JP7609352B2

JP7609352B2 - Novel lactic acid bacteria, lactic acid bacteria preparation for silage preparation, and silage preparation method

Info

Publication number: JP7609352B2
Application number: JP2020131623A
Authority: JP
Inventors: 大樹谷口; 満本間; 亨北村
Original assignee: Snow Brand Seed Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Seed Co Ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2025-01-07
Anticipated expiration: 2040-08-03
Also published as: JP2021090408A

Description

NPMD NPMD NITE BP-03013NITE BP-03013

本発明は、乳酸菌及びサイレージ調製用の乳酸菌製剤並びにこれを用いたサイレージの調製方法に関する。 The present invention relates to lactic acid bacteria, a lactic acid bacteria preparation for silage preparation, and a method for preparing silage using the same.

飼料作物をサイロなどで発酵させたものがサイレージである。一般には、青刈りした牧草を発酵させたもの（牧草サイレージ又はグラスサイレージ）をいう。またそれ以外の場合には、サイレージの前に原料となる穀物名を付けて呼ぶこともある（例：コーンサイレージ、稲ワラサイレージ等）。乳牛、特に泌乳牛にとって、サイレージは、主食にあたる重要な飼料であり、この品質が酪農経営に大きく影響する。
良好な品質のサイレージを調製するために、乳酸菌を主成分とする乳酸菌製剤が使用されている。一般的に、サイレージ調製用の乳酸菌製剤や乳酸菌添加材は、牧草中での増殖能が強い乳酸菌が含有されている。この乳酸菌を牧草に噴霧し、嫌気条件にすることでサイレージの乳酸発酵を促進させ、異常発酵の原因となる酪酸菌、カビや酵母の発生を抑制し、サイレージを長期的に保存可能にする。
一方、天候が不順で雨の多い時期に収穫した、雑菌の多い高水分の牧草や飼料作物をサイレージ原料とする場合、添加した乳酸菌の増殖力を雑菌の増殖スピードが上回る。このとき、しばしば酪酸発酵が乳酸発酵に優先し、その結果、サイレージの品質低下をきたす。酪酸発酵が優先したサイレージは、特有の悪臭が発生し、牛が食さないため、飼料としての価値を失ってしまう場合もある。
このような酪酸発酵を抑制するナイシン産生乳酸菌を用いたサイレージ調製の先行技術が、特許文献１に記載されている。しかしこのような乳酸菌をサイレージの調製に用いても、降雨により高水分となった牧草や飼料作物をサイレージとする場合は、酪酸発酵を抑制することが困難であり、低品質のサイレージしか得ることができない。このためサイレージ調製方法や、使用する乳酸菌株について様々な提案がなされている。 Silage is made by fermenting feed crops in a silo or other facility. In general, it refers to fermented green grass (grass silage or grass silage). In other cases, it may be called silage by adding the name of the grain used as the raw material (e.g. corn silage, rice straw silage, etc.). For dairy cows, especially lactating cows, silage is an important staple food, and its quality has a major impact on dairy farm management.
Lactic acid bacteria preparations containing lactic acid bacteria as the main ingredient are used to prepare good quality silage. Generally, lactic acid bacteria preparations and lactic acid bacteria additives for silage preparation contain lactic acid bacteria that have a strong ability to grow in pasture. Spraying this lactic acid bacteria on pasture and creating anaerobic conditions promotes lactic acid fermentation of the silage, suppresses the growth of butyric acid bacteria, mold, and yeast that cause abnormal fermentation, and enables the silage to be stored for a long time.
On the other hand, when silage is made from grass or feed crops that are high in moisture and contain a lot of bacteria, harvested during periods of bad weather and lots of rain, the growth rate of the bacteria exceeds the growth rate of the added lactic acid bacteria. In this case, butyric acid fermentation often takes precedence over lactic acid fermentation, resulting in a decline in the quality of the silage. Silage that has been given priority over butyric acid fermentation produces a peculiar foul odor and may lose its value as feed because cattle will not eat it.
A prior art for silage preparation using nisin-producing lactic acid bacteria that inhibit butyric acid fermentation is described in Patent Document 1. However, even if such lactic acid bacteria are used for silage preparation, it is difficult to inhibit butyric acid fermentation when silage is made from grass or feed crops that have become highly moist due to rainfall, and only low-quality silage can be obtained. For this reason, various proposals have been made for silage preparation methods and lactic acid bacteria strains to be used.

酪酸発酵の原因となる微生物を抑制するために、予めサイレージ原料に強酸を噴霧する方法が知られている。これは、強酸例えばギ酸を原料牧草に０．３～０．４質量％直接添加することで、ｐＨを低下させ、酪酸発酵の原因菌を抑制する方法である（非特許文献１）。しかし強酸のため、火傷の危険性や機械・サイロに対する腐食があること、添加した直後に植物の呼吸も止めてしまうため、予乾した材料ではサイロ内に酸素が残り、二次発酵のリスクが高くなることなどが問題である。また、ギ酸によって前記した好ましい乳酸発酵を促進する目的で添加した乳酸菌も、その一部が死滅してしまうため、サイレージが完成するまでに長時間を要する。さらにまた、ギ酸添加では酵母の抑制ができないことが経験的に知られている。したがって、ギ酸を添加しただけでは、異常発酵や二次発酵が生じ、品質の低下したサイレージとなってしまうことがある。 In order to suppress the microorganisms that cause butyric acid fermentation, a method of spraying a strong acid on the silage raw material in advance is known. This method involves directly adding 0.3 to 0.4% by mass of a strong acid, such as formic acid, to the raw grass to lower the pH and suppress the bacteria that cause butyric acid fermentation (Non-Patent Document 1). However, because it is a strong acid, there is a risk of burns and corrosion to machines and silos, and since it also stops the respiration of plants immediately after addition, oxygen remains in the silo in pre-dried materials, increasing the risk of secondary fermentation. In addition, some of the lactic acid bacteria added to promote the above-mentioned preferable lactic acid fermentation are killed by formic acid, so it takes a long time to complete the silage. Furthermore, it is empirically known that yeast cannot be suppressed by adding formic acid. Therefore, if formic acid is only added, abnormal fermentation or secondary fermentation may occur, resulting in silage of lower quality.

特許文献２には、ギ酸耐性を持つラクトバチルス―プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）とギ酸塩を飼料１ｔあたり１，５００ｇ添加し、サイレージを調製する技術が開示されている。このラクトバチルス―プランタルムとギ酸塩の添加はサイレージ中の酵母やカビの低減に効果的であったことが記載されている。そして、このラクトバチルス―プランタルムの凍結乾燥製剤は、ギ酸ナトリウムの水溶液（３０％、ｐＨ６．２５）中で、少なくとも４時間、１０^９ＣＦＵ／ｍＬを保つことが記載されている。 Patent Document 2 discloses a technique of preparing silage by adding 1,500g of formic acid-resistant Lactobacillus plantarum and formate per ton of feed. It is described that the addition of Lactobacillus plantarum and formate is effective in reducing yeast and mold in silage. It is also described that the freeze-dried preparation of Lactobacillus plantarum maintains 10 ⁹ CFU/mL for at least 4 hours in an aqueous solution of sodium formate (30%, pH 6.25).

特許文献３に記載の発明には、バクテリオシンを産生する乳酸菌エンテロコカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）ＮＡＳ６２菌株（ＮＩＴＥＰ－７８１）をサイレージ用乳酸菌として用いることで、バクテリオシンの抗菌作用により有害微生物を抑制しようとするものである。 The invention described in Patent Document 3 aims to use the bacteriocin-producing lactic acid bacteria Enterococcus faecium NAS62 strain (NITE P-781) as a silage lactic acid bacterium, and to suppress harmful microorganisms through the antibacterial action of the bacteriocin.

特許文献４には、抗真菌作用を有するロイテリン調製能を有するホモ型発酵乳酸菌と、グリセロールと、ビタミンＢ１２と、を含む、サイレージ調製用添加剤が提案されている。ロイテリンは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母およびカビに対して抗菌性を示す。
特許文献３～４はいずれも、乳酸菌の産生する抗菌性を有する物質によって異常発酵や二次発酵を抑制する発明である。 Patent Document 4 proposes an additive for preparing silage, which contains homofermentative lactic acid bacteria capable of preparing reuterin having an antifungal effect, glycerol, and vitamin B12. Reuterin exhibits antibacterial properties against gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, yeast, and mold.
Patent Documents 3 and 4 are all inventions in which abnormal fermentation and secondary fermentation are suppressed by antibacterial substances produced by lactic acid bacteria.

特許第５９３１０６４号公報Patent No. 5931064 特公平０５－０４７１８３号公報Special Publication No. 05-047183 特開２０１１－０４１４７４号公報JP 2011-041474 A 特開２００８－０３５７２８号公報JP 2008-035728 A

北獣会誌５７巻２４３－２４８，２０１３Northern Animal Journal Vol. 57, 243-248, 2013 Applied and Environmental Microbiology ，February 2017 Volume 83 Issue 3 e02702-16Applied and Environmental Microbiology, February 2017 Volume 83 Issue 3 e02702-16

種々のサイレージ調製用乳酸菌株やこれを用いたサイレージ製造のための乳酸菌製剤が提案されている。しかしサイレージの品質に重要な影響を及ぼす酪酸発酵を抑制するという作用は、必ずしも満足できるものがないことも現実である。今後、酪酸菌の生育抑制や、サイレージの二次発酵抑制が、飼料調製やサイレージを原料とするＴＭＲ（ｔｏｔａｌｍｉｘｅｄｒａｔｉｏｎ：混合飼料）の大きな問題となる可能性がある。
酪酸発酵の抑制や、サイレージの二次発酵を抑制するために、ギ酸を添加しｐＨを低く保つことが、第１選択として推奨されている。しかし、ギ酸はサイレージの発酵に適した乳酸菌も死滅させてしまう危険があることも周知である。
本願発明は、サイレージ調製にあたって、このようなギ酸添加による強い酸性条件下でも生育可能であり、好ましいサイレージを調製可能にする、新規な乳酸菌及びサイレージ調製に有用な乳酸菌製剤を提供することを課題とする。 Various lactic acid bacteria strains for silage preparation and lactic acid bacteria preparations using them for silage production have been proposed. However, the fact remains that none of them are necessarily satisfactory in terms of the effect of inhibiting butyric acid fermentation, which has an important effect on the quality of silage. In the future, inhibition of the growth of butyric acid bacteria and inhibition of secondary fermentation of silage may become major problems in feed preparation and TMR (total mixed ration) using silage as a raw material.
Adding formic acid to keep the pH low is recommended as the first choice to suppress butyric acid fermentation and secondary fermentation of silage, but it is also well known that formic acid has the risk of killing lactic acid bacteria suitable for silage fermentation.
An objective of the present invention is to provide novel lactic acid bacteria and a lactic acid bacteria preparation useful for silage preparation that can grow even under the strong acidic conditions caused by the addition of formic acid and enable the preparation of favorable silage.

本発明は、次の構成からなる。
（１）菌体外多糖の主要な構成糖がガラクトース、マンノース、グルコースである菌体外多糖を産生するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（２）菌体外多糖の産生量が菌体の乾燥質量１ｇあたり、少なくとも８３ｍｇである（１）に記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（３）菌体外多糖が、構成糖にアミノ糖を含まず、菌体外多糖の質量あたり、グルコース５０～６０質量％、マンノース２０～３０質量％、ガラクトース１０～２０質量％を含むものである（１）又は（２）に記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（４）ギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素による生育抑制に対して耐性を有する、（１）～（３）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（５）０．２質量％のギ酸、１１質量％のエチルアルコール、及び１５０ｐｐｍの過酸化水素のいずれか１以上を含有するＭＲＳ培地中で生育可能な（１）～（４）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（６）ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）が、ＳＢＳ－００１１株（ＮＩＴＥＢＰ－０３０１３）である（１）～（５）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有するサイレージ調製用乳酸菌製剤。
（８）サイレージ調製用乳酸菌製剤が、液剤、顆粒剤、粉末剤から選択されるいずれかの形態である（７）に記載の製剤。
（９）（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を含む製剤をサイレージ原料に散布した後、発酵させることを特徴とするサイレージの調製方法。
（１０）サイレージ原料あたり、少なくとも１×１０^４ＣＦＵ／ｇの、（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を添加して発酵させるサイレージの調製方法。
（１１）サイレージ原料あたりギ酸を少なくとも０．１質量％含有するギ酸水溶液を散布後、（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）、または（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有するサイレージ調製用乳酸菌製剤を添加して発酵させるサイレージの調製方法。
（１２）（１）～（６）のいずれかに記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を用いて発酵させたことを特徴とするサイレージ。 The present invention comprises the following configuration.
(1) Lactobacillus paracasei, which produces exopolysaccharides whose main constituent sugars are galactose, mannose, and glucose.
(2) Lactobacillus paracasei according to (1), in which the amount of exopolysaccharide produced is at least 83 mg per 1 g of dry mass of the bacterial cells.
(3) The Lactobacillus paracasei according to (1) or (2), wherein the exopolysaccharide does not contain amino sugars as its constituent sugars and contains 50 to 60% by mass of glucose, 20 to 30% by mass of mannose, and 10 to 20% by mass of galactose per mass of the exopolysaccharide.
(4) Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (3), which is resistant to growth inhibition by formic acid, ethyl alcohol and hydrogen peroxide.
(5) Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (4), which can grow in an MRS medium containing one or more of 0.2% by mass of formic acid, 11% by mass of ethyl alcohol, and 150 ppm of hydrogen peroxide.
(6) Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (5), wherein the Lactobacillus paracasei is SBS-0011 strain (NITE BP-03013).
(7) A lactic acid bacteria preparation for preparing silage, comprising the Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6).
(8) The lactic acid bacteria preparation for silage preparation according to (7) above, wherein the preparation is in any form selected from a liquid, a granule, and a powder.
(9) A method for preparing silage, comprising spraying a preparation containing Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6) onto silage raw materials, followed by fermentation.
(10) A method for preparing silage, comprising adding at least 1×10 ⁴ CFU/g of Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6) per silage raw material and fermenting the silage.
(11) A method for preparing silage, comprising spraying an aqueous formic acid solution containing at least 0.1% by mass of formic acid per silage raw material, and then adding Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6) or a lactic acid bacteria preparation for preparing silage containing Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6) to ferment the silage.
(12) Silage, characterized by being fermented using Lactobacillus paracasei according to any one of (1) to (6).

本発明により提供される新規乳酸菌は、菌体外多糖の主要な構成糖がガラクトース、マンノース、グルコースである菌体外多糖を産生するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌である。菌体外に上記構成成分の多糖を産生するラクトバチルス・パラカゼイは従来知られておらず、本発明によって初めて提供される。しかも、本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）は、高濃度のギ酸に対して生育耐性を有し、さらに１１質量％濃度のエチルアルコールを含む培養液、１５０ｐｐｍの過酸化水素を含む培養液でも生育可能である。このような乳酸菌は、これまで提供されていない。この新規乳酸菌は、サイレージ調製にあたって、原料となる牧草にギ酸を散布して、酪酸菌の生育を抑制する強酸性条件であっても増殖可能である。
したがって、本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を散布したのちにギ酸を散布したとしても乳酸菌が速やかに増殖して乳酸発酵を促進し、酪酸発酵が抑制され、さらに残存酸素を消費して低下させるため、酵母が減少しており、発酵終了後に得られるサイレージは、二次発酵が抑制される。その結果牛の嗜好性を満足させるサイレージとなる。
また、本発明のサイレージ調製用の乳酸菌製剤は、どのような劣悪環境においても速やかにサイレージ原料の乳酸発酵を促進する。異常発酵が発生した場合であっても、本発明の乳酸菌が増殖することでｐＨの低下が促進されて、異常発酵が早期に抑制される。
さらにまた、ギ酸と併用可能なため、雨に濡れた牧草や、牛糞などに汚染されたワラなどの酪酸発酵の懸念のあるサイレージ原料等にも利用可能であり、均質なサイレージを得ることができる。また、酪酸発酵を始めとする異常発酵が起きないため、安全性が高く牛の採食性が改善される。そして、乳牛の乳量増加や肥育牛の体重増大などが期待される。特に、日本や東南アジアなど高温多湿地域でも良好なサイレージを得ることができる。 The novel lactic acid bacteria provided by the present invention are lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus paracasei, which produce exopolysaccharides whose main constituent sugars are galactose, mannose, and glucose. Lactobacillus paracasei that produces the above-mentioned constituent polysaccharides outside the cell has not been known in the past, and is provided for the first time by the present invention. Moreover, the lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei of the present invention has growth resistance to high concentrations of formic acid, and can also grow in a culture solution containing 11% by mass of ethyl alcohol and a culture solution containing 150 ppm of hydrogen peroxide. Such lactic acid bacteria have not been provided so far. This novel lactic acid bacteria can grow even under strongly acidic conditions that suppress the growth of butyric acid bacteria by spraying formic acid on the grass used as a raw material in silage preparation.
Therefore, even if the Lactobacillus paracasei of the present invention is sprayed and then formic acid is sprayed, lactic acid bacteria rapidly grow and promote lactic acid fermentation, butyric acid fermentation is inhibited, and residual oxygen is consumed and reduced, so yeast is reduced, and secondary fermentation is inhibited in the silage obtained after fermentation.As a result, the silage satisfies the palatability of cows.
Furthermore, the lactic acid bacteria preparation for silage preparation of the present invention rapidly promotes lactic acid fermentation of silage raw materials even in any adverse environment. Even if abnormal fermentation occurs, the proliferation of the lactic acid bacteria of the present invention promotes a decrease in pH, and the abnormal fermentation is suppressed at an early stage.
Furthermore, since it can be used in combination with formic acid, it can be used with silage raw materials such as rain-soaked grass and straw contaminated with cow manure that are at risk of butyric acid fermentation, making it possible to obtain homogeneous silage. In addition, since abnormal fermentation such as butyric acid fermentation does not occur, it is highly safe and improves the feeding ability of cows. It is also expected to increase milk production in dairy cows and weight gain in fattening cows. In particular, good silage can be obtained in hot and humid regions such as Japan and Southeast Asia.

過酸化水素に対する耐性試験の結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a resistance test against hydrogen peroxide. 過酸化水素とエタノールを含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a growth test using an MRS culture medium containing hydrogen peroxide and ethanol. 過酸化水素とギ酸を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a growth test using an MRS culture medium containing hydrogen peroxide and formic acid. 過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．１％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a growth test using an MRS culture medium containing 50 to 150 ppm hydrogen peroxide, 0.1% formic acid, and 5 to 11% ethanol. 過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．２％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a growth test using an MRS culture medium containing 50 to 150 ppm hydrogen peroxide, 0.2% formic acid, and 5 to 11% ethanol. 過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．３％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of a growth test using an MRS culture medium containing 50 to 150 ppm hydrogen peroxide, 0.3% formic acid, and 5 to 11% ethanol. ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株及びラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株をジャーファーメンター（以下「ジャー」）で一晩培養した後の培養液の観察画像である。この乳酸菌を同条件で培養したジャー（左ＳＢＳ－０００３株、右ＳＢＳ－００１１株）の画像である。右のＳＢＳ－００１１株を培養した培養液は、多糖産生による雲状の混濁が生じていることを示す画像である。These are images of the culture medium after culturing Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain and Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain overnight in a jar fermenter (hereinafter referred to as "jar"). These are images of jars (left: SBS-0003 strain, right: SBS-0011 strain) in which these lactic acid bacteria were cultured under the same conditions. The image on the right shows that the culture medium in which the SBS-0011 strain was cultured has cloudy turbidity due to polysaccharide production. シバムギを用いて調製したサイレージ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．２％ギ酸を添加して調製したシバムギサイレージ中の有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH in quackgrass silage prepared using quackgrass, and quackgrass silage prepared by adding the SBS-0011 strain obtained by the present invention and 0.2% formic acid. リードカナリーグラスに０．３％ギ酸を添加して調製したサイレージ、リードカナリーグラスに本発明の乳酸菌株の親株であるＳＢＳ－０００３株と０．２％ギ酸を添加して調製したサイレージ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．２％ギ酸を添加して調製したサイレージ、それぞれの有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH of each of silages prepared by adding 0.3% formic acid to reed canary grass, silage prepared by adding SBS-0003 strain, which is a parent strain of the lactic acid bacteria strain of the present invention, and 0.2% formic acid to reed canary grass, and silage prepared by adding SBS-0011 strain obtained by the present invention and 0.2% formic acid. リードカナリーグラスに、市販のサイレージ調製用乳酸菌製剤サイマスターＡＣ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．１％ギ酸又は０．２％ギ酸を添加して調製したリードカナリーグラスサイレージの、それぞれの有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH of reed canary grass silage prepared by adding a commercially available lactic acid bacteria preparation for silage, Cymaster AC, the SBS-0011 strain obtained according to the present invention, and 0.1% formic acid or 0.2% formic acid to reed canary grass. 牛糞汁によって汚染したリードカナリーグラスに、市販のサイレージ調製用乳酸菌製剤サイマスターＡＣ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．１％ギ酸又は０．２％ギ酸を添加して調製したリードカナリーグラスサイレージの、それぞれの有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH of reed canary grass silage prepared by adding a commercially available lactic acid bacteria preparation for silage, Cymaster AC, the SBS-0011 strain obtained according to the present invention, and 0.1% formic acid or 0.2% formic acid to reed canary grass contaminated with cow dung. チモシーとメドウフェスクの混合原料に、市販のサイレージ調製用乳酸菌製剤サイマスターＡＣ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．１％ギ酸又は０．２％ギ酸を添加して調製したチモシー・メドウフェスクサイレージの、それぞれの有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH of timothy-meadow fescue silage prepared by adding a commercially available lactic acid bacteria preparation for silage, Cymaster AC, the SBS-0011 strain obtained by the present invention, and 0.1% formic acid or 0.2% formic acid to a mixed raw material of timothy and meadow fescue. チモシーとメドウフェスクの混合原料に、酪酸発酵したサイレージから調製した酪酸発酵リード液を添加処理後、市販のサイレージ調製用乳酸菌製剤サイマスターＡＣ、本発明により得られたＳＢＳ－００１１株及び０．１％ギ酸又は０．２％ギ酸を添加して調製したチモシー・メドウフェスクサイレージの、それぞれの有機酸含有量、およびｐＨを測定した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the organic acid content and pH of timothy-meadow fescue silage prepared by adding a butyric acid fermentation lead liquid prepared from butyric acid fermented silage to a mixed raw material of timothy and meadow fescue, and then adding a commercially available lactic acid bacteria preparation for silage preparation, Cymaster AC, the SBS-0011 strain obtained by the present invention, and 0.1% formic acid or 0.2% formic acid.

本願明細書において「％」は、特段の説明がない限り「質量％」を意味している。
本発明の新規乳酸菌は、菌体外多糖の主要な構成糖がガラクトース、マンノース、グルコースである菌体外多糖を産生するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌である。そしてギ酸、エチルアルコール、過酸化水素を含む培地でも生育可能である。
このラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）は、市販されている公知の乳酸菌株であるサイレージ用乳酸菌製剤サイマスターＡＣ（雪印種苗株式会社製）に含有されている、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株（ＮＩＴＥＢＰ－１１０９）に紫外線を照射して、ＵＶ変異を起こさせて、その変異株から選抜された乳酸菌である。
ＳＢＳ－０００３株は、優れたサイレージ用乳酸菌であるが、この乳酸菌に紫外線による変異を誘発させ、変異した乳酸菌から菌体外に多糖を産生し、ギ酸耐性を持つ乳酸菌を選抜することで、本発明の新規ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を得ることができる。 In this specification, "%" means "mass %" unless otherwise specified.
The novel lactic acid bacteria of the present invention are lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus paracasei, which produce exopolysaccharides whose main constituent sugars are galactose, mannose, and glucose, and can grow in a medium containing formic acid, ethyl alcohol, and hydrogen peroxide.
This Lactobacillus paracasei is a lactic acid bacterium selected from a mutant strain of Lactobacillus paracasei SBS-0003 (NITE BP-1109) contained in a lactic acid bacteria preparation for silage, Cymaster AC (manufactured by Snow Brand Seed Co., Ltd.), which is a commercially available known lactic acid bacteria strain, which is irradiated with ultraviolet light to cause UV mutation.
The SBS-0003 strain is an excellent lactic acid bacterium for silage, and the novel Lactobacillus paracasei of the present invention can be obtained by inducing mutations in this lactic acid bacterium using ultraviolet light, causing the mutated lactic acid bacterium to produce polysaccharides outside the bacterial cell, and selecting lactic acid bacteria that are resistant to formic acid.

変異の誘発と選抜は次のとおり行なう。
本発明の新規ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）は、親株ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株を５ｍＬのＭＲＳ培地で対数増殖期まで増殖させ、ＰＢＳで３回洗浄した菌体をシャーレ上に乗せたのち、クリーンベンチ内のＵＶランプ直下にて約５０秒間ＵＶに曝露させた。次いで、暗黒下で３時間ＧＹＰ培地を用いて３７℃で培養し、さらにその培養液を５本の０．４質量％ギ酸含有ＧＹＰ培地それぞれに１質量％植菌し、その後、３７℃で一晩培養して、生存したクローンを釣菌することで高い生育能力を有するクローンを選抜できる。なおＵＶランプには東芝ライテック株式会社の殺菌ランプＧＬ１５を使用した。
本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）は、ビオメリュー・ジャパン株式会社販売の微生物同定検査用製品「アピマニュアルキット／ＩＤ３２アピシリーズ」中の「アピ２０ＮＥ細菌同定キットシステム」で４８時間培養して同定するとき、次の特性を示すことで特定できる。
コロニー形態：親株であるＳＢＳ－０００３株と比較し、コロニーがラフ様の形態を示す。
糖の資化性：親株であるＳＢＳ－０００３株、本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ＳＢＳ－００１１株の４８時間培養後の糖資化性を表１に示す。 Mutation induction and selection are carried out as follows.
The novel Lactobacillus paracasei of the present invention is prepared by growing the parent strain Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain in 5 mL of MRS medium until the logarithmic growth phase, placing the bacteria on a petri dish after washing three times with PBS, and then exposing them to UV for about 50 seconds directly under a UV lamp in a clean bench. Next, the bacteria are cultured at 37 ° C. for 3 hours in the dark using GYP medium, and the culture solution is inoculated at 1% by mass into five GYP media containing 0.4% by mass of formic acid, and then cultured overnight at 37 ° C. to select clones with high growth ability by picking up surviving clones. The UV lamp used was a germicidal lamp GL15 from Toshiba Lighting & Technology Corporation.
The Lactobacillus paracasei of the present invention can be identified by exhibiting the following characteristics when cultured for 48 hours using the "API 20NE Bacteria Identification Kit System" in the "API Manual Kit/ID32 API Series" microbial identification test product sold by bioMérieux Japan Co., Ltd.
Colony morphology: Compared to the parent strain SBS-0003, the colonies exhibit a rough morphology.
Sugar assimilation: Table 1 shows the sugar assimilation after 48 hours of culture of the parent strain SBS-0003 and the Lactobacillus paracasei strain SBS-0011 of the present invention.

ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ＳＢＳ－００１１株は、親株であるＳＢＳ－０００３株に比して、２１番グルコピラノシドの資化性がなく、４７番グルコネートの資化性が向上するなど、明らかにワイルドであるＳＢＳ－０００３株とは異なる表現型を示している。また、コーンスティプリカーを含む培地でジャー培養中に、培養液中に多糖を大量に産生する。したがってジャー培養液の多糖生産を指標として再度選抜することでより確実に本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を得ることができる。ジャー培養において主要な構成糖がガラクトース、マンノース、グルコースである菌体外多糖を産生する点で、公知のラクトバチルス・パラカゼイと明らかに異なっている。
またこの菌体外多糖からは、アミノ糖は検出されない。そして菌体外多糖の質量あたり、グルコース５０～６０質量％、マンノース２０～３０質量％、ガラクトース１０～２０質量％を含む。
また高濃度のギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素を含有する培地であっても生育可能である。
このような特性から、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ＳＢＳ－００１１株は新規なラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）であると判断した。 Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain, compared with its parent strain SBS-0003 strain, shows a phenotype that is clearly different from the wild SBS-0003 strain, such as lack of assimilation of glucopyranoside 21 and improved assimilation of gluconate 47. In addition, during jar culture in a medium containing corn steep liquor, it produces a large amount of polysaccharides in the culture solution. Therefore, the Lactobacillus paracasei of the present invention can be obtained more reliably by reselecting using the polysaccharide production in the jar culture solution as an indicator. It is clearly different from known Lactobacillus paracasei in that it produces extracellular polysaccharides whose main constituent sugars are galactose, mannose, and glucose during jar culture.
Furthermore, no amino sugars are detected in this exopolysaccharide, and the exopolysaccharide contains 50 to 60% by mass of glucose, 20 to 30% by mass of mannose, and 10 to 20% by mass of galactose based on the mass of the exopolysaccharide.
It can also grow in media containing high concentrations of formic acid, ethyl alcohol, and hydrogen peroxide.
From these characteristics, it was determined that the Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain is a novel Lactobacillus paracasei.

親株であるＳＢＳ－０００３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）にＮＩＴＥＢＰ－１１０９として寄託されている（寄託日：平成２３年６月１５日）。
そして本発明の乳酸菌であるラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ＳＢＳ－００１１株は、同じく独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）にＮＩＴＥＢＰ－０３０１３として国際寄託されている（寄託日：令和元年８月８日）。 The parent strain, SBS-0003, has been deposited at the Patent Microorganisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation (Address: 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan) under the accession number NITE BP-1109 (Deposit date: June 15, 2011).
The lactic acid bacterium of the present invention, Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain, is also deposited internationally as NITE BP-03013 at the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Deposit Center (address: 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818) (deposit date: August 8, 2019).

本発明の菌体外に多糖を産生し、ギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素に耐性を有する新規なラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を増殖させるための好ましい培養条件は、通常の乳酸菌が生育する条件であればよく、例えば牧草煮汁培地中に０．１～１．０質量％接種し、２５～３５℃で８～２４時間静置培養すればよい。
あるいは、ＧＹＰ培地（小崎道雄監修（１９９２）、乳酸菌実験マニュアル、朝倉書店刊）、ＭＲＳ培地（Ｊ．Ｃ．ｄｅＭａｎ，ｅｔａｌ．（１９６０），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，１３０－１３５）を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常、ｐＨ５．０～７．０、２５～４０℃、１０～２４時間で培養することができる。
培養した本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）は、培養液あるいは菌体を濃縮した濃縮液の状態で、サイレージ調製用乳酸菌製剤としてサイレージ原料または発酵飼料原料に添加することもできる。また、これらの液を凍結品として保存し、用時解凍して使用しても良い。
さらにまた、培養した乳酸菌を適当な保護剤や基材とともに凍結乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥させた粉末の状態で、サイレージ調製用乳酸菌製剤とすることもできる。 Preferred culture conditions for growing the novel Lactobacillus paracasei of the present invention, which produces extracellular polysaccharides and is resistant to formic acid, ethyl alcohol, and hydrogen peroxide, may be those under which normal lactic acid bacteria grow. For example, the strain may be inoculated into a grass broth medium at 0.1 to 1.0% by mass and cultured at 25 to 35° C. for 8 to 24 hours.
Alternatively, GYP medium (edited by Michio Ozaki (1992), Lactic Acid Bacteria Experiment Manual, Asakura Publishing Co., Ltd.) or MRS medium (J.C. de Man, et al. (1960), Journal of Applied Bacteriology, Vol. 23, 130-135) can be used. There are no particular limitations on the culture conditions, but the culture can usually be carried out at pH 5.0 to 7.0, at 25 to 40° C., and for 10 to 24 hours.
The cultured Lactobacillus paracasei of the present invention can be added to silage raw materials or fermented feed raw materials as a lactic acid bacteria preparation for silage preparation in the form of a culture liquid or a concentrated liquid obtained by concentrating the bacteria. These liquids can also be stored as frozen products and thawed when used.
Furthermore, the cultured lactic acid bacteria can be freeze-dried, spray-dried, or fluidized bed dried together with an appropriate protective agent or base material to give a powdered lactic acid bacteria preparation for silage preparation.

本発明のサイレージ調製用乳酸菌製剤には、本発明の、ギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素に耐性を有するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）以外に、サイレージ調製に用いられる乳酸菌を含有させても良い。 The lactic acid bacteria preparation for silage preparation of the present invention may contain lactic acid bacteria used in silage preparation in addition to the Lactobacillus paracasei of the present invention that is resistant to formic acid, ethyl alcohol, and hydrogen peroxide.

また、本発明におけるサイレージ調製用の乳酸菌製剤には、必要に応じて、サイレージの調製に使用される公知の酵素や添加剤を含有しても良い。酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどが例示できる。添加剤は、安定剤や酸化防止剤、乳化剤等を例示できる。 The lactic acid bacteria preparation for silage preparation of the present invention may contain known enzymes and additives used in silage preparation, if necessary. Examples of enzymes include cellulase and hemicellulase. Examples of additives include stabilizers, antioxidants, emulsifiers, etc.

本発明のサイレージ調製用の乳酸菌製剤は、水分含量が高く、酪酸発酵などの異常発酵が危惧されるサイレージ原料に、ギ酸の散布と併用すると、好ましいサイレージを得ることができる。ギ酸の散布は、サイレージ原料あたり０．１～０．３質量％、そして本発明のギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素に耐性を有するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を１×１０^４ＣＦＵ／ｇ～１×１０^６ＣＦＵ／ｇ添加することで、好ましい乳酸発酵したサイレージを得ることができる。
また異常発酵の危険のない低水分のサイレージ原料の場合は、本発明のギ酸、エチルアルコール及び過酸化水素に耐性を有する本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）をサイレージ原料あたり１×１０^４ＣＦＵ／ｇ～１×１０^６ＣＦＵ／ｇとなるように添加して密封発酵することで、好ましい乳酸発酵したサイレージを得ることができる。 The lactic acid bacteria preparation for silage preparation of the present invention can obtain favorable silage when used in combination with formic acid spraying on silage raw materials that have a high moisture content and are at risk of abnormal fermentation such as butyric acid fermentation. By spraying formic acid at 0.1 to 0.3 mass% per silage raw material and adding 1 x 10 ⁴ CFU/g to 1 x 10 ⁶ CFU/g of Lactobacillus paracasei of the present invention that is resistant to formic acid, ethyl alcohol, and hydrogen peroxide, favorable lactic acid fermented silage can be obtained.
In the case of low-moisture silage raw materials with no risk of abnormal fermentation, the Lactobacillus paracasei of the present invention, which is resistant to formic acid, ethyl alcohol and hydrogen peroxide, can be added to the silage raw materials at a concentration of 1 x ¹⁰⁴ CFU/g to 1 x ¹⁰⁶ CFU/g, and then fermented in a sealed container to obtain a suitable lactic acid fermented silage.

本発明において、上記のサイレージ調製用乳酸菌製剤は、様々なサイレージや発酵飼料の調製に使用することができる。サイレージや発酵飼料原料としては通常飼料として利用されている原料であれば特に限定されるものではないが、例えば牧草や飼料作物としてアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラス、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガム、スーダングラス、ヒエ、トウモロコシ、飼料イネなどが挙げられる。食品製造副産物としてビール粕、豆腐粕、茶粕、焼酎粕、ウィスキー粕、ビートパルプ、バガス、コーヒー粕、ジュース粕、ケール粕、デンプン粕などが挙げられる。農産副産物として稲ワラ、麦ワラ、規格外野菜などが挙げられる。また、オカラ、ビール麦芽搾汁粕など食品製造副産物、農産副産物、乾草、濃厚飼料、ビタミン・ミネラル製剤とサイレージを混合して調製する発酵ＴＭＲにも添加することができる。
これらのサイレージ原料や発酵飼料原料は、水分を４０～９０質量％に調節して使用することが望ましい。 In the present invention, the lactic acid bacteria preparation for silage preparation can be used to prepare various silages and fermented feeds. The raw materials for silage and fermented feeds are not particularly limited as long as they are raw materials that are usually used as feeds, and examples of pasture and feed crops include alfalfa, clover, timothy, orchard grass, reed canary grass, quackgrass, Italian ryegrass, perennial ryegrass, tall fescue, meadow fescue, festulolium, Kentucky bluegrass, red top, guinea grass, rhodes grass, napier grass, oats, barley, rye, sorghum, sudan grass, barley, corn, and feed rice. Food manufacturing by-products include beer lees, tofu lees, tea lees, shochu lees, whiskey lees, beet pulp, bagasse, coffee lees, juice lees, kale lees, and starch lees. Agricultural by-products include rice straw, wheat straw, and non-standard vegetables. It can also be added to fermented TMR prepared by mixing food manufacturing by-products such as soybean lees and malt residue, agricultural by-products, hay, concentrated feed, vitamin and mineral preparations and silage.
It is desirable to adjust the moisture content of these silage and fermented feed materials to 40 to 90% by mass before use.

添加する方法としては、本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）または本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有する乳酸菌製剤を水などに溶解・懸濁して原料に噴霧する方法や、粉状又は粒状の乳酸菌製剤を原料に散布・混合する方法などがある。 Methods for adding include dissolving or suspending the Lactobacillus paracasei of the present invention or a lactic acid bacteria preparation containing the Lactobacillus paracasei of the present invention in water or the like and spraying the mixture onto the raw material, or spraying or mixing a powdered or granular lactic acid bacteria preparation onto the raw material.

サイレージや発酵飼料は、本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）または乳酸菌製剤を添加後、嫌気条件下で発酵させる。発酵用の容器は、嫌気条件がある程度保持できるものであれば特に限定されない。例えばバンカーサイロ、スタックサイロ、トレンチサイロ、タワーサイロ、地下サイロ、ブロックサイロ、カップサイロ、ロールベール、フレコンバックなど、一般的にサイレージ調製用に用いる容器或いは装置が挙げられる。そして外気温（５～３０℃程度）で１週間以上、好ましくは２ヶ月放置することで発酵させる。 Silage or fermented feed is fermented under anaerobic conditions after the Lactobacillus paracasei or lactic acid bacteria preparation of the present invention is added. There are no particular limitations on the fermentation vessel as long as it can maintain anaerobic conditions to a certain extent. Examples include vessels or devices commonly used for silage preparation, such as bunker silos, stack silos, trench silos, tower silos, underground silos, block silos, cup silos, roll bales, and flexi-con bags. The silage or fermented feed is then left to ferment at ambient temperature (approximately 5 to 30°C) for at least one week, preferably for two months.

本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）または乳酸菌製剤を用いて得られるサイレージや発酵飼料は、酪酸発酵が抑制されるため牛の嗜好性、採食量が良好である。また、ケトーシスも生じない。さらに比較的低温から高温の条件でも好ましい発酵を持続する。
さらに、ギ酸散布後のサイレージ原料に、本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）または乳酸菌製剤を噴霧後、サイレージを調製すると、好ましい発酵が進行して酪酸菌の成育が抑制され、異常発酵が生じない。そしてサイレージ中の酸素の残存量がギ酸のみを添加した場合に比較して低くなるため、酵母の生育が抑制され、その結果、完成したサイレージを密封状態から好気的環境に開放しても酵母の増殖が起こらず、二次発酵の心配がないものとなる。なお、ギ酸の添加は、乳酸菌製剤を噴霧後に行なっても良い。本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）乳酸菌は、ギ酸添加後に散布しても特段の問題も生じず、良好なサイレージ発酵が進行することが確認されている。これは、本発明の大きな特徴の一つである。すなわち従来の乳酸菌製剤と異なり、ギ酸の添加順序が異なっても良いという利点がある。
また過酸化水素、エタノールに対して耐性を有しており、異常発酵によって発生するパーオキサイドやアルコールによる生育抑制が起きないため、持続的に乳酸を産生し続けることができ、異常発酵の原因となる酪酸菌や酵母の生育を抑制できる。 Silage or fermented feed obtained by using the Lactobacillus paracasei or lactic acid bacteria preparation of the present invention has good palatability and feeding amount for cattle because butyric acid fermentation is suppressed.In addition, ketosis does not occur.Furthermore, favorable fermentation continues even under relatively low to high temperature conditions.
Furthermore, when the Lactobacillus paracasei or lactic acid bacteria preparation of the present invention is sprayed on the silage raw material after spraying with formic acid, and then silage is prepared, favorable fermentation proceeds, the growth of butyric acid bacteria is suppressed, and abnormal fermentation does not occur.The residual amount of oxygen in the silage is lower than that when only formic acid is added, so the growth of yeast is suppressed, and as a result, even if the completed silage is opened from a sealed state to an aerobic environment, yeast does not grow, and there is no need to worry about secondary fermentation.In addition, formic acid may be added after spraying with the lactic acid bacteria preparation.It has been confirmed that the Lactobacillus paracasei lactic acid bacteria of the present invention can be sprayed after adding formic acid without any particular problems, and good silage fermentation proceeds.This is one of the major features of the present invention. That is, unlike conventional lactic acid bacteria preparations, this has the advantage that the order of addition of formic acid may be different.
In addition, it is resistant to hydrogen peroxide and ethanol, and its growth is not inhibited by peroxides or alcohol generated by abnormal fermentation, so it can continue to produce lactic acid and inhibit the growth of butyric acid bacteria and yeast that cause abnormal fermentation.

本発明のラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株（ＮＩＴＥＢＰ－０３０１３）及び、比較例として、雪印種苗株式会社において保有しているサイレージから分離し樹立した、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株（ＮＩＴＥＢＰ－１１０９）、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センターのＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）に保管されている各種乳酸菌の特性および特徴を代表する基準株（ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ）、ＪＣＭ８１３０Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＪＣＭ１１６４Ｌｂ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＪＣＭ１１４９Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ＪＣＭ１１３２Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを用いて試験を行い、本発明の乳酸菌の能力評価を行った。 The Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain (NITE BP-03013) of the present invention and, as comparative examples, Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain (NITE BP-1109) isolated and established from silage held by Snow Brand Seed Co., Ltd., and type strains representing the characteristics and features of various lactic acid bacteria stored in the Japan Collection of Microorganisms (JCM) at the RIKEN BioResource Research Center, National Research and Development Agency, JCM8130 Lb. paracasei, JCM1164 Lb. coryniformis subsp. coryniformis, and JCM1149 Lb. Tests were conducted using L. plantarum and JCM1132 Lb. acidophilus to evaluate the capabilities of the lactic acid bacteria of the present invention.

１．ＭＲＳ培地における生育試験
親株であるＳＢＳ－０００３株、本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株のＭＲＳ培地及び０．２％ギ酸含有ＭＲＳ培地における生育試験を行った。
（１）試験方法
５ｍＬのＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃、一晩培養して得た培養液を、５ｍＬのＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）または０．２％ギ酸含有ＭＲＳ培地（ｐＨ６．０）に１％（Ｖ/Ｖ）植菌後、３７℃のインキュベータに静置し、０、３、６、９、２４、４８時間ごとに２００μＬをサンプリングして、９６穴マイクロプレートリーダーを用いて６００ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ６００）を測定し、この値を増殖の指標とした。 1. Growth Test in MRS Medium Growth tests were carried out on the parent strain SBS-0003 and the lactic acid bacterium strain SBS-0011 of the present invention in MRS medium and in MRS medium containing 0.2% formic acid.
(1) Test method The culture solution obtained by culturing overnight at 37°C in 5 mL of MRS medium (Difco) was inoculated at 1% (V/V) into 5 mL of MRS medium (Difco) or 0.2% formic acid-containing MRS medium (pH 6.0) and then allowed to stand in an incubator at 37°C. 200 µL was sampled every 0, 3, 6, 9, 24, and 48 hours, and the absorbance (OD600) was measured at a wavelength of 600 nm using a 96-well microplate reader. This value was used as an index of growth.

（２）結果
ＭＲＳ培地における増殖結果を表２に、０．２％ギ酸含有ＭＲＳ培地における増殖結果を表３に示す。 (2) Results The growth results in MRS medium are shown in Table 2, and the growth results in MRS medium containing 0.2% formic acid are shown in Table 3.

表２に示すように、本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株の、ＭＲＳ培地における生育速度は、親株の生育と同等であった。一方、０．２％ギ酸含有ＭＲＳ培地では、表３に示すとおり２４～４８時間培養において、ＳＢＳ－００１１株の生育速度が明らかに勝っていた。本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株は、ギ酸濃度０．２％（２００ｐｐｍ）であっても速やかに生育する。一方ＳＢＳ－０００３株は、同じギ酸濃度では生育の遅れが発生した。 As shown in Table 2, the growth rate of the SBS-0011 strain, which is a lactic acid bacterium of the present invention, in MRS medium was equivalent to that of the parent strain. On the other hand, in MRS medium containing 0.2% formic acid, the growth rate of the SBS-0011 strain was clearly superior when cultured for 24 to 48 hours, as shown in Table 3. The SBS-0011 strain, which is a lactic acid bacterium of the present invention, grows rapidly even at a formic acid concentration of 0.2% (200 ppm). On the other hand, the SBS-0003 strain experienced delayed growth at the same formic acid concentration.

２．ギ酸、エタノール、過酸化水素に対する耐性試験
（１）耐性試験用培地の調製
ギ酸に加えて、乳酸菌の生育を抑制することが知られているエタノール、過酸化水素に対する本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株の生育耐性を試験した。比較のため、前記の例示した各種乳酸菌の基準株（ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ）、ＪＣＭ８１３０Ｌｂ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＪＣＭ１１６４Ｌｂ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＪＣＭ１１４９Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ＪＣＭ１１３２Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓについても試験を行った。なお各基準株は、国立研究開発法人理化学研究所より分譲を受けた。 2. Tolerance test against formic acid, ethanol, and hydrogen peroxide (1) Preparation of medium for resistance test The growth resistance of the lactic acid bacteria of the present invention, SBS-0011 strain, against ethanol and hydrogen peroxide, which are known to inhibit the growth of lactic acid bacteria in addition to formic acid, was tested. For comparison, the type strains of the various lactic acid bacteria exemplified above, JCM8130 Lb. paracasei, JCM1164 Lb. coryniformis subsp. coryniformis, JCM1149 Lb. plantarum, and JCM1132 Lb. acidophilus were also tested. Each type strain was provided by the National Research and Development Agency, RIKEN.

ＭＲＳ培地に含有されるギ酸（Ｆ）、エタノール（Ｅ）、過酸化水素（Ｈ）濃度が、表４に示すような濃度になるように、ギ酸、エタノール、過酸化水素を含有するＭＲＳ培地を調製した。この培地を用いて、ギ酸、エタノール、過酸化水素を含む培養液中での乳酸菌の生育試験を行い、本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株の特性を確認した。 An MRS medium containing formic acid, ethanol, and hydrogen peroxide was prepared so that the concentrations of formic acid (F), ethanol (E), and hydrogen peroxide (H) contained in the MRS medium were as shown in Table 4. Using this medium, a growth test of lactic acid bacteria in a culture solution containing formic acid, ethanol, and hydrogen peroxide was performed to confirm the characteristics of the SBS-0011 strain, which is a lactic acid bacterium of the present invention.

（２）生育試験
前記と同様に、３７℃で一晩培養後の各乳酸菌ＭＲＳ培養液を１％（Ｖ/Ｖ）、各培地に植菌後、この培地を８連ＰＣＲチューブにいれ、これを嫌気ジャー（三菱ガス化学株式会社製）に入れ、３７℃で１４４時間、好気培養した。
各乳酸菌の生育の程度は、培養後菌液５０μＬ、蒸留水５０μＬをマイクロプレートで混合後、マイクロプレートリーダーで６００ｎｍの波長により測定、この吸光濁度値を乳酸菌の生育量として表した。 (2) Growth test As described above, each lactic acid bacteria MRS culture solution after overnight culture at 37°C was inoculated into each medium at 1% (V/V), and the medium was then placed in an 8-tube PCR tube, which was then placed in an anaerobic jar (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.) and cultured aerobically at 37°C for 144 hours.
The degree of growth of each lactic acid bacterium was measured by mixing 50 μL of the cultured bacterial solution and 50 μL of distilled water on a microplate, and measuring the absorbance turbidity at a wavelength of 600 nm using a microplate reader, and the amount of growth of the lactic acid bacteria was expressed as the absorbance turbidity.

（３）結果
１）過酸化水素に対する耐性
図１に過酸化水素に対する耐性試験の結果を示す。
本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株は、過酸化水素を含む培地においても、その生育はほとんど抑制されなかった。一方基準株は、いずれも過酸化水素の濃度が上昇するにつれて生育が明らかに抑制された。特にＪＣＭ１１６４とＪＣＭ１１３２は過酸化水素濃度が１５０ｐｐｍに上昇するとほとんど生育できなかった。 (3) Results 1) Resistance to hydrogen peroxide The results of the resistance test to hydrogen peroxide are shown in FIG.
The growth of the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was hardly inhibited even in a medium containing hydrogen peroxide. On the other hand, the growth of the type strains was clearly inhibited as the concentration of hydrogen peroxide increased. In particular, JCM1164 and JCM1132 were hardly able to grow when the hydrogen peroxide concentration increased to 150 ppm.

２）過酸化水素とエタノールに対する耐性
過酸化水素とエタノールを含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を図２に示す。本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株は、過酸化水素とエタノールを含む培地では、エタノール濃度５％及び８％において、その生育はほとんど抑制されなかった。一方比較のための基準株は、すべてエタノール濃度が８％に上昇すると顕著に抑制された。またエタノール濃度８％、過酸化水素濃度１５０ｐｐｍで、全ての乳酸菌の生育が抑制された。エタノールと過酸化水素の共存は、乳酸菌の生育を抑制することが明らかとなった。しかし、本発明の乳酸菌は、エタノール濃度８％、過酸化水素濃度１００ｐｐｍ条件においても生育をほとんど抑制されなかった。 2) Tolerance to hydrogen peroxide and ethanol The results of a growth test using an MRS culture medium containing hydrogen peroxide and ethanol are shown in FIG. 2. In a medium containing hydrogen peroxide and ethanol, the growth of the SBS-0011 strain, which is the lactic acid bacteria of the present invention, was hardly inhibited at ethanol concentrations of 5% and 8%. On the other hand, the growth of all the standard strains for comparison was significantly inhibited when the ethanol concentration was increased to 8%. Furthermore, the growth of all the lactic acid bacteria was inhibited at an ethanol concentration of 8% and a hydrogen peroxide concentration of 150 ppm. It was revealed that the coexistence of ethanol and hydrogen peroxide inhibits the growth of lactic acid bacteria. However, the growth of the lactic acid bacteria of the present invention was hardly inhibited even at an ethanol concentration of 8% and a hydrogen peroxide concentration of 100 ppm.

３）過酸化水素とギ酸に対する耐性
過酸化水素とギ酸を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を図３に示す。本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株は、過酸化水素とギ酸を含む培地では、ギ酸濃度０．３％、過酸化水素１００ｐｐｍの濃度まで生育は抑制されなかった。またギ酸濃度０．３％、過酸化水素１５０ｐｐｍとした場合でも、その抑制は軽微であった。一方比較のための基準株は、ギ酸濃度と過酸化水素濃度が上昇すると、濃度上昇に依存して生育が抑制された。 3) Resistance to hydrogen peroxide and formic acid The results of a growth test using an MRS culture medium containing hydrogen peroxide and formic acid are shown in Figure 3. In a medium containing hydrogen peroxide and formic acid, the growth of the SBS-0011 strain, which is a lactic acid bacterium of the present invention, was not inhibited up to a formic acid concentration of 0.3% and hydrogen peroxide concentration of 100 ppm. Even when the formic acid concentration was 0.3% and hydrogen peroxide concentration was 150 ppm, the inhibition was slight. On the other hand, the growth of the standard strain for comparison was inhibited depending on the increase in formic acid and hydrogen peroxide concentrations.

４）過酸化水素、エタノール、ギ酸に対する耐性
過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．１％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を図４、過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．２％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を図５、過酸化水素５０～１５０ｐｐｍとギ酸０．３％、エタノール５～１１％を含有するＭＲＳ培養液による生育試験結果を図６に示す。
図４～６から明らかなように、過酸化水素、ギ酸、エタノールが共存すると、基準株の乳酸菌は顕著に生育が抑制されるが、本発明の乳酸菌であるＳＢＳ－００１１株は、生育を抑制されないことが明らかである。すなわち、本発明の乳酸菌は、過酸化水素１５０ｐｐｍ、エタノール１１％、ギ酸０．３％濃度でも生育が抑制されない。 4) Tolerance to hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid The results of a growth test using an MRS culture medium containing 50-150 ppm hydrogen peroxide, 0.1% formic acid, and 5-11% ethanol are shown in Figure 4, the results of a growth test using an MRS culture medium containing 50-150 ppm hydrogen peroxide, 0.2% formic acid, and 5-11% ethanol in Figure 5, and the results of a growth test using an MRS culture medium containing 50-150 ppm hydrogen peroxide, 0.3% formic acid, and 5-11% ethanol in Figure 6.
4 to 6, in the presence of hydrogen peroxide, formic acid, and ethanol, the growth of the type strain of lactic acid bacteria is significantly inhibited, but the growth of the SBS-0011 strain, which is the lactic acid bacteria of the present invention, is not inhibited. That is, the growth of the lactic acid bacteria of the present invention is not inhibited even in the presence of 150 ppm hydrogen peroxide, 11% ethanol, and 0.3% formic acid.

以上の生育試験の結果から、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株は、従来の乳酸菌基準株にない、過酸化水素、エタノール、ギ酸の示す生育抑制に対して強い抵抗性を有していることが明らかとなった。 The results of the above growth tests revealed that the lactic acid bacteria strain SBS-0011 of the present invention has strong resistance to the growth inhibition caused by hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid, which is not present in conventional lactic acid bacteria type strains.

３．多糖生産能確認試験
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株は、従来の乳酸菌ラクトパチルス・パラカゼイ基準株が持っていない、過酸化水素、エタノール、ギ酸の示す生育抑制に対して強い抵抗性を示す。また本発明のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）と従来の乳酸菌パラカゼイを比較すると、本発明の乳酸菌は、菌体外多糖を有し、さらに多糖の構成糖が公知のラクトバチルス・パラカゼイの持つ多糖の構成糖（非特許文献２参照）と明らかに異なっているという特徴を確認できた。この構造の相違が、過酸化水素、エタノール、ギ酸による生育抑制に対する強い抵抗性をもたらしているものと考えられる。この菌体外多糖の産生例と解析例を示して説明する。 3. Polysaccharide production ability confirmation test The lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain of the present invention shows strong resistance to growth inhibition by hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid, which is not possessed by conventional lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei standard strains. In addition, when comparing the Lactobacillus paracasei of the present invention with conventional lactic acid bacteria paracasei, it was confirmed that the lactic acid bacteria of the present invention have extracellular polysaccharides, and furthermore, the constituent sugars of the polysaccharides are clearly different from the constituent sugars of the polysaccharides possessed by known Lactobacillus paracasei (see Non-Patent Document 2). It is considered that this difference in structure brings about strong resistance to growth inhibition by hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid. An example of production and analysis of this extracellular polysaccharide will be shown and explained.

（１）多糖産生のためのラクトバチルス・パラカゼイの培養
あらかじめラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株、及び従来のラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株の各保存菌株を賦活させた後、各乳酸菌株をＭＲＳ培地５ｍＬに１容量％植菌し、３７℃で２４時間前培養した。
次いで、ジャーファーメンター（以下「ジャー」）培養用培地５０ｍＬに、上記の前培養した培養液を１容量％植菌し、３７℃で２４時間培養した。培養後、ｐＨ５．５に調整した２．５ｌのジャー培養用培地（下記表５の組成）に、この培養液を１容量％植菌したのち、ジャー培養装置を用いて、３７℃、６０ｒｐｍ、ｐＨ５．５の条件で一晩培養した。
培養の終了は、ｐＨ調整装置をストップしてから３０分間ｐＨが低下しないことを確認し、装置の運転を停止させた。 (1) Cultivation of Lactobacillus paracasei for polysaccharide production After preservation of Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain and conventional Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain, each lactic acid bacteria strain was inoculated into 5 mL of MRS medium at 1% by volume and pre-cultured at 37° C. for 24 hours.
Next, 1% by volume of the pre-cultured culture solution was inoculated into 50 mL of a jar fermenter (hereinafter referred to as "jar") culture medium, and cultured for 24 hours at 37° C. After the culture, 1% by volume of this culture solution was inoculated into 2.5 L of a jar culture medium (composition shown in Table 5 below) whose pH had been adjusted to 5.5, and cultured overnight using a jar culture apparatus at 37° C., 60 rpm, and pH 5.5.
The cultivation was terminated when it was confirmed that the pH did not decrease for 30 minutes after the pH adjustment device was stopped, and then the operation of the device was stopped.

なお、培養終了後の培養液の状態を撮影した画像を図７に示す。ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株の培養液中には、図７に示すように雲状～モヤ状又はコロイド状の浮遊物が観察できる。すなわち菌体外多糖が産生されていることが観察された。一方、比較対照のラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株は、培養液全体が混濁状態であった。 Figure 7 shows an image of the state of the culture solution after the end of cultivation. As shown in Figure 7, cloud-like, hazy or colloidal floating matter can be observed in the culture solution of Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain. In other words, it was observed that exopolysaccharides were being produced. On the other hand, in the case of the control Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain, the entire culture solution was cloudy.

（２）培養菌体の回収
ジャー培養の終了後、それぞれの培養液を回収し、これを３５００ｒｐｍ、４℃の条件で、１５分間遠心することで、培養上清と沈殿物に分離した。沈殿物を回収し、蒸留水で洗浄し菌体を得た。
蒸留水で洗浄した菌体は、凍結乾燥に付した後、乾燥物を回収して粉砕した。回収した乾燥物の質量を測定し、これを菌体の質量とした。 (2) Recovery of cultured bacterial cells After the jar culture was completed, each culture solution was recovered and centrifuged at 3,500 rpm and 4° C. for 15 minutes to separate the culture supernatant and precipitate. The precipitate was recovered and washed with distilled water to obtain bacterial cells.
The cells were washed with distilled water, freeze-dried, and then the dried product was collected and pulverized. The mass of the collected dried product was measured and used as the mass of the cells.

（３）菌体中の炭素（Ｃ）窒素（Ｎ）分析
菌体の主要構成成分を明らかにするため、ＬＥＣＯ社製「窒素・たんぱく質分析装置ＴｒｕＭａｃＣＮ」を用いて分析した。分析方法は、装置に付属の使用マニュアルに従った。 (3) Analysis of carbon (C) and nitrogen (N) in the bacterial body To clarify the main components of the bacterial body, analysis was performed using a nitrogen and protein analyzer TruMac CN manufactured by LECO Corp. The analysis method was performed according to the instruction manual attached to the device.

（４）乾燥菌体に含有される菌体外多糖の分離回収
菌体粉末１ｇを秤量した。この粉末に含有されている、可溶性不純物を取り除くために１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次いで、１２，０００ｇ、４℃の条件で１５分間遠心分離した。沈殿物を回収して、これを再度１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、同じく１２，０００ｇ、４℃の条件で１５分間遠心分離処理した。
次いで、多糖を分離溶出させるため、沈殿物に１ＭＮａＯＨを１０ｍＬ添加し、振とう培養器で１晩４℃、６０ｒｐｍで振とうした。
その後、この水酸化ナトリウム含有溶液を、１２，０００ｇ、４℃の条件で、１５分間遠心分離処理を行い、上清を回収した。回収した上清に等量の氷冷エタノール１０ｍＬを加えて混合し、３０分間、４℃で静置し、アルカリ可溶性多糖を析出させた。
この溶液を１２，０００ｇ、４℃の条件で、３５分間遠心分離を行い、得られた沈殿物を回収した。
回収した沈殿物を２０～５０ｍＬの蒸留水に溶解させた後、トリクロロ酢酸を１０容量％になるように添加し、よく撹拌後、４℃で３０分間静置した。ついで、１２，０００ｇ、室温条件下で１０分間遠心分離し、上清を回収した。
回収した上清に２倍容量のエタノールを添加し、４℃で３０分間静置した後、１２，０００ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離を行い、生じた沈殿物を回収し、さらにデシケータ内で脱気して乾固させた。この乾固物全量に１０ｍＬの蒸留水を加えて溶解させ、これを単糖やオリゴ糖を除去するためＶｉｖａｓｐｉｎ５Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を使用して、５ｋＤａ以下の低分子化合物を除去した。低分子物質を除去した残液をエッペンドルフチューブに移し、遠心エバポレータによって乾固させた。
以上の操作によって、得られた乾固物をラクトバチルス・パラカゼイの菌体外多糖として取り扱い、その構成糖を分析した。 (4) Separation and recovery of extracellular polysaccharides contained in dried cells One gram of cell powder was weighed. To remove soluble impurities contained in the powder, the powder was washed with 10 mL of PBS, and then centrifuged at 12,000 g and 4° C. for 15 minutes. The precipitate was collected, washed again with 10 mL of PBS, and centrifuged again at 12,000 g and 4° C. for 15 minutes.
Next, in order to separate and elute the polysaccharide, 10 mL of 1 M NaOH was added to the precipitate, and the mixture was shaken overnight at 4° C. and 60 rpm in a shaking incubator.
Thereafter, the sodium hydroxide-containing solution was centrifuged at 12,000 g and 4° C. for 15 minutes to recover the supernatant. The recovered supernatant was mixed with an equal amount of ice-cold ethanol (10 mL) and allowed to stand at 4° C. for 30 minutes to precipitate the alkali-soluble polysaccharide.
This solution was centrifuged at 12,000 g and 4° C. for 35 minutes, and the resulting precipitate was collected.
The collected precipitate was dissolved in 20 to 50 mL of distilled water, and trichloroacetic acid was added to give a 10% by volume concentration. After thorough stirring, the mixture was allowed to stand for 30 minutes at 4° C. Then, the mixture was centrifuged at 12,000 g at room temperature for 10 minutes, and the supernatant was collected.
The collected supernatant was added with 2 volumes of ethanol, and the mixture was left to stand at 4°C for 30 minutes, then centrifuged at 12,000g and 4°C for 10 minutes to collect the precipitate, which was then degassed and dried in a desiccator. 10 mL of distilled water was added to the entire dried product to dissolve it, and low molecular weight compounds of 5 kDa or less were removed using Vivaspin 5K (manufactured by Cytiva) to remove monosaccharides and oligosaccharides. The remaining liquid from which the low molecular weight substances had been removed was transferred to an Eppendorf tube and dried using a centrifugal evaporator.
The dried product obtained by the above procedures was treated as an exopolysaccharide of Lactobacillus paracasei, and its constituent sugars were analyzed.

（５）ラクトバチルス・パラカゼイ菌体外多糖の分析
１）酸加水分解
得られた菌体外多糖の全量を２０μＬの超純水に溶解し、これを酸加水分解による糖分析に付した。
超純水溶解液の５μＬを採取し、これに８Ｍトリフルオロ酢酸５μＬを加えて、撹拌し、軽く遠心し、そのまま１００℃、３時間保温した後、空冷し、再度軽く遠心した。次いで遠心エバポレータ装置を用いて蒸発乾固させた。
乾固物にイソプロパノールを４０μＬを加え、撹拌後、軽く遠心し、さらに遠心エバポレータ装置を用いて溶媒を蒸発乾固させた。この乾固物にピリジン／メタノール（１０／９０、ｖ／ｖ）４０μＬを加え、撹拌後、軽く遠心後に無水酢酸１０μＬを加え、撹拌し、再度軽く遠心した。
遠心チューブの蓋を外し、アルミ箔をかぶせて室温で３０分間放置し、次いで遠心エバポレータ装置を用いて蒸発乾固させた。 (5) Analysis of Lactobacillus paracasei Exopolysaccharide 1) Acid Hydrolysis The total amount of the obtained exopolysaccharide was dissolved in 20 μL of ultrapure water, and this was subjected to sugar analysis by acid hydrolysis.
5 μL of the ultrapure water solution was taken, to which 5 μL of 8 M trifluoroacetic acid was added, stirred, briefly centrifuged, and then kept at 100° C. for 3 hours, cooled in air, and briefly centrifuged again.Then, the solution was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
40 μL of isopropanol was added to the dried product, stirred, briefly centrifuged, and the solvent was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator. 40 μL of pyridine/methanol (10/90, v/v) was added to the dried product, stirred, briefly centrifuged, and then 10 μL of acetic anhydride was added, stirred, and briefly centrifuged again.
The lid of the centrifuge tube was removed, and the tube was covered with aluminum foil and left to stand at room temperature for 30 minutes, and then evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.

２）多糖を構成する糖の標識化
この蒸発乾固させた酸加水分解処理後の菌体外多糖分析試料に超純水５μＬを加え、次いで、あらかじめ調製済みＡＢＥＥ試薬（ＧｌｙＳｃｏｐｅＡＢＥＥ標識化キット：コスモバイオ株式会社：調製方法は添付マニュアルによる）を冷凍庫より出し、溶解した後、２０μＬ加え、撹拌後、軽く遠心した。
次いで、この溶液を８０℃、６０分間保温し、空冷したのち遠心して液を遠心チューブの底に落とし、蓋を外し、超純水２００μＬ、クロロホルム４００μＬを添加し、３０秒間ボルテックスミキサーを用いて撹拌混合し、再度２０，０００ｇで１分間遠心分離し、上清と沈殿物に分離させた。
上清を回収し、これにクロロホルム４００μＬを加えて３０秒間ボルテックスミキサーを用いて撹拌混合し、さらに２０，０００ｇで１分間遠心して、沈殿物と上清に分離させた。上清をメンブランフィルター（メッシュサイズ０．２２μ）でろ過した。このろ過液を、構成糖を分析するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析用試料とした。 2) Labeling of sugars constituting polysaccharides 5 μL of ultrapure water was added to the extracellular polysaccharide analysis sample after the acid hydrolysis treatment that had been evaporated to dryness, and then 20 μL of a previously prepared ABEE reagent (GlyScope ABEE labeling kit: Cosmo Bio Co., Ltd.; preparation method is according to the attached manual) was removed from the freezer and dissolved, and then the mixture was added, stirred, and lightly centrifuged.
Next, this solution was kept at 80°C for 60 minutes, air-cooled, and then centrifuged to allow the liquid to fall to the bottom of the centrifuge tube. The lid was removed, and 200 µL of ultrapure water and 400 µL of chloroform were added, stirred and mixed using a vortex mixer for 30 seconds, and centrifuged again at 20,000 g for 1 minute to separate the supernatant and precipitate.
The supernatant was collected, 400 μL of chloroform was added, and the mixture was stirred and mixed using a vortex mixer for 30 seconds, and then centrifuged at 20,000 g for 1 minute to separate the precipitate from the supernatant. The supernatant was filtered through a membrane filter (mesh size 0.22 μ). The filtrate was used as a sample for high performance liquid chromatography (HPLC) analysis to analyze the constituent sugars.

３）構成糖のＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣの分析条件は、次の通りである。
溶離液Ａ：０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）
溶離液Ｂ：１００％アセトニトリル

・カラムの平衡化条件
溶離液Ａ：９７％（初期条件）
溶離液Ｂ：３％（初期条件）
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ

Ｂ液の条件（主要単糖グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノース、ラムノース）
０～２ｍｉｎ３～１０％（分離）
２～７ｍｉｎ１０～２１％（分離）
７～８ｍｉｎ４０％（洗い）
８～１０ｍｉｎ３％（初期条件）
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
オートサンプラー温度：１０℃
吸収波長：３０５ｎｍ
蛍光波長：３６０ｎｍ
サンプルインジェクション量：２μＬ 3) HPLC analysis of constituent sugars The HPLC analysis conditions are as follows.
Eluent A: 0.2 M potassium borate buffer (pH 8.9)
Eluent B: 100% acetonitrile

Column equilibration conditions Eluent A: 97% (initial condition)
Eluent B: 3% (initial conditions)
Flow rate: 0.7mL/min

Conditions for solution B (major monosaccharides: glucose, xylose, galactose, arabinose, rhamnose)
0-2 min 3-10% (separation)
2-7 min 10-21% (separation)
7-8 min 40% (wash)
8-10 min 3% (initial condition)
Flow rate: 0.7mL/min
Column temperature: 50°C
Autosampler temperature: 10°C
Absorption wavelength: 305 nm
Fluorescence wavelength: 360 nm
Sample injection volume: 2 μL

（５）結果
１）菌体回収量
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株の菌体質量は６．５４ｇであった。一方比較対照としたラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－０００３株の菌体質量は５．３３ｇであった。培養液中の菌数は、両菌株ともほぼ同じであったにも関わらずＳＢＳ－００１１株の菌体質量は、ＳＢＳ－０００３株に対して２０％以上増加していた。 (5) Results 1) Yield of bacterial cells The bacterial cell mass of the lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain of the present invention was 6.54 g. On the other hand, the bacterial cell mass of the control Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain was 5.33 g. Although the number of bacteria in the culture solution was almost the same for both strains, the bacterial cell mass of the SBS-0011 strain was increased by 20% or more compared to the SBS-0003 strain.

２）菌体中の炭素（Ｃ）窒素（Ｎ）分析
菌体中のＣ、Ｎ分析結果を下記の表６に示す。 2) Analysis of Carbon (C) and Nitrogen (N) in Bacteria The analysis results of C and N in the bacteria are shown in Table 6 below.

Ｃ／Ｎ比から明らかなようにＳＢＳ－００１１株のＣ含有量がＳＢＳ－０００３株に対して２０％以上増加していた。 As is clear from the C/N ratio, the C content of the SBS-0011 strain was increased by more than 20% compared to the SBS-0003 strain.

３）回収多糖の構成糖
ＨＰＬＣ分析によって得られた構成糖の種類及び回収菌体質量（ｇ）あたりの含有量（ｍｇ）を下記表７に示す。また表８に菌体外多糖あたりの構成糖の比率（％）を示す。 3) Constituent sugars of recovered polysaccharides The types of constituent sugars obtained by HPLC analysis and the contents (mg) per mass (g) of recovered cells are shown in Table 7. Table 8 shows the ratios (%) of the constituent sugars per extracellular polysaccharide.

表７に示す通り、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株は、ガラクトース、マンノース、グルコースを主構成糖とする菌体外多糖を保持していることが判明した。また菌体外多糖には、ガラクトサミンやグルコサミンなどのアミノ糖が含まれていないことが明らかとなった。
さらに、表８に示すように、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株は、その産生する菌体外多糖の構成比率は変えずに、その産生量を増加させることで、過酸化水素、エタノール、ギ酸などの生育障害に対する抵抗性を増強していることが分かった。 As shown in Table 7, it was found that the Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain retains extracellular polysaccharides mainly composed of galactose, mannose, and glucose. It was also found that the extracellular polysaccharides do not contain amino sugars such as galactosamine and glucosamine.
Furthermore, as shown in Table 8, it was found that Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain enhances resistance to growth disorders caused by hydrogen peroxide, ethanol, formic acid, etc. by increasing the amount of extracellular polysaccharides produced without changing the composition ratio of the exopolysaccharides produced.

（６）考察
回収した菌体重量及び菌体のＣ／Ｎ比の結果から、本発明のラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ－００１１株は、菌体外に菌体の乾燥質量あたり２０％を超える菌体外多糖をまとっていることが明らかとなった。また、多糖の構成糖を解析した結果、この多糖は、ガラクトース、マンノース、グルコースを主構成糖としているが、菌体外に多糖を産生しないＳＢＳ－０００３株は、過酸化水素、エタノール、ギ酸によって生育を抑制されるが、ＳＢＳ－００１１株は、生育抑制されない。すなわちこの菌体外に産生される多糖を莢膜としてまとうことによって、過酸化水素、エタノール、ギ酸などの菌体に有害な成分から保護されるものと考えられる。また菌体外にガラクトース、マンノース、グルコースを主構成糖とする多糖を産生するラクトバチルス・パラカゼイは知られていないことから、本発明のラクトバチルス・パラカゼイが新規乳酸菌であることが明らかとなった。 (6) Discussion From the results of the collected cell weight and the C/N ratio of the cells, it was revealed that the Lactobacillus paracasei SBS-0011 strain of the present invention has more than 20% extracellular polysaccharide per dry mass of the cells. In addition, as a result of analyzing the constituent sugars of the polysaccharide, the polysaccharide has galactose, mannose, and glucose as its main constituent sugars, but the SBS-0003 strain, which does not produce polysaccharides extracellularly, is inhibited in growth by hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid, whereas the SBS-0011 strain is not inhibited in growth. That is, it is considered that the polysaccharide produced extracellularly is protected from harmful components such as hydrogen peroxide, ethanol, and formic acid by covering the cells as a capsule. In addition, since no Lactobacillus paracasei is known that produces polysaccharides mainly composed of galactose, mannose, and glucose extracellularly, it was revealed that the Lactobacillus paracasei of the present invention is a novel lactic acid bacterium.

３．ＳＢＳ－００１１株を用いたサイレージの調製試験（１）
本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を用いて、発酵品質が劣悪となりやすく、サイレージ調製にあたって問題となっているシバムギ、リードカナリーグラスの２種を原料としたサイレージ調製試験を行った。
（１）シバムギを用いたパウチサイレージの調製
１）試験方法
シバムギの出穂初めから出穂期までのサイレージ調製適期に刈り取り、裁断機にて裁断長１ｃｍに裁断し、３００ｇずつ小分けし、試験区に併せて本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加したのちギ酸を散布した。
乳酸菌およびギ酸の添加には霧吹きを用いた。サイレージの調製は、ビニールフィルムによるラッピング法によって行った。具体的には乳酸菌噴霧後の牧草を１パウチ袋（旭化成パックス株式会社、規格袋飛竜Ｎ－９）あたり１００ｇ入れ、業務用卓上密封包装機（ＳＱ－３０３Ｗ）を用いて脱気密閉することでサイレージを作成した。なお１処理区あたりの反復を３とした。
サイレージの貯蔵日数は、２５℃条件で２ヶ月とし、発酵状況を確認するため、２ヶ月経過後サイレージ中の主要な有機酸含量とｐＨを測定した。また臭気等の官能評価を専門評価員によって行った。
なおサイレージへの乳酸菌の添加量は、一般的なサイレージ用乳酸菌添加量の半量である０．５×１０^５個／牧草１ｇ、ギ酸添加量を０．２％とした。 3. Silage preparation test using SBS-0011 strain (1)
Using the lactic acid bacteria strain SBS-0011 of the present invention, a silage preparation test was carried out using two types of raw materials, quackgrass and reed canary grass, which are prone to poor fermentation quality and therefore pose problems in silage preparation.
(1) Preparation of pouch silage using quackgrass 1) Test method Quackgrass was harvested at the optimum time for silage preparation, from the beginning of heading to the heading stage, cut into pieces with a cutting machine having a cutting length of 1 cm, and divided into 300 g portions. The lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was added to the test plots, and then formic acid was sprayed.
A spray bottle was used to add the lactic acid bacteria and formic acid. Silage was prepared by wrapping with vinyl film. Specifically, 100 g of grass after spraying with lactic acid bacteria was placed in one pouch bag (Asahi Kasei Pax Corporation, standard bag Hiryu N-9), and silage was made by degassing and sealing the bag using a commercial tabletop sealing packaging machine (SQ-303W). Each treatment area was repeated three times.
The silage was stored for two months at 25°C, and the main organic acid contents and pH of the silage were measured after two months to check the fermentation status. Sensory evaluation of odor, etc. was also performed by a specialist evaluator.
The amount of lactic acid bacteria added to the silage was 0.5 x ¹⁰⁵ cells/g of grass, which is half the amount of lactic acid bacteria generally added to silage, and the amount of formic acid added was 0.2%.

有機酸分析とｐＨ測定は次の通りである。
開封後のサイレージ３０ｇをストマフィルター（株式会社セントラル科学貿易社製）に量り取り、オートクレーブ（１２１℃、１５分）済みのメスシリンダーを用いて滅菌済みの蒸留水を９０ｍＬ加えた後、マスティケーターＳ型（株式会社セントラル科学貿易社製）にて１分間揉みこんだ。揉みこみ終了後、４℃で一晩静置し、サイレージ中の水可溶性成分を水画分に移行させた。
一晩静置後、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｎｏ．５Ａのろ紙を用いてろ過した。このろ過液をｐＨの測定および有機酸分析に用いた。なおｐＨ測定は、ｐＨメーターを用いた。
有機酸分析は、ろ液を、純水を用いて１０倍希釈したのち０．２２μＬのフィルター（メルクミリポア社製、ＭｉｌｌｅｘＧＰ）でろ過したものを測定試料とした。
ＨＰＬＣによる有機酸分析には、株式会社島津製作所製ＬＣ－２０ＡＤ、ＬＣ－３０ＡＤ、ＳＩＬ－３０ＡＣ、ＣＴＯ－２０Ａ、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用い、ポストカラム法で分析した。有機酸分離用のカラムとしてＴＯＳＯＨのＴＳＫｇｅｌＯＡｐａｋ－Ａ、カラム温度４０℃、流速Ａ液、Ｃ液ともに０．８ｍＬ／ｍｉｎとした。
移動相（Ａ液）は、７５ｍＭの硫酸溶液、反応液（Ｃ液）はＢＴＢ溶液（０．１ｍＭＢＴＢ、７．５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４）を用いた。分析はポストカラム法で行った。
また、乳酸、酢酸、酪酸、ギ酸の検量線を作成した。各有機酸とも０．１質量％、０．０５質量％、０．０１質量％の標準溶液による検量線を作成した。 The organic acid analysis and pH measurements are as follows:
30 g of the opened silage was weighed into a Stoma Filter (Central Science Trading Co., Ltd.), 90 mL of sterilized distilled water was added using an autoclaved (121°C, 15 minutes) graduated cylinder, and the silage was kneaded for 1 minute with a Masticator S (Central Science Trading Co., Ltd.) After kneading, the silage was left to stand overnight at 4°C to transfer the water-soluble components in the silage to the water fraction.
After standing overnight, the mixture was filtered using an ADVANTEC No. 5A filter paper. The filtrate was used for pH measurement and organic acid analysis. The pH was measured using a pH meter.
For the organic acid analysis, the filtrate was diluted 10-fold with pure water and then filtered through a 0.22 μL filter (Millex GP, manufactured by Merck Millipore) to prepare a measurement sample.
The organic acid analysis by HPLC was performed by a post-column method using LC-20AD, LC-30AD, SIL-30AC, CTO-20A, and SPD-M20A manufactured by Shimadzu Corporation. The organic acid separation column was TSKgel OApak-A manufactured by TOSOH, the column temperature was 40° C., and the flow rate of both solution A and solution C was 0.8 mL/min.
The mobile phase (liquid A) was a 75 mM sulfuric acid solution, and the reaction solution (liquid C) was a BTB solution (0.1 mM BTB, 7.5 mM Na ₂ HPO ₄ ). The analysis was carried out by a post-column method.
In addition, calibration curves were prepared for lactic acid, acetic acid, butyric acid, and formic acid. For each organic acid, calibration curves were prepared using standard solutions of 0.1 mass %, 0.05 mass %, and 0.01 mass %.

２）試験結果
サイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表９及び図８に示した。 2) Test Results The organic acid contents and pH in the silage are shown in Table 9 and FIG.

表９及び図８に示すとおり、シバムギのみで調製したサイレージは酪酸含量が高く、酪酸臭気の強い、悪臭のする低品質サイレージとなった。またｐＨは５．２と高く、極めて低品質のサイレージであることが明らかである。
一方、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加後、ギ酸を散布したサイレージは、乳酸含有量が高くｐＨ３．６を示す、極めて高品質のサイレージであった。
シバムギに常在する酪酸生産菌は、ギ酸の散布により抑制されたことが分かった。また乳酸菌ＳＢＳ－００１１株は、順調に生育して乳酸を産生していることが明らかとなった。 As shown in Table 9 and Figure 8, the silage made only from quackgrass had a high butyric acid content and a strong butyric acid odor, resulting in a low-quality silage with a foul odor. The pH was also high at 5.2, clearly indicating that the silage was of extremely low quality.
On the other hand, the silage to which the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was added and then sprayed with formic acid was extremely high quality silage, having a high lactic acid content and a pH of 3.6.
It was found that the butyric acid-producing bacteria normally present in quackgrass were suppressed by spraying with formic acid, and it was also found that the lactic acid bacteria SBS-0011 strain grew well and produced lactic acid.

（２）リードカナリーグラスを用いたパウチサイレージの調製
１）試験方法
リードカナリーグラスの出穂初めから出穂期までのサイレージ調製適期に刈り取り、裁断機にて裁切断長１ｃｍに裁断し、３００ｇずつ小分けし、試験区に併せて、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株、又は比較のためＳＢＳ－０００３株を添加したのちギ酸を散布した。
乳酸菌およびギ酸の添加には霧吹きを用いた。サイレージの調製は、ボトルサイレージ法によって行った。またサイレージ調製量は、１ボトルあたり７００ｇとした。１処理区あたりの反復を３とした。
サイレージの貯蔵日数は、２５℃条件で１ヶ月とし、開封後はサイレージ中の主要な有機酸含量とｐＨをシバムギと同様に測定した。また臭気等の官能評価を専門評価員によって行った。
なおサイレージへの乳酸菌の添加量は１×１０^４～１×１０^５個／牧草１ｇ、ギ酸添加量は０．２％とした。 (2) Preparation of pouch silage using reed canary grass 1) Test method Reed canary grass was harvested at the optimum time for silage preparation from the beginning of heading to the heading stage, cut into cutting lengths of 1 cm using a cutter, and divided into 300 g portions. Depending on the test plot, the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention or SBS-0003 strain for comparison was added, and then formic acid was sprayed.
A spray bottle was used to add lactic acid bacteria and formic acid. Silage was prepared by the bottle silage method. The amount of silage prepared was 700 g per bottle. Each treatment was repeated three times.
The silage was stored at 25°C for one month, and after opening, the main organic acid contents and pH of the silage were measured in the same manner as for quackgrass. Sensory evaluation of odor, etc. was also conducted by a specialist evaluator.
The amount of lactic acid bacteria added to the silage was 1×10 ⁴ to 1×10 ⁵ cells/g of grass, and the amount of formic acid added was 0.2%.

２）試験結果
サイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表１０及び図９に示した。 2) Test Results The organic acid contents and pH in the silage are shown in Table 10 and FIG.

表１０及び図９に示すとおり、リードカナリーグラスにギ酸のみを散布して調製したサイレージは、酪酸発酵を行わなかったが、乳酸含量の低いサイレージとなった。またｐＨは４．０と高く、二次発酵の危険のある、低品質のサイレージであった。
ＳＢＳ－０００３株と０．２％ギ酸散布を行ったサイレージは、ｐＨも低く、比較的良好な発酵状態を示した。しかし乳酸の産生量は、一般のサイレージより低めであった。
一方、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加後、０．２％ギ酸を散布したリードカナリーグラスサイレージは、乳酸含有量が高くｐＨ３．６～３．７を示す、極めて高品質のサイレージであった。またサイレージの香気も、好ましいものであった。
リードカナリーグラスに常在する酪酸生産菌は、サイレージ原料あたり０．２質量％ギ酸の散布により抑制されることが分かった。また乳酸菌ＳＢＳ－００１１株は、ギ酸による発酵遅延や、乳酸菌の死滅もなく、順調に生育して乳酸を産生していることが明らかとなった。 As shown in Table 10 and Figure 9, the silage prepared by spraying only formic acid on reed canary grass did not undergo butyric acid fermentation, but had a low lactic acid content. In addition, the pH was high at 4.0, and the silage was of low quality with a risk of secondary fermentation.
The silage treated with SBS-0003 and 0.2% formic acid had a low pH and showed relatively good fermentation conditions, but the amount of lactic acid produced was lower than that of normal silage.
On the other hand, the reed canary grass silage to which the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was added and then sprayed with 0.2% formic acid was an extremely high quality silage with a high lactic acid content and a pH of 3.6 to 3.7. The silage also had a pleasant aroma.
It was found that butyric acid-producing bacteria normally present in reed canary grass were suppressed by spraying 0.2% by mass of formic acid per silage raw material. It was also found that the lactic acid bacteria SBS-0011 strain grew smoothly and produced lactic acid without any delay in fermentation or death due to formic acid.

４．ＳＢＳ－００１１株を用いたサイレージの調製試験（２）
本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株及び、親株であるＳＢＳ－０００３株を使用したサイレージ調製用乳酸菌製剤：商品名「サイマスターＡＣ」（雪印種苗株式会社製）を用いて、リードカナリーグラスを原料としたサイレージ調製試験を行った。 4. Silage preparation test using SBS-0011 strain (2)
A lactic acid bacteria preparation for preparing silage using the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention and its parent strain SBS-0003 strain, trade name "Cymaster AC" (manufactured by Snow Brand Seed Co., Ltd.), was used in a silage preparation test using reed canary grass as a raw material.

（１）ボトルサイレージの調製
１）試験方法
酪農学園大学敷地内で栽培中のリードカナリーグラス（品種名：パラトン）を、５月２７日に刈り取り、雪印種苗株式会社北海道研究農場にて裁断長１ｃｍで裁断機にかけ、ボトルサイレージを調製した。なお、採取したリードカナリーグラスの生育ステージは出穂前の若いものであった。
ボトルに詰めたリードカナリーグラス量は６７０ｇとした。
試験区は次の４区とした。なお１処理区あたりの反復を３とし、Ｔｕｋｅｙ法により有意差検定を行った。
Ａ．無添加
Ｂ．サイマスターＡＣ
Ｃ．ＳＢＳ－００１１＋０．１％ギ酸
Ｄ．ＳＢＳ－００１１＋０．２％ギ酸 (1) Preparation of bottle silage 1) Test method Reed canary grass (variety name: Paraton) cultivated on the grounds of Rakuno Gakuen University was harvested on May 27th and cut into 1 cm pieces using a cutter at the Hokkaido Research Farm of Snow Brand Seed Co., Ltd. to prepare bottle silage. The reed canary grass harvested was in a young growth stage before ear emergence.
The amount of reed canary glass packed in the bottle was 670 g.
The test was conducted in the following four sections. Each treatment section was repeated three times, and a significant difference test was conducted by the Tukey method.
A. No additives B. Cymaster AC
C. SBS-0011 + 0.1% formic acid D. SBS-0011 + 0.2% formic acid

サイマスターＡＣは、製品使用説明書の記載に従って、スプレーで規定量の乳酸菌を添加し、さらに添付されている繊維分解酵素を添加した。
ＳＢＳ－００１１株を添加した試験区は、乳酸菌の添加量を、一般的な添加量の半量である０．５×１０^５個／牧草１ｇとし、さらにサイマスターＡＣに添付されている繊維分解酵素の添加量はサイマスターＡＣ試験区の半量とした。
約２ヶ月後の７月２３日に開封し、開封後、シバムギと同様にｐＨおよび有機酸分析を行った。 According to the instructions in the product instructions, the prescribed amount of lactic acid bacteria was added to Cymaster AC via spray, and the attached fiber-degrading enzyme was also added.
In the test group to which the SBS-0011 strain was added, the amount of lactic acid bacteria added was half the usual amount, 0.5 x ¹⁰⁵ cells/g of grass, and further the amount of the fibrous enzyme included with Cymaster AC added was half that of the Cymaster AC test group.
It was opened about two months later on July 23rd, and after opening, pH and organic acid analyses were carried out in the same manner as for quackgrass.

２）試験結果
サイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表１１及び図１０に示した。 2) Test Results The organic acid contents and pH in the silage are shown in Table 11 and FIG.

表１１及び図１０に示すとおり、リードカナリーグラスのみで調製したサイレージは酪酸含量が高く、酪酸臭気の強い、悪臭のする低品質サイレージとなった。またｐＨは５．１と高く、極めて低品質のサイレージであることが明らかとなった。水分量には大きな差が認められなかった。
市販のサイマスターＡＣを用いたサイレージはｐＨがやや高い傾向にあった。また酪酸も検出された。
一方、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加後、ギ酸を散布したサイレージは、乳酸含有量が高く、ＳＢＳ－００１１株を添加後、ギ酸を０．１％又は０．２％添加することで酪酸発酵を完全に抑制することができ、ｐＨ４．１又は３．９を示す、極めて高品質のサイレージであった。すなわちサイマスターＡＣより酪酸の少ないサイレージを得ることが可能であった。特に、リードカナリーグラスに適用すると、常在する酪酸生産菌は、ギ酸の散布により抑制されたことが分かった。また乳酸菌ＳＢＳ－００１１株は、順調に生育して乳酸を産生していることが明らかとなった。 As shown in Table 11 and Figure 10, the silage prepared only from reed canary grass had a high butyric acid content and a strong butyric acid odor, resulting in a low-quality silage with a foul odor. The pH was also high at 5.1, making it clear that the silage was of extremely low quality. No significant difference was observed in the moisture content.
Silage made using commercially available Cystar AC tended to have a slightly higher pH. Butyric acid was also detected.
On the other hand, the silage to which the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was added and then sprayed with formic acid had a high lactic acid content, and by adding 0.1% or 0.2% formic acid after the addition of SBS-0011 strain, butyric acid fermentation could be completely inhibited, resulting in an extremely high quality silage with a pH of 4.1 or 3.9. In other words, it was possible to obtain silage with less butyric acid than Cymaster AC. In particular, when applied to reed canary grass, it was found that the normally present butyric acid-producing bacteria were inhibited by spraying with formic acid. It was also revealed that the lactic acid bacteria SBS-0011 strain grew smoothly and produced lactic acid.

５．ＳＢＳ－００１１株を用いたサイレージの調製試験（３）
牛糞により汚染されたサイレージ原料を想定したサイレージ調製試験を行った。すなわち、牛糞をガーゼろ過して調製した糞汁を散布したサイレージ原料について、上記４のリードカナリーグラスサイレージ試験と同様に、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株及び親株であるＳＢＳ－０００３株を使用したサイレージ調製用乳酸菌製剤：商品名「サイマスターＡＣ」（雪印種苗株式会社製）を用いて、リードカナリーグラスを原料としたサイレージ調製試験を行った。 5. Silage preparation test using SBS-0011 strain (3)
A silage preparation test was carried out assuming a silage raw material contaminated with cow dung. That is, a silage raw material was sprayed with fecal juice prepared by filtering cow dung through gauze, and a silage preparation test was carried out using reed canary grass as a raw material, using a lactic acid bacteria preparation for silage preparation, product name "Cymaster AC" (manufactured by Snow Brand Seed Co., Ltd.), which uses the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention and its parent strain SBS-0003, in the same manner as in the reed canary grass silage test in 4 above.

（１）ボトルサイレージの調製
１）糞汁液の調製
雪印種苗株式会社研究農場で飼育している和牛子牛より新鮮な牛糞を採取し、これを2重ガーゼでろ過した液を糞汁液として用いた。 (1) Preparation of bottle silage 1) Preparation of fecal juice Fresh cow feces was collected from Japanese black cattle calves raised at the Snow Brand Seed Co., Ltd. research farm, and the liquid obtained by filtering the fecal juice through double gauze was used as the fecal juice.

２）試験方法
上記と同様の条件のリードカナリーグラス（品種名：パラトン）に、糞汁液を牧草質量あたり１×１０^５個一般細菌／ｇ散布し、汚染サイレージ原料を調製した。具体的にはサイレージ調整３日前に和牛子牛より新鮮な糞を採取し、その糞に含まれる一般細菌（嫌気条件）を測定、それらの菌数を基準に添加量を決定した。一般細菌の測定にはＮＬｉ培地（Ｄｉｆｃｏ社製普通培地に０．５％塩化リチウムを添加した培地）を用い、混釈法にて行った。培養温度は３７℃とし、２日間培養することで得られるコロニーをカウントすることで菌数を算出した。採取した糞はサイレージ調製に使用するまで４℃条件下にて保存し、使用した。
なおボトルに詰めた汚染リードカナリーグラスの質量は、各試験ボトルとも６７０ｇとした。
試験区は、同様に次の４区とした。なお１処理区あたりの反復を３とし、Ｔｕｋｅｙ法により有意差検定を行った。
Ａ．無添加
Ｂ．サイマスターＡＣ
Ｃ．ＳＢＳ－００１１＋０．１％ギ酸
Ｄ．ＳＢＳ－００１１＋０．２％ギ酸 2) Test method Fecal juice was sprayed on reed canary grass (variety name: Paraton) under the same conditions as above at 1 x ¹⁰⁵ general bacteria/g per grass mass to prepare contaminated silage raw material. Specifically, fresh feces were collected from Japanese beef calves 3 days before silage preparation, and the general bacteria (anaerobic conditions) contained in the feces were measured, and the amount of addition was determined based on the number of bacteria. The measurement of general bacteria was performed using NLi medium (a medium made by Difco Co., Ltd., with 0.5% lithium chloride added) by the pour method. The incubation temperature was 37°C, and the number of bacteria was calculated by counting the colonies obtained by incubation for 2 days. The collected feces was stored at 4°C until it was used for silage preparation.
The mass of the contaminated reed canary glass packed in each test bottle was 670 g.
Similarly, the test was performed in the following four sections. Each treatment section was repeated three times, and a significant difference test was performed by the Tukey method.
A. No additives B. Cymaster AC
C. SBS-0011 + 0.1% formic acid D. SBS-0011 + 0.2% formic acid

サイマスターＡＣは、製品使用説明書の記載に従って、スプレーで規定量の乳酸菌を添加し、さらに添付されている繊維分解酵素を添加した。
ＳＢＳ－００１１株を添加した試験区は、乳酸菌の添加量を、一般的な添加量の半量である０．５×１０^５個／牧草１ｇとし、さらにサイマスターＡＣに添付されている繊維分解酵素の添加量はサイマスターＡＣ試験区の半量とした。 According to the instructions in the product instructions, the prescribed amount of lactic acid bacteria was added to Cymaster AC via spray, and the attached fiber-degrading enzyme was also added.
In the test group to which the SBS-0011 strain was added, the amount of lactic acid bacteria added was half the usual amount, 0.5 x ¹⁰⁵ cells/g of grass, and further the amount of the fibrous enzyme included with Cymaster AC added was half that of the Cymaster AC test group.

２ヶ月後に開封し、開封後、シバムギの試験と同様に、ｐＨおよび有機酸分析を行った。 After two months, the containers were opened and pH and organic acid analyses were carried out in the same manner as in the quackgrass test.

３）試験結果
サイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表１２及び図１１に示した。 3) Test Results The organic acid contents and pH in the silage are shown in Table 12 and FIG.

表１２及び図１１に示すとおり、糞汁の汚染によってリードカナリーグラスのみで調製したサイレージは、さらに酪酸含量が増加し、酪酸臭気の強い、悪臭のする低品質サイレージとなった。またｐＨは５．１と高く、極めて低品質のサイレージであることが明らかとなった。
市販のサイマスターＡＣを用いたサイレージは、乳酸発酵が優先していたが、糞尿汚染がない時と比較して乳酸含量の低下および酪酸含量の増加が認められた。
本発明によるサイレージは、市販のサイマスターＡＣを用いたサイレージより乳酸発酵が優先しており、糞尿などの汚染に対してより抵抗性があることがわかった。
一方、糞汁汚染したサイレージ原料に本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加し、ギ酸を散布したサイレージは、乳酸含有量が高く、ＳＢＳ－００１１株を添加した後、ギ酸を０．１％又は０．２％散布することで酪酸発酵を抑止できた。ｐＨも４．２と低値を維持し、極めて高品質のサイレージであった。
リードカナリーグラスに常在する酪酸生産菌や糞汁によって汚染されたサイレージ原料であっても、ギ酸の散布により酪酸発酵や二次発酵が抑制され、乳酸菌ＳＢＳ－００１１株の散布によって好ましい乳酸発酵サイレージとなった。 As shown in Table 12 and Figure 11, the silage prepared only from reed canary grass was contaminated with feces, and the butyric acid content increased, resulting in a low-quality silage with a strong butyric acid odor and a foul odor. The pH was also high at 5.1, making it clear that the silage was of extremely low quality.
In silage made using commercially available Cystar AC, lactic acid fermentation predominated, but a decrease in lactic acid content and an increase in butyric acid content were observed compared to when there was no manure contamination.
It was found that the silage according to the present invention had a higher lactic acid fermentation rate than the silage made using commercially available Cysmaster AC, and was more resistant to contamination by manure and other substances.
On the other hand, the silage obtained by adding the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention to the feces-contaminated silage raw material and spraying with formic acid had a high lactic acid content, and butyric acid fermentation could be suppressed by spraying with 0.1% or 0.2% formic acid after adding the SBS-0011 strain. The pH was also maintained at a low value of 4.2, making it an extremely high quality silage.
Even when the silage raw material was contaminated with butyric acid-producing bacteria or feces that are normally present in reed canary grass, the spraying of formic acid suppressed butyric acid fermentation and secondary fermentation, and the spraying of lactic acid bacteria SBS-0011 strain produced a favorable lactic acid fermented silage.

６．２種の牧草を用いたサイレージ調製試験
代表的な牧草であるチモシーとメドウフェスクを用いたサイレージ調製試験を実施し、本発明の効果を評価した。本試験は、通常の条件でサイレージ調製を行った「Ａ．通常試験」及び、予め酪酸発酵したサイレージから調製した乳酸菌を含む酪酸発酵リード液を散布した「Ｂ．酪酸発酵リード液添加試験」の２試験を行い、本発明の乳酸菌の効果とギ酸添加による効果を評価した。 6. Silage preparation test using two kinds of grass Silage preparation tests using timothy and meadow fescue, which are representative grasses, were conducted to evaluate the effects of the present invention. In this test, two tests were conducted: "A. Normal test" in which silage was prepared under normal conditions, and "B. Butyric acid fermentation Reed liquid addition test" in which butyric acid fermentation Reed liquid containing lactic acid bacteria prepared from silage that had been butyric acid fermented in advance was sprayed, and the effects of the lactic acid bacteria of the present invention and the effects of adding formic acid were evaluated.

Ａ．通常試験
１）試験方法
雪印種苗株式会社北海道研究農場内の圃場で栽培中のチモシー（品種：ホライズン）及びメドウフェスク（品種：コスモポリタン）を刈り取り、雪印種苗株式会社北海道研究農場にて裁断長１ｃｍで裁断機にかけ、ボトルサイレージを調製した。チモシーは穂がそろい、メドウフェスクは一部種がついた刈り遅れの草を用いた。また、圃場におけるチモシーとメドウフェスクの割合は、チモシー３割、メドウフェスク７割であった。
ボトルにつめた牧草重量は６００ｇであった。
試験区は次の４区とした。なお１処理区あたりの反復を３とし、Ｔｕｋｅｙ法により有意差検定を行った。
Ａ．無添加
Ｂ．サイマスターＡＣ
Ｃ．ＳＢＳ－００１１＋０．１％ギ酸
Ｄ．ＳＢＳ－００１１＋０．２％ギ酸 A. Normal test 1) Test method Timothy (variety: Horizon) and meadow fescue (variety: Cosmopolitan) cultivated in a field in the Hokkaido research farm of Snow Brand Seed Co., Ltd. were harvested and cut into 1 cm lengths using a cutter at the Hokkaido research farm of Snow Brand Seed Co., Ltd. Bottle silage was prepared. Timothy grass was used with even ears, and meadow fescue grass was used with some seeds and late cutting. The ratio of timothy to meadow fescue in the field was 30% timothy and 70% meadow fescue.
The weight of grass packed in the bottle was 600 g.
The test was conducted in the following four sections. Each treatment section was repeated three times, and a significant difference test was conducted by the Tukey method.
A. No additives B. Cymaster AC
C. SBS-0011 + 0.1% formic acid D. SBS-0011 + 0.2% formic acid

サイマスターＡＣは、製品使用説明書の記載に従って、スプレーして説明書に規定された量の乳酸菌を添加し、さらに添付されている繊維分解酵素を添加した（生草１０トンあたりサイマスター製品添付の酵素１５０ｇを添加）。
ＳＢＳ－００１１株を添加した試験区は、乳酸菌の添加量を、一般的な添加量の半量である０．５×１０^５個／牧草１ｇとし、さらにサイマスターＡＣに添付されている繊維分解酵素の添加量をサイマスターＡＣ試験区の半量とした。
乳酸菌、酵素、ギ酸の添加は市販の少量霧吹きを用いた。 According to the instructions for use of the product, Cymaster AC was sprayed to add the amount of lactic acid bacteria specified in the instructions, and the attached fiber-degrading enzyme was also added (150 g of the enzyme attached to the Cymaster product was added per 10 tons of fresh grass).
In the test group to which the SBS-0011 strain was added, the amount of lactic acid bacteria added was half the usual amount, 0.5 x ¹⁰⁵ cells/g of grass, and further the amount of fibrous enzyme included with Cymaster AC was half that of the Cymaster AC test group.
Lactic acid bacteria, enzymes, and formic acid were added using a commercially available small-volume sprayer.

２ヶ月後に開封し、開封後、シバムギの試験同様に、ｐＨおよび有機酸分析を行った。なお、有機酸分析は、上記に示したシバムギの試験と同様の方法でＨＰＬＣを用いて行った。 After two months, the containers were opened, and pH and organic acid analysis was performed in the same manner as in the test for quackgrass. The organic acid analysis was performed using HPLC in the same manner as in the test for quackgrass shown above.

２）試験結果
各試験区のサイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表１３及び図１２に示した。 2) Test Results The organic acid content and pH in the silage of each test plot are shown in Table 13 and FIG.

表１３及び図１２に示すとおり、代表的な牧草であるチモシーとメドウフェスクの混合サイレージは、ギ酸０．１％又は０．２％を噴霧し、ＳＢＳ－００１１株添加によってｐＨが低下し、酪酸を含有しない、高品質のものとなった。
一方、無添加の試験区は乳酸が検出されなかった。これは発酵初期のｐＨは高いため、酪酸菌が成育し、これに伴って産生された乳酸が消費されたものと考えられた。そのためサイレージは、悪臭の強い不良品であった。またサイマスターＡＣを添加したサイレージも好ましい発酵状態を示し、好ましいサイレージとなったが、ｐＨは、ギ酸０．１％又は０．２％を噴霧し、ＳＢＳ－００１１株を添加した試験区より若干高い結果となった。
また、本発明の乳酸菌を用いた場合、開封後のサイレージの二次発酵が起こらなかった。このため、開封後も長時間放置できることが明らかとなった。 As shown in Table 13 and FIG. 12, the mixed silage of timothy and meadow fescue, which are representative pasture grasses, was sprayed with 0.1% or 0.2% formic acid, and the pH was lowered by adding the SBS-0011 strain, resulting in a high-quality product that did not contain butyric acid.
On the other hand, in the test plot without addition, lactic acid was not detected. This was thought to be because the pH was high in the early stage of fermentation, which led to the growth of butyric acid bacteria, and the lactic acid produced was consumed. As a result, the silage was a defective product with a strong foul odor. The silage to which Cymaster AC was added also showed a favorable fermentation state and was a favorable silage, but the pH was slightly higher than that of the test plot to which 0.1% or 0.2% formic acid was sprayed and the SBS-0011 strain was added.
Furthermore, when the lactic acid bacteria of the present invention were used, secondary fermentation of the silage did not occur after opening, which revealed that the silage could be left for a long period of time after opening.

Ｂ．酪酸発酵リード液添加試験
本発明の乳酸菌の汚染原料に対する効果を確認するため、予め、酪酸発酵の原因菌を含む溶液（酪酸発酵リード液）を添加した牧草を原料として使用し、本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株の効果を試験した。 B. Butyric Acid Fermentation Lead Solution Addition Test In order to confirm the effect of the lactic acid bacteria of the present invention on contaminated raw materials, grass to which a solution containing the causative bacteria of butyric acid fermentation (butyric acid fermentation lead solution) had been added in advance was used as a raw material, and the effect of the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention was tested.

（１）試験方法
１）酪酸発酵リード液（以下「リード液」）の調製
リード液は、酪酸発酵したサイレージ（リードサイレージ）３０ｇを、ストマフィルター（株式会社セントラル科学貿易社製）に入れたのち、滅菌蒸留水３０ｍＬを加え、１分間マスティケーターＳ型（株式会社セントラル科学貿易社製）を用いて揉みこんで調製した溶液を用いた。
リード液中の乳酸菌数は段階希釈法により測定した。
このリード液の乳酸菌数は、５．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬであった。これをサイレージ原料である刈り取ったチモシーとメドウフェスクに２．０ｍＬ／ｋｇ噴霧した。 (1) Test Method 1) Preparation of Butyric Acid Fermented Reed Liquor (hereinafter referred to as "Reed Liquor") Reed liquor was prepared by placing 30 g of butyric acid fermented silage (reed silage) in a stoma filter (manufactured by Central Scientific Trading Co., Ltd.), adding 30 mL of sterile distilled water, and kneading for 1 minute using a Masticator S type (manufactured by Central Scientific Trading Co., Ltd.).
The number of lactic acid bacteria in the lead solution was determined by serial dilution method.
The lactic acid bacteria count of this Reid solution was 5.5 x ¹⁰⁷ CFU/mL, and this solution was sprayed at 2.0 mL/kg onto cut timothy and meadow fescue, which are silage raw materials.

２）サイレージの調製
上記の「Ａ．通常試験」と同様のチモシーとメドウフェスク３：７の比率の混合牧草を用いた。
ボトルにつめた牧草重量は、「Ａ．通常試験」と同様に６００ｇであった。
試験区は次の４区とした。なお１処理区あたりの反復を３とし、Ｔｕｋｅｙ法により有意差検定を行った。
Ａ．無添加
Ｂ．サイマスターＡＣ
Ｃ．ＳＢＳ－００１１＋０．１％ギ酸
Ｄ．ＳＢＳ－００１１＋０．２％ギ酸 2) Preparation of silage The same mixed grass of timothy and meadow fescue in a ratio of 3:7 as in "A. Conventional Test" above was used.
The weight of grass packed in the bottle was 600 g, the same as in "A. Regular Test."
The test was conducted in the following four sections. Each treatment section was repeated three times, and a significant difference test was conducted by the Tukey method.
A. No additives B. Cymaster AC
C. SBS-0011 + 0.1% formic acid D. SBS-0011 + 0.2% formic acid

Ｂ．サイマスターＡＣ、Ｃ．ＳＢＳ－００１１＋０．１％ギ酸、Ｄ．ＳＢＳ－００１１＋０．２％ギ酸の試験区は、上記の添加は「「Ａ．通常試験」と同様に実施した。 For the test sections B. Cymaster AC, C. SBS-0011 + 0.1% formic acid, and D. SBS-0011 + 0.2% formic acid, the above additions were carried out in the same manner as in "A. Regular Test."

２ヶ月後に開封し、開封後、ｐＨおよび有機酸分析を行った。なお、有機酸分析は、上記シバムギサイレージ試験と同様に、ＨＰＬＣを用いて行った。 After two months, the containers were opened, and pH and organic acid analyses were performed. The organic acid analyses were performed using HPLC, as in the quackgrass silage test described above.

３）試験結果
サイレージ中の有機酸含量及びｐＨを表１４及び図１３に示した。 3) Test Results The organic acid contents and pH in the silage are shown in Table 14 and FIG.

表１４及び図１３に示すとおり、代表的な牧草であるチモシーとメドウフェスクの混合サイレージは、ギ酸０．１％又は０．２％を噴霧し、ＳＢＳ－００１１株を添加することによってｐＨが極めて低く、酪酸を含有しない、高品質のものとなった。特にギ酸の散布濃度を０．２％とした場合、酪酸は全く検出されなかった。またｐＨは、ギ酸０．１％を噴霧した場合、３．９、ギ酸０．２％を噴霧した場合、３．７となった。ｐＨがこのように低い理由は、ギ酸散布と本発明の乳酸菌による相乗効果のためと考えられた。 As shown in Table 14 and Figure 13, mixed silage of timothy and meadow fescue, which are typical pasture grasses, became high quality with an extremely low pH and no butyric acid when sprayed with 0.1% or 0.2% formic acid and added with SBS-0011 strain. In particular, when the spray concentration of formic acid was 0.2%, no butyric acid was detected. Furthermore, the pH was 3.9 when 0.1% formic acid was sprayed, and 3.7 when 0.2% formic acid was sprayed. The reason for such a low pH was thought to be due to the synergistic effect of the spray of formic acid and the lactic acid bacteria of the present invention.

一方、無添加の試験区は、「Ａ．通常試験」で乳酸が検出されなかった。これは発酵初期のｐＨが高いため、酪酸菌が成育し、これに伴って乳酸菌によって産生された乳酸が消費されたものと考えられた。得られたサイレージは、酪酸に由来する悪臭の強い不良品であった。
またサイマスターＡＣを添加したサイレージは、乳酸量の多い、好ましい発酵状態を示したが、リード液中の酪酸菌により酪酸発酵も同時に進行して、最終的に得られたものは好ましいサイレージとならなかった。ｐＨもこのため４．６と高い結果となった。
以上の「Ａ．通常試験」、「Ｂ．酪酸発酵リード液添加試験」の結果から、サイレージ原料の牧草に予め本発明の乳酸菌を散布し、０．１～０．２％濃度のギ酸を散布することで、酪酸菌の生育を抑制し、酪酸菌に汚染された牧草であっても好ましいサイレージとなることが確認できた。
また、本発明の乳酸菌を用いた場合、開封後のサイレージは、二次発酵が起こらないため、開封後も長時間放置できることが明らかとなった。 On the other hand, in the test plot without the additive, no lactic acid was detected in "A. Regular test". This was thought to be because the pH was high at the beginning of fermentation, which caused butyric acid bacteria to grow, and the lactic acid produced by the lactic acid bacteria was consumed as a result. The obtained silage was a defective product with a strong foul odor caused by butyric acid.
The silage to which Cymaster AC was added showed a favorable fermentation state with a high lactic acid content, but the butyric acid fermentation also progressed at the same time due to the butyric acid bacteria in the reed liquor, and the final silage was not favorable. The pH was also high at 4.6.
From the results of "A. Conventional test" and "B. Butyric acid fermentation lead liquid addition test" above, it was confirmed that by spraying the lactic acid bacteria of the present invention on the grass used as silage material in advance and then spraying formic acid at a concentration of 0.1 to 0.2%, the growth of butyric acid bacteria is inhibited, and even grass contaminated with butyric acid bacteria can be used to produce desirable silage.
It was also revealed that when the lactic acid bacteria of the present invention are used, secondary fermentation does not occur in silage after opening, so that the silage can be left for a long period of time after opening.

７．サイレージ調製試験の総括
本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株は、ギ酸耐性が強い乳酸菌である。このため、サイレージ原料の牧草に本発明の乳酸菌ＳＢＳ－００１１株を添加し、ギ酸を散布して、ｐＨを低下させ、酪酸菌生育を抑制して発酵させることで、常に高品質のサイレージを得ることができる。また持続的に乳酸を産生し続けるため、異常発酵の原因となる酪酸菌や酵母の生育を抑制できる。さらにサイレージ開封後の二次発酵も観察されず、速やかなｐＨの低下と乳酸の持続的な産生により二次発酵の原因となる酵母等の生育抑制効果が高いことが明らかとなった。 7. Summary of silage preparation test The lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention is a lactic acid bacterium with strong resistance to formic acid. Therefore, by adding the lactic acid bacteria SBS-0011 strain of the present invention to grass as a silage raw material, spraying formic acid to lower the pH, inhibit the growth of butyric acid bacteria, and fermenting, high quality silage can be obtained at all times. In addition, since lactic acid is continuously produced, the growth of butyric acid bacteria and yeast that cause abnormal fermentation can be inhibited. Furthermore, secondary fermentation was not observed after opening the silage, and it was revealed that the rapid decrease in pH and the continuous production of lactic acid have a high effect of inhibiting the growth of yeast and the like that cause secondary fermentation.

Claims

The main constituent sugars of the exopolysaccharide are galactose, mannose, and glucose , and the SBS-0011 strain (NITE BP-03013) is a Lactobacillus paracasei strain that produces an exopolysaccharide.

The Lactobacillus paracasei according to claim 1, wherein the exopolysaccharide does not contain amino sugars as its constituent sugars and contains 50 to 60% by mass of glucose, 20 to 30% by mass of mannose, and 10 to 20 % by mass of galactose per mass of the exopolysaccharide.

3. The Lactobacillus paracasei according to claim 1 or 2 , which is resistant to growth inhibition by formic acid, ethyl alcohol and hydrogen peroxide.

The Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 3 , which can grow in an MRS medium containing any one or more of 0.2% by mass of formic acid, 11% by mass of ethyl alcohol, and 150 ppm of hydrogen peroxide.

A lactic acid bacteria preparation for preparing silage, comprising the Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 4 .

The lactic acid bacteria preparation for silage preparation according to claim 5 , which is in any form selected from the group consisting of a liquid preparation, a granule preparation, and a powder preparation.

A method for preparing silage, comprising spraying a preparation containing Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 4 onto silage raw materials, followed by fermentation.

A method for preparing silage, comprising adding at least 1×10 ⁴ CFU/g of Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 4 to a silage raw material and fermenting the silage.

A method for preparing silage, comprising spraying an aqueous solution of formic acid containing 0.1 to 0.3 % by mass of formic acid per silage raw material, and then adding a lactic acid bacteria preparation for preparing silage, which contains Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 4 or Lactobacillus paracasei according to claim 5 , to ferment the silage.

A silage fermented using the Lactobacillus paracasei according to any one of claims 1 to 4 .