーターよりも遥かに強力なプロモーター活性を有していることを見出した。すなわち、本発明は以下の構成を含む。
＜１＞
糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する糸状菌用プロモーターであって、
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ２）上記（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ２）上記（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
＜２＞
上記エンハンサー配列が、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、＜１＞に記載の糸状菌用プロモーター。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の糸状菌用プロモーターを含む、ベクター。
＜４＞
＜３＞に記載のベクターに含まれる糸状菌用プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
＜５＞
＜４＞に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
＜６＞
＜５＞に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
As a result of intensive research, the present inventors have found that a promoter in which a specific sequence in a gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and a specific sequence in an adh promoter-derived sequence are arranged in this order has a promoter activity far stronger than that of the strong promoters that have been conventionally used.
＜1＞
A promoter for filamentous fungi having promoter activity in a filamentous fungal cell,
A polynucleotide comprising a gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and an adh promoter-derived sequence linked in this order;
The gpdA promoter-derived sequence is any one of the following (A1) to (A4):
The adh promoter-derived sequence is any one of the following promoters (B1) to (B4):
(A1) a polynucleotide comprising at least the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:1;
(A2) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (A1) above, and has promoter activity in a filamentous fungal cell when the polynucleotide, an enhancer sequence, and the polynucleotide (B1) below are linked in this order;
(A3) A polynucleotide having the base sequence shown in (A1) above in which one or more bases have been substituted, deleted or added, and which has promoter activity under the same conditions as (A2) above;
(A4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) above, and having promoter activity under the same conditions as (A2) above;
(B1) a polynucleotide comprising at least the 831st to 907th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:2;
(B2) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (B1) above, and has promoter activity in a filamentous fungal cell when the polynucleotide of (A1) above, an enhancer sequence, and the polynucleotide are linked in this order;
(B3) A polynucleotide having the base sequence shown in (B1) above, in which one or more bases have been substituted, deleted or added, and which has promoter activity under the same conditions as (B2) above;
(B4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) above, and having promoter activity under the same conditions as (B2) above.
＜2＞
The promoter for filamentous fungi described in <1>, wherein the enhancer sequence is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
＜3＞
A vector comprising the promoter for filamentous fungi according to <1> or <2>.
＜4＞
A method for transformation of a filamentous fungus with the vector according to <3>, comprising ligating a gene encoding a target protein downstream of a promoter for filamentous fungi contained in the vector.
＜5＞
A transformant obtained by the transformation method according to <4>.
＜6＞
A method for producing a protein, comprising a step of culturing the transformant according to <5>.
本発明の一態様によれば、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターが提供される。 According to one aspect of the present invention, a promoter for filamentous fungi is provided that has higher protein expression efficiency than conventional techniques.
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明は以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例も、本発明の技術的範囲に含まれる。本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。 One embodiment of the present invention is described below, but the present invention is not limited to the configurations described below, and various modifications are possible within the scope of the claims. Embodiments and examples obtained by appropriately combining the technical means disclosed in different embodiments and examples are also included in the technical scope of the present invention. All academic literature and patent documents described in this specification are incorporated herein by reference. Unless otherwise specified in this specification, "A to B" representing a numerical range means "greater than or equal to A, and less than or equal to B."
本明細書では、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合に基づいて説明する。なお、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、以下の説明において「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」に読み替えればよい。 In this specification, the explanation will be given based on the case where the polynucleotide is DNA. If the polynucleotide is RNA, "T (thymine)" should be replaced with "U (uracil)" in the following explanation.
本明細書では、注目するＤＮＡ鎖の５’末端側を「上流」、３’末端側を「下流」と表現している場合がある。例えば、「配列Ａの上流に」とは、「配列Ａの５’末端側に」を意味する。「配列Ａの下流に」とは、「配列Ａの３’末端側に」を意味する。「上流から下流に」とは、「５’末端側から３’末端側に」を意味する。 In this specification, the 5' end of the DNA strand of interest may be referred to as "upstream" and the 3' end as "downstream." For example, "upstream of sequence A" means "to the 5' end of sequence A." "Downstream of sequence A" means "to the 3' end of sequence A." "From upstream to downstream" means "from the 5' end to the 3' end."
本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。ＲＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、ｍＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、種々のＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡおよびＤＮＡは、任意の構造を取りうる（二本鎖または一本鎖など）。 As used herein, "polynucleotide" includes RNA and DNA. Examples of polynucleotides in the form of RNA include mRNA. Examples of polynucleotides in the form of DNA include various DNA fragments, cDNA, and genomic DNA. RNA and DNA can have any structure (e.g., double-stranded or single-stranded).
〔１．糸状菌用プロモーター〕
図１は、本発明の一態様に係る糸状菌用プロモーター１０を含むポリヌクレオチドの構造を模式的に示した図である。糸状菌用プロモーター１０は、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１、エンハンサー配列５、およびａｄｈプロモーター由来配列２を有している。これらの配列は、上流から下流に、上記の順番で配置されている。
1. Promoters for filamentous fungi
1 is a schematic diagram showing the structure of a polynucleotide including a filamentous
糸状菌用プロモーター１０は、目的タンパク質をコードする配列７にコードされているタンパク質の発現を、従来のプロモーターよりも遥かに高める。目的タンパク質をコードする配列７は、糸状菌用プロモーター１０の下流に配置されている。なお、図１に表されているポリヌクレオチドは、細胞内に存在していてもよいし（形質転換体など）、細胞外に存在していてもよい（ベクターなど）。図１のポリヌクレオチドがベクターを表している場合、当該ベクターを糸状菌に導入して形質転換させることにより、形質転換体が得られる。
The
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号１は、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号１に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位の塩基」とは、「ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準として、第－１０００位～第－４０２位の塩基」に該当する。
The gpdA promoter-derived
ａｄｈプロモーター由来配列２は、配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号２は、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号２に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位の塩基」とは、「ａｄｈの翻訳開始コドンを基準として、第－１７０位～第－９４位の塩基」に該当する。
The adh promoter-derived
なお、本明細書では特記しない限り、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１に関連する塩基の位置は、配列番号１に基づく塩基の位置を記載する。また、ａｄｈプロモーター由来配列２に関連する塩基の位置は、配列番号２に基づく塩基の位置を記載する。
In this specification, unless otherwise specified, the base positions related to the gpdA promoter-derived
［１．１．ｇｐｄＡプロモーター由来配列］
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ａ１）
配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ａ２）
（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ３）
（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ４）
（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
[1.1. Sequence derived from gpdA promoter]
The gpdA promoter-derived
(A1)
A polynucleotide comprising at least the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
(A2)
A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (A1), and has promoter activity in a filamentous fungal cell when the polynucleotide, an enhancer sequence, and the polynucleotide of (B1) are linked in this order.
(A3)
A polynucleotide having the base sequence shown in (A1) in which one or more bases have been substituted, deleted or added, and which has promoter activity under the same conditions as (A2).
(A4)
A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) and having promoter activity under the same conditions as those of (A2) above.
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ａ２）～（Ａ４）は、（Ａ１）のバリアントに該当する。以下、（Ａ１）～（Ａ４）で使用されている表現について、個別に説明する。 In the above polynucleotides, (A2) to (A4) are variants of (A1). Below, the expressions used in (A1) to (A4) are explained individually.
「配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ａ１）の長さは、６５０ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）の塩基配列は、配列番号１の第１位～第５９９位の塩基配列を含み、かつ、配列番号１の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ａ１）の終点は、配列番号１の、第５９９位～第６２５位の範囲、第５９９位～第６５０位の範囲、第５９９位～第７００位の範囲、第５９９位～第８００位の範囲、第５９９位～第９００位の範囲、または、第５９９位～第１０００位の範囲に存在しうる。
"Contains at least the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:1"
The entire sequence of polynucleotide (A1) is not particularly limited as long as it contains at least the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one embodiment, polynucleotide (A1) contains only the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one embodiment, polynucleotide (A1) contains an additional base sequence. In this case, the length of polynucleotide (A1) may be 650 bp or less, 700 bp or less, 800 bp or less, 900 bp or less, or 1000 bp or less. In one embodiment, the base sequence of polynucleotide (A1) contains the 1st to 599th bases of SEQ ID NO: 1 and is a part of SEQ ID NO: 1. In this case, the end point of polynucleotide (A1) may be in the range of positions 599 to 625, 599 to 650, 599 to 700, 599 to 800, 599 to 900, or 599 to 1000 of SEQ ID NO:1.
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１（ポリヌクレオチド（Ａ１）～（Ａ４））の全長は、８００ｂｐ以下または９００ｂｐ以下が好ましい。 Considering the convenience of constructing a vector, the total length of gpdA promoter-derived sequence 1 (polynucleotides (A1) to (A4)) is preferably 800 bp or less or 900 bp or less.
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。ここで、１×ＳＳＣの組成は、塩化ナトリウム：１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム：１５ｍＭである。
"Hybridize under stringent conditions"
As used herein, "hybridizing under stringent conditions" refers to conditions in which hybridization is performed in a hybridization solution having a salt concentration of 6xSSC at 50-60°C for 16 hours, followed by washing in a solution having a salt concentration of 0.1xSSC, where the composition of 1xSSC is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」
本明細書において、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」とは、糸状菌細胞内における特定のタンパク質の発現量を、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量よりも高めることを意味する。例えば、糸状菌用プロモーター１０によるタンパク質の発現量は、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量の、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上または２．５倍以上でありうる。タンパク質の発現量は、タンパク質の種類に応じた適当な公知の手段により、測定できる。なお、ｅｎｏＡ１４２プロモーターに関しては、［Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1),206-208, 2005］を参照（当該文献中で、ｅｎｏＡ１４２プロモーターは、「P-enoA142f」と表記されている）。
"Has promoter activity in filamentous fungal cells"
In this specification, "having promoter activity in a filamentous fungal cell" means that the expression level of a specific protein in a filamentous fungal cell is increased to be higher than the expression level of the protein by the enoA142 promoter. For example, the expression level of a protein by the
（Ａ３）および（Ａ４）における、「（Ａ２）と同条件」とは、「（Ａ３）または（Ａ４）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。 In (A3) and (A4), "the same conditions as (A2)" means that "when the polynucleotide (A3) or (A4), the enhancer sequence, and the polynucleotide (B1) are linked in this order, they have promoter activity in a filamentous fungal cell."
「複数個の塩基（Ａ３）」
ポリヌクレオチド（Ａ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
"Multiple bases (A3)"
With respect to polynucleotide (A3), a "plurality of bases" is, for example, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 bases.
「配列同一性」
本明細書において、「配列同一性」とは、同一の塩基数の割合を意味する。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
"Sequence Identity"
As used herein, "sequence identity" refers to the percentage of identical bases. The sequence identity may be 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
塩基配列の配列同一性は、例えば、BLASTNを利用して決定することができる（Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403-410）。BLASTNによって塩基配列を解析する際のパラメーターは、例えば、score＝100, wordlength＝12を採用できる。これらの解析方法の具体的な手法は周知である。比較対象となる塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失を許容してもよい。 The sequence identity of nucleotide sequences can be determined, for example, using BLASTN (Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol. 215 (Issue 3), pp. 403-410). The parameters for analyzing nucleotide sequences using BLASTN can be, for example, score = 100 and word length = 12. Specific techniques for these analysis methods are well known. Additions or deletions may be allowed in order to align the nucleotide sequences to be compared in an optimal state.
［１．２．ａｄｈプロモーター由来配列］
ａｄｈプロモーター由来配列２は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ｂ１）
配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ｂ２）
（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ３）
（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ４）
（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
[1.2. adh promoter-derived sequence]
The adh promoter-derived
(B1)
A polynucleotide comprising at least the 831st to 907th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:2.
(B2)
A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (B1), and has promoter activity in a filamentous fungal cell when the polynucleotide of (A1), an enhancer sequence, and the polynucleotide are linked in this order.
(B3)
A polynucleotide having the base sequence shown in (B1) in which one or more bases have been substituted, deleted or added, and which has promoter activity under the same conditions as (B2).
(B4)
A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) and having promoter activity under the same conditions as (B2).
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ｂ２）～（Ｂ４）は、（Ｂ１）のバリアントに該当する。以下、（Ｂ１）～（Ｂ４）で使用されている表現について、個別に説明する。 In the above polynucleotides, (B2) to (B4) are variants of (B1). Below, the expressions used in (B1) to (B4) are explained individually.
「配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の長さは、１００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の塩基配列は、配列番号２の第８３１位～第９０７位の塩基配列を含み、かつ、配列番号２の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の始点は、配列番号２の、第１位～第８３１位、第１０１位～第８３１位、第２０１位～第８３１位、第３０１位～第８３１位、第４０１位～第８３１位、第５０１位～第８３１位、第６０１位～第８３１位、第７０１位～第８３１位、第７８１位～第８３１位、または、第８０１位～第８３１位の範囲に存在しうる。また、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の終点は、配列番号２の、第９０７位～第９２０位、第９０７位～第９４０位、第９０７位～第９６０位、第９０７位～第９８０位、または、第９０７位～第１０００位の範囲に存在しうる。
"Contains at least the 831st to 907th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO:2"
The entire sequence of the polynucleotide (B1) is not particularly limited as long as it contains at least the 831st to 907th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:2. In one embodiment, the polynucleotide (B1) contains only the 831st to 907th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:2. In one embodiment, the polynucleotide (B1) contains an additional base sequence. In this case, the length of the polynucleotide (B1) may be 100 bp or less, 150 bp or less, 200 bp or less, 300 bp or less, 400 bp or less, 500 bp or less, 600 bp or less, 700 bp or less, 800 bp or less, 900 bp or less, or 1000 bp or less. In one embodiment, the base sequence of the polynucleotide (B1) contains the 831st to 907th base sequence of SEQ ID NO:2 and is a part of SEQ ID NO:2. In this case, the starting point of the polynucleotide (B1) may be in the range of
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ａｄｈプロモーター由来配列２（ポリヌクレオチド（Ｂ１）～（Ｂ４））の全長は、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下または７００ｂｐ以下が好ましい。 Considering the convenience in constructing a vector, the total length of the adh promoter-derived sequence 2 (polynucleotides (B1) to (B4)) is preferably 500 bp or less, 600 bp or less, or 700 bp or less.
「複数個の塩基（Ｂ３）」
ポリヌクレオチド（Ｂ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
"Multiple bases (B3)"
With respect to the polynucleotide (B3), a "plurality of bases" is, for example, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 bases.
「（Ｂ２）と同条件」
（Ｂ３）および（Ｂ４）における、「（Ｂ２）と同条件」とは、「（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ３）または（Ｂ４）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。
"Same conditions as (B2)"
In (B3) and (B4), "the same conditions as (B2)" means that "when the polynucleotide (A1), the enhancer sequence, and the polynucleotide (B3) or (B4) are linked in this order, they have promoter activity in a filamentous fungal cell."
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」および「配列同一性」に関する説明は、［１．１．］節の説明が援用される。 The explanations of "hybridizing under stringent conditions," "having promoter activity in filamentous fungal cells," and "sequence identity" are given in Section [1.1.].
［１．３．エンハンサー配列］
本明細書において「エンハンサー配列」とは、タンパク質の発現を正に調節する塩基配列を意味する。エンハンサー配列５をｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置することにより、目的タンパク質をコードする配列７の転写活性が上昇し、結果として目的タンパク質が高発現するようになる。
[1.3. Enhancer sequence]
As used herein, the term "enhancer sequence" refers to a base sequence that positively regulates protein expression. By locating the
エンハンサー配列５の具体的な配列は、特に限定されない。エンハンサー配列５の例としては、［化学と生物(2019) Vol.57, No.9, pp.532-540］に記載の配列が挙げられる。より具体的には、ＣＧＧＮ8ＣＧＧ、ＣＣＧＮ2ＣＣＮ6ＧＧ、ＣＧＧＮ8ＣＣＧ、ＣＧＧＮ11ＣＣＧ、ＣＧＧＮＴＡＡＷ、ＴＴＡＧＳＣＴＡＡ、ＧＧＣＴＡＲ、ＧＧＣＷＷＷ、ＧＧＮＴＡＡＡ、ＣＧＧＤＴＡＡＷが挙げられる。
The specific sequence of the
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列（５’－ＣＧＧＮＮＡＴＴＴＡ－３’；Ｎは任意の塩基を表す）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列からなる。一実施形態において、配列番号３中の「ＮＮ」は、「ＧＣ」である。
In one embodiment,
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示されている塩基配列（５’－ＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴ－３’）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示される塩基配列からなる。
In one embodiment,
一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが配置されてなる塩基配列である。一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが、交互に複数回配置されてなる配列である。配列番号３および配列番号４に示される塩基配列は、合計で、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上、配置されていてもよい。また、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列との間には、任意構成のスペーサー配列が挿入されていてもよい。スペーサー配列の長さは、例えば、８０ｂｐ以下、７０ｂｐ以下、６０ｂｐ以下または５０ｂｐ以下とすることができる。以上を総合すると、一実施形態において、エンハンサー配列５は、下記の構造を取る。
５’－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）・・・－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－３’。
In one embodiment, the
5'-(SEQ ID NO:3)-(spacer sequence of any configuration)-(SEQ ID NO:4)-(spacer sequence of any configuration)-(SEQ ID NO:3)-(spacer sequence of any configuration)-(SEQ ID NO:4) ...-(SEQ ID NO:3)-(spacer sequence of any configuration)-(SEQ ID NO:4)-3'.
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号５に示される塩基配列である。配列番号５に示される塩基配列は、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列を、それぞれ１２個ずつ含んでいる。本明細書では、配列番号５に示されるエンハンサー配列を、「ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ」と称する。
In one embodiment,
図１では、エンハンサー配列５は１個のみ描かれている。しかし、２個以上のエンハンサー配列５を、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置してもよい。この場合、同じ配列のエンハンサー配列５を採用してもよいし、異なる配列のエンハンサー配列５を組合せて採用してもよい。また、上記に例示したエンハンサー配列は、逆位に挿入してもよい。すなわち、上記に例示したエンハンサー配列の、５’末端と３’末端を入れ替えた配列をエンハンサー配列５として採用してもよい。
In FIG. 1, only one
［１．４．糸状菌］
糸状菌用プロモーター１０を適用する糸状菌は、特に限定されない。すなわち、本発明の一態様に係る形質転換方法を適用する糸状菌、および、本発明の一態様に係る形質転換体の宿主となる糸状菌は、特に限定されない。
[1.4. Filamentous fungi]
There are no particular limitations on the filamentous fungus to which the filamentous
糸状菌の例としては、アスペルギルス属糸状菌、ペニシリウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、リゾプス属糸状菌、ムコール属糸状菌、モナスカス属糸状菌、フザリウム属糸状菌が挙げられる。中でも、糸状菌用プロモーター１０は、アスペルギルス属糸状菌において奏効しうる。これは、糸状菌用プロモーター１０が、アスペルギルス・オリゼ由来の塩基配列から構成されているためである。
Examples of filamentous fungi include Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Monascus, and Fusarium. In particular, the
アスペルギルス属糸状菌の例としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）が挙げられる。 Examples of Aspergillus fungi include Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus kawachii, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus terreus, and Aspergillus phoenicis.
ペニシリウム属糸状菌の例としては、ペニシリウム・カマンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・ノタトウム（Penicillium notatum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、ペニシリウム・パルロゼナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）が挙げられる。 Examples of Penicillium fungi include Penicillium camemberti, Penicillium notatum, Penicillium multicolor, Penicillium purpurogenum, and Penicillium roqueforti.
トリコデルマ属糸状菌の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）が挙げられる。 Examples of Trichoderma fungi include Trichoderma reesei and Trichoderma viride.
リゾプス属糸状菌の例としては、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）が挙げられる。 Examples of Rhizopus fungi include Rhizopus oryzae and Rhizopus japonicus.
ムコール属糸状菌の例としては、ムコール・エスピー（Mucor sp.）が挙げられる。 An example of a Mucor filamentous fungus is Mucor sp.
モナスカス属糸状菌の例としては、モナスカス・パープレウス（Monascus purpureus）が挙げられる。 An example of a Monascus fungus is Monascus purpureus.
フザリウム属糸状菌の例としては、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）が挙げられる。 An example of a Fusarium fungus is Fusarium oxysporum.
〔２．ベクター〕
本発明の一態様に係るベクターは、糸状菌用プロモーター１０を含んでいる。このベクターは、糸状菌用プロモーター１０の下流側に、目的タンパク質をコードする遺伝子７を有していてもよい（図１を参照）。目的タンパク質をコードする遺伝子７がベクターに含まれる場合、当該ベクターで糸状菌を組換えることにより、目的タンパク質を高発現する形質転換体が得られる。
2. Vector
A vector according to one embodiment of the present invention includes a filamentous
本発明の一実施形態に係るベクターの具体的な形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドが挙げられる。プラスミドベクターの形状は、環状であってもよいし、鎖状であってもよい。 The specific form of the vector according to one embodiment of the present invention is not particularly limited, but examples include a plasmid. The shape of the plasmid vector may be circular or linear.
本発明の一実施形態に係るベクターを構成するポリヌクレオチドの由来は、特に限定されない。例えば、本発明を食品などに応用する場合には、セルフクローニングを行うことが好ましいといえる。セルフクローニングを行う場合、ベクターを構成する各ポリヌクレオチドは、当該ベクターが導入される宿主と同一（同種）の生物由来である。糸状菌用プロモーター１０はアスペルギルス・オリゼ由来であるため、上述の場合には、ベクターを構成するポリヌクレオチドは、アスペルギルス属糸状菌由来であることが好ましく、アスペルギルス・オリゼ由来であることがより好ましい。
The origin of the polynucleotides constituting the vector according to one embodiment of the present invention is not particularly limited. For example, when the present invention is applied to food or the like, it is preferable to perform self-cloning. When performing self-cloning, each polynucleotide constituting the vector is derived from the same organism (same species) as the host into which the vector is introduced. Since the
本発明の一実施形態に係るベクターを構成する、それぞれのポリヌクレオチドは、公知の技術によって取得できる。例えば、公知の配列情報に基づいて、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅手段を用いて、目的の配列を取得できる。あるいは、糸状菌の染色体ＤＮＡライブラリーからのクローニングによっても取得できる。 Each polynucleotide constituting the vector according to one embodiment of the present invention can be obtained by known techniques. For example, the target sequence can be obtained using a DNA amplification method such as PCR based on known sequence information. Alternatively, it can be obtained by cloning from a chromosomal DNA library of a filamentous fungus.
［２．１．目的タンパク質］
目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質の例としては、糸状菌由来の細胞内タンパク質、分泌タンパク質、原核生物由来タンパク質、真核生物由来タンパク質が挙げられる。より具体的な例としては、酵素（α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなど）、リボソーム構成タンパク質、トランスポーター、シャペロン、転写調節因子が挙げられる。機能未知のタンパク質を、目的タンパク質としてもよい。また、レポーターを目的タンパク質としてもよい。
2.1. Target Protein
The type of target protein is not particularly limited. Examples of target proteins include intracellular proteins derived from filamentous fungi, secreted proteins, proteins derived from prokaryotes, and proteins derived from eukaryotes. More specific examples include enzymes (α-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, β-galactosidase, cellulase, chitinase, protease, aminopeptidase, carboxypeptidase, lipase, phospholipase, phytase, nuclease, catalase, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, etc.), ribosome-constituting proteins, transporters, chaperones, and transcriptional regulators. Proteins with unknown functions may be used as target proteins. Also, reporters may be used as target proteins.
本発明の一実施形態に係るベクターは、宿主糸状菌細胞内で目的タンパク質を発現させるための発現単位を１つ以上含んでいる。発現単位には、プロモーター領域（糸状菌用プロモーター１０など）、目的タンパク質をコードする遺伝子７のオープンリーディングフレーム、ターミネーター領域が含まれる。
A vector according to one embodiment of the present invention contains one or more expression units for expressing a target protein in a host filamentous fungal cell. The expression unit includes a promoter region (e.g., a
［２．２．その他の配列］
本発明の一実施形態に係るベクターは、本技術分野で公知の、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点、目的遺伝子を導入する際に使用する制限酵素認識配列などを付加することができる。また、目的タンパク質をコードする遺伝子７と、その他のタンパク質（グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡなど）をコードする遺伝子とを連結してもよい。このような構成とすれば、目的タンパク質と上記その他のタンパク質との融合タンパク質を発現させることができる。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離できる。
[2.2. Other sequences]
A vector according to one embodiment of the present invention can be added with a terminator, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, a replication origin, a restriction enzyme recognition sequence used when introducing a target gene, and the like, which are known in the art. In addition, the
本発明の一実施形態に係るベクターは、１個以上の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーとしては、糸状菌形質転換体の選択に一般的に使用されているマーカーを利用できる。具体例としては、ｎｉａＤ、ｓＣ、ａｒｇＢ、ａｄｅＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧが挙げられる。また、大腸菌などの細菌培養用の薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子など）を選択マーカーとしてもよい。選択マーカーを利用して、上記ベクターが宿主細胞に導入されたか否かを確認できる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain one or more selection markers. As the selection marker, a marker that is generally used for selecting filamentous fungal transformants can be used. Specific examples include niaD, sC, argB, adeA, ptrA, and pyrG. In addition, a drug resistance gene for culturing bacteria such as E. coli (e.g., tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, etc.) may be used as the selection marker. Using the selection marker, it is possible to confirm whether the above vector has been introduced into the host cell.
目的タンパク質を、選択マーカーとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を選択マーカーとして用い、目的タンパク質をＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。 The target protein may be expressed as a fusion polypeptide with a selection marker. For example, green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea victoria may be used as a selection marker, and the target protein may be expressed as a GFP fusion polypeptide.
本発明の一実施形態に係るベクターは、制限酵素認識配列を含んでいてもよい。ベクター内に１箇所のみ存在し、かつ標的配列の内部に存在しない制限酵素認識配列は、当該標的配列をベクター内に導入する際に利用できる。ベクターの汎用性を考慮すると、制限酵素認識配列は、認識部位の出現頻度が少ない６塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることが好ましく、８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることがより好ましい。６塩基を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ）、ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）、ＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ）、ＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、ＣＣＡＴＧＧ（ＮｃｏＩ）、ＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩ）、ＣＡＣＧＴＧ（ＰｍｌＩ）、ＧＣＡＴＧＣ（ＳｐｈＩ）、ＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ）、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）が挙げられる。８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＣＧＣＧＣＣ（ＡｓｃＩ）、ＧＣＧＡＴＣＧＣ（ＡｓｉＳＩ）、ＧＧＣＣＧＧＣＣ（ＦｓｅＩ）、ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）、ＴＴＡＡＴＴＡＡ（ＰａｃＩ）、ＧＴＴＴＡＡＡＣ（ＰｍｅＩ）、ＣＣＴＧＣＡＧＧ（ＳｂｆＩ）、ＧＣＣＣＧＧＧＣ（ＳｒｆＩ）、ＡＴＴＴＡＡＡＴ（ＳｗａＩ）が挙げられる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain a restriction enzyme recognition sequence. A restriction enzyme recognition sequence that exists only at one site in a vector and does not exist within a target sequence can be used when introducing the target sequence into a vector. Considering the versatility of the vector, the restriction enzyme recognition sequence is preferably a recognition sequence of a restriction enzyme that recognizes six or more bases, the recognition site of which is less frequent, and more preferably a recognition sequence of a restriction enzyme that recognizes eight or more bases. Examples of recognition sequences of restriction enzymes that recognize six bases include GGGCCC (ApaI), GGATCC (BamHI), ATCGAT (ClaI), AAGCTT (HindIII), CCATGG (NcoI), CATATG (NdeI), CACGTG (PmlI), GCATGC (SphI), TCTAGA (XbaI), and CTCGAG (XhoI). Examples of recognition sequences for restriction enzymes that recognize eight or more bases include GGCGCGCC (AscI), GCGATCGC (AsiSI), GGCCGGCC (FseI), GCGGCCGC (NotI), TTAATTAA (PacI), GTTTAAAC (PmeI), CCTGCAGG (SbfI), GCCCGGGC (SrfI), and ATTTAAAT (SwaI).
本発明の一実施形態に係るベクターは、相同組換えを行わせるために必要な宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドの長さは、特に限定されない。相同組換えの効率を考えると、２００ｂｐ～２００００ｂｐであることが好ましく、５００ｂｐ～１００００ｂｐであることがより好ましい。２００ｂｐ以上の長さがあれば、相同組換えを効率よく生じさせられる。２００００ｂｐ以下の長さであれば、ベクターを宿主糸状菌の細胞内に効率よく取込ませることができる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain a polynucleotide derived from a host filamentous fungus that is necessary for homologous recombination. The length of the polynucleotide derived from the host filamentous fungus is not particularly limited. In consideration of the efficiency of homologous recombination, it is preferably 200 bp to 20,000 bp, and more preferably 500 bp to 10,000 bp. If the length is 200 bp or more, homologous recombination can be efficiently caused. If the length is 20,000 bp or less, the vector can be efficiently incorporated into the cells of the host filamentous fungus.
〔３．形質転換方法、形質転換体およびタンパク質の生産方法〕
本発明の一態様に係る形質転換方法は、〔２〕節で説明したベクターで、糸状菌を形質転換する。このベクターは、上流から順に、糸状菌用プロモーター１０と、目的タンパク質をコードする遺伝子７とを含んでいる。この形質転換方法によって、本発明の一態様に係る形質転換体が得られる。また、この形質転換体を培養することによって、本発明の一態様に係るタンパク質の生産方法が実施できる。これらの実施形態によれば、目的タンパク質を高効率で生産できる。
3. Transformation method, transformant, and protein production method
In a transformation method according to one aspect of the present invention, a filamentous fungus is transformed with the vector described in section [2]. This vector contains, from upstream to downstream, a
本発明の一実施形態に係る形質転換方法において、糸状菌を形質転換する方法には、公知の方法が適宜採用される。具体例としては、カルシウム－ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法が挙げられる。 In the transformation method according to one embodiment of the present invention, a known method is appropriately adopted as a method for transforming a filamentous fungus. Specific examples include the calcium-PEG method and the electroporation method.
本発明の一実施形態に係る形質転換体において、宿主となる糸状菌の例としては、上述した糸状菌が挙げられる。 In the transformant according to one embodiment of the present invention, examples of the filamentous fungus that serves as the host include the filamentous fungi described above.
本発明の一実施形態に係るタンパク質の生産方法において、形質転換体を培養する方法は、糸状菌の培養方法に通常用いられる培地、培養条件を適宜選択すればよい。形質転換体の培養は、固体培養であっても液体培養であってもよい。培養に用いる培地の例としては、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、Czapek-dox培地（０．２％ ＮａＮＯ３、０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳＯ４、３％ グルコースまたは３％ デンプン、ｐＨ５．５）、フスマ培地（小麦フスマ、水分含量４０％）が挙げられる。培養温度は、形質転換体が生育できる範囲内の適当な温度を採用できる。培養温度の一例を挙げると、２０～３７℃である。 In the method for producing a protein according to one embodiment of the present invention, the transformant may be cultured in a medium and under culture conditions that are generally used in the culture of filamentous fungi. The transformant may be cultured in a solid or liquid medium. Examples of the medium used for the culture include dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 .7H 2 O), Czapek-dox medium (0.2% NaNO 3 , 0.1% K 2 HPO 4 , 0.05% MgSO 4 , 0.05% KCl, 0.001% FeSO 4 , 3% glucose or 3% starch, pH 5.5), and bran medium (wheat bran, moisture content 40%). The culture temperature may be any appropriate temperature within the range in which the transformant can grow. An example of the culture temperature is 20 to 37°C.
本発明の一実施形態に係る形質転換体の培養物には、目的タンパク質が含まれている。必要に応じて、目的タンパク質を定性分析または定量分析してもよい。あるいは、培養物から目的タンパク質を単離または精製してもよい。 The culture of the transformant according to one embodiment of the present invention contains a target protein. If necessary, the target protein may be subjected to qualitative or quantitative analysis. Alternatively, the target protein may be isolated or purified from the culture.
形質転換体を液体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、菌体培養液そのものを回収して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。形質転換体を固体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、適当な緩衝液を用いて培養物から目的タンパク質を含む溶液を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。菌体内に目的タンパク質が蓄積されている場合には、菌体を公知の手段で破砕し、適当な緩衝液を用いて目的タンパク質を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。糸状菌を用いたタンパク質生産系の場合、目的タンパク質は分泌される場合が多い。 When the transformant is cultured in liquid and the target protein is secreted outside the cells, the cell culture liquid itself can be collected and used for analysis, isolation, or purification of the target protein. When the transformant is cultured in solid state and the target protein is secreted outside the cells, a solution containing the target protein can be extracted from the culture using an appropriate buffer solution and used for analysis, isolation, or purification of the target protein. When the target protein accumulates inside the cells, the cells can be disrupted by known means, and the target protein can be extracted using an appropriate buffer solution and used for analysis, isolation, or purification of the target protein. In protein production systems using filamentous fungi, the target protein is often secreted.
上記のようにして回収した目的タンパク質をさらに精製する場合は、例えば、タンパク質を含む溶液を公知の方法によって精製すればよい。このような方法の例としては、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーが挙げられる。タンパク質の精製には、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が好ましく採用される。 When the target protein recovered as described above is to be further purified, for example, the solution containing the protein may be purified by a known method. Examples of such methods include ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography. High performance liquid chromatography ("HPLC") is preferably used for purifying proteins.
［コントロールベクターの構築］
本実施例では、コントロールベクターとして、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を使用した。このベクターは、既知の強力な改良プロモーターであるｅｎｏＡ１４２プロモーターを有しており、目的遺伝子を高発現できる。ｐＳＥＮＳＵ２５１２の構築手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ（Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.）を、ＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ／ＸｂａＩ－ＳｍａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて２－５－１２ターミネーター（Ｔ－２５１２；日本国特許第５，６８６，９７４号を参照）を増幅させた。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にＸｂａＩサイト、当該断片の３’末端側にＳｍａＩサイト、当該断片の両端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号６および配列番号７に示した。
３．Ｔ－２５１２の断片をＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵのＸｂａＩ－ＳｍａＩサイトにライゲーションすることにより、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を構築した。
[Construction of control vector]
In this example, pSENSU2512 was used as a control vector. This vector has the enoA142 promoter, a known strong improved promoter, and can highly express the target gene. The construction procedure for pSENSU2512 is as follows (see also FIG. 2).
1. pSENSU (Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.) was digested with XbaI-SmaI. The pSENSU/XbaI-SmaI digest was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
2. The 2-5-12 terminator (T-2512; see Japanese Patent No. 5,686,974) was amplified by PCR using genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 (purchased from the National Institute of Technology and Evaluation) by a standard method as a template. The primers used here were designed so that an XbaI site was located at the 5'-end of the fragment to be amplified, an SmaI site was located at the 3'-end of the fragment, and GGG was located at both ends of the fragment. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7.
3. The T-2512 fragment was digested with XbaI-SmaI and purified. The purified product was ligated to the XbaI-SmaI site of pSENSU to construct pSENSU2512.
〔実施例１：ＣＡＬＢ活性の比較〕
実施例１では、Candida antarctica由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）をレポータータンパク質として、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
Example 1: Comparison of CALB activity
In Example 1, the effect of enhancing protein expression by the filamentous fungal promoter according to one embodiment of the present invention was examined using Candida antarctica-derived lipase B (CALB) as a reporter protein.
［ＣＡＬＢ発現コントロールベクターの構築］
ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化することにより、ｈｓｐ１２の５’ＵＴＲとターミネーターとの間に、レポーター遺伝子としてＣＡＬＢを導入した。具体的な手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．合成したＣＡＬＢ遺伝子（塩基配列は配列番号８）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＡＬＢ遺伝子断片を増幅させた。この鋳型は、ＣＡＬＢの分泌シグナルを、αアミラーゼの分泌シグナルに置換したものである。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトを配置し、当該断片の３’末端にＧＧＧが付加されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号９および配列番号１０に示した。
３．得られたＣＡＬＢ遺伝子断片をＸｂａＩ消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵ２５１２のＰｍｌＩ－ＸｂａＩサイトにライゲーションすることにより、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of CALB expression control vector]
By digesting pSENSU2512 with PmlI-XbaI, CALB was introduced as a reporter gene between the 5'UTR and terminator of hsp12. The specific procedure is as follows (see also FIG. 2).
1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. The pSENSU2512/PmlI-XbaI digest was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
2. Using the synthesized CALB gene (base sequence: SEQ ID NO: 8) as a template, a CALB gene fragment was amplified by PCR. This template had the secretion signal of CALB replaced with the secretion signal of α-amylase. The primers used here were designed to include TCGCAAAC at the 5' end of the fragment to be amplified, making the 5'UTR of hsp12 full length, and to place an XbaI site at the 3' end of the fragment, with GGG added to the 3' end of the fragment. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
3. The resulting CALB gene fragment was digested with XbaI and purified. The purified product was ligated to the PmlI-XbaI site of pSENSU2512 to construct a CALB expression control vector.
［ＣＡＬＢ発現ベクターの構築］
Aspergillus oryzae RIB40由来のグリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｐＵＣ１１８部分配列ならびにｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を含む、複数の塩基配列（配列番号１１～２１）を合成した。以下では、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下にｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）を配置されたＣＡＬＢ発現ベクターの構築方法を説明する（図３も参照）。
１．合成した遺伝子配列を鋳型として、ｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片（全長の塩基配列は配列番号１１）をＰＣＲ法により増幅させた。具体的なプライマーの配列は、配列番号２２および配列番号２３に示した。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、増幅した断片を単離および精製した。
２．精製したｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
３．ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを鋳型として、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣからなる断片を、インバースＰＣＲ法により増幅させた。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２４および配列番号２５に示した。
４．２で得たｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片と、３で得たｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とをライゲーションした。これにより、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下に配列番号１の全長が配置されたＣＡＬＢ発現ベクター（比較例１－１）を構築した。
また、同様の手順によって、以下のプロモーター配列を有するＣＡＬＢ発現ベクターを構築した。具体的には、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１２～１８に変更したベクターが、それぞれ、比較例１－２～１－８に係るベクターである。また、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１９～２１に変更したベクターが、それぞれ、実施例１－１～１－３に係るベクターである。なお、以下の配列は、配置順が上流から下流になるように記載している。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の全長（比較例１－２）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第１０００位（比較例１－３）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第１０００位（比較例１－４）。
・配列番号１の第１位～第２９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第３００位～第１０００位（比較例１－５）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第８２５位（比較例１－６）。
・配列番号２の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－７）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－８）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－１）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第７８１位～第９０７位（実施例１－２）。
・配列番号１の第１位～第６２５位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－３）。
[Construction of CALB expression vector]
A plurality of base sequences (SEQ ID NOs: 11 to 21) were synthesized, including promoter-derived sequences of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpdA) and/or alcohol dehydrogenase gene (adh) derived from Aspergillus oryzae RIB40, Region III, a pUC118 partial sequence, and an hsp12 5'UTR partial sequence. Hereinafter, a method for constructing a CALB expression vector in which a gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) is located immediately downstream of Region III will be described (see also FIG. 3).
1. Using the synthesized gene sequence as a template, a gene fragment (full length base sequence is SEQ ID NO: 11) having a pUC118 partial sequence, a RegionIII, a gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and an hsp12 5'UTR partial sequence was amplified by PCR. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23. Next, the PCR product was subjected to agarose electrophoresis, and the amplified fragment was isolated and purified.
2. The purified gene fragment containing the pUC118 partial sequence, Region III, the gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and the hsp12 5'UTR partial sequence was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
3. Using the CALB expression control vector as a template, a fragment consisting of the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC was amplified by inverse PCR. The PCR product was then subjected to agarose electrophoresis, isolated and purified. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO:24 and SEQ ID NO:25.
The gene fragment having the pUC118 partial sequence, RegionIII, gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and hsp12 5'UTR partial sequence obtained in 4.2 was ligated with the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC fragment obtained in 3. This resulted in the construction of a CALB expression vector (Comparative Example 1-1) in which the full length of SEQ ID NO: 1 was located immediately downstream of RegionIII.
In addition, a CALB expression vector having the following promoter sequence was constructed by the same procedure. Specifically, the vectors in which the sequence of the gene fragment to be ligated with the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC fragment was changed to SEQ ID NOs: 12 to 18 are the vectors according to Comparative Examples 1-2 to 1-8, respectively. In addition, the vectors in which the sequence of the gene fragment to be ligated with the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC fragment was changed to SEQ ID NOs: 19 to 21 are the vectors according to Examples 1-1 to 1-3, respectively. The following sequences are described so that the arrangement order is from upstream to downstream.
Region III, full length of SEQ ID NO:2 (Comparative Example 1-2).
Region III, positions 600 to 1000 of SEQ ID NO: 1 (Comparative Example 1-3).
Region III, positions 600 to 1000 of SEQ ID NO:2 (Comparative Example 1-4).
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本項目で作製したＣＡＬＢ発現ベクターは、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターと比較すると、プロモーター配列のみが置換されていることになる。 Compared to the CALB expression control vector, the CALB expression vector prepared in this section has only the promoter sequence replaced.
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、Aspergillus oryzae NS4株（変異処理により取得した、ｎｉａＤおよびｓＣの二重欠損株）を、プロトプラスト－ＰＥＧ法にて形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
[Preparation of transformants]
Using the prepared vector, Aspergillus oryzae NS4 strain (a double-deficient strain of niaD and sC obtained by mutation treatment) was transformed by the protoplast-PEG method. From these, a transformant in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome was selected by the PCR method. The selected transformant was cultured in dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 ·7H 2 O) for 3 days, and the culture supernatant was used as a crude enzyme solution.
［ＣＡＬＢ活性の測定］
２５０μＬの１００％エタノールに５μＬｐ－ニトロフェニルブチレートを加え、ピペットで懸濁させた。この懸濁液を、蒸留水で５０ｍＬにメスアップすることにより、ＰＮＰＢ溶液を得た。次に、１５０μＬのＰＮＰＢ溶液と、５０μＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、基質溶液を得た。得られた基質溶液に、適宜稀釈した２μＬの粗酵素液を加え、反応を開始させた。反応温度は３７℃、反応時間は３分間とした。４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより、ＣＡＬＢ活性を測定した。その結果を表１に示す。なお、表１では、ｅｎｏＡ１４２プロモーターを有するコントロールベクターの活性に対する相対活性として、ＣＡＬＢ活性を表記している。ｅｎｏＡ１４２プロモーターとは、エノラーゼ遺伝子（ｅｎｏＡ）のプロモーターを制限酵素処理し、その間にＲｅｇｉｏｎＩＩＩを挿入したプロモーターである。
[Measurement of CALB activity]
5 μL p-nitrophenyl butyrate was added to 250 μL 100% ethanol and suspended with a pipette. This suspension was made up to 50 mL with distilled water to obtain a PNPB solution. Next, 150 μL of the PNPB solution was mixed with 50 μL of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a substrate solution. 2 μL of crude enzyme solution appropriately diluted was added to the obtained substrate solution to start the reaction. The reaction temperature was 37° C., and the reaction time was 3 minutes. CALB activity was measured by measuring the increase in absorbance at 400 nm. The results are shown in Table 1. In Table 1, CALB activity is expressed as a relative activity to the activity of a control vector having an enoA142 promoter. The enoA142 promoter is a promoter in which the promoter of the enolase gene (enoA) is treated with a restriction enzyme and Region III is inserted between them.
（結果）
実施例１－１～１－３に係るプロモーターは、コントロール（ｅｎｏＡ１４２プロモーター）よりも、ＣＡＬＢ活性を大幅に向上させることが判った。このことから、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順で配置されている、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＣＡＬＢの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
It was found that the promoters according to Examples 1-1 to 1-3 significantly improved CALB activity compared to the control (enoA142 promoter). This suggests that the promoter for filamentous fungi according to one embodiment of the present invention, in which the gpdA promoter-derived sequence, the enhancer sequence, and the adh promoter-derived sequence are arranged in this order, significantly increases the expression amount of CALB.
ｇｐｄＡプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－１、１－３、１－５、１－６において、発現効率は最大でコントロールの１．１倍であった。また、ａｄｈプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－２、１－４、１－７において、発現効率は最大でコントロールの１．３倍であった。これに対して、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩおよびａｄｈプロモーター由来配列の組合せを検討した実施例１－１～１－３では、発現効率は最大でコントロールの２．５倍に達した。 In Comparative Examples 1-1, 1-3, 1-5, and 1-6, in which the combination of the gpdA promoter-derived sequence and Region III was examined, the expression efficiency was up to 1.1 times that of the control. In Comparative Examples 1-2, 1-4, and 1-7, in which the combination of the adh promoter-derived sequence and Region III was examined, the expression efficiency was up to 1.3 times that of the control. In contrast, in Examples 1-1 to 1-3, in which the combination of the gpdA promoter-derived sequence, Region III, and the adh promoter-derived sequence was examined, the expression efficiency reached up to 2.5 times that of the control.
実施例１－１と実施例１－３とを比較すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、少なくとも第１位～第５９９位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。また、実施例１－１と比較例１－８とを比較すると、ａｄｈプロモーター由来配列は、少なくとも第８３１位～第９０７位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。これは、実施例１－１の領域には機能に必須の領域が含まれており、比較例１－８の領域には機能に必須の領域が含まれていないと考えられるためである。
Comparing Example 1-1 with Example 1-3 suggests that the gpdA promoter-derived sequence has the function of increasing expression efficiency if it contains at
〔実施例２：ＧＵＳ活性の比較〕
実施例２では、大腸菌由来β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
Example 2: Comparison of GUS activity
In Example 2, β-glucuronidase (GUS) derived from Escherichia coli was used as a reporter protein, and the effect of enhancing protein expression by the filamentous fungal promoter according to one embodiment of the present invention was examined.
［ＧＵＳ発現コントロールベクターの構築］
ＧＵＳを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、ＧＵＳ遺伝子断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２６および配列番号２７に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物とＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションすることにより、ＧＵＳ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of GUS expression control vector]
A control vector expressing GUS was constructed as follows.
1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. The pSENSU2512/PmlI-XbaI digest was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
2. Using pBI221 (Clontech) as a template, the GUS gene was amplified by PCR. Next, the GUS gene fragment was isolated and purified by agarose electrophoresis. The primers used at this time were designed so that the 5'UTR of hsp12 was full-length by including TCGCAAAC at the 5' end of the fragment to be amplified, an XbaI site was located at the 3' end of the GUS gene fragment, and GGG was located at the 3' end of the fragment. The specific primer sequences are shown in SEQ ID NO:26 and SEQ ID NO:27.
3. The purified GUS gene fragment was digested with XbaI. The GUS/XbaI digest was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
4. A GUS expression control vector was constructed by ligating pSENSU2512/PmlI-XbaI digest with GUS/XbaI digest.
［ＧＵＳ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３０および配列番号３１に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる遺伝子断片と、３で得たＧＵＳ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＧＵＳ発現ベクターは、ＧＵＳ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
[Construction of GUS expression vector]
A GUS expression vector having the same promoter as in Example 1-1 (promoter arranged in this order at
1. Using the vector prepared in Example 1-1 as a template, a fragment consisting of T-2512-sC-pUC-
2. The GUS gene was amplified by PCR using pBI221 (Clontech) as a template. The GUS gene fragment was then isolated and purified by agarose electrophoresis. The specific primer sequences are shown in SEQ ID NO:30 and SEQ ID NO:31.
3. The purified GUS gene fragment was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
The gene fragment consisting of T-2512-sC-pUC-
［形質転換体の作製およびＧＵＳ活性の比較］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法により、Aspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入されている形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて２日間培養した。その後、形質転換体を集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですり潰して、粗酵素液を得た。粗酵素液のＧＵＳ活性は、公知の方法（Proc Natl Acad Sci (1986) Vol.83,No.22, pp.8447-8451）に準じて測定した。
[Preparation of transformants and comparison of GUS activity]
Aspergillus oryzae was transformed with the prepared vector by the protoplast-PEG method. From these, transformants in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome were selected by the PCR method. The selected transformants were cultured in a dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 .7H 2 O) for 2 days. Thereafter, the transformants were collected and ground in liquid nitrogen using a mortar to obtain a crude enzyme solution. The GUS activity of the crude enzyme solution was measured according to a known method (Proc Natl Acad Sci (1986) Vol. 83, No. 22, pp. 8447-8451).
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＧＵＳ発現ベクターを使用した場合のＧＵＳ活性は、コントロールのＧＵＳ活性の１．５倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＧＵＳの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
When a GUS expression vector having the same promoter as in Example 1-1 was used, the GUS activity was 1.5 times that of the control, suggesting that the promoter for filamentous fungi according to one embodiment of the present invention significantly increases the expression level of GUS.
〔実施例３：Ｌａｃ活性の比較〕
実施例３では、Aspergillus oryzae由来ラクターゼ（Ｌａｃ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
Example 3: Comparison of Lac activity
In Example 3, lactase (Lac) derived from Aspergillus oryzae was used as a reporter protein, and the effect of enhancing protein expression by the filamentous fungal promoter according to one embodiment of the present invention was examined.
［Ｌａｃ発現コントロールベクターの構築］
Ｌａｃを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２を、ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、Ｌａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３２および配列番号３３に示した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物と、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションした。これにより、Ｌａｃ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of Lac expression control vector]
A control vector expressing Lac was constructed as follows.
1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. Then, the pSENSU2512/PmlI-XbaI digest was isolated and purified by agarose electrophoresis.
2. Using genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 by a conventional method as a template, the Lac gene fragment was amplified by PCR. The fragment was then isolated and purified by agarose electrophoresis. The primers used at this time were designed so that the 5'UTR of hsp12 was full-length by including TCGCAAAC at the 5' end of the fragment to be amplified, an XbaI site was located at the 3' end of the fragment, and GGG was located at the 3' end of the fragment. The specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
3. The purified Lac gene fragment was digested with XbaI. The Lac/XbaI digest was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
4. The pSENSU2512/PmlI-XbaI digest was ligated to the Lac/XbaI digest to construct a Lac expression control vector.
［Ｌａｃ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３４および配列番号３５に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＬａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動を行って、断片を単離および精製した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ断片と、３で得たＬａｃ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＬａｃ発現ベクターは、Ｌａｃ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
[Construction of Lac expression vector]
A Lac expression vector having the same promoter as in Example 1-1 (promoter arranged in this order at
1. Using the vector prepared in Example 1-1 as a template, a fragment consisting of T-2512-sC-pUC-
2. Using genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 by a conventional method as a template, a Lac gene fragment was amplified by PCR using primers set forth in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35. The fragment was then isolated and purified by agarose electrophoresis.
3. The purified Lac gene fragment was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
The T-2512-sC-pUC-
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法によりAspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
[Preparation of transformants]
Using the prepared vector, Aspergillus oryzae was transformed by the protoplast-PEG method. From these, a transformant in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome was selected by the PCR method. The selected transformant was cultured in a dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 ·7H 2 O) for 3 days, and the culture supernatant was used as a crude enzyme solution.
［Ｌａｃ活性の比較］
２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させて、５．７ｍＭ基質溶液を調製した。１７５μＬの基質溶液に、適宜稀釈した粗酵素液を２５μＬ加え、反応を開始させた。反応温度は３０℃、反応時間は１０分間とした。反応後、５０μＬの１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、Ｌａｃ活性を測定した。
[Comparison of Lac activity]
2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 4.5) to prepare a 5.7 mM substrate solution. 25 μL of an appropriately diluted crude enzyme solution was added to 175 μL of the substrate solution to initiate the reaction. The reaction temperature was 30° C., and the reaction time was 10 minutes. After the reaction, 50 μL of 1M sodium carbonate solution was added. Lac activity was measured by measuring the absorbance at 415 nm.
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＬａｃ発現ベクターを使用した場合のＬａｃ活性は、コントロールのＬａｃ活性の１．６倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、Ｌａｃの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
When the Lac expression vector having the same promoter as in Example 1-1 was used, the Lac activity was 1.6 times that of the control, suggesting that the promoter for filamentous fungi according to one embodiment of the present invention significantly increases the expression amount of Lac.
実施例１～３の結果から、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによれば、糸状菌の細胞中において、広汎なタンパク質を高発現させられることが示唆される。 The results of Examples 1 to 3 suggest that the filamentous fungal promoter according to one embodiment of the present invention can be used to highly express a wide range of proteins in filamentous fungal cells.
本発明は、例えば、糸状菌を用いたタンパク質の生産に利用できる。 The present invention can be used, for example, to produce proteins using filamentous fungi.
１ ｇｐｄＡプロモーター由来配列
２ ａｄｈプロモーター由来配列
５ エンハンサー配列
７ 目的タンパク質をコードする配列
１０ 糸状菌用プロモーター
1 gpdA promoter-derived
Claims (6)
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）、（Ａ３）または（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）、（Ｂ３）または（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１～６０個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ３）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１～８個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ３）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 A promoter for a filamentous fungus having promoter activity in a filamentous fungal cell,
A polynucleotide comprising a gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and an adh promoter-derived sequence linked in this order;
The gpdA promoter-derived sequence is any one of the following (A1), (A3), or (A4) :
The adh promoter-derived sequence is a promoter for filamentous fungi, which is any one of the following (B1), (B3) and (B4) :
(A1) a polynucleotide comprising at least the 1st to 599th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:1 ;
(A3) A polynucleotide having a nucleotide sequence shown in (A1) above in which 1 to 60 nucleotides have been substituted, deleted or added , and which has promoter activity in a filamentous fungal cell when said polynucleotide, an enhancer sequence and the polynucleotide shown in (B1) below are linked in this order ;
(A4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) above, and having promoter activity under the same conditions as ( A3 ) above;
(B1) a polynucleotide comprising at least the 831st to 907th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO:2 ;
(B3) A polynucleotide in which 1 to 8 bases are substituted, deleted or added among the base sequence shown in (B1) above , and which has promoter activity in a filamentous fungal cell when the polynucleotide of (A1) above, an enhancer sequence and the polynucleotide are linked in this order;
(B4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) above, and having promoter activity under the same conditions as ( B3 ) above.
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