JP7618641B2

JP7618641B2 - 新規アレルゲン

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Publication number: JP7618641B2
Application number: JP2022500515A
Authority: JP
Inventors: ヨナスリドホルム; ラースマットソン; アンジェリカエーレンベルク; ホーカンラーソン; ヨナスエストリング
Original assignee: Phadia AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2025-01-21
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: EP3994155A1; US20220241406A1; WO2021004885A1; US12539330B2; JP2022538691A

Description

本発明は、アレルギーの分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒノキ科ファミリーに属する種の花粉からの新規アレルゲンの特定、ならびにかかる花粉に対するアレルギーおよび特に関連する食物アレルギーの診断および治療に関する。

工業先進国における人口のおよそ２０％が、様々な環境生物物質または食物からの抗原に曝露されると、過敏性（アレルギー）となる。即時型および／または遅延型の過敏症を誘導する抗原は、主にタンパク質または糖タンパク質であり、アレルゲンと呼ばれ［１］、花粉、ヒョウヒダニ、動物の皮屑、昆虫の毒液、植物または動物由来食物など、様々な源に見られる。アレルギー性疾患の基本的な免疫学的機構は、一般に感作と呼ばれる、かかるアレルゲンに対するアレルゲン特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の形成である。ＩｇＥ抗体は、特定の高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩを介して、好塩基球、肥満細胞、樹状細胞と結合する。アレルゲンに曝露されると、細胞表面上のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、各アレルゲン分子の少なくとも２つの異なるエピトープの認識を通して架橋され、これらの細胞からヒスタミンおよびロイコトリエンなどの炎症性媒介物が放出される。その結果、組織炎症およびアレルギーの生理学的症状が生じる［２］。

臨床診療では、医師によるアレルギーの診断は通常、同じアレルゲンに対する感作の証拠と組み合わせた、アレルゲンに対する過敏性の納得できる病歴に基づいている。アレルゲン感作の診断検査手順は、患者の血液試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのインビトロイムノアッセイ、または患者の皮膚へのアレルゲン抽出物の局所適用によって実行される皮膚プリック検査（ＳＰＴ）のいずれかを利用できる［３］。どちらの様式でも、アレルゲン源からのタンパク質抽出物を含むアレルゲン試薬が従来使用されている。かかる検査は高い感受性、それによる高い陰性の予測値を有し得るが、天然アレルゲン抽出物における成分に対する感作は、必ずしもアレルギーの臨床症状が発生することを意味するわけではない。検出可能な感作と臨床的アレルギーとの間のかかる解離は、部分的には、天然抽出物に存在する異なるアレルゲンタンパク質の不等な有意性によるものである。アレルゲン源における特定のタンパク質に対する感作が他のものよりも臨床疾患と密接に関連しているという事実は、診断検査に純粋な形態でかかる特定のタンパク質を利用することにより、改善された臨床的有用性を伴う診断検査の開発へ向かう手段を開いた。個々のアレルゲンタンパク質に対するＩｇＥ抗体についてのインビトロ診断検査は、多くの場合成分分解診断（ＣＲＤ）と呼ばれる［４］。

アレルゲン抽出物を使用する従来のＩｇＥ分析と比較して、ＣＲＤにはいくつかの明確な利点があることが現在広く認識されている。ＣＲＤの１つの重要な特徴は、アレルゲン源に対する一次感作と交差反応性による感作を区別する能力であり、前者はより重度の症状に、後者は軽度の症状または臨床的耐性に関連する。食物アレルギーでは、一次感作は通常、豊富で多くの場合安定したタンパク質に指向する。結果として、問題の食物を少量でも誤って摂取すると、相当量のかかる食物タンパク質に曝露され、感作された個体において高いリスクの重度の反応をもたらすであろう。対照的に、花粉アレルゲンと相同で交差反応する食物タンパク質は、通常、少量しか存在しないため、重度の症状を引き起こすことはめったにない［５、６］。関連する食物アレルゲン成分に対するＩｇＥ抗体の分析は、小麦、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツに対するアレルギーに例示されるように、診断値および臨床的有用性を有意に増加させることが示されている［７～１３］。ＣＲＤを使用することにより、重度で生命を脅かす可能性のあるアレルギー反応のリスクが高い患者を特定し、食物への曝露を厳密に回避し、緊急治療のためにアドレナリン自動注入器を常に携帯するように指示することができる一方で、かかる重篤な反応のリスクがない患者は、不当な不安から解放され、改善された生活の質から恩恵を受けることができる。同様に、呼吸器アレルギーでは、一次感作と交差反応性感作とを区別するＣＲＤの能力により、重要性の低い交差反応性感作ではなく、アレルギー症状の真の原因を対象としたアレルゲン免疫療法治療（ＡＩＴ）の最適な選択が容易になる［１４］。

精製された天然または組換えアレルゲン成分の別の用途は、天然アレルゲン抽出物中の対応するタンパク質の不均衡または不足に対抗するためのスパイク試薬としてのそれらの使用である。これは、アレルゲンマイクロアレイまたは診療所での検査など、小型化されたまたは実験室以外のイムノアッセイで特に重要となり得、あまり好ましくないアッセイ条件、抗体結合アレルゲン試薬の能力の低下、および効力が制限された天然アレルゲン抽出物の組み合わせは、不十分な診断感度を引き起こし得る。

２０１６年、欧州アレルギー学会（ＥＡＡＣＩ）は、「ＥＡＡＣＩ分子アレルギー学－ユーザーガイド」を発表した［１］。これは、より信頼性の高い診断のために、アレルギー患者をアレルゲン成分で検査することの重要性を認識する上で画期的な出来事であった。このガイドを使用することにより、アレルギー専門医および他の医療専門家は、交差反応性および特定の感作パターンに関連するリスクのレベルをよりよく理解し、それによって適切なアレルゲン回避戦略を含む、患者のより適切な管理を提供することができる。

アレルギーの最も一般的な治療法は、一時的に症状を緩和するように作用するが治癒的ではない薬理学的（例えば、抗ヒスタミン薬）である。アレルギーの長期的および治癒的な治療は、患者の免疫学的脱感作を引き起こすアレルゲン免疫療法（ＡＩＴ）で達成することができる。治療は、皮下または舌下のいずれかで、原因アレルゲンの抽出物の用量を、非常に低いレベルから１００～１０００倍高い維持用量まで徐々に増加させる用量の投与を含む。この制御され、徐々に増加するアレルゲン曝露は、時に免疫系の再教育とも称される、アレルゲンタンパク質に対する防御免疫応答の特異的な活性化を引き起こす。免疫療法の確立された形態の可能なさらなる発展は、天然のアレルゲン抽出物の代わりに、１つまたはいくつかの精製アレルゲンタンパク質の使用である。このような免疫療法の試験は、イネ科草本［１５、１６］およびカバノキ［１７］の花粉アレルギーに対して成功裏に実施されており、ペット動物に対するアレルギーの治療にも提案されている［４、１８］。

ＡＩＴの疾患修飾メカニズムは完全には理解されていないが、それが主にＩｇＧ４サブクラスからなるアレルゲン特異的ＩｇＧ応答を誘導することが周知である。これらのＩｇＧ抗体は、アレルゲンを遮断することによって直接的に、またはＦｃ受容体を介して作用することによって間接的にＩｇＥ抗体の効果を調節し得る［１９～２１］。ＩｇＧ抗体応答は免疫療法の成功の機構の一部であると考えられているため［２０、２１］、アレルゲン特異的ＩｇＧの分析は、治療の関連する免疫学的効果をモニタリングする方法であり得る。結論として、アレルゲン特異的ＩｇＧレベルの測定は、環境曝露または免疫療法治療を通したアレルゲンに対する自然または誘導耐性を反映している可能性があり、ＩｇＥ測定と組み合わせて、アレルギーにおける診断検査の臨床的関連性を高める可能性がある。

花粉アレルゲンは工業先進国における呼吸器アレルギーの主な原因であり、おそらく気候変動の結果として、花粉症は過去数十年の間に着実に増加している［２２］。花粉症は、季節性鼻炎、結膜炎、喘息などの様々な症状を示す。花粉粒は、イネ科草本、雑草、樹木の花から放出され、風または昆虫のいずれかによって飛散される。樹木からのほとんどのアレルギー性花粉は風で運ばれ、ブナ目、シソ目、ヤマモガシ目、およびマツ目に属する種によって産生される。マツ目は裸子植物であり、別々に雄花および雌花を有することによって特徴づけされる。アレルギーに関連するマツ目種は主にヒノキ科ファミリーに属し、主に比較的温暖な気候で見られる［２３］。地中海地域では、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（地中海またはイタリアのヒノキ）が冬の花粉症の重要な原因であり、ヒノキ花粉に対する感作の有病率は過去数十年で劇的に増加している。特定の地域では、感作率は、アトピー性個体の間で４２％高く達し得る［２４、２５］。地中海ヒノキはアリゾナヒノキ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓａｒｉｚｏｎｉｃａ）と密接に関連しており、北米および日本でそれぞれ見られるマウンテンシダ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉ、同義名Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、二ホンヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓｏｂｔｕｓａ）、および二ホンシダ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）とは若干離れている。これらの種の主要なアレルゲンであるＣｕｐｓ１、Ｃｕｐａ１、Ｊｕｎａ１、Ｃｈａｏ１、およびＣｒｙｊ１はそれぞれ、９０％を超えるヒノキ科花粉アレルギー患者を感作している。これらのアレルゲンはすべて糖タンパク質であり、４０～５０ｋＤａの分子量を有し、ペクチン酸リアーゼタンパク質ファミリーに属する。アレルゲンは交差反応性が高く、７０％～９５％の配列同一性を共有する［２６、２７］。２群アレルゲン（Ｃｕｐｓ２、Ｃｕｐａ２、Ｊｕｎａ２、Ｃｈａｏ２、およびＣｒｙｊ２）はポリガラクツロナーゼファミリーに属し、７１％～９７％の配列同一性を示す。感作率はヒノキ科花粉アレルギー患者間で８０％高くなる可能性があり、したがってそれを主要なアレルゲンと見なすこともできる［２４］。３群および４群のヒノキ科花粉アレルゲンは、それぞれタウマチン様タンパク質ファミリーおよびポルカルシンタンパク質ファミリーに属し、少数アレルゲンとして記載されている［２７、２８］。これらの４つの群を超えて、ヒノキ科花粉において約１５個の他のアレルゲンタンパク質が報告されている。

花粉に対する感作は、多くの場合相同な花粉および食物タンパク質の間の交差反応性のために、異なる植物性食物に対するアレルギーと関連している。かかる交差反応性は、花粉および植物由来食物中に存在する相同タンパク質間の構造的類似性の結果として生じる。関連するタンパク質のかかる対間のアミノ酸配列同一性および三次元構造類似性のレベルが高いほど、交差反応性の確率および強度が高くなる。互いに６０％以上の配列同一性を有するタンパク質間で広範な交差反応性が期待できるが、関連性の低いタンパク質間で生じ得る［２９］。

花粉関連食物アレルギーは、主にまたは完全に花粉感作によって駆動されると考えられている。これは通常、口腔症状を引き起こすため、口腔アレルギー症候群（ＯＡＳ）と称される。花粉関連食物アレルギーの最も周知である広く見られる例は、カバノキ花粉によって引き起こされ、様々な果物および野菜におけるいわゆるＰＲ－１０タンパク質Ｂｅｔｖ１および相同タンパク質が関係している［３０］。別の例は、任意の花粉感作によって駆動され得るプロフィリン媒介性食物アレルギーであり、これは頻度が低く、メロン、バナナ、および他の果物などの食物に対してアレルギーを引き起こし得る［３１、３２］。

さらに別の例では、ヒノキ科花粉感作とモモアレルギーとの関連を示すいくつかの患者の症例が報告された［３３］。その調査では、４５ｋＤａのモモアレルゲンが、免疫ブロット阻害実験によって交差反応性の原因の可能性があると特定された。最近では、Ｐｒｕｐ７またはｐｅａｍａｃｌｅｉｎと称された新規モモアレルゲンが、南イタリアのモモアレルギー患者の主要なアレルゲンとして報告された［３４］。Ｐｒｕｐ７は、日本において果物アレルギーの重要な原因としても報告されているジベレリン制御性タンパク質（ＧＲＰ）ファミリーに属する７ｋＤａのシステインに富むタンパク質である［３５］。フランス南部では、Ｐｒｕｐ７感作を特徴とする重度のモモアレルギーとヒノキ科花粉症との間に有意な関連が観察されている［３６］。阻害実験を行うことにより、ヒノキ花粉抽出物は、Ｐｒｕｐ７とのＩｇＥ結合を凌駕することが見出され、ヒノキ花粉におけるＰｒｕｐ７と交差反応するタンパク質の存在を示している。ヒノキ花粉由来のＢＰ１４と称される１４ｋＤａのタンパク質は、ＧＲＰファミリーの別のメンバーであるジャガイモタンパク質ｓｎａｋｉｎ－１［３７］と配列相同性のある１３アミノ酸残基のペプチドを含むことが報告されている。この配列伸展は、１３残基のＢＰ１４配列を使用したＢｌａｓｔ検索によって証明されるように、４０を超える植物種からのＧＲＰで同一である高度に保存されたＧＲＰセグメントを含むすが、ヒノキ科種からの他の利用可能な配列は含まれない。したがって、報告されたＢＰ１４ペプチドには、ヒノキ科花粉ＧＲＰに特徴的および区別する配列情報が含まれておらず、したがって、かかるタンパク質の特定の特徴に向けたガイダンスは提供されていない。これまでのところ、Ｐｒｕｐ７に対応するヒノキ科花粉タンパク質は特定および特性づけされていない。

したがって、１型アレルギー、特に食物中のタンパク質との交差反応性を示し、および感作を誘発し、食物アレルギー反応を引き起こし得るアレルゲンの診断、予後、治療および／または予防に使用することができる、さらなるヒノキ科花粉アレルゲンを特定するための当技術分野における必要性が依然として存在する。

上記の必要性は現在満たされているか、少なくともヒノキ科花粉の新規に単離された７ｋＤａアレルゲン（本明細書ではＣｕｐｓＧＲＰとも称される）の特定および提供によって軽減されている。アレルゲンは、モモにおけるＰｒｕｐ７と相同であり、ジベレリン制御性タンパク質（ＧＲＰ）ファミリーに属する７ｋＤａの塩基性システインリッチタンパク質であり、Ｐｒｕｐ７によって媒介される重度のモモアレルギーの主要な感作物質である可能性が高いことが示されている。かかるアレルゲンの発見は、１型アレルギー診断の分野での大きな必要性、ならびに果物および潜在的な他の植物性食物に対して重度のアレルギーを発症するリスクのあるヒノキ科花粉アレルギーの個体の特定に対応する。

本明細書で特定されたアレルゲンであるＣｕｐｓＧＲＰは、ヒノキ科ファミリーからの他の種の対応する花粉タンパク質と高い配列相同性を共有する。したがって、本明細書は、ヒノキ科ファミリーからの３つの種におけるＣｕｐｓＧＲＰを含むアレルゲンの特定についても記載する。Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉから特定されたアレルゲンは、本明細書では、それぞれ、ＣｕｐｓＧＲＰ、ＣｒｙｊＧＲＰ、およびＪｕｎａＧＲＰと称される。３つの花粉ＧＲＰアレルゲンは、Ｃｕｐｓ７、Ｊｕｎａ７、およびＣｒｙｊ７とも称される。

本明細書ではまた、それぞれＣｕｐｓＧＲＰａおよびＣｕｐｓＧＲＰｂと称されるＣｕｐｓＧＲＰの２つのタンパク質アイソフォームが示される。

したがって、本明細書の第１の態様では、単離アレルゲンタンパク質（すなわち、本明細書で特定されたアレルゲン（複数可））であって、該タンパク質が、配列番号４に従うアミノ酸配列（すなわち、ＣｕｐｓＧＲＰａ）を含むか、または機能的に同等のそのタンパク質断片もしくはバリアントが、少なくとも８５％の配列番号４との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質が提供される。本明細書では、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列番号４との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質または機能的に同等のそのタンパク質断片もしくはバリアントも提供される。

本明細書では、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号８のいずれか１つに従うアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる単離アレルゲンタンパク質も提供される（すなわち、それぞれＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰ）。本明細書では、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性のそれぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号８のいずれか１つとの配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質または機能的に同等のそのタンパク質断片もしくはバリアントも提供される。

さらなる態様では、本明細書に示されるそれぞれの単離タンパク質をコードする単離核酸分子が提供される。かかる単離核酸分子は、ＩＵＰＡＣ多義性コードに従う同義コドンおよびバリアントを含む花粉ＧＲＰの縮重ＤＮＡ配列を提示する配列番号１０に従う配列によって表される。

さらなる態様では、本明細書の他の場所に開示される単離核酸配列を含む単離核酸分子を含む、発現ベクター（本明細書では単にベクターとも称される）が提供される。

さらに別の態様では、本明細書に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞が提供される。該宿主細胞は、発現ベクターによってコードされる目的のタンパク質を発現させるために使用される。

さらに別の態様では、アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、本明細書に記載の単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアントを追加するステップを含む、方法が提供される。

さらに別の態様では、本明細書に記載のアレルゲン組成物を産生するための方法によって得られるアレルゲン組成物であって、該アレルゲン組成物が、本明細書の他の場所でさらに定義される、単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアントを含む、アレルゲン組成物が提供される。

本明細書に記載の単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアント、ならびにアレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含むアレルゲン組成物も提供される。

さらに別の態様では、１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための、本明細書に開示される単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアントの使用が提供される。

さらに別の態様では、本明細書では、１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための方法であって、１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、本明細書に記載の単離アレルゲンタンパク質、またはその断片もしくはバリアントと接触させるステップと、該試料において、該タンパク質、断片もしくはバリアント、またはその機能的に同等の断片と特異的に結合する抗体、例えば、ＩｇＥ抗体などの存在を決定するステップと、を含み、該タンパク質、断片またはバリアントと特異的に結合する該試料中の抗体またはその機能的に同等の断片の存在が、該対象における１型アレルギーに関して有益である、方法が提供される。

さらに別の態様では、キットオブパーツであって、可溶性または固体支持体に固定化された、本明細書に記載の単離アレルゲンタンパク質、または断片もしくはバリアントを含み、該キットが、任意に、検出試薬および／または使用説明書をさらに含む、キットオブパーツが提供される。

別の態様では、１型アレルギーの治療または予防に使用するための、本明細書に開示される単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアントが提供される。

さらに別の態様では、本明細書に開示される単離アレルゲンタンパク質、またはその断片もしくはバリアント、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、薬学的組成物が提供される。

さらに別の態様では、１型アレルギーの治療または予防のための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される単離アレルゲンタンパク質、またはその断片もしくはバリアント、あるいはアレルゲン組成物、あるいは薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。

カチオン交換クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕｐ７の第１の精製ステップを示す。２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率は、それぞれ実線および斜線で示す。括弧は、さらに精製するためにプールされた画分を示す。サイズ排除クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕｐ７の第２の精製ステップを示す。２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率は、それぞれ実線および斜線で示す。括弧は、さらに精製するためにプールされた画分を示す。抗Ｐｒｕｐ３モノクローナル抗体を使用する親和性免疫吸着クロマトグラフィを含む天然Ｐｒｕｐ７の第３の精製ステップを示す。２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率は、それぞれ実線および斜線で示す。括弧は、さらに精製するために収集した非結合の物質を示す。逆相クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕｐ７の第４の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度およびアセトニトリルのパーセンテージを伴うクロマトグラムはそれぞれ実線および斜線で示す。矢印はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した画分を示し、括弧はさらなる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥは図４ａに示す。レーン７～９には、図４ａの括弧で示した画分が含まれる。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。カチオン交換クロマトグラフィによる組み換えＰｒｕｐ７の第１の精製ステップを示す。２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率は、それぞれ実線および斜線で示す。括弧は、さらに精製するためにプールされた画分を示す。サイズ排除クロマトグラフィによる組換えＰｒｕｐ７の第２の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率を伴うクロマトグラムはそれぞれ実線および斜線で示す。括弧はさらなる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）サイズ排除クロマトグラフィステップからのプールの還元（レーン１）および非還元（レーン２）試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの異なる抗血清希釈でのａ）組換えＰｒｕｐ７、およびｂ）Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物との結合を示す。同じウサギからの免疫前血清を陰性対照として使用した。サイズ排除クロマトグラフィによるＣｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物からのｎＣｕｐｓＧＲＰの精製の第１のステップを示す。２１４ｎｍ（Ａ₂₁₄）での吸光度および導電率は、それぞれ実線および斜線で示す。括弧は、さらに精製するためにプールされた画分を示す。イオン交換クロマトグラフィによるｎＣｕｐｓＧＲＰの精製の第２のステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率を伴うクロマトグラムはそれぞれ実線および点線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの結合について試験した画分を示す。括弧はさらなる精製のためにプールされた画分を示す。ｂ）画分と結合するａｎｔｉ－Ｐｒｕｐ７ＩｇＧのレベルは図９ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥは図９ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｕｐｓＧＲＰの精製の第３のステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度を伴うクロマトグラムは実線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの結合について試験した画分を示し、括弧はさらなる精製のためにプールされた画分を示す。ｂ）画分と結合するａｎｔｉ－Ｐｒｕｐ７ＩｇＧのレベルは図１０ａに示す。ｃ）画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥは図１０ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ｄ）画分のプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥは、図１０ａ（ｎＣｕｐｓＧＲＰ、レーン１）およびｒＰｒｕｐ７（レーン２）に示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ＭＳ／ＭＳによるｎＣｕｐｓＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９のヌクレオチド配列（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。中断された仮想上オープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡおよびＴＡＧ）には下線が引かれている。ｂ）４つのペプチドの整列（Ｐｅｐ１～４）は、ＢＹ８７８０７９によって仮想的にコードされたアミノ酸配列を使用して、ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。予測されるシグナルペプチドには下線が引かれ、終止コドンはアスタリスクで示した。ｃ）アミノ酸を伴うＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｕｐｓＧＲＰのアミノ酸配列は、配列の上に示された２つの多型部位で確認された下線付きのＢＹ８７８０７９の修正版によって仮想的にコードされた配列から逸脱する。ｄ）ＣｕｐｓＧＲＰおよびＰｒｕｐ７のアミノ酸配列の整列。垂直線、コロン、およびピリオドは、それぞれ同一、保存、および半保存の位置を示す。サイズ排除クロマトグラフィによるｎＪｕｎａＧＲＰの第３および最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率を伴うクロマトグラムはそれぞれ実線および斜線で示す。括弧は、クロマトグラムに示した３つの吸光度ピーク（プール１～３）のプールされた画分を示す。ｂ）サイズ排除クロマトグラフィから選択した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１２ａに示す。プール１～３を含むフ画分は、括弧で示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ｃ）棒グラフは、図１２ａに示す３つのプールによるウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ結合のレベルを示す。サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｒｙｊＧＲＰの第３および最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）での吸光度および導電率を伴うクロマトグラムはそれぞれ実線および斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの結合による分析のために選択した画分を示す。括弧は、さらなる精製のためにプールされた画分を示す。ｂ）画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１３ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ｃ）棒グラフは、図１３ａに示す画分によるウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ結合のレベルを示す。ＭＳ／ＭＳによるｎＪｕｎａＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９の修正版のヌクレオチド配列は、精製された７ｋＤａのＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致である。架空のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、修正された以前の終止コドン（ＴＧＹ）、および末端終止コドン（ＴＡＧ）に下線が引かれている。ｂ）４つのペプチドの整列（Ｐｅｐ１～４）は、ＢＹ８７８０７９の修正版によって仮想的にコードされたアミノ酸配列を使用して、ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。予測されるシグナルペプチドには下線が引かれ、終止コドンはアスタリスクで示した。ｃ）アミノ酸を伴うＭＳ／ＭＳによって決定されたＪｕｎａＧＲＰのアミノ酸配列は、下線で示された修正ＢＹ８７８０７９によって仮想的にコードされた配列から逸脱する。ｄ）ＪｕｎａＧＲＰおよびＰｒｕｐ７のアミノ酸配列の整列。垂直線、コロン、およびピリオドは、それぞれ同一、保存、および半保存の位置を示す。ＭＳ／ＭＳによるｎＣｒｙｊＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０のヌクレオチド配列（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。仮想上オープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）コドンには下線が引かれている。ｂ）５つのペプチドの整列（Ｐｅｐ１～５）は、ＢＹ９００４８０によって仮想的にコードされたアミノ酸配列を使用して、ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。予測されるシグナルペプチドには下線が引かれ、終止コドンはアスタリスクで示した。ｃ）ＣｒｙｊＧＲＰのアミノ酸配列はＭＳ／ＭＳによって決定した。ｄ）ＣｒｙｊＧＲＰおよびＰｒｕｐ７のアミノ酸配列の整列。垂直線、コロン、およびピリオドは、それぞれ同一、保存、および半保存の位置を示す。ヒノキ科花粉由来ＧＲＰの配列および電気泳動の比較を示す。ａ）ＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰアミノ酸配列の多整列。すべての配列において同一のアミノ酸を有する位置はアスタリスクで示す。ｂ）上記のアミノ酸配列のマトリックス比較は、配列同一性の割合を示す。ｃ）３つの７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（レーン１）、Ｊ．ａｓｈｅｉ（レーン２）、およびＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ（レーン３）花粉ならびに組換えＰｒｕｐ７（レーン４）から精製された。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は右側に示した。ｒＣｕｐｓＧＲＰａ（レーン１）、ｒＣｕｐｓＧＲＰｂ（レーン２）、精製された天然ＣｕｐｓＧＲＰ（レーン３）、およびｒＰｒｕｐ７（レーン４）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）は左側に示した。４４人のモモアレルギー対象間のｒＰｒｕｐ７およびｎＣｕｐｓＧＲＰとのＩｇＥ結合の比較を示す。アッセイの０．１ｋＵ_A／Ｌ定量限界（ＬｏＱ）を下回る値は、０．１ｋＵ_A／Ｌに設定した。斜線対角線は１：１の勾配を示す。１８人のモモアレルギー対象間のｎＣｕｐｓＧＲＰおよび組換えＣｕｐｓＧＲＰの２つのバリアントとのＩｇＥ結合の比較を示す。ａ）ｒＣｕｐｓＧＲＰａ対ｎＣｕｐｓＧＲＰ、およびｂ）ｒＣｕｐｓＧＲＰｂ対ｎＣｕｐｓＧＲＰ。ｃ）ｒＣｕｐｓＧＲＰｂ対ｒＣｕｐｓＧＲＰａ。斜線対角線は１：１の勾配を示す。４人の異なる対象の血清において、天然および組換えＣｕｐｓＧＲＰｂによるｒＰｒｕｐ７とのＩｇＥ結合の阻害を示す。結果は、希釈緩衝液対照の割合として表される。１８人のモモアレルギー対象間のａ）ｎＪｕｎａＧＲＰおよびｎＣｕｐｓＧＲＰ、ｂ）ｎＣｒｙｊＧＲＰおよびｎＣｕｐｓＧＲＰ、ならびにｃ）ｎＣｒｙｊＧＲＰおよびｎＪｕｎａＧＲＰとのＩｇＥ結合の対比較を示す。斜線対角線は１：１の勾配を示す。ヒノキ花粉に感作された８８人の対象の血清におけるｎＣｕｐｓＧＲＰに対するＩｇＥ抗体の保有率およびレベルを示す。アッセイの０．１ｋＵ_A／Ｌ定量限界（ＬｏＱ）を下回る値（斜垂直線および水平線で示される）は、０．５ｋＵ_A／Ｌに設定した。斜線対角線は１：１の勾配を示す。プロフィリンＢｅｔｖ２、Ｃｏｒａ２、Ｍａｌｄ４、Ｐｒｕａｖ４、Ｐｙｒｃ４、Ａｐｉｇ４、Ｄａｕｃ４、およびＰｈｌｐ１２間の免疫学的および配列比較を示す。ａ）対比較は異なるプロフィリンとのＩｇＥ結合を比較する。斜水平線および垂直線は０．３５ｋＵ_A／Ｌレベルを示し、対角線は１：１の勾配を示す。ｂ）対配列比較は、パーセント配列同一性を示す。ＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰ配列と、これら４つの配列に基づくヒノキ科コンセンサス配列との整列を示す。ＣｕｐｓＧＲＰａのアミノ酸から逸脱するアミノ酸のみは、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰの配列において示される。変動性を示すアミノ酸位置は、他の配列の上部に整列したヒノキ科花粉ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号９）のＸで示される。３７個の既知のＧＲＰ配列の複数の整列を示す。アスタリスクは、比較されたすべての配列の中で系統的に保存されたアミノ酸を示す。ヒノキ科花粉ＧＲＰコンセンサス配列、配列番号９、Ｐｒｕｐ７の配列整列を示す。行Ａにおいて、Ｚで示されるアミノ酸位置は、ヒノキ科花粉ＧＲＰとＰｒｕｐ７との間で異なる。行Ｂにおいて、ヒノキ科花粉とＰｒｕｐ７との間で保存されているが、図２５に示すように整列された３７個の配列間で異なるアミノ酸を示す。行Ｃにおいて、３７個の整列された配列すべての間で保存されているアミノ酸を示す。配列番号５２は、ヒノキ科花粉ＧＲＰ配列とＰｒｕｐ７との間のコンセンサス配列であり、Ｘはこの比較において保存されていないアミノ酸を表す。

定義
本発明の詳細を以下に示す。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の材料および方法を本発明の実施または試験に使用することができるが、次に、好ましい材料および方法を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、記載から明らかになるであろう。記載において、単数形は、別段に文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。

「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、当技術分野においてそれらの通常の意味を有すると解釈されるべきである。別段に明記されない限り、これらの用語は本明細書では互換的に使用される。

「単離」タンパク質とは、その天然環境から単離または除去されたタンパク質を指す。また、ヒトの介入によって生産されており、タンパク質産生環境で共存する材料から実質的に分離されていることも示す。

「単離タンパク質」または「タンパク質」が本明細書で言及される場合はいつでも、これは本明細書でさらに記載される単離タンパク質と配列同一性を有し、起源の全長タンパク質と機能的に同等である、該単離タンパク質の断片またはバリアントを指し得る。「機能的に同等」は、本明細書の他の場所でさらに定義される。

本明細書において、「タンパク質」、「単離タンパク質」、「アレルゲンタンパク質」、「その断片またはバリアント」、「単離アレルゲンタンパク質の断片またはバリアント」、および「アレルゲン」という用語は、は互換的に使用することができ、本開示のすべての文脈および態様で想定される。

「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列が、整列における同じ位置に同じ残基を有する程度に関連し、割合で表される。この点での「整列」は、最大レベルの同一性を達成するために２つ以上の生物学的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を一致させるプロセスまたは結果、アミノ酸配列の場合、類似性の程度および相同性の可能性を評価する目的での保存に関連する。「全体的な」配列同一性を決定するために、その断片またはバリアントと比較したそれぞれの単離タンパク質のアミノ酸配列、またはそれをコードする核酸配列を整列に使用することができる［３８、３９］。

タンパク質の「長さ」は、タンパク質のアミノ酸残基の数である。

本明細書において、タンパク質の「断片」は、起源タンパク質の全長にわたって計算されるように、起源タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する断片を意味すると解釈されるべきである。換言すると、本開示に従うと、全長起源タンパク質のアミノ酸残基の少なくとも８５％が断片において存在する。本明細書に開示されるように、起源タンパク質は、配列番号４に従うアミノ酸配列を有し得る。結果として、本明細書に開示される「断片」は、配列番号４の全長にわたって計算されるように、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し得る。タンパク質断片は、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー配列、またはベクター由来アミノ酸など、それらの産生の結果として追加のアミノ酸をさらに含み得る。

タンパク質の「バリアント」は、バリアントタンパク質の全長にわたって計算されるように、該起源タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアントに関する。起源タンパク質は、配列番号４に従うアミノ酸配列を有し得る。結果として、本明細書に開示される「バリアント」は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し得る。ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）が提供するＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａなど、起源タンパク質とバリアントタンパク質とを整列し、配列同一性を計算するための多数のソフトウェアツールが市販されている。タンパク質バリアントは、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー配列、またはベクター由来アミノ酸など、それらの産生の結果として追加のアミノ酸をさらに含み得る。

本明細書において、タンパク質の「機能的に同等のタンパク質断片またはバリアント」、またはタンパク質の「機能的に同等の断片またはバリアント」に言及する場合はいつでも、これはタンパク質およびその断片またはバリアントが同等のＩｇＥ結合特性を有することを意味することが意図される。より詳細には、起源の単離アレルゲンタンパク質の機能的に同等のバリアントまたは断片であるために：
（ａ）バリアントまたは断片は、起源アレルゲンタンパク質に感作された代表的な患者の血清試料からのＩｇＥ抗体の、起源アレルゲンタンパク質による結合を、緩衝液のみによる模擬阻害と比較して少なくとも５０％阻害する（ＩｇＥ希釈剤、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。バリアントまたは断片のこの特性は、例えば、実施例９に記載されるように、当技術分野で即知の任意の好適な阻害アッセイを使用することによってアッセイすることができる。
（ｂ）バリアントまたは断片は、起源アレルゲンタンパク質と実質的に同じレベルでＩｇＥ抗体と結合する。結合レベルは、例えば、実施例８に記載されるように、バリアントまたは断片を固相に固定化し、個々の血清のＩｇＥ反応性を測定し、測定されたＩｇＥ反応性を起源単離アレルゲンタンパク質のＩｇＥ反応性と比較することによって測定することができる。この定義の目的について、「実質的に同じレベル」とは、バリアントの結合レベルが起源タンパク質の結合レベルと最大で２５％、２０％、１５％、１０％、または５％異なることを意味すると解釈されるべきである。
（ｃ）バリアントまたは断片には、ヒノキ科ＧＲＰコンセンサス配列のすべての保存アミノ酸が含まれる（すなわち、配列番号９；保存アミノ酸については図２６を参照されたい）：
（ｄ）（ｉ）それがバリアントである場合、バリアントは、配列番号４と比較して交換される９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基（複数可）など、配列番号４と比較して交換される最大９個のアミノ酸残基を有するか、または
（ｉｉ）それが断片である場合、断片は、配列番号４と比較して削除される９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基（複数可）など、配列番号４と比較して削除される最大９個のアミノ酸残基を有するか、または
（ｉｉｉ）それがバリアントおよび断片の組み合わせである場合、バリアントおよび断片の組み合わせは、配列番号４と比較して最大９個のアミノ酸残基の交換または削除を有する。

実施例１０および１２は、交差反応性に起因するアレルゲンタンパク質のＩｇＥ結合が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するアレルゲンタンパク質間で非常に類似していることを示している。互いに少なくとも８０％、例えば、９０％以上の配列同一性を有する相同タンパク質は、著しく類似したＩｇＥ反応性を示す。

アミノ酸配列の特定の位置にあるアミノ酸残基は、該位置のアミノ酸残基が、比較された整列タンパク質配列間で同一である場合、同じタンパク質ファミリーの異なるタンパク質間で「系統的に保存された」、時には単に「保存された」と記される。したがって、異なるタンパク質間で「保存されていない」アミノ酸残基は、比較したタンパク質配列間で同一ではない。保存されていないアミノ酸残基は、比較されるタンパク質配列にわたって「系統的に制限された」または「系統的に制限された変動性」を有し得、これは、特定の位置におけるアミノ酸が、例えば、ＧＲＰタンパク質ファミリーからの類似のタンパク質の群の系統的比較で見出される制限された数のアミノ酸からなる群から選択されることを意味することが意図される。

「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、外来遺伝物質を別の細胞に人工的に運び、そこで複製および／または発現させることができるビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子に関する。

「宿主細胞」は、目的のタンパク質、断片またはバリアントを発現するために本明細書に開示されるベクターによって形質転換されている細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞に関する。

タンパク質「アイソフォーム」は、高い類似性を有するタンパク質の群のメンバーであり、単一遺伝子の対立遺伝子バリアントまたは遺伝子ファミリーの非同一メンバーに由来し、遺伝的差異から生じる。多くのアイソフォームは、同じまたは類似の生物学的機能を実行する。

詳細な記載
本明細書で前述したように、本発明者らは、Ｐｒｕｐ７によって媒介される重度のモモアレルギーに対する一次感作物質であると考えられる、Ｐｒｕｐ７に対応するヒノキ科花粉タンパク質を初めて特定することに成功した（実施例８に提示した結果を参照されたい）。天然起源からの高純度のＰｒｕｐ７の単離は、真に特異的な抗Ｐｒｕｐ７ウサギ抗血清を得るための前提条件であった。Ｐｒｕｐ７タンパク質は、Ｐｒｕｐ３と同様の生化学的特性を有するので、Ｐｒｕｐ３の市販の調製物におけるＰｒｕｐ７混入の実証によって証明されるように［３４］、Ｐｒｕｐ３を除去するための生体特異的親和性吸着、および他の共精製タンパク質を除去するための逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）のステップなど、本目的のために精巧な精製方法を開発した（実施例１を参照されたい）。高度に精製された天然Ｐｒｕｐ７調製物を用いてウサギを免疫化することによって得られた抗Ｐｒｕｐ７抗血清をさらに使用して、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉｃａｊａｐｏｎｉｃａ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉ花粉抽出物の溶出画分においてＰｒｕｐ７相同体を検出できる。以前に本明細書で言及したＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓからの以前に報告された１４ｋＤａのＢＰ１４タンパク質を考慮して予想され得たこととは対照的に、ウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ抗体は、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物、ならびにＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉおよびＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの花粉抽出物において７ｋＤａタンパク質（すなわち、ＢＰ－１４の半分のサイズのタンパク質）のみを検出した。特定されると、これらのタンパク質は、質量分析による分析ならびに生化学的および免疫学的特性評価のために均一に精製され得る。

Ｎ末端配列決定データ、各調製物の異なる酵素消化からのＭＳ／ＭＳデータ、および反復プロセスにおけるＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａからの中断／不完全なＥＳＴ配列を組み合わせることにより、７ｋＤａタンパク質の完全なアミノ酸配列は、ＣｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉから一緒に推定／当惑され得る。ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａからのＰｒｕｐ７相同体の完全な配列は、ＥＳＴデータベースにおけるＭＳ／ＭＳデータを分析することによって決定された。３つの天然ヒノキ科花粉アレルゲン間の免疫学的類似性は、実施例１０で証明され、論じられる。

本プロジェクトの別の必要条件は、正確に折りたたまれた免疫反応性組換えＧＲＰアレルゲンを実用的に有用な量で産生するための方法論の開発であった。これは、ｒＰｒｕｐ７およびｒＣｕｐｓＧＲＰの産生のための様々な発現系、ベクタークローニングバリアント、および発酵戦略の調査を伴う。異なる標準的な手順に従ういくつかの最初の試みは、生化学的および免疫学的に欠陥のあるタンパク質産物を生成したが、最終的に精巧に作られた方法論は、品質とおよび収量の両方に関して非常に成功した。

本明細書で確立および開示されたＣｕｐｓＧＲＰの配列に基づいて、組換えＣｕｐｓＧＲＰはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生され、天然精製タンパク質と同様の生化学的特性およびＩｇＥ反応性を有することが示された。組換えタンパク質は、Ｐｒｕｐ７とのＩｇＥ結合を阻害し、モモタンパク質Ｐｒｕｐ７とＣｕｐｓＧＲＰとの間に交差反応性があり、後者が一次感作物質として作用し得ることを示す。

このタンパク質の特定とそれに続くその組換え産生は、１型アレルギーの新しくかつ改善された診断への道を築く。重度のモモアレルギーとヒノキ科花粉症との関連が確立されているため、現在開示されている所見は、花粉および食物アレルギーの両方の診断、治療、および／または予防に応用できるであろう。

本明細書で言及したように、何年にもわたって、花粉からジベレリン制御性タンパク質ファミリーのアレルゲンタンパク質を特定し、単離し、特徴づける多くの試みがあった。このタンパク質ファミリーの花粉アレルゲンの重要性についての推測された理解にもかかわらず、本開示がかかるタンパク質の完全な配列を首尾よく単離および記載することに成功するまで、だれも実施してこなかった。本明細書で言及したように、配列情報の断片は以前に報告されているが、完全な配列、タンパク質の構造およびそれが同じタンパク質ファミリーの他のメンバーとどのように比較されるかを理解するための、ならびに診断および治療用途のための組換えタンパク質を生成するための必要条件は、依然として明らかにされていない。

これまでの進展の欠如は、花粉からこのタンパク質ファミリーのタンパク質を特定および単離することの難しさを示している。特に、本発明者らは、この問題を解決する方法を発見した。例として、本明細書に記載のタンパク質の完全な詳細の供給をもたらす機能的な実験プロトコル、ならびに単離および特徴づけのプロセスを通して得られた発見を取得して適用する方法を特定するには、実質的な発明の要点が必要であった。しかしながら、最終的に、アレルゲンタンパク質は、本明細書でさらに示され、記載されるように、単離され、評価され、利用された。

したがって、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号４に従うアミノ酸配列を含むか、または機能的に同等のそのタンパク質断片もしくはバリアントが、少なくとも８５％の配列番号４との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質が提供される。さらに、該配列番号４との配列同一性は、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。

単離タンパク質は、本明細書において、相同性の高いタンパク質であるＣｕｐｓＧＲＰ（タンパク質アイソフォームａ（配列番号４）およびタンパク質アイソフォームｂ（配列番号５））、ＪｕｎａＧＲＰ（配列番号６）およびＣｒｙｊＧＲＰ（配列番号８）によって表され、例示されている。

Ｐｒｕｐ７（Ｐｒｕｐ７）のアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
〔配列表１〕

配列番号１（ｎＰｒｕｐ７）

ＣｕｐｓＧＲＰａのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
〔配列表２〕

配列番号４（ＣｕｐｓＧＲＰａ）

ＣｕｐｓＧＲＰｂのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
〔配列表３〕

配列番号５（ＣｕｐｓＧＲＰｂ）

ＪｕｎａＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
〔配列表４〕

配列番号６（ＪｕｎａＧＲＰ）

ＣｒｙｊＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
〔配列表５〕

配列番号８（ＣｒｙｊＧＲＰ）

以下の実施例１３に記載および示されるように、ヒノキ科－Ｐｒｕｐ７ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号５２）が設計されており、本明細書に開示される。配列番号５２に従う該コンセンサス配列において、アミノ酸が本明細書に開示される異なるヒノキ科花粉ＧＲＰ間で変化する位置（すなわち、ＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰ）、ならびにアミノ酸が本明細書に開示されるヒノキ科花粉ＧＲＰとモモＧＲＰとの間で変化する位置（すなわち、Ｐｒｕｐ７）が、Ｘで示される（図２６）。図２６の行Ａにおいて、アミノ酸が本明細書に開示されるヒノキ科花粉ＧＲＰとモモＧＲＰとの間で変化する位置（すなわち、Ｐｒｕｐ７）が、Ｚで示される。
〔配列表６〕

したがって、本開示は、単離アレルゲンタンパク質であって、該タンパク質が、配列番号５２に従う以下のアミノ酸配列を含み、
〔配列表７〕

ここで、位置Ｘのうちの最大９つ、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つには、表３で定義される任意のアミノ酸が含まれ、
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸が、配列番号４の対応する位置のアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

特に、本開示は、単離アレルゲンタンパク質であって、該タンパク質が、配列番号５２に従う以下のアミノ酸配列を含み、
〔配列表８〕

ここで、位置Ｘのうちの最大４つには、表３で定義される任意のアミノ酸が含まれ、
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸が、配列番号４の対応する位置のアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

表３に列挙されるアミノ酸残基は、配列番号５２の位置Ｘにおいて系統的に制限された変動性を有するアミノ酸残基であることに留意されたい。

さらに提供されるのは、それぞれ、配列番号５、６、または８の機能的に同等のタンパク質断片またはバリアントであり、該断片またはバリアントは、配列番号５、配列番号６、または配列番号８とそれぞれ少なくとも８５％の配列同一性を有する。さらに、該配列番号５、６、または８との配列同一性は、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。

ヒノキ科ファミリーからのこれらの例示された単離タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるように、最大７つのアミノ酸位置においてのみ互いに異なる。上記のファミリーメンバー間の相違性および類似性を示す配列整列を図２４に示す。本明細書の実施例１０において、少なくともこれらの位置でアミノ酸残基を変化させても、それらの意図された目的のためのタンパク質の機能性に影響を及ぼさないことが証明された。したがって、それにより、アミノ酸配列におけるある程度の構造的柔軟性が示され、これは、配列番号４によって示される単離タンパク質の機能的に同等のバリアントまたは断片が想定され、本開示の文脈において有用であることが証明されることを意味する。本明細書に提示される配列番号４に従う単離タンパク質の機能的に同等のバリアントまたは断片の定義は、本明細書の他の場所に記載される。

したがって、本明細書はさらに、単離アレルゲンタンパク質であって、該タンパク質が、配列番号９に従う以下のアミノ酸配列を含み、
〔配列表９〕

ここで、任意の位置Ｘが、ＸがＣではないという条件で、任意のアミノ酸を含む、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

本明細書において、配列番号９または配列番号５２における位置Ｘ（のうちのいずれか）が「任意のアミノ酸」を含み得ると述べる場合、この表現は、任意の天然または非天然起源アミノ酸を意味することを意図する。特に、本明細書では、配列番号９または配列番号５２における位置Ｘ（のうちのいずれか）が任意の天然起源アミノ酸を含み得ることが開示される。

配列番号９は、本明細書で特定された単離タンパク質を表すヒノキ科花粉ＧＲＰコンセンサス配列の例と見なすことができ、該最大７つのアミノ酸位置（位置２、１８、３１、３４、４１、４６、および５２）において、アミノ酸残基が、ＸがＣではないという条件で、およびかかるタンパク質が、本明細書の他の場所に記載される意図された目的に関して、起源タンパク質と機能的に同等の活性を維持するという条件で、任意の他のアミノ酸について１つ以上の位置で変動、すなわち交換することができる。本明細書では、同じ配列類似性を有するが、追加または代替のアミノ酸残基が変動し、該バリアントが起源タンパク質と同じ機能的活性を維持する、すなわち、該バリアントが、起源タンパク質、または上記の７つの位置でのアミノ酸が本明細書でさらに記載されるように変動しているタンパク質と機能的に同等である、配列番号４の他のバリアントも想定される。本明細書には、配列番号９に従う単離タンパク質の機能的に同等の断片も提供される。

実施例１３に示されるように、該７つのアミノ酸位置Ｘにおいて、アミノ酸は、系統的に制限されたアミノ酸からなる群から選択されることが想定される。

図２５によれば、以下のアミノ酸が、配列番号９の各位置Ｘにおいて系統的に好ましい：
位置２：ＡＥＳＤＴＬＹ
位置１８：ＹＬＩＶＦＭＲ
位置３１：ＥＤＱＡＧＳＫ
位置３４：ＱＮＨＫ
位置４１：ＹＦＡＳ
位置４６：ＥＶＡＱ
位置５２：ＤＥＮ

位置Ｘにおいて上記で開示される好ましいアミノ酸残基はすべて、系統的に制限された相互の変動性を有し、図２５に整列された既知のＧＲＰ配列に見られるものと一致している。

さらに、ヒノキ科花粉ＧＲＰタンパク質の配列によれば、以下のアミノ酸が、配列番号９の各位置Ｘにおいて系統的に好ましい：
位置２におけるＸが、ＱもしくはＨであり、
位置１８におけるＸが、ＡもしくはＬであり、
位置３１におけるＸが、ＫもしくはＥであり、
位置３４におけるＸが、ＨもしくはＮであり、
位置４１におけるＸが、ＡもしくはＹであり、
位置４６におけるＸが、ＶもしくはＳであり、および／または
位置５２におけるＸが、ＨもしくはＮである。

該上記に開示されるアミノ酸残基は、系統的に制限された変動性を有し、図２４の整列に示されるように、ヒノキ科花粉ＧＲＰ、すなわち、ＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰに見られるものと一致する。

したがって、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大６つ、例えば、５、４、３、２、または１つが、ＸがＣではないという条件で、任意のアミノ酸を含み、
残りの位置Ｘ（複数可）において、アミノ酸が、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、もしくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、もしくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、もしくはＱのうちのいずれか１つから選択され、および／または
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、もしくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

特に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、または１つが、ＸがＣではないという条件で、任意のアミノ酸を含み、
残りの位置Ｘ（複数可）において、アミノ酸が、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、もしくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、もしくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、もしくはＱのうちのいずれか１つから選択され、および／または
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、もしくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

さらに、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大６つ、例えば、５、４、３、２、または１つが、ＸがＣではないという条件で、任意のアミノ酸を含み、
該残りの位置Ｘにおいて、該アミノ酸が、
位置２におけるＸが、ＱまたはＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、ＡまたはＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、ＫまたはＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、ＡまたはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、ＶまたはＳのうちのいずれか１つから選択され、および
位置５２におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

特に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、または１つが、ＸがＣではないという条件で、任意のアミノ酸を含み、
該残りの位置Ｘにおいて、該アミノ酸が、
位置２におけるＸが、ＱまたはＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、ＡまたはＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、ＫまたはＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、ＡまたはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、ＶもしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、および
位置５２におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

より詳細には、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、位置Ｘにおいて、該アミノ酸が、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、もしくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、もしくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、および／または
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、もしくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

さらに、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、
位置２におけるＸが、ＱもしくはＨであり、
位置１８におけるＸが、ＡもしくはＬであり、
位置３１におけるＸが、ＫもしくはＥであり、
位置３４におけるＸが、ＨもしくはＮであり、
位置４１におけるＸが、ＡもしくはＹであり、
位置４６におけるＸが、ＶもしくはＳであり、および／または
位置５２におけるＸが、ＨもしくはＮである、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

さらに、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、または１つが、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、もしくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、もしくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、および／または
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、もしくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択されるアミノ酸を含み、
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸が、配列番号４の対応する位置のアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

より詳細には、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、または１つが、
位置２におけるＸが、ＱもしくはＨであり、
位置１８におけるＸが、ＡもしくはＬであり、
位置３１におけるＸが、ＫもしくはＥであり、
位置３４におけるＸが、ＨもしくはＮであり、
位置４１におけるＸが、ＡもしくはＹであり、
位置４６におけるＸが、ＶもしくはＳであり、および／または
位置５２におけるＸが、ＨもしくはＮである、単離アレルゲンタンパク質が提供される。

詳細には、本開示は、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号８に従うアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる単離アレルゲンタンパク質をさらに提供する。

本明細書に記載のタンパク質はまた、起源配列に化学的に修飾されたアミノ酸を付加することができ、これは、側鎖が化学的に修飾されているアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、フルオロフォアまたは放射性標識などのシグナル伝達部分を含むように修飾され得る。側鎖は、チオール、カルボン酸、またはアミノ基などの新しい官能基を含むように修飾され得る。翻訳後修飾されたアミノ酸も、化学的に修飾されたアミノ酸の定義に含まれる。

本明細書を通して開示される単離タンパク質、そのバリアントまたは断片は、組換え的に産生され得る。一般に、研究、診断または他の用途におけるアレルゲンタンパク質の実用的な利用は、組換え形態でのそれらの利用可能性によって大いに促進される。アレルゲンタンパク質が特定され、そのアミノ酸配列が確立されると、それは周知の方法を使用して組換えタンパク質として産生することができる［４０］）。しかしながら、教科書的な例として挙動しない困難な場合において、有用な量の機能性タンパク質を得るという目標を達成するために、発現系構成、培養方法、および／または精製戦略を広範に適応させるか、さらには新たに開発する必要性があり得る。かかる広範な適応をどのように達成するかは、当業者にとってさえ容易に予見することはできない。タンパク質をコードする遺伝子は、アレルゲン起源物質から調製されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの形態でクローン化するか、または所望のＤＮＡ配列に従って合成することができる。同じアミノ酸を指定する最大６つの異なるコドンを有する遺伝暗号の冗長性により、所与のアミノ酸配列は、多数の同義ＤＮＡ配列によってコード化することができる。必要に応じて、タンパク質への機能的な追加または修飾は、合成遺伝子の設計を通じて、部位特異的変異誘発によって、またはクローニング戦略の一部として導入することができる。目的のアレルゲンをコードする遺伝子は、様々な異なる発現ベクターのうちのいずれかにクローン化され、様々な原核生物または真核生物の発現宿主のうちのいずれかに導入される［４０］。一般的な発現宿主には、グラム陰性菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来する昆虫細胞株、ならびに哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されない。

組換えタンパク質は、可溶性もしくは不溶性の形態で細胞内に発現されるか、または培養培地に分泌され得る。組換えタンパク質の回収および精製は、様々な周知の方法またはそれらの組み合わせによって実施することができる。一般的なクロマトグラフィ技術には、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィが含まれる。

本明細書に提示される単離タンパク質は、組換え的に産生される場合、特定の目的のために意図的に修飾され得、それにより、例えば、抗体結合特性に関してタンパク質に機能的に影響を与えることなく、非天然起源タンパク質をもたらす。非天然起源タンパク質は、発現レベルまたは溶解性を高めるために別のタンパク質と融合された組換えタンパク質であり得る。かかる融合パートナーの例には、チオレドキシン（ＴＲＸ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。別の例は、タンパク質を培養培地に分泌することを可能にするシグナルペプチドの添加であり、そこからそれを可溶性形態で容易に回収することができる。非天然起源タンパク質はまた、短いペプチドタグが親和性精製を可能にする目的で該タンパク質に遺伝的に移植されている組換えタンパク質であり得る。かかるペプチドタグの例には、金属イオン親和性を付与するためのヘキサヒスチジン、または抗ヘマグルチニン、抗ｃ－ｍｙｃもしくは抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体などの特定の抗体のためのペプチドエピトープが含まれる。

組換えタンパク質へのかかる付加物の分離および削除を可能にするために、部位特異的タンパク質分解切断のための短いペプチド配列を、目的のタンパク質と融合パートナーまたはペプチドタグとの間に挿入することができる。タンパク質分解酵素のかかる標的部位の例には、エンテロキナーゼのＤＤＤＤＫ、第Ｘａ因子のＩＥＧＲ、ＴＥＶプロテアーゼのＥＮＬＹＦＱＡ、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるインビボプロセシングのためのＫｅｘ２／Ｓｔｅ１３のＥＫＲＥＡＥＡＥＦが含まれる。かかる標的配列のいくつかのアミノ酸残基は、切断後に、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌発現の場合、ＥＡＥＦＥＦまたはその一部が残存し得る。

本明細書に開示される単離タンパク質、断片またはバリアントをコードする単離核酸分子もまた本明細書に提供される。単離核酸は、配列番号１０によってコードされ得る。配列番号１０は、コンセンサスヒノキ科アミノ酸配列（すなわち、配列番号９）をコードする縮重ＤＮＡ配列であり、これは、本明細書に記載のＣｕｐｓＧＲＰａ、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰ配列、すなわち、ＩＵＰＡＣ多義性コードに従った同義のコドンおよびバリアントを含む、本明細書に開示される単離タンパク質に基づく。配列番号１０に従うコンセンサスヒノキ科核酸配列は、ＣｕｐｓＧＲＰａアミノ酸配列（すなわち、配列番号４）から開始し、逆翻訳され、同義コドンを含み、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、および／またはＣｒｙｊＧＲＰがＣｕｐｓＧＲＰａアミノ酸配列と異なる７つのアミノ酸位置を考慮して構築された。７つの可変アミノ酸位置をコードするヌクレオチドは、以下の太字のテキストでマークアップされる。

配列番号１０、すなわちヒノキ科コンセンサス核酸配列：
〔配列表１０〕

ここで、
Ｎ＝Ｔ、Ｃ、Ａ、またはＧ；
Ｒ＝ＡまたはＧ；
Ｈ＝Ｔ、Ｃ、またはＡ；
Ｙ＝ＴまたはＣ；
Ｍ＝ＣまたはＡ；
Ｗ＝ＴまたはＡ；
Ｓ＝ＧまたはＣ；
Ｂ＝Ｃ、Ｇ、またはＴ；
Ｋ＝ＧまたはＴ；および
Ｄ＝Ａ、Ｇ、またはＴ。

本明細書には、以下の核酸配列も提供される：
配列番号５０、すなわち、ＣｕｐｓＧＲＰａが逆翻訳され、同義コドンを考慮する：
〔配列表１１〕

配列番号５１、すなわち、ＣｕｐｓＧＲＰａが逆翻訳され、７つの可変アミノ酸位置（太字でマークアップ）をコードするヌクレオチドが、ＣｕｐｓＧＲＰｂ、ＪｕｎａＧＲＰ、および／またはＣｒｙｊＧＲＰに存在するアミノ酸をコードするヌクレオチドに変更されている：
〔配列表１２〕

配列番号５０および配列番号５１において、可変ヌクレオチドは、上記で定義されたように、配列番号１０におけるものと同じ意味を有する。

本明細書には、配列番号１０、５０、もしくは５１のうちのいずれか１つに従う核酸配列、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、それと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む核酸分子も提供される。

本明細書に開示される単離核酸分子を含む、ベクターまたは発現ベクターも提供される。単離核酸分子は、本明細書に開示される単離タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードし得、したがって、本明細書に開示される任意の核酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

さらに、本明細書に記載のベクターまたは発現ベクターを含む、単離宿主細胞も提供される。本明細書で前述したように、該ベクターまたは発現ベクターは、本明細書の他の場所に開示されているように、単離タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸分子を含む。

アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、本明細書に記載の単離タンパク質または機能的に同等の断片もしくはバリアントを追加するステップを含む、方法が提供される。かかる方法によって得られるアレルゲン組成物も提供される。かかるアレルゲン組成物は、本明細書に提示されるように、単離タンパク質、その断片、またはバリアントに「スパイク」することができる。かかるアレルゲン組成物は、アレルゲン抽出物、または本明細書に提示される単離タンパク質を含まないかもしくは低い含有量を有する精製または組換えアレルゲン成分の混合物であり得、単離タンパク質、その断片またはバリアントは、ＩｇＥが他の方法ではアレルゲン組成物と結合しないか、または不十分に結合する患者からのＩｇＥと結合するために、該アレルゲン組成物に追加（すなわち、アレルゲン組成物が「スパイク」される）される。したがって、この態様は、かかる組成物を産生するための方法に関し、方法は、アレルゲン抽出物（任意に他の成分をスパイクすると言及したように）または精製された天然または組換えアレルゲン成分の混合物などのアレルゲン組成物に該タンパク質を追加するステップを含む。本明細書に記載の単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアント、ならびにアレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含むアレルゲン組成物も提供される。

本明細書では、１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための、単離タンパク質またはその機能的に同等の断片もしくはバリアントの使用も提供される。

明細書では、該１型アレルギー症状がヒノキ科種の花粉によって誘発される場合の使用も提供される。さらに、該１型アレルギーが、モモ、アプリコット、プラム、柑橘系果物またはザクロなどの食物によって誘発される症状を伴う花粉関連食物アレルギーである場合の使用も提供される。

ヒトまたは動物検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出または測定は、いくつかの異なる方法で実行できるが、通常、問題のアレルゲンと結合する抗体を捕捉する最初のステップと、それに続く非結合抗体を除去するための洗浄ステップ、ＩｇＥ検出試薬を適用するステップ、非結合のかかる試薬を除去するための洗浄ステップ、およびＩｇＥ検出試薬からのシグナルを生成して記録する最終ステップが含まれる。アレルゲンは、アレルゲン特異的抗体を捕捉するために固体または可溶性の支持体に固定化するか、またはかかる複合体のその後の捕捉および定量化のために溶液中の抗体と複合体を形成することができる。アレルゲン検出試薬は、通常、レポーター物質または蛍光法または比色法で定量可能な生成物の形成を触媒することができる酵素のいずれかと結合したモノクローナル抗体である。アレルゲン特異的抗体を測定するためのアッセイには、一次応答単位を抗体濃度単位に変換できる較正システムも含まれる。同じアッセイ原理が他のアイソタイプのアレルゲン特異的抗体の測定にも適用されるが、唯一の違いは使用される検出試薬の特異性である。

さらに、本明細書では、１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための方法であって、１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、本明細書に記載の単離アレルゲンタンパク質、またはその断片もしくはバリアントと接触させるステップと、該試料において、該タンパク質、その断片またはバリアントと特異的に結合する抗体、例えば、ＩｇＥ抗体などの存在を決定するステップと、を含み、該タンパク質と特異的に結合する該試料中の抗体の存在が、該対象における１型アレルギーに関して有益である、方法が提供される。ＩｇＥ抗体が該試料中に存在し、該タンパク質と特異的に結合する一実施形態では、これは、該対象におけるＩ型アレルギーを示す。

体液試料は、対象からの血液または血清試料であり得、該体液試料は、該対象試料が、単離タンパク質、そのバリアント、または断片と特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むかを決定するために、単離タンパク質、またはその断片もしくはバリアント、または該タンパク質、またはその断片もしくはバリアントを含む組成物と接触させる。

本明細書で言及される任意の単離タンパク質の断片またはバリアントは、起源タンパク質と機能的に同等である天然または人工的な断片またはバリアントであり得る。

キットオブパーツであって、可溶性または固体支持体に固定化された、単離アレルゲンタンパク質、または断片もしくはバリアントを含み、該キットが、任意に、検出試薬および／または使用説明書をさらに含む、キットオブパーツがさらに提供される。固体支持体は、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、およびプラスチックの群から選択することができ、ならびに／またはマイクロアレイチップ、もしくは当技術分野で利用可能な他の任意の好適な固体支持体である。

本明細書の他の場所で言及されるように、キットは、固定化されたタンパク質と結合したＩｇＥ抗体などの抗体と結合することができる検出剤もさらに含み得る。かかる検出剤は、例えば、免疫アッセイの分野で即知である、色素、フルオロフォアまたは酵素などの検出可能な標識で標識された抗ＩｇＥ抗体であり得る。

タンパク質およびペプチドの固定化に好適な支持体は当技術分野で周知であり、本明細書では、この態様において、タンパク質またはタンパク質断片の免疫原性に実質的な程度で悪影響を及ぼさない任意の支持体が含まれる。この文脈において、「固定化された」という用語は、特定の支持体に好適な任意の種類の付着物であり得ることが理解される。単離タンパク質またはタンパク質断片は、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ、ＥｌｉＡ、またはＶａｒｅｌｉｓＡなどの診断方法での使用に好適な固体支持体に固定化することができる。代替的に、タンパク質またはタンパク質断片は、溶液中の１つ以上の樹状突起構造など、溶液中の天然または合成ポリマー構造に固定化され得る。

標識または標識要素が提供されている、本明細書に記載の単離タンパク質、その断片またはバリアントもまた本明細書に提供される。したがって、本明細書には、光発光標識、蛍光標識またはリン光標識、化学発光標識または放射線ルミネセンス標識などの発光標識が提供されているタンパク質またはタンパク質断片もしくはバリアントも提供される。親和性機能などの特定され得る要素で誘導体化された単離タンパク質、その断片もしくは誘導体もまた、本開示に含まれる。タンパク質およびペプチドの標識のための親和性機能は当技術分野で周知であり、当業者は、ビオチンなどの任意の好適な機能を選択することができるであろう。

１型アレルギーの治療または予防に使用するための、単離タンパク質またはその機能的に同等の断片もしくはバリアントもまた本明細書で提供される。１型アレルギーは、ヒノキ科種の花粉によって引き起こされ得、および／またはモモ、アプリコット、プラム、柑橘系果物、またはザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うヒノキ科の花粉関連の食物アレルギーであり得る。同様に、１型アレルギーの治療または予防のための薬剤の製造において、本明細書に開示される単離タンパク質または機能的に同等の断片もしくはバリアントの使用も提供される。１型アレルギーは、ヒノキ科種の花粉によって引き起こされ得、および／またはモモ、アプリコット、プラム、柑橘系果物、またはザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うヒノキ科の花粉関連の食物アレルギーであり得る。

本明細書では、薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、単離タンパク質またはその機能的に同等の断片もしくはバリアント、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、薬学的組成物がさらに提供される。

本明細書における薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。各成分は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「薬学的に許容される」ものである必要がある。また、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織または臓器と接触して使用するのに好適である必要がある。

本明細書では、１型アレルギーの治療または予防のための方法も本明細書であって、薬学的有効量の、本明細書に記載の単離タンパク質、その断片もしくはバリアント、アレルゲン組成物、または該単離タンパク質、その断片もしくはバリアントを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。免疫療法におけるタンパク質、そのバリアントまたは断片の使用には、例えば成分分解免疫療法が含まれる［４１］。単離タンパク質は、その天然の形態で、または天然のタンパク質と同様の生化学的および免疫学的特性を示す組換え形態で使用することができる。単離タンパク質は、化学的または遺伝的に生成される修飾形態で使用され得る。単離タンパク質への修飾の例には、タンパク質の断片化、トランケーション、タンデマー化（ｔａｎｄｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）もしくは凝集、内部セグメントの削除（複数可）、アミノ酸残基の置換（複数可）、ドメインの再配置、またはジスルフィド架橋の破壊もしくは別の高分子構造もしくは他の低分子量化合物へのその結合による三次構造の少なくとも一部の破壊が含まれるが、それらに限定されない。

本明細書に開示される薬学的組成物の任意の好適な投与方法が、単離タンパク質の投与の目的に応じて使用することができる。投与の用量およびタイミングは、治療される対象に適切であるとして医師によって決定されるであろう。

本明細書の他の場所で言及されているように、タンパク質はその天然起源から精製することができる。それはまた、組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、または当業者に即知である方法によって、または本出願に記載されるように化学的に合成され得る。

本明細書では、該１型アレルギーが、ヒノキ科種の花粉によって引き起こされる１型アレルギーであり、および／またはモモ、アプリコット、プラム、柑橘系果物、またはザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うヒノキ科の花粉関連の食物アレルギーである、方法がさらに提供される。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものと見なされるべきではない。

実験セクション
表
以下の表１は、本開示の一部である配列表による配列番号、および該配列の対応する定義／名称を特定する。

表２：ａ）ｎＣｕｐｓＧＲＰ、ｂ）ｎＣｕｐｓＧＲＰのアイソフォームバリアント、ｃ）ｎＪｕｎａＧＲＰ、およびｄ）ｎＣｒｙｊＧＲＰのＭＳ／ＭＳ分析で特定されたペプチド配列のリスト。列１はペプチドの配列を示し、列２は対応する配列番号、列３は統計的有意性値－ｌｏｇＰ、列４はＤａでのペプチドの実験的に決定した質量（Ｍ／Ｚ－１．００７９４）、列５は実験的に決定した生物学的または実験的修飾の質量補正（ＰＴＭ）、列６はペプチドの理論的に計算した質量、列７～８はペプチドが表す成熟タンパク質のアミノ酸配列の開始位置および終了位置、列９は分析したペプチド中に存在する修飾である。ＭＳ／ＭＳ分析の前に、すべてのシステイン残基がプロピオンアミド残基に修飾された結果、システイン残基当たり７１．０３７１２Ｄａの質量が増加した。いくつかのペプチドでは、以下の列９に示すように、末端グルタミン酸のアミド化が発生し、０．９８４Ｄａの質量の減少を引き起こした。このＭＳ／ＭＳ分析の文脈では、生物学的または実験的なアミノ酸修飾はＰＴＭと称される。

表３は、配列番号５２の位置Ｘにおいて系統的に制限された変動性を有するアミノ酸、すなわち、２１個の可変位置を有するヒノキ科－Ｐｒｕｐ７ＧＲＰコンセンサス配列を特定する。

位置１、３、４、７、８、１０、１１、１７、１９、２０、４４、５１、５９、および６０におけるアミノ酸は、本明細書に開示される４つのヒノキ科ＧＲＰタンパク質間で保存されているが、Ｐｒｕｐ７の対応する位置のアミノ酸とは異なる。該位置は、図２６の行ＡではＺで示されるが、配列番号５２ではＸで示される。

位置２、１８、３１、３４、４１、４６、および５２におけるアミノ酸は、本明細書に開示される４つのヒノキ科ＧＲＰタンパク質間で異なる。該位置は、配列番号９および配列番号５２の両方においてＸで示される。

別段に明記されない限り、すべてのフィルター、クロマトグラフィ媒体、および機器は、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手した。

実施例１：缶詰のモモからの天然Ｐｒｕｐ７の調製
天然Ｐｒｕｐ７の精製
天然Ｐｒｕｐ７は、４つのクロマトグラフィステップを使用して缶詰のモモから精製した。換言すると、缶詰のモモを１３０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５の台所用ブレンダーで混合し、４°Ｃで粉砕球（ＨａｌｄｅｎｗａｎｇｅｒＭＴＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）と攪拌しながら２時間インキュベートした。抽出物を遠心分離によって清澄化し、濾過し、１３０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに負荷した。洗浄および溶出は、１３０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５でそれぞれ０．１５および０．５ＭのＮａＣｌの均一濃度ステップで実施した（図１）。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、顕著な７ｋＤａバンドを含むその画分をプールして、２０ｍＭＮａＰＯ₄、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃ ｐＨ７．４で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５調製グレード（ｐｇ）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムに適用した。溶出を平衡化緩衝液（図２）を用いて実施し、顕著な７ｋＤａバンドを含む画分をプールした。

Ｐｒｕｐ７と同様のサイズおよび等電点を有するＰｒｕｐ３の残留量を特異的に除去するために、生物特異的親和性吸着ステップを適用した。この目的のために、Ｐｒｕｐ３抗体に対する独自のモノクローナル抗体をＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムと結合させた。ＳＥＣプールを、２０ｍＭＮａＰ_i ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃で平衡化した抗Ｐｒｕｐ３親和性カラムに適用した。平衡化緩衝液で溶出した後（図３）、未結合の物質を収集し、０．１％ＴＦＡで平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）カラムに適用した（図４ａ）。結合タンパク質は、０～５５％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し（図４ｂ）、純粋な７ｋＤａのバンドを含む画分を図４ａに示すようにプールし、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上で２０ｍＭＭＯＰＳ、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ７．６に脱塩した。

ｎＰｒｕｐ７の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）
天然Ｐｒｕｐ７のプールは、トリプシンまたはキモトリプシンのいずれかによる還元、アルキル化、および酵素的切断の後、ＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＴｒｉｂｒｉｄｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。データ分析は、これらの消化から得られたＭＳスペクトルの組み合わせで行った。データは、緑色植物データベースの分類ＩＤ３３０９０に対して分析し、精製したタンパク質がＰｒｕｐ７（配列番号１）であることを確認した。Ｐｒｕｐ３または他のモモタンパク質の痕跡は調製物中に検出されなかった。

結論として、実施例１は、天然Ｐｒｕｐ７の精製、およびＭＳ／ＭＳによるその同一性の確認について記載する。続いて、この調製物を、Ｐｒｕｐ７に対するポリクローナルウサギ抗体の産生に使用した。

実施例２：組換えＰｒｕｐ７の発現および精製
Ｐｒｕｐ７をコードする合成遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ構築物を調製し、酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。形質転換株を増殖させ、誘導して、３リットルバイオリアクター（ＢｅｌａｃｈＢｉｏｔｅｋｎｉｋ，Ｓｋｏｇａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で組換えＰｒｕｐ７を産生した。培地を遠心分離により収集し、上清を回収した。ＨＡｃでｐＨを４．５に調整し、ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｆガラスマイクロファイバーフィルタを通して濾過した後、上清を５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに適用した。組換えタンパク質は、同じ緩衝液中で直線０～１ＭＮａＣｌ勾配で溶出した（図５）。ｒＰｒｕｐ７を含む画分を収集し、５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５、１５０ｍＭＮａＣｌ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラムでＳＥＣによりさらに精製した（図６ａ）。ｒＰｒｕｐ７を含む画分をプールし、０．７２ｍｇ^-1 ｍＬｃｍ^-1の計算した吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって濃度を決定した。アレルゲン調製物の純度および同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６ｂ）および質量分析によって検証した。実験的ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ試験（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、以前に記載されたように調整し［４２］、免疫学的活性は、関連する患者の血清試料を使用して評価した。

結論として、実施例２は、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｒＰｒｕｐ７の発現および組換えタンパク質の精製を記載する。組換えＰｒｕｐ７を使用して、ｎＰｒｕｐ７に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体を特徴づけ、関連する患者血清中のＰｒｕｐ７に対するＩｇＥ反応性を研究することができる。

実施例３：Ｐｒｕｐ７に対するポリクローナルＩｇＧ抗体の生成および利用
実施例１に記載したように調製した精製したｎＰｒｕｐ７を使用して、Ｐｒｕｐ７に対するポリクローナルウサギ抗体を産生した。ウサギを抗原の４回の追加免疫注入を含むプロトコルに従って、ｎＰｒｕｐ７で免疫した。免疫化の前に、免疫前の血清試料をウサギから採取し、その後の実験で対照として使用した。すべての手順は、地域倫理承認の下で、ＡｇｒｉｓｅｒａＡＢ（Ｖａｎｎａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実施した。

得られた抗Ｐｒｕｐ７抗血清は、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化されたｒＰｒｕｐ７およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物の両方に対して一連の希釈で試験した。抗血清は、最高希釈率（１：８０００）でも、前血清と比較して固定化ｒＰｒｕｐ７との強いＩｇＧ結合を示し（図７ａ）、Ｐｒｕｐ７反応性ＩｇＧの含有を確認した。さらに、血清はＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物との結合を示し（図７ｂ）、Ｐｒｕｐ７と交差反応する今まで未知であったタンパク質の存在を示唆する。したがって、以下の実施例に示すように、抗Ｐｒｕｐ７抗血清をプローブとして使用して、Ｐｒｕｐ７のこの潜在的なヒノキ科花粉相同体を追跡し、精製することができる。

実施例４：新規Ｐｒｕｐ７に関連するＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉アレルゲンの精製
実施例３において、Ｐｒｕｐ７に対して産生されたポリクローナルウサギＩｇＧ抗体が、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉の固定化タンパク質抽出物と結合することが示された。同じ抗体を利用して、Ｐｒｕｐ７と交差反応するＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質を特定、精製、および特性づけすることができた。

換言すると、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉（Ａｌｌｅｒｇｏｎ，Ｖａｌｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を５０ｍＭＮａＡｃ、１ＭＮａＣｌｐＨ４．５で、４°Ｃで７２時間撹拌しながら抽出し、遠心分離によって清澄化し、ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｆガラスマイクロファイバーフィルタで濾過し、５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムで脱塩した（図８）。空隙容量で溶出するタンパク質含有画分をプールし、５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに負荷した。溶出を同じ緩衝液中で０～１ＭＮａＣｌの直線勾配で実施した（図９ａ）。９つの選択した画分をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化し、抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ結合活性をアッセイし（図９ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図９ｃ）。抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの最高の結合を示し、顕著な７ｋＤａタンパク質バンドを含む画分７～９を、図９ａに示すようにプールし、ＳＰセファロースＨＰカラムに濃縮した。濃縮したプールは、２０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５、２５０ｍＭＮａＣｌで平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇカラムでのＳＥＣによってさらに精製した。溶出を同じ緩衝液で実施した（図１０ａ）。８つの選択した画分をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化し、上述のように抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ結合活性を試験し（図１０ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図１０ｃ）。抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの最も高い結合は、７ｋＤａで単一の明確なバンドを示した画分３～５で見られた。したがって、図１０ａに示すように画分３～５をプールし、この広範に精製したＰｒｕｐ７に関連するＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質を以下に記載するように生化学的および免疫学的に分析した。精製したＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質は、Ｐｒｕｐ７と同等の見かけ上の分子量を示した（図１０ｄ）。

結論として、実施例４は、一連のクロマトグラフィステップおよび実施例３に記載の抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ抗体を使用して、以下でＣｕｐｓＧＲＰと称される、新規Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質をどのように精製したかを記載する。

実施例５：ＣｕｐｓＧＲＰのアミノ酸配列の解明
実施例４で精製した７ｋＤａのＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質の同一性および一次構造を確立するために、それをＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＴｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、またはＬｙｓ－Ｃのいずれかで酵素切断した。ＭＳデータ分析は、７ｋＤａタンパク質の３つの消化物から得られたスペクトルの組み合わせで行った。

ＮＣＢＩタンパク質データベースの記録は、ＭＳデータとの確証的で完全な配列一致を提供しなかった。したがって、ヒノキ科ＥＳＴ（発現配列タグ）データベースに存在するヌクレオチド配列の仮想上翻訳に対して検索を行った。このデータベースにおいて最も一致したのは、記録ＢＹ８７８０７９（配列番号２）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの雄球花からのｃＤＮＡ配列であった（図１１ａ）。このＥＳＴ配列は、位置３０２～３０４での終止コドンによって分離された２つの仮想上アミノ酸配列（図１１ｂ）に翻訳された、中断されたオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置４４～３９７）を含んでいた。ＭＳ／ＭＳによって特定した４つのペプチドは、図１１ｂに示すように、ＢＹ８７８０７９の仮想上アミノ酸配列と完全に一致し、２つは終止コドンのうちのいずれかの側にある。この観察により、位置３０２～３０４の終止コドンが配列決定エラーの結果である可能性が生じた。

この概念を支持して、中断されたＢＹ８７８０７９由来配列とＰｒｕｐ７のアミノ酸配列との間の整列は、位置３０２～３０４での終止コドンにわたって伸びる相同性を示した（示さず）。実際に、ＴＧＡ終止コドンにおけるＡがＴまたはＣのいずれかに変更された場合、その代わりにシステイン残基をコードし、対応する位置でＰｒｕｐ７と完全に一致する。ＢＹ８７８０７９（配列番号３）のかかる修正を導入した後、ＭＳ／ＭＳデータの改善された全体的な一致が得られ、精製したＣｕｐｓＧＲＰタンパク質が、修正されたＢＹ８７８０７９に由来する仮想上アミノ酸配列の残基８７に対応する位置に実際にシステインを有していたことを示す（図１１ｂ）。

得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの分析についてＰＥＡＫＳＳｔｕｄｉｏソフトウェア（ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓＩｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＣｕｐｓＧＲＰの完全な６３残基のアミノ酸配列（図１１ｃ、配列番号４）は、４つの反復ステップで決定できる。ＣｕｐｓＧＲＰ配列は、図１１ｃに示すように、さらに４つの位置で修正されたＢＹ８７８０７９由来配列とは異なった。ＭＳ／ＭＳ分析は、修正されたＢＹ８７８０７９記録によってコードされた配列の残基５５～１１７に対応する、このアミノ酸配列の完全な適用範囲を示した。この配列の一部である特定したペプチドの例を表２ａに示す。

さらに、新たに決定したＣｕｐｓＧＲＰ配列を標的配列として使用するＭＳ／ＭＳデータの再分析は、ＣｕｐｓＧＲＰ配列の２つの位置：位置１８（Ａｌａ／Ｌｅｕ）および位置５２（Ａｓｎ／Ｈｉｓ）に多型が存在することを明らかにした（図１１ｃ、表２ｂ）。位置１８にＡｌａおよび位置５２にＡｓｎを含む最初に決定したＣｕｐｓＧＲＰ配列は、以下ではＣｕｐｓＧＲＰａと称され、代替アミノ酸、すなわち位置１８にＬｅｕおよび位置５２位にＨｉｓの両方を含む配列は、ＣｕｐｓＧＲＰｂ（配列番号５）と称される。ＣｕｐｓＧＲＰａおよびＣｕｐｓＧＲＰｂに加えて、２つの代替アミノ酸のうちのいずれか一方または他方を含む２つの他のアイソフォームの存在が考えられる。

ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９によってコードされたアミノ酸配列には、予測した２４残基のシグナルペプチドが含まれた（図１１ｂにおける下線付き配列）。加えて、ＭＳ／ＭＳによって特定したシグナルペプチドとＣｕｐｓＧＲＰペプチド１（図１１ｂにおけるＰｅｐ１）に一致する配列との間に、一致するＣｕｐｓＧＲＰペプチドが特定されなかった３０個のアミノ酸の伸展が存在した。

それにもかかわらず、精製したＣｕｐｓＧＲＰがかかるＮ末端ペプチドを含むかを決定するために、タンパク質は、［４３］に記載されるように、エドマン分解によるＮ末端配列決定に供した。タンパク質の最初の４つのアミノ酸残基は、Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ－Ａｓｐとして特定され、ＭＳ／ＭＳによって特定されたＣｕｐｓＧＲＰペプチド１のＮ末端部分と正確に一致した。したがって、ＣｕｐｓＧＲＰの前駆体は、ＢＹ８７８０７９由来配列の残基２５～５４に対応する部分を含み得るが、それは切断され、成熟ＣｕｐｓＧＲＰタンパク質中にはもはや存在しない。

ＣｕｐｓＧＲＰ調製の完全性およびタンパク質の新規に決定したアミノ酸配列の証拠は、試料の還元およびアルキル化の後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得られ、その無傷の分子量を決定した。分析は、すべてのシステイン残基が減少した非修飾タンパク質の分子量６８２８．９８Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝７６８２．４３で優勢なピークが明らかになった。これは、すべてのシステイン残基が減少したＣｕｐｓＧＲＰａ配列（配列番号４）について計算したモノアイソトピック分子量と完全に一致する。

Ｎ末端配列および全質量ＭＳ分析は、ＭＳ／ＭＳ分析によって得られたアミノ酸配列がＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉から精製した７ｋＤａのタンパク質の完全なアミノ酸配列を網羅していることを確認した。Ｐｆａｍシグネチャ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）のＣｕｐｓＧＲＰのこのアミノ酸配列の分析は、タンパク質が、ＧＡＳＡタンパク質ファミリーとしても知られるジベレリン制御性タンパク質ファミリーに属することを確認した。ＧＲＰ配列は植物界全体で高度に保存されており、ＣｕｐｓＧＲＰａおよびＣｕｐｓＧＲＰｂ配列の両方がＰｒｕｐ７と６８％の配列同一性を示した（図１１ｄ）。

結論として、実施例５は、ＣｕｐｓＧＲＰのアミノ酸配列がＭＳ／ＭＳおよびＮ末端配列決定によってどのように決定したかを記載する。ＭＳ分析により、無傷タンパク質の質量を決定し、計算した理論上質量と完全に一致することを見出した。６３残基配列は、２つの位置に代替アミノ酸を有し、その天然状態におけるタンパク質の４つの可能なアイソフォームをもたらすことを示した。

実施例６：ＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉおよびＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのＰｒｕｐ７関連タンパク質の精製およびアミノ酸配列決定
上記の実施例４に記載したＣｕｐｓＧＲＰの精製のために作成した手順は、２つの他のヒノキ科種、ＪｕｎｉｐｅｒｕｓａｓｈｅｉおよびＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの花粉からの対応するタンパク質の精製に使用した。

Ｊ．ａｓｈｅｉからの花粉を抽出し、記載した精製およびモニタリングの手順を実行した。第３に精製ステップでは、ＳＥＣを使用して、以前のカチオン交換クロマトグラフィステップからの画分の濃縮プールに存在するタンパク質を分離した。ＳＥＣカラムから溶出した３つの顕著なピーク（図１２ａ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる個々の画分の分析（図１２ｂ）は、３つのピークの各々に明確に異なるタンパク質バンドを明らかにした。３つのピークを図１２ａに示すように別々にプールし、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相と結合させ、ウサギ抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧ抗体と結合する能力を分析した（図１２ｃ）。

ピーク２は、約７ｋＤａに優勢なタンパク質バンドを含むことを見出し、強い抗体結合活性を示した。以下ではＪｕｎａＧＲＰと称される、Ｊ．ａｓｈｅｉ花粉からのこのタンパク質調製物は、以下に記載するように生化学的および免疫学的に分析した。

同様に、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａからの花粉の抽出物を調製し、脱塩し、カチオン交換クロマトグラフィに供した。抗体結合活性を示す画分をプールし、ＳＥＣに適用した（図１３ａ）。このＳＥＣクロマトグラムは、Ｊ．ａｓｈｅｉ花粉抽出物で得られたものよりも複雑な外観を示した。選択した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗Ｐｒｕｐ７ＩｇＧの結合について分析した。分析は、画分２および３において約７ｋＤａのタンパク質バンドを明らかにし（図１３ｂ、レーン２および３）、これらの画分も強い抗体結合活性を示した（図１３ｃ）。結果に基づいて、画分２および３は図１３ａの括弧で示したように、プールした。以下ではＣｒｙｊＧＲＰと称される、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのこのタンパク質調製物は、以下に記載するように生化学的および免疫学的に分析した。

ＪｕｎａＧＲＰ調製物は、実施例５に記載されるように、試料調製後にＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＴｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。この場合も、得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの最適なデータベースの致はＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９であった（図１１ａ、配列番号２）。図１４ａは、ＢＹ８７８０７９の修正版を示し、実施例５において特定したように、位置３０２～３０４の誤ったＴＧＡ終止コドンは、システインコドンＴＧＹ（配列番号３）によって置き換えられ、Ｙは、ＩＵＰＡＣ多義性コードシステム［４４］で定義されるようにＣまたはＴを表す。図１４ｂには、修飾ＢＹ８７８０７９（配列番号６）のヌクレオチド４４～３９４によってコードされるアミノ酸配列を示し、ＭＳ／ＭＳによって特定したＪｕｎａＧＲＰペプチドが下を配置した。

得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの分析にＰＥＡＫＳＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、ＪｕｎａＧＲＰの完全なアミノ酸配列（図１４ｃ、配列番号６）を４つの反復ステップで決定できる。ＪｕｎａＧＲＰ配列は、図１４ｃに示すように、５つの位置で修正されたＢＹ８７８０７９由来配列とは異なった。ＭＳ／ＭＳ分析は、修正されたＢＹ８７８０７９記録によってコードされた配列の残基５５～１１７に対応する、このアミノ酸配列の完全な適用範囲を示した。この配列を表す特定したペプチドの例を表２ｃに示す。分析において多型は検出されず、配列はＰｒｕｐ７と６７％の同一性を示した（図１４ｄ）。

ＪｕｎａＧＲＰ調製物の完全性の証拠、および新規に決定したアミノ酸配列の確証は、試料をＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元した後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得た。分析により、分子量６８２８．０３Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝６８２９．０４で優勢なピークが明らかになった。これは、配列番号６のすべてのシステイン残基が減少したＪｕｎａＧＲＰ配列で計算したモノアイソトピック質量と完全に一致する。

ＣｒｙｊＧＲＰ調製物は、実施例５に記載されるように、試料調製後にＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＴｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの最適なデータベースの致は、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａの雄球花からのｃＤＮＡ配列である、ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０であった（図１５ａ、配列番号７）。図１５ｂには、ＢＹ９００４８０のヌクレオチド位置１５～３６５に及ぶオープンリーディングフレームの翻訳されたアミノ酸配列を示し、ＭＳ／ＭＳによって特定したＣｒｙｊＧＲＰペプチドを下に配置した。タンパク質全体を表す、ＭＳ／ＭＳによって特定した選択ＣｒｙｊＧＲＰペプチドのリストを表２ｄに示す。ＣｒｙｊＧＲＰの完全なアミノ酸配列を図１５ｃ、配列番号８に示す。分析において多型は検出されず、配列はＰｒｕｐ７と６８％の同一性を示した（図１５ｄ）。

ＣｕｐｓＧＲＰおよびＪｕｎａＧＲＰの場合と同様に、ＣｒｙｊＧＲＰは、最も一致するデータベース記録によってコードされたアミノ酸配列の最初の５４残基を欠いていた。この場合も、最初の２４残基は予測したシグナルペプチドを含み、続く３０残基はタンパク質成熟中に切断されたプロペプチドを表すと結論づけた。

ＣｒｙｊＧＲＰ調製物の完全性の証拠、および新規に決定したアミノ酸配列の確証は、試料をＴＣＥＰで還元した後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得た。分析により、分子量６８９４．９５Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝６８９５．９６で大きなピークが明らかになった。これは、配列番号８のすべてのシステイン残基が減少したＣｒｙｊＧＲＰ配列で計算したモノアイソトピック分子量質量と完全に一致する。

３つのヒノキ科花粉由来ＧＲＰ配列、ＣｕｐｓＧＲＰ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰは、９０～９８％の配列同一性を共有し（図１６ａ～ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて同じ電気泳動移動度有する（図１６ｃ）。

結論として、実施例６は、Ｊ．ａｓｈｅｉおよびＣｊａｐｏｎｉｃａからのＰｒｕｐ７関連花粉タンパク質ＪｕｎａＧＲＰおよびＣｒｙｊＧＲＰの精製、アミノ酸配列決定、ならびに質量決定をそれぞれ記載する。

実施例７：２つの組換えＣｕｐｓＧＲＰアイソフォームのクローニングおよび精製
実施例５からのＣｕｐｓＧＲＰａおよびＣｕｐｓＧＲＰｂのアミノ酸配列をコードするように設計した合成遺伝子を、発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａにクローン化し、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。２つの組換えタンパク質は、実施例２においてｒＰｒｕｐ７について記載しものと同じ手順を使用して発現および精製した。ＭＳ／ＭＳ分析により、精製した組換えタンパク質の同一性および完全性を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＣｕｐｓＧＲＰの２つの組換えアイソフォーム、ｎＣｕｐｓＧＲＰ、およびｒＰｒｕｐ７の比較は、見かけ上の分子量が７ｋＤａで、４つのタンパク質調製物のほぼ同一の電気泳動的外観を示した（図１７）。

結論として、実施例７は、実施例５において決定したアミノ酸配列バリアントのうちの２つを表す、ＣｕｐｓＧＲＰの２つの組換えアイソフォームのクローニングおよび精製を記載する。

実施例８：ｒＰｒｕｐ７と比較した天然および組換えＣｕｐｓＧＲＰのＩｇＥ結合活性
４４人のモモアレルギー対象間血清中の精製したｎＣｕｐｓＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析して、ｒＰｒｕｐ７と比較した（図１８）。試験した４４個の血清のうち、４３個（９８％）がｎＣｕｐｓＧＲＰに対して、３８個（８６％）がｒＰｒｕｐ７に対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵ_A／Ｌ）を示した。ｒＰｒｕｐ７に対して陰性であると試験された６つの血清のうち５つはｎＣｕｐｓＧＲＰに対して陽性ＩｇＥ応答を示した。ｎＣｕｐｓＧＲＰおよびｒＰｒｕｐ７とのＩｇＥ結合のレベルは有意に相関しており（ｒ＝０．６８）、結合の中央値はｎＣｕｐｓＧＲＰよりも約２倍高かった。分析は、ＣｕｐｓＧＲＰおよびＰｒｕｐ７が免疫学的に関連していることを示したが、Ｐｒｕｐ７はＣｕｐｓＧＲＰと比較して不完全なエピトープ提示を保有することも示した。

産生した２つの組換えＣｕｐｓＧＲＰタンパク質の免疫学的活性および確実性を評価するために、ｎＣｕｐｓＧＲＰを用いたＩｇＥ結合活性の比較を、１９人のモモアレルギー対象の血清を使用するＩｍｍｕｎｏＣＡＰで実行した。図１９ａおよび１９ｂに示すデータは、ｎＣｕｐｓＧＲＰと比較したｒＣｕｐｓＧＲＰａ（配列番号３）およびｒＣｕｐｓＧＲＰｂ（配列番号４）の両方の本質的に同等のＩｇＥ結合活性（それぞれｒ＝０．９８およびｒ＝０．９９）、ｒＣｕｐｓＧＲＰａよりもｒＣｕｐｓＧＲＰｂとのわずかに高いＩｇＥ結合を明らかにした。結果は、組換えＣｕｐｓＧＲＰタンパク質の構造的および免疫学的確実性の両方の証拠を提供する。

結論として、実施例８は、ヒトＩｇＥ抗体による認識に関しても、ウサギＩｇＧ抗体によって最初に確立したモモアレルゲンＰｒｕｐ７とＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質ＣｕｐｓＧＲＰとの間の免疫学的関連を確認する。第２に、Ｐｒｕｐ７よりもＣｕｐｓＧＲＰと結合するＩｇＥレベルが高いことは、ＣｕｐｓＧＲＰが一次感作物質として作用し、Ｐｒｕｐ７と交差反応するＩｇＥ抗体を誘発し得ることを示唆する。

実施例９：Ｐｒｕｐ７とＣｕｐｓＧＲＰとの間の交差反応性
Ｐｒｕｐ７とＣｕｐｓＧＲＰとの間の免疫学的関連をさらに特徴づけするために、ＩｇＥ競合実験を実行した。４つのＰｒｕｐ７反応性ヒト血清を、２０μｇ／ｍＬの最終濃度でｎＣｕｐｓＧＲＰもしくはｒＣｕｐｓＧＲＰｂと個別に、または陰性対照として役割を果たす同じ容量比率の希釈緩衝液のみと組み合わせた。抗体／抗原複合体形成を可能にするために室温で２時間インキュベートした後、すべての試料をＩｍｍｕｎｏＣＡＰによってＰｒｕｐ７とのＩｇＥ結合について試験した。ｎＣｕｐｓＧＲＰおよびｒＣｕｐｓＧＲＰｂによるＰｒｕｐ７とのＩｇＥ結合の阻害レベルを、希釈緩衝液対照の割合として計算した。

実験結果を図２０に示す。試験した４つの血清のうち３つにおいて、ｎＣｕｐｓＧＲＰおよびｒＣｕｐｓＧＲＰｂの両方が、ｒＰｒｕｐ７とのＩｇＥ結合を本質的に完全に阻害した。また、第４の血清において、ｒＰｒｕｐ７とのＩｇＥの結合は、ｎＣｕｐｓＧＲＰによって完全に打ち負かされたが、ｒＣｕｐｓＧＲＰｂは約８０％の阻害を引き起こした。別の対照実験において、ｎＣｕｐｓＧＲＰが非関連のカバノキ花粉アレルゲンＢｅｔｖ１とのＩｇＥ結合に対して阻害効果を発揮しないこと、Ｐｒｕｐ７とのＩｇＥ結合に対するその効果の特異性を確信させることを確認した。

結論として、ＩｇＥ競合実験は、Ｐｒｕｐ７およびＣｕｐｓＧＲＰとのＩｇＥ結合における相関が、他の理由による共変動ではなく、２つのタンパク質に共通するエピトープ構造の抗体認識によって本当に引き起こされることを示す。

実施例１０：ＣｕｐｓＧＲＰ、ＪｕｎａＧＲＰ、およびＣｒｙｊＧＲＰ間の免疫学的類似性
この研究において特定および精製した３つの天然ヒノキ科花粉ＧＲＰ間の免疫学的類似性の程度は、比較ＩｇＥ結合分析で評価した。各樹木アレルゲンをＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相と結合させ、アッセイを使用して、１８人のモモアレルギー対照の血清中のＩｇＥ抗体結合を測定した。比較を図２１ａ～ｃに示す。ｎＣｕｐｓＧＲＰおよびｎＪｕｎａＧＲＰとのＩｇＥ結合のレベル（図２１ａ）は、ｎＣｕｐｓＧＲＰとわずかに高い結合傾向（中央値レベル比１．１２）で、非常に高い相関関係があることを見出した（ｒ＝０．９８）。ｎＣｕｐａＧＲＰおよびｎＣｒｙｊＧＲＰ（図２１ｂ）はまた、ｎＣｕｐｓＧＲＰとわずかに高い結合ではあるが（中央値レベル比１．４６）、ＩｇＥ結合と強い相関関係を示し（ｒ＝０．８４）、血清を分析において使用した対象におけるＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉に対する一次感作の欠如を反映している可能性がある。ｎＪｕｎａＧＲＰおよびｎＣｒｙｊＧＲＰの比較（図２１ｃ）は、ＩｇＥ結合において同様の相関（ｒ＝０．８７）を示したが、再びｎＣｒｙｊＧＲＰとのわずかに低い結合を伴った（中央値レベル比１．２８）。

この例は、ＧＲＰタンパク質ファミリーからの４つのタンパク質（＞９０％の配列同一性）が非常に類似したＩｇＥ反応性を有することを示す。これは、アミノ酸配列において小さな変動があるにもかかわらず、ＩｇＥ反応性が本質的に同じままであるという、高い配列同一性の他の小さなアレルゲンタンパク質について行われた観察を支持する。さらに実施例１２を参照されたく、これは、交差反応性によるＩｇＥ反応性が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するタンパク質間で非常に類似していることも示す。

実施例１１：ヒノキ花粉症を有する対象間のＣｕｐｓＧＲＰに対する感作の有病率
８８人のヒノキ花粉感作対象（ｔ２３＞０．１ｋＵ_A／Ｌ）の血清間の精製したｎＣｕｐｓＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析した（図２２）。これらの血清のうち、２８個（３２％）がｎＣｕｐｓＧＲＰに対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵ_A／Ｌ）を示した。血清のうちの１３個（１５％）において、ｎＣｕｐｓＧＲＰおよびヒノキ花粉抽出物と同様のレベルのＩｇＥを観察し、このサブセットにおける対象のヒノキ花粉感作におけるＣｕｐｓＧＲＰの優勢な役割を示す。

分析は、ヒノキ花粉感作対象の約３分の１が、ヒノキ科花粉ＧＲＰに相同なタンパク質を含む食物に対してアレルギー反応のリスクを与える感作プロファイルを有することを示唆する。かかる個体は、好適で代表的なヒノキ科花粉ＧＲＰを含むＩｇＥ試験を使用して特定することができる。

より詳細には、モモアレルギーに関して選択されていない花粉症患者の分子分析は、これらの個体のうちの３分の１のみがＣｕｐｓＧＲＰに対する検出可能なＩｇＥを有し、３分の２の大多数がこのアレルゲンに対する感作を欠いていることを示した。この発見は、ＣｕｐｓＧＲＰがヒノキ花粉においてマイナー的なアレルゲンであることを明らかにし、ヒノキ花粉感作患者の特定可能な亜群がモモまたは他のＧＲＰ含有食物に対するアレルギー反応のリスクがあることを示唆する。ヒノキ科花粉曝露が高い地域においてこの亜群を構成する実質的な絶対数およびＧＲＰ媒介性食物アレルギー反応の潜在的な重症度を考慮すると、ＧＲＰ感作を伴うそれらを特定することは、この患者群の管理におけるリスク低減の貴重なステップとなるであろう。この目的のために、実施例７において記載したように、インビトロ診断用途のための試薬として好適な、完全に免疫反応性の組換えＣｕｐｓＧＲＰの生成が、第１の重要なステップである。

実施例１２：同じタンパク質ファミリーからの密接に関連するタンパク質－プロフィリンのＩｇＥ反応性の分析
類似アレルゲンの互換性を実証するために、異なるアレルゲン起源からの８つの異なるプロフィリンタンパク質を比較した。カバノキ（ｒＢｅｔｖ２）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒａ２）、リンゴ（Ｍａｌｄ４）、サクランボ（Ｐｒｕａｖ４）、ナシ（Ｐｙｒｃ４）、セロリ（Ａｐｉｇ４）、ニンジン（Ｄａｕｃ４）、およびチモシー牧草（Ｐｈｌｐ１２）からの組換えプロフィリンを、ｉｍｍｕｎｏＣＡＰに固定化し、いくつかの血清を使用して試験した。タンパク質の各対間のＩｇＥ反応性の比較は、試験した血清の大部分について、試験したすべてのタンパク質の強い相関および非常に類似したＩｇＥ結合活性を示した（図２３ａ）。

これらのタンパク質の配列は、Ｅｍｂｏｓｓ針プログラム［４５］を使用して対合整列した（図２３ｂ）。対合配列同一性は、これらのタンパク質間で７４％～９３％の範囲であった。

配列データをＰｈｙｒｅ２［４６］などの構造予測プログラムによって分析した場合、これら８つの配列はすべて、プロフィリンについて実験的に決定したものに近い折りたたみ構造と一致すると結論づけすることができる（データは示さず）。

ＩｇＥデータは、これらのプロフィリンのうち４つを比較したＳｃｈｅｕｒｅｒらのデータと良好一致する［４７］。その研究において、Ｂｅｔｖ２、Ｐｒｕａｖ４、Ｐｙｒｃ４、およびＡｐｉｇ４が比較され、これらのタンパク質は細胞媒介物放出試験でほぼ同一のアレルゲン特性を示すと結論づけられた。これらの４つのタンパク質の対合配列同一性は７６～８６％の間で変化した。同様の結論およびプロフィリン間の高い交差反応性のさらなる証拠が、Ｖｉｌｌａｌｔａらによる研究で提示された［４８］。

結論として、この実施例は、交差反応性によるＩｇＥ反応性が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するタンパク質間で非常に類似していることを示す。この研究において、タンパク質は可溶性で折りたたまれた小さなサイズのタンパク質であり、対合配列同一性は約８０％であった。上述の研究はすべて天然起源タンパク質バリアントを用いて実行したが、特定のプロフィリンと高い配列同一性を有するこれらのタンパク質の人工的なバリアントも、バリアントが可溶性の折りたたみタンパク質で提供される場合、非常に高い類似性のＩｇＥ反応性を示すであろう。依然として可溶性および折りたたみプロフィリンの人工的なバリアントは、アミノ酸が系統的に保存されていない位置での制限された数のアミノ酸置換によって設計され得る。かかる置換が任意のかかる位置で他のプロフィリンにおいて生じるアミノ酸で行われる場合、これは可溶性の折りたたみタンパク質を産生する可能性を高めるであろう。

実施例１３：異なるヒノキ科種の花粉から実験的に決定したＧＲＰの配列の分析
同様のＩｇＥ抗体結合反応性を割り当てた４つの配列を整列させた（図２４）。これらの４つの配列から、非保存的なすべてのアミノ酸がＸでマークされているヒノキ科花粉ＧＲＰコンセンサス配列を構築できる。

さらに、このコンセンサス配列を使用してＢＬＡＳＴ検索を実行し、このコンセンサス配列と相同性を有するすべての既知の配列を特定した。特に、このヒノキ科花粉ＧＲＰコンセンサス配列に対して７０％（４４／６３）を超えるアミノ酸同一性を示す既知の配列は存在せず、本明細書で特定したヒノキ科花粉からの配列が、Ｐｒｕｐ７などの食物に存在するＧＲＰタンパク質から系統的に比較的離れていることを示す。

コンセンサス配列と５９％（３７／６３）を超える配列同一性を有する３７個の記録配列の選択を使用して、多重配列整列を行った。ｃｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａプログラムを使用して作成したこの多重配列整列（図２５）から、図２６の行Ｃに示すように、分析したすべての配列で同一である２２個の高度に保存されたアミノ酸を同定した。これらの位置におけるアミノ酸交換は、タンパク質のＩｇＥ結合能力に影響を与え得る構造変化をもたらし得る。加えて、Ｐｒｕｐ７と系統的に比較的離れたヒノキ科花粉コンセンサス配列との間で２０個のアミノ酸が同一であり、図２６の行Ｂを参照されたい。これらの位置におけるアミノ酸交換は、タンパク質のＩｇＥ結合能力に影響を与え得る構造変化を誘導する高い可能性を有するであろう。最後に、ヒノキ科花粉コンセンサス配列とＰｒｕｐ７との間で異なる１４個のアミノ酸残基が存在し、図２６の行ＡにおいてＺで示した。表３に列挙したように、系統的に関連するタンパク質において生じるアミノ酸残基へのこれらの１４個のアミノ酸位置Ｚのうちのいずれか１つ以上のアミノ酸置換は、タンパク質の全体的な構造を妨害しない可能性が高い。

これらの配列から、ヒノキ科－Ｐｒｕｐ７ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号５２）を設計し、ヒノキ科花粉ＧＲＰ間で非保存的であるか、またはヒノキ科花粉およびＰｒｕｐ７ＧＲＰ間で非保存的であるかのいずれかであるすべてのアミノ酸をＸで示した（図２６および配列番号５２）。

図２５に示す整列を調査することにより、ヒノキ科－Ｐｒｕｐ７ＧＲＰコンセンサス配列の系統的に非保存的な位置（図２６における２１個のＸ位置）で使用されているすべてのアミノ酸を特定できた。表３において、ヒノキ科花粉ＧＲＰ配列から実験的に決定したものを含む、これらの系統的に試験したアミノ酸を列挙した（図２４）。

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４８．Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｄ．ａｎｄＲ．Ａｓｅｒｏ，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｐｏｌｌｅｎｐａｎ－ａｌｌｅｒｇｅｎｐｒｏｆｉｌｉｎ．ＩｓｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｕｓｅｆｕｌ？ＪＩｎｖｅｓｔｉｇＡｌｌｅｒｇｏｌＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２０１０．２０（７）：ｐ．５９１－５．

Claims

配列番号４のアミノ酸配列からなる単離アレルゲンタンパク質、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記単離アレルゲンタンパク質のバリアント。
配列番号４のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９５％である、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号５２の以下のアミノ酸配列からなり、
ここで、位置Ｘのうちの最大４つには、下記表３で定義される各位置の任意のアミノ酸が含まれ、
残りの位置Ｘにおいて、前記アミノ酸が、配列番号４の対応する位置のアミノ酸と同一である、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号９の以下のアミノ酸配列からなり、
配列番号９の前記位置Ｘのうち最大４つが、以下のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸を有し：
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、もしくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、もしくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、もしくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、もしくはＱのうちのいずれか１つから選択され、および／または
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、もしくはＥのうちのいずれか１つから選択され、
残りの位置Ｘにおいて、前記アミノ酸が、配列番号４の対応する位置のアミノ酸と同一である、
請求項１または２に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記位置Ｘのうち最大４つにおいて、前記アミノ酸が、以下のアミノ酸の群から選択される：
位置２におけるＸが、ＱまたはＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、ＡまたはＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置３１におけるＸが、ＫまたはＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、ＡまたはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、ＶまたはＳのうちのいずれか１つから選択され、および
位置５２におけるＸが、ＨまたはＮのうちのいずれか１つから選択される、
請求項４に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号５のアミノ酸配列と少なくと９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号６のアミノ酸配列からなるか、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、配列番号８のアミノ酸配列からなるか、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントが、組換え的に産生されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントをコードする、単離核酸分子。
前記核酸分子が、配列番号１０の核酸配列を有する、請求項１１に記載の単離核酸分子。
請求項１２に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
請求項１３に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントを追加するステップを含む、方法。
請求項１５に記載の方法によって得られる、アレルゲン組成物。
１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントの使用。
前記１型アレルギーが、ヒノキ科種の花粉によって引き起こされる、請求項１７に記載の使用。
前記１型アレルギーが、食物に関連する、請求項１７に記載の使用。
前記１型アレルギーが、果物に関連する、請求項１９に記載の使用。
前記１型アレルギーが、花粉食物に関連する、請求項１７に記載の使用。
前記１型アレルギーが、花粉食物関連症候群（ＰＦＡＳ）に関連する、請求項２１に記載の使用。
１型アレルギーのインビトロ診断または評価のための方法であって、
１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントと接触させるステップと、
前記試料において、前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントと特異的に結合する抗体の存在を決定するステップと、を含み、
前記単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントと特異的に結合する前記試料中の抗体の存在が、前記対象における１型アレルギーの情報を提供する、方法。
可溶性または固体支持体に固定化された、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアントを含む、請求項２３に記載の方法において使用するためのキット。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質またはそのバリアント、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。