JP7540709B2 - 糸状菌用プロモーターおよびその利用 - Google Patents
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Description
本発明は糸状菌用プロモーターおよびその利用に関する。
従来遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主として、糸状菌を採用する技術が知られている。この技術においては、タンパク質を高発現させるために、種々の有用なプロモーターが探求されている。例えば、特許文献１には、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）のプロモーターが開示されている。また、特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーターが開示されている。
しかし、上記のような従来技術には、タンパク質の発現効率をさらに高める余地が残されていた。
そこで、本発明の一態様は、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターを提供することを目的とする。
本発明者らは鋭意検討した結果、ｇｐｄＡプロモーター由来配列中の特定の配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列中の特定の配列をこの順番で配置したプロモーターが、従来使用されている強力なプロモーターよりも遥かに強力なプロモーター活性を有していることを見出した。すなわち、本発明は以下の構成を含む。
＜１＞
糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する糸状菌用プロモーターであって、
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ２）上記（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ２）上記（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
＜２＞
上記エンハンサー配列が、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、＜１＞に記載の糸状菌用プロモーター。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の糸状菌用プロモーターを含む、ベクター。
＜４＞
＜３＞に記載のベクターに含まれる糸状菌用プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
＜５＞
＜４＞に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
＜６＞
＜５＞に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
＜１＞
糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する糸状菌用プロモーターであって、
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ２）上記（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ２）上記（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
＜２＞
上記エンハンサー配列が、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、＜１＞に記載の糸状菌用プロモーター。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の糸状菌用プロモーターを含む、ベクター。
＜４＞
＜３＞に記載のベクターに含まれる糸状菌用プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
＜５＞
＜４＞に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
＜６＞
＜５＞に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
本発明の一態様によれば、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターが提供される。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明は以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例も、本発明の技術的範囲に含まれる。本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
本明細書では、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合に基づいて説明する。なお、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、以下の説明において「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」に読み替えればよい。
本明細書では、注目するＤＮＡ鎖の５’末端側を「上流」、３’末端側を「下流」と表現している場合がある。例えば、「配列Ａの上流に」とは、「配列Ａの５’末端側に」を意味する。「配列Ａの下流に」とは、「配列Ａの３’末端側に」を意味する。「上流から下流に」とは、「５’末端側から３’末端側に」を意味する。
本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。ＲＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、ｍＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、種々のＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡおよびＤＮＡは、任意の構造を取りうる（二本鎖または一本鎖など）。
〔１．糸状菌用プロモーター〕
図１は、本発明の一態様に係る糸状菌用プロモーター１０を含むポリヌクレオチドの構造を模式的に示した図である。糸状菌用プロモーター１０は、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１、エンハンサー配列５、およびａｄｈプロモーター由来配列２を有している。これらの配列は、上流から下流に、上記の順番で配置されている。
図１は、本発明の一態様に係る糸状菌用プロモーター１０を含むポリヌクレオチドの構造を模式的に示した図である。糸状菌用プロモーター１０は、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１、エンハンサー配列５、およびａｄｈプロモーター由来配列２を有している。これらの配列は、上流から下流に、上記の順番で配置されている。
糸状菌用プロモーター１０は、目的タンパク質をコードする配列７にコードされているタンパク質の発現を、従来のプロモーターよりも遥かに高める。目的タンパク質をコードする配列７は、糸状菌用プロモーター１０の下流に配置されている。なお、図１に表されているポリヌクレオチドは、細胞内に存在していてもよいし（形質転換体など）、細胞外に存在していてもよい（ベクターなど）。図１のポリヌクレオチドがベクターを表している場合、当該ベクターを糸状菌に導入して形質転換させることにより、形質転換体が得られる。
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号１は、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号１に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位の塩基」とは、「ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準として、第－１０００位～第－４０２位の塩基」に該当する。
ａｄｈプロモーター由来配列２は、配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号２は、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号２に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位の塩基」とは、「ａｄｈの翻訳開始コドンを基準として、第－１７０位～第－９４位の塩基」に該当する。
なお、本明細書では特記しない限り、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１に関連する塩基の位置は、配列番号１に基づく塩基の位置を記載する。また、ａｄｈプロモーター由来配列２に関連する塩基の位置は、配列番号２に基づく塩基の位置を記載する。
［１．１．ｇｐｄＡプロモーター由来配列］
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ａ１）
配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ａ２）
（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ３）
（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ４）
（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ａ１）
配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ａ２）
（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ３）
（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ４）
（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ａ２）～（Ａ４）は、（Ａ１）のバリアントに該当する。以下、（Ａ１）～（Ａ４）で使用されている表現について、個別に説明する。
「配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ａ１）の長さは、６５０ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）の塩基配列は、配列番号１の第１位～第５９９位の塩基配列を含み、かつ、配列番号１の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ａ１）の終点は、配列番号１の、第５９９位～第６２５位の範囲、第５９９位～第６５０位の範囲、第５９９位～第７００位の範囲、第５９９位～第８００位の範囲、第５９９位～第９００位の範囲、または、第５９９位～第１０００位の範囲に存在しうる。
ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ａ１）の長さは、６５０ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）の塩基配列は、配列番号１の第１位～第５９９位の塩基配列を含み、かつ、配列番号１の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ａ１）の終点は、配列番号１の、第５９９位～第６２５位の範囲、第５９９位～第６５０位の範囲、第５９９位～第７００位の範囲、第５９９位～第８００位の範囲、第５９９位～第９００位の範囲、または、第５９９位～第１０００位の範囲に存在しうる。
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１（ポリヌクレオチド（Ａ１）～（Ａ４））の全長は、８００ｂｐ以下または９００ｂｐ以下が好ましい。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。ここで、１×ＳＳＣの組成は、塩化ナトリウム：１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム：１５ｍＭである。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。ここで、１×ＳＳＣの組成は、塩化ナトリウム：１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム：１５ｍＭである。
「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」
本明細書において、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」とは、糸状菌細胞内における特定のタンパク質の発現量を、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量よりも高めることを意味する。例えば、糸状菌用プロモーター１０によるタンパク質の発現量は、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量の、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上または２．５倍以上でありうる。タンパク質の発現量は、タンパク質の種類に応じた適当な公知の手段により、測定できる。なお、ｅｎｏＡ１４２プロモーターに関しては、［Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1),206-208, 2005］を参照（当該文献中で、ｅｎｏＡ１４２プロモーターは、「P-enoA142f」と表記されている）。
本明細書において、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」とは、糸状菌細胞内における特定のタンパク質の発現量を、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量よりも高めることを意味する。例えば、糸状菌用プロモーター１０によるタンパク質の発現量は、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量の、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上または２．５倍以上でありうる。タンパク質の発現量は、タンパク質の種類に応じた適当な公知の手段により、測定できる。なお、ｅｎｏＡ１４２プロモーターに関しては、［Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1),206-208, 2005］を参照（当該文献中で、ｅｎｏＡ１４２プロモーターは、「P-enoA142f」と表記されている）。
（Ａ３）および（Ａ４）における、「（Ａ２）と同条件」とは、「（Ａ３）または（Ａ４）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。
「複数個の塩基（Ａ３）」
ポリヌクレオチド（Ａ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
ポリヌクレオチド（Ａ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
「配列同一性」
本明細書において、「配列同一性」とは、同一の塩基数の割合を意味する。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
本明細書において、「配列同一性」とは、同一の塩基数の割合を意味する。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
塩基配列の配列同一性は、例えば、BLASTNを利用して決定することができる（Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403-410）。BLASTNによって塩基配列を解析する際のパラメーターは、例えば、score＝100, wordlength＝12を採用できる。これらの解析方法の具体的な手法は周知である。比較対象となる塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失を許容してもよい。
［１．２．ａｄｈプロモーター由来配列］
ａｄｈプロモーター由来配列２は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ｂ１）
配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ｂ２）
（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ３）
（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ４）
（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
ａｄｈプロモーター由来配列２は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ｂ１）
配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ｂ２）
（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ３）
（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ４）
（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ｂ２）～（Ｂ４）は、（Ｂ１）のバリアントに該当する。以下、（Ｂ１）～（Ｂ４）で使用されている表現について、個別に説明する。
「配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の長さは、１００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の塩基配列は、配列番号２の第８３１位～第９０７位の塩基配列を含み、かつ、配列番号２の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の始点は、配列番号２の、第１位～第８３１位、第１０１位～第８３１位、第２０１位～第８３１位、第３０１位～第８３１位、第４０１位～第８３１位、第５０１位～第８３１位、第６０１位～第８３１位、第７０１位～第８３１位、第７８１位～第８３１位、または、第８０１位～第８３１位の範囲に存在しうる。また、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の終点は、配列番号２の、第９０７位～第９２０位、第９０７位～第９４０位、第９０７位～第９６０位、第９０７位～第９８０位、または、第９０７位～第１０００位の範囲に存在しうる。
ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の長さは、１００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の塩基配列は、配列番号２の第８３１位～第９０７位の塩基配列を含み、かつ、配列番号２の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の始点は、配列番号２の、第１位～第８３１位、第１０１位～第８３１位、第２０１位～第８３１位、第３０１位～第８３１位、第４０１位～第８３１位、第５０１位～第８３１位、第６０１位～第８３１位、第７０１位～第８３１位、第７８１位～第８３１位、または、第８０１位～第８３１位の範囲に存在しうる。また、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の終点は、配列番号２の、第９０７位～第９２０位、第９０７位～第９４０位、第９０７位～第９６０位、第９０７位～第９８０位、または、第９０７位～第１０００位の範囲に存在しうる。
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ａｄｈプロモーター由来配列２（ポリヌクレオチド（Ｂ１）～（Ｂ４））の全長は、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下または７００ｂｐ以下が好ましい。
「複数個の塩基（Ｂ３）」
ポリヌクレオチド（Ｂ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
ポリヌクレオチド（Ｂ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
「（Ｂ２）と同条件」
（Ｂ３）および（Ｂ４）における、「（Ｂ２）と同条件」とは、「（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ３）または（Ｂ４）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。
（Ｂ３）および（Ｂ４）における、「（Ｂ２）と同条件」とは、「（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ３）または（Ｂ４）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」および「配列同一性」に関する説明は、［１．１．］節の説明が援用される。
［１．３．エンハンサー配列］
本明細書において「エンハンサー配列」とは、タンパク質の発現を正に調節する塩基配列を意味する。エンハンサー配列５をｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置することにより、目的タンパク質をコードする配列７の転写活性が上昇し、結果として目的タンパク質が高発現するようになる。
本明細書において「エンハンサー配列」とは、タンパク質の発現を正に調節する塩基配列を意味する。エンハンサー配列５をｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置することにより、目的タンパク質をコードする配列７の転写活性が上昇し、結果として目的タンパク質が高発現するようになる。
エンハンサー配列５の具体的な配列は、特に限定されない。エンハンサー配列５の例としては、［化学と生物(2019) Vol.57, No.9, pp.532-540］に記載の配列が挙げられる。より具体的には、ＣＧＧＮ8ＣＧＧ、ＣＣＧＮ2ＣＣＮ6ＧＧ、ＣＧＧＮ8ＣＣＧ、ＣＧＧＮ11ＣＣＧ、ＣＧＧＮＴＡＡＷ、ＴＴＡＧＳＣＴＡＡ、ＧＧＣＴＡＲ、ＧＧＣＷＷＷ、ＧＧＮＴＡＡＡ、ＣＧＧＤＴＡＡＷが挙げられる。
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列（５’－ＣＧＧＮＮＡＴＴＴＡ－３’；Ｎは任意の塩基を表す）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列からなる。一実施形態において、配列番号３中の「ＮＮ」は、「ＧＣ」である。
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示されている塩基配列（５’－ＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴ－３’）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示される塩基配列からなる。
一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが配置されてなる塩基配列である。一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが、交互に複数回配置されてなる配列である。配列番号３および配列番号４に示される塩基配列は、合計で、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上、配置されていてもよい。また、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列との間には、任意構成のスペーサー配列が挿入されていてもよい。スペーサー配列の長さは、例えば、８０ｂｐ以下、７０ｂｐ以下、６０ｂｐ以下または５０ｂｐ以下とすることができる。以上を総合すると、一実施形態において、エンハンサー配列５は、下記の構造を取る。
５’－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）・・・－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－３’。
５’－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）・・・－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－３’。
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号５に示される塩基配列である。配列番号５に示される塩基配列は、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列を、それぞれ１２個ずつ含んでいる。本明細書では、配列番号５に示されるエンハンサー配列を、「ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ」と称する。
図１では、エンハンサー配列５は１個のみ描かれている。しかし、２個以上のエンハンサー配列５を、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置してもよい。この場合、同じ配列のエンハンサー配列５を採用してもよいし、異なる配列のエンハンサー配列５を組合せて採用してもよい。また、上記に例示したエンハンサー配列は、逆位に挿入してもよい。すなわち、上記に例示したエンハンサー配列の、５’末端と３’末端を入れ替えた配列をエンハンサー配列５として採用してもよい。
［１．４．糸状菌］
糸状菌用プロモーター１０を適用する糸状菌は、特に限定されない。すなわち、本発明の一態様に係る形質転換方法を適用する糸状菌、および、本発明の一態様に係る形質転換体の宿主となる糸状菌は、特に限定されない。
糸状菌用プロモーター１０を適用する糸状菌は、特に限定されない。すなわち、本発明の一態様に係る形質転換方法を適用する糸状菌、および、本発明の一態様に係る形質転換体の宿主となる糸状菌は、特に限定されない。
糸状菌の例としては、アスペルギルス属糸状菌、ペニシリウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、リゾプス属糸状菌、ムコール属糸状菌、モナスカス属糸状菌、フザリウム属糸状菌が挙げられる。中でも、糸状菌用プロモーター１０は、アスペルギルス属糸状菌において奏効しうる。これは、糸状菌用プロモーター１０が、アスペルギルス・オリゼ由来の塩基配列から構成されているためである。
アスペルギルス属糸状菌の例としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）が挙げられる。
ペニシリウム属糸状菌の例としては、ペニシリウム・カマンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・ノタトウム（Penicillium notatum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、ペニシリウム・パルロゼナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）が挙げられる。
トリコデルマ属糸状菌の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）が挙げられる。
リゾプス属糸状菌の例としては、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）が挙げられる。
ムコール属糸状菌の例としては、ムコール・エスピー（Mucor sp.）が挙げられる。
モナスカス属糸状菌の例としては、モナスカス・パープレウス（Monascus purpureus）が挙げられる。
フザリウム属糸状菌の例としては、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）が挙げられる。
〔２．ベクター〕
本発明の一態様に係るベクターは、糸状菌用プロモーター１０を含んでいる。このベクターは、糸状菌用プロモーター１０の下流側に、目的タンパク質をコードする遺伝子７を有していてもよい（図１を参照）。目的タンパク質をコードする遺伝子７がベクターに含まれる場合、当該ベクターで糸状菌を組換えることにより、目的タンパク質を高発現する形質転換体が得られる。
本発明の一態様に係るベクターは、糸状菌用プロモーター１０を含んでいる。このベクターは、糸状菌用プロモーター１０の下流側に、目的タンパク質をコードする遺伝子７を有していてもよい（図１を参照）。目的タンパク質をコードする遺伝子７がベクターに含まれる場合、当該ベクターで糸状菌を組換えることにより、目的タンパク質を高発現する形質転換体が得られる。
本発明の一実施形態に係るベクターの具体的な形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドが挙げられる。プラスミドベクターの形状は、環状であってもよいし、鎖状であってもよい。
本発明の一実施形態に係るベクターを構成するポリヌクレオチドの由来は、特に限定されない。例えば、本発明を食品などに応用する場合には、セルフクローニングを行うことが好ましいといえる。セルフクローニングを行う場合、ベクターを構成する各ポリヌクレオチドは、当該ベクターが導入される宿主と同一（同種）の生物由来である。糸状菌用プロモーター１０はアスペルギルス・オリゼ由来であるため、上述の場合には、ベクターを構成するポリヌクレオチドは、アスペルギルス属糸状菌由来であることが好ましく、アスペルギルス・オリゼ由来であることがより好ましい。
本発明の一実施形態に係るベクターを構成する、それぞれのポリヌクレオチドは、公知の技術によって取得できる。例えば、公知の配列情報に基づいて、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅手段を用いて、目的の配列を取得できる。あるいは、糸状菌の染色体ＤＮＡライブラリーからのクローニングによっても取得できる。
［２．１．目的タンパク質］
目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質の例としては、糸状菌由来の細胞内タンパク質、分泌タンパク質、原核生物由来タンパク質、真核生物由来タンパク質が挙げられる。より具体的な例としては、酵素（α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなど）、リボソーム構成タンパク質、トランスポーター、シャペロン、転写調節因子が挙げられる。機能未知のタンパク質を、目的タンパク質としてもよい。また、レポーターを目的タンパク質としてもよい。
目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質の例としては、糸状菌由来の細胞内タンパク質、分泌タンパク質、原核生物由来タンパク質、真核生物由来タンパク質が挙げられる。より具体的な例としては、酵素（α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなど）、リボソーム構成タンパク質、トランスポーター、シャペロン、転写調節因子が挙げられる。機能未知のタンパク質を、目的タンパク質としてもよい。また、レポーターを目的タンパク質としてもよい。
本発明の一実施形態に係るベクターは、宿主糸状菌細胞内で目的タンパク質を発現させるための発現単位を１つ以上含んでいる。発現単位には、プロモーター領域（糸状菌用プロモーター１０など）、目的タンパク質をコードする遺伝子７のオープンリーディングフレーム、ターミネーター領域が含まれる。
［２．２．その他の配列］
本発明の一実施形態に係るベクターは、本技術分野で公知の、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点、目的遺伝子を導入する際に使用する制限酵素認識配列などを付加することができる。また、目的タンパク質をコードする遺伝子７と、その他のタンパク質（グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡなど）をコードする遺伝子とを連結してもよい。このような構成とすれば、目的タンパク質と上記その他のタンパク質との融合タンパク質を発現させることができる。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離できる。
本発明の一実施形態に係るベクターは、本技術分野で公知の、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点、目的遺伝子を導入する際に使用する制限酵素認識配列などを付加することができる。また、目的タンパク質をコードする遺伝子７と、その他のタンパク質（グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡなど）をコードする遺伝子とを連結してもよい。このような構成とすれば、目的タンパク質と上記その他のタンパク質との融合タンパク質を発現させることができる。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離できる。
本発明の一実施形態に係るベクターは、１個以上の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーとしては、糸状菌形質転換体の選択に一般的に使用されているマーカーを利用できる。具体例としては、ｎｉａＤ、ｓＣ、ａｒｇＢ、ａｄｅＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧが挙げられる。また、大腸菌などの細菌培養用の薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子など）を選択マーカーとしてもよい。選択マーカーを利用して、上記ベクターが宿主細胞に導入されたか否かを確認できる。
目的タンパク質を、選択マーカーとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を選択マーカーとして用い、目的タンパク質をＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
本発明の一実施形態に係るベクターは、制限酵素認識配列を含んでいてもよい。ベクター内に１箇所のみ存在し、かつ標的配列の内部に存在しない制限酵素認識配列は、当該標的配列をベクター内に導入する際に利用できる。ベクターの汎用性を考慮すると、制限酵素認識配列は、認識部位の出現頻度が少ない６塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることが好ましく、８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることがより好ましい。６塩基を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ）、ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）、ＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ）、ＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、ＣＣＡＴＧＧ（ＮｃｏＩ）、ＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩ）、ＣＡＣＧＴＧ（ＰｍｌＩ）、ＧＣＡＴＧＣ（ＳｐｈＩ）、ＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ）、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）が挙げられる。８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＣＧＣＧＣＣ（ＡｓｃＩ）、ＧＣＧＡＴＣＧＣ（ＡｓｉＳＩ）、ＧＧＣＣＧＧＣＣ（ＦｓｅＩ）、ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）、ＴＴＡＡＴＴＡＡ（ＰａｃＩ）、ＧＴＴＴＡＡＡＣ（ＰｍｅＩ）、ＣＣＴＧＣＡＧＧ（ＳｂｆＩ）、ＧＣＣＣＧＧＧＣ（ＳｒｆＩ）、ＡＴＴＴＡＡＡＴ（ＳｗａＩ）が挙げられる。
本発明の一実施形態に係るベクターは、相同組換えを行わせるために必要な宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドの長さは、特に限定されない。相同組換えの効率を考えると、２００ｂｐ～２００００ｂｐであることが好ましく、５００ｂｐ～１００００ｂｐであることがより好ましい。２００ｂｐ以上の長さがあれば、相同組換えを効率よく生じさせられる。２００００ｂｐ以下の長さであれば、ベクターを宿主糸状菌の細胞内に効率よく取込ませることができる。
〔３．形質転換方法、形質転換体およびタンパク質の生産方法〕
本発明の一態様に係る形質転換方法は、〔２〕節で説明したベクターで、糸状菌を形質転換する。このベクターは、上流から順に、糸状菌用プロモーター１０と、目的タンパク質をコードする遺伝子７とを含んでいる。この形質転換方法によって、本発明の一態様に係る形質転換体が得られる。また、この形質転換体を培養することによって、本発明の一態様に係るタンパク質の生産方法が実施できる。これらの実施形態によれば、目的タンパク質を高効率で生産できる。
本発明の一態様に係る形質転換方法は、〔２〕節で説明したベクターで、糸状菌を形質転換する。このベクターは、上流から順に、糸状菌用プロモーター１０と、目的タンパク質をコードする遺伝子７とを含んでいる。この形質転換方法によって、本発明の一態様に係る形質転換体が得られる。また、この形質転換体を培養することによって、本発明の一態様に係るタンパク質の生産方法が実施できる。これらの実施形態によれば、目的タンパク質を高効率で生産できる。
本発明の一実施形態に係る形質転換方法において、糸状菌を形質転換する方法には、公知の方法が適宜採用される。具体例としては、カルシウム－ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
本発明の一実施形態に係る形質転換体において、宿主となる糸状菌の例としては、上述した糸状菌が挙げられる。
本発明の一実施形態に係るタンパク質の生産方法において、形質転換体を培養する方法は、糸状菌の培養方法に通常用いられる培地、培養条件を適宜選択すればよい。形質転換体の培養は、固体培養であっても液体培養であってもよい。培養に用いる培地の例としては、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、Czapek-dox培地（０．２％ ＮａＮＯ３、０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳＯ４、３％ グルコースまたは３％ デンプン、ｐＨ５．５）、フスマ培地（小麦フスマ、水分含量４０％）が挙げられる。培養温度は、形質転換体が生育できる範囲内の適当な温度を採用できる。培養温度の一例を挙げると、２０～３７℃である。
本発明の一実施形態に係る形質転換体の培養物には、目的タンパク質が含まれている。必要に応じて、目的タンパク質を定性分析または定量分析してもよい。あるいは、培養物から目的タンパク質を単離または精製してもよい。
形質転換体を液体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、菌体培養液そのものを回収して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。形質転換体を固体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、適当な緩衝液を用いて培養物から目的タンパク質を含む溶液を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。菌体内に目的タンパク質が蓄積されている場合には、菌体を公知の手段で破砕し、適当な緩衝液を用いて目的タンパク質を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。糸状菌を用いたタンパク質生産系の場合、目的タンパク質は分泌される場合が多い。
上記のようにして回収した目的タンパク質をさらに精製する場合は、例えば、タンパク質を含む溶液を公知の方法によって精製すればよい。このような方法の例としては、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーが挙げられる。タンパク質の精製には、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が好ましく採用される。
［コントロールベクターの構築］
本実施例では、コントロールベクターとして、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を使用した。このベクターは、既知の強力な改良プロモーターであるｅｎｏＡ１４２プロモーターを有しており、目的遺伝子を高発現できる。ｐＳＥＮＳＵ２５１２の構築手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ（Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.）を、ＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ／ＸｂａＩ－ＳｍａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて２－５－１２ターミネーター（Ｔ－２５１２；日本国特許第５，６８６，９７４号を参照）を増幅させた。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にＸｂａＩサイト、当該断片の３’末端側にＳｍａＩサイト、当該断片の両端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号６および配列番号７に示した。
３．Ｔ－２５１２の断片をＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵのＸｂａＩ－ＳｍａＩサイトにライゲーションすることにより、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を構築した。
本実施例では、コントロールベクターとして、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を使用した。このベクターは、既知の強力な改良プロモーターであるｅｎｏＡ１４２プロモーターを有しており、目的遺伝子を高発現できる。ｐＳＥＮＳＵ２５１２の構築手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ（Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.）を、ＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ／ＸｂａＩ－ＳｍａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて２－５－１２ターミネーター（Ｔ－２５１２；日本国特許第５，６８６，９７４号を参照）を増幅させた。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にＸｂａＩサイト、当該断片の３’末端側にＳｍａＩサイト、当該断片の両端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号６および配列番号７に示した。
３．Ｔ－２５１２の断片をＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵのＸｂａＩ－ＳｍａＩサイトにライゲーションすることにより、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を構築した。
〔実施例１：ＣＡＬＢ活性の比較〕
実施例１では、Candida antarctica由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）をレポータータンパク質として、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
実施例１では、Candida antarctica由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）をレポータータンパク質として、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
［ＣＡＬＢ発現コントロールベクターの構築］
ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化することにより、ｈｓｐ１２の５’ＵＴＲとターミネーターとの間に、レポーター遺伝子としてＣＡＬＢを導入した。具体的な手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．合成したＣＡＬＢ遺伝子（塩基配列は配列番号８）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＡＬＢ遺伝子断片を増幅させた。この鋳型は、ＣＡＬＢの分泌シグナルを、αアミラーゼの分泌シグナルに置換したものである。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトを配置し、当該断片の３’末端にＧＧＧが付加されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号９および配列番号１０に示した。
３．得られたＣＡＬＢ遺伝子断片をＸｂａＩ消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵ２５１２のＰｍｌＩ－ＸｂａＩサイトにライゲーションすることにより、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを構築した。
ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化することにより、ｈｓｐ１２の５’ＵＴＲとターミネーターとの間に、レポーター遺伝子としてＣＡＬＢを導入した。具体的な手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．合成したＣＡＬＢ遺伝子（塩基配列は配列番号８）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＡＬＢ遺伝子断片を増幅させた。この鋳型は、ＣＡＬＢの分泌シグナルを、αアミラーゼの分泌シグナルに置換したものである。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトを配置し、当該断片の３’末端にＧＧＧが付加されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号９および配列番号１０に示した。
３．得られたＣＡＬＢ遺伝子断片をＸｂａＩ消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵ２５１２のＰｍｌＩ－ＸｂａＩサイトにライゲーションすることにより、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを構築した。
［ＣＡＬＢ発現ベクターの構築］
Aspergillus oryzae RIB40由来のグリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｐＵＣ１１８部分配列ならびにｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を含む、複数の塩基配列（配列番号１１～２１）を合成した。以下では、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下にｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）を配置されたＣＡＬＢ発現ベクターの構築方法を説明する（図３も参照）。
１．合成した遺伝子配列を鋳型として、ｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片（全長の塩基配列は配列番号１１）をＰＣＲ法により増幅させた。具体的なプライマーの配列は、配列番号２２および配列番号２３に示した。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、増幅した断片を単離および精製した。
２．精製したｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
３．ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを鋳型として、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣからなる断片を、インバースＰＣＲ法により増幅させた。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２４および配列番号２５に示した。
４．２で得たｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片と、３で得たｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とをライゲーションした。これにより、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下に配列番号１の全長が配置されたＣＡＬＢ発現ベクター（比較例１－１）を構築した。
また、同様の手順によって、以下のプロモーター配列を有するＣＡＬＢ発現ベクターを構築した。具体的には、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１２～１８に変更したベクターが、それぞれ、比較例１－２～１－８に係るベクターである。また、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１９～２１に変更したベクターが、それぞれ、実施例１－１～１－３に係るベクターである。なお、以下の配列は、配置順が上流から下流になるように記載している。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の全長（比較例１－２）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第１０００位（比較例１－３）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第１０００位（比較例１－４）。
・配列番号１の第１位～第２９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第３００位～第１０００位（比較例１－５）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第８２５位（比較例１－６）。
・配列番号２の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－７）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－８）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－１）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第７８１位～第９０７位（実施例１－２）。
・配列番号１の第１位～第６２５位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－３）。
Aspergillus oryzae RIB40由来のグリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｐＵＣ１１８部分配列ならびにｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を含む、複数の塩基配列（配列番号１１～２１）を合成した。以下では、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下にｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）を配置されたＣＡＬＢ発現ベクターの構築方法を説明する（図３も参照）。
１．合成した遺伝子配列を鋳型として、ｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片（全長の塩基配列は配列番号１１）をＰＣＲ法により増幅させた。具体的なプライマーの配列は、配列番号２２および配列番号２３に示した。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、増幅した断片を単離および精製した。
２．精製したｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
３．ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを鋳型として、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣからなる断片を、インバースＰＣＲ法により増幅させた。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２４および配列番号２５に示した。
４．２で得たｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片と、３で得たｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とをライゲーションした。これにより、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下に配列番号１の全長が配置されたＣＡＬＢ発現ベクター（比較例１－１）を構築した。
また、同様の手順によって、以下のプロモーター配列を有するＣＡＬＢ発現ベクターを構築した。具体的には、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１２～１８に変更したベクターが、それぞれ、比較例１－２～１－８に係るベクターである。また、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１９～２１に変更したベクターが、それぞれ、実施例１－１～１－３に係るベクターである。なお、以下の配列は、配置順が上流から下流になるように記載している。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の全長（比較例１－２）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第１０００位（比較例１－３）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第１０００位（比較例１－４）。
・配列番号１の第１位～第２９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第３００位～第１０００位（比較例１－５）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第８２５位（比較例１－６）。
・配列番号２の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－７）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－８）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－１）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第７８１位～第９０７位（実施例１－２）。
・配列番号１の第１位～第６２５位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－３）。
本項目で作製したＣＡＬＢ発現ベクターは、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターと比較すると、プロモーター配列のみが置換されていることになる。
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、Aspergillus oryzae NS4株（変異処理により取得した、ｎｉａＤおよびｓＣの二重欠損株）を、プロトプラスト－ＰＥＧ法にて形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
作製したベクターを用いて、Aspergillus oryzae NS4株（変異処理により取得した、ｎｉａＤおよびｓＣの二重欠損株）を、プロトプラスト－ＰＥＧ法にて形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
［ＣＡＬＢ活性の測定］
２５０μＬの１００％エタノールに５μＬｐ－ニトロフェニルブチレートを加え、ピペットで懸濁させた。この懸濁液を、蒸留水で５０ｍＬにメスアップすることにより、ＰＮＰＢ溶液を得た。次に、１５０μＬのＰＮＰＢ溶液と、５０μＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、基質溶液を得た。得られた基質溶液に、適宜稀釈した２μＬの粗酵素液を加え、反応を開始させた。反応温度は３７℃、反応時間は３分間とした。４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより、ＣＡＬＢ活性を測定した。その結果を表１に示す。なお、表１では、ｅｎｏＡ１４２プロモーターを有するコントロールベクターの活性に対する相対活性として、ＣＡＬＢ活性を表記している。ｅｎｏＡ１４２プロモーターとは、エノラーゼ遺伝子（ｅｎｏＡ）のプロモーターを制限酵素処理し、その間にＲｅｇｉｏｎＩＩＩを挿入したプロモーターである。
２５０μＬの１００％エタノールに５μＬｐ－ニトロフェニルブチレートを加え、ピペットで懸濁させた。この懸濁液を、蒸留水で５０ｍＬにメスアップすることにより、ＰＮＰＢ溶液を得た。次に、１５０μＬのＰＮＰＢ溶液と、５０μＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、基質溶液を得た。得られた基質溶液に、適宜稀釈した２μＬの粗酵素液を加え、反応を開始させた。反応温度は３７℃、反応時間は３分間とした。４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより、ＣＡＬＢ活性を測定した。その結果を表１に示す。なお、表１では、ｅｎｏＡ１４２プロモーターを有するコントロールベクターの活性に対する相対活性として、ＣＡＬＢ活性を表記している。ｅｎｏＡ１４２プロモーターとは、エノラーゼ遺伝子（ｅｎｏＡ）のプロモーターを制限酵素処理し、その間にＲｅｇｉｏｎＩＩＩを挿入したプロモーターである。
（結果）
実施例１－１～１－３に係るプロモーターは、コントロール（ｅｎｏＡ１４２プロモーター）よりも、ＣＡＬＢ活性を大幅に向上させることが判った。このことから、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順で配置されている、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＣＡＬＢの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
実施例１－１～１－３に係るプロモーターは、コントロール（ｅｎｏＡ１４２プロモーター）よりも、ＣＡＬＢ活性を大幅に向上させることが判った。このことから、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順で配置されている、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＣＡＬＢの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
ｇｐｄＡプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－１、１－３、１－５、１－６において、発現効率は最大でコントロールの１．１倍であった。また、ａｄｈプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－２、１－４、１－７において、発現効率は最大でコントロールの１．３倍であった。これに対して、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩおよびａｄｈプロモーター由来配列の組合せを検討した実施例１－１～１－３では、発現効率は最大でコントロールの２．５倍に達した。
実施例１－１と実施例１－３とを比較すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、少なくとも第１位～第５９９位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。また、実施例１－１と比較例１－８とを比較すると、ａｄｈプロモーター由来配列は、少なくとも第８３１位～第９０７位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。これは、実施例１－１の領域には機能に必須の領域が含まれており、比較例１－８の領域には機能に必須の領域が含まれていないと考えられるためである。
〔実施例２：ＧＵＳ活性の比較〕
実施例２では、大腸菌由来β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
実施例２では、大腸菌由来β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
［ＧＵＳ発現コントロールベクターの構築］
ＧＵＳを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、ＧＵＳ遺伝子断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２６および配列番号２７に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物とＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションすることにより、ＧＵＳ発現コントロールベクターを構築した。
ＧＵＳを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、ＧＵＳ遺伝子断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２６および配列番号２７に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物とＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションすることにより、ＧＵＳ発現コントロールベクターを構築した。
［ＧＵＳ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３０および配列番号３１に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる遺伝子断片と、３で得たＧＵＳ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＧＵＳ発現ベクターは、ＧＵＳ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３０および配列番号３１に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる遺伝子断片と、３で得たＧＵＳ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＧＵＳ発現ベクターは、ＧＵＳ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
［形質転換体の作製およびＧＵＳ活性の比較］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法により、Aspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入されている形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて２日間培養した。その後、形質転換体を集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですり潰して、粗酵素液を得た。粗酵素液のＧＵＳ活性は、公知の方法（Proc Natl Acad Sci (1986) Vol.83,No.22, pp.8447-8451）に準じて測定した。
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法により、Aspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入されている形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて２日間培養した。その後、形質転換体を集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですり潰して、粗酵素液を得た。粗酵素液のＧＵＳ活性は、公知の方法（Proc Natl Acad Sci (1986) Vol.83,No.22, pp.8447-8451）に準じて測定した。
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＧＵＳ発現ベクターを使用した場合のＧＵＳ活性は、コントロールのＧＵＳ活性の１．５倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＧＵＳの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
実施例１－１と同じプロモーターを有するＧＵＳ発現ベクターを使用した場合のＧＵＳ活性は、コントロールのＧＵＳ活性の１．５倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＧＵＳの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
〔実施例３：Ｌａｃ活性の比較〕
実施例３では、Aspergillus oryzae由来ラクターゼ（Ｌａｃ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
実施例３では、Aspergillus oryzae由来ラクターゼ（Ｌａｃ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
［Ｌａｃ発現コントロールベクターの構築］
Ｌａｃを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２を、ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、Ｌａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３２および配列番号３３に示した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物と、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションした。これにより、Ｌａｃ発現コントロールベクターを構築した。
Ｌａｃを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２を、ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、Ｌａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３２および配列番号３３に示した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物と、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションした。これにより、Ｌａｃ発現コントロールベクターを構築した。
［Ｌａｃ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３４および配列番号３５に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＬａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動を行って、断片を単離および精製した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ断片と、３で得たＬａｃ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＬａｃ発現ベクターは、Ｌａｃ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３４および配列番号３５に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＬａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動を行って、断片を単離および精製した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ断片と、３で得たＬａｃ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＬａｃ発現ベクターは、Ｌａｃ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法によりAspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法によりAspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
［Ｌａｃ活性の比較］
２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させて、５．７ｍＭ基質溶液を調製した。１７５μＬの基質溶液に、適宜稀釈した粗酵素液を２５μＬ加え、反応を開始させた。反応温度は３０℃、反応時間は１０分間とした。反応後、５０μＬの１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、Ｌａｃ活性を測定した。
２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させて、５．７ｍＭ基質溶液を調製した。１７５μＬの基質溶液に、適宜稀釈した粗酵素液を２５μＬ加え、反応を開始させた。反応温度は３０℃、反応時間は１０分間とした。反応後、５０μＬの１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、Ｌａｃ活性を測定した。
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＬａｃ発現ベクターを使用した場合のＬａｃ活性は、コントロールのＬａｃ活性の１．６倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、Ｌａｃの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
実施例１－１と同じプロモーターを有するＬａｃ発現ベクターを使用した場合のＬａｃ活性は、コントロールのＬａｃ活性の１．６倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、Ｌａｃの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
実施例１～３の結果から、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによれば、糸状菌の細胞中において、広汎なタンパク質を高発現させられることが示唆される。
本発明は、例えば、糸状菌を用いたタンパク質の生産に利用できる。
１ ｇｐｄＡプロモーター由来配列
２ ａｄｈプロモーター由来配列
５ エンハンサー配列
７ 目的タンパク質をコードする配列
１０ 糸状菌用プロモーター
２ ａｄｈプロモーター由来配列
５ エンハンサー配列
７ 目的タンパク質をコードする配列
１０ 糸状菌用プロモーター
Claims (6)
- 糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する糸状菌用プロモーターであって、
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）、（Ａ３）または（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）、（Ｂ３）または（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１～６０個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ３）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１～８個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ３）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 - 上記エンハンサー配列が、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１に記載の糸状菌用プロモーター。
- 請求項１または２に記載の糸状菌用プロモーターを含む、ベクター。
- 請求項３に記載のベクターに含まれる糸状菌用プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
- 請求項４に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
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|---|---|---|---|---|
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| Appl. Environ. Microbiol.，2001年，Vol.67，pp.1280-1283 |
| J． Biotechnol.，2000年，Vol.81，pp.35-44 |
| Microb. Cell Fact.，2017年，Vol.16，32 (pp.1-15) |
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