Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
JP7630904B2 - 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 - Google Patents
[go: Go Back, main page]

JP7630904B2 - 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 - Google Patents

核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7630904B2
JP7630904B2 JP2019135474A JP2019135474A JP7630904B2 JP 7630904 B2 JP7630904 B2 JP 7630904B2 JP 2019135474 A JP2019135474 A JP 2019135474A JP 2019135474 A JP2019135474 A JP 2019135474A JP 7630904 B2 JP7630904 B2 JP 7630904B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
rna
dna
sequence
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019135474A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021016370A (ja
Inventor
英一 赤星
美津子 石原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toshiba Corp
Original Assignee
Toshiba Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to JP2019135474A priority Critical patent/JP7630904B2/ja
Application filed by Toshiba Corp filed Critical Toshiba Corp
Priority to EP20716922.8A priority patent/EP4004220A1/en
Priority to CN202080004819.9A priority patent/CN112639113A/zh
Priority to CN202411097059.7A priority patent/CN118979066A/zh
Priority to PCT/IB2020/051711 priority patent/WO2021014224A1/en
Publication of JP2021016370A publication Critical patent/JP2021016370A/ja
Priority to US17/189,376 priority patent/US20210230636A1/en
Priority to JP2023079952A priority patent/JP7646729B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7630904B2 publication Critical patent/JP7630904B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

本発明の実施形態は、核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法に関する。
近年、ＤＮＡを部位特異的に切断するＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（Ｃａｓ９）や、目的ＤＮＡを切り出し、細胞のゲノムに挿入するトランスポゼースなど、遺伝子工学において有用な機能性タンパク質が多数発見されている。このような機能性タンパク質を遺伝子工学に利用するために、機能性タンパク質を細胞内により効率よく導入し、発現させる技術の開発が望まれている。
例えば、機能性タンパク質をコードするＤＮＡ（ベクター等）を細胞に導入することで、機能性タンパク質を細胞内で発現させる方法が用いられている。しかしながら、ＤＮＡ単独では細胞膜を通過して細胞に進入することが難しい。ＤＮＡを細胞に導入する方法として、リポフェクタミンを用いた方法がある。リポフェクタミンは、核酸と結合して複合体を形成し、核酸を細胞に導入しやすくする。
Lingmin et al. NPG Asia Materials (2017) 9, e441 Zeming Chen et al. Adv. Funct. Mater. 2017, 27, 1703036 Shai Zhen et al. Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 6), pp: 9375-9387
本発明は、目的のＤＮＡ配列をより効率的且つ安全に細胞のゲノムに導入することができる核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法を提供することを目的とする。
実施形態に従う核酸導入キャリアは、第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる。核酸導入キャリアは、第１の配列を含むドナーＤＮＡと、ゲノムへの第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、ドナーＤＮＡ及びＲＮＡ剤を内包する脂質粒子とを備える。
図１は、実施形態の核酸導入キャリアの一例を示す断面図である。 図２は、実施形態の核酸導入方法の一例を示すフローチャートである。 図３は、実施形態の核酸導入キャリアの一例を示す断面図である。 図４は、実施形態の核酸導入キャリアセットの一例を示す断面図である。 図５は、例１の実験結果を示すグラフである。 図６は、例１の実験結果を示す顕微鏡写真である。 図７は、例２の実験結果を示すヒストグラムである。 図８は、例３の実験結果を示すヒストグラムである。 図９は、例４の実験結果を示すグラフである。 図１０は、例４の実験結果を示すヒストグラムである。 図１１は、例５の実験結果を示すグラフである。 図１２は、例６の実験結果を示す電気泳動写真である。 図１３は、例６の実験結果を示す顕微鏡写真である。
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
実施形態に従う核酸導入キャリアは、第１の配列を含むドナーＤＮＡと、ゲノムへの第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、ドナーＤＮＡ及びＲＮＡ剤を内包する脂質粒子とを備える。核酸導入キャリアは、第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる。また、実施形態によれば、ドナーＤＮＡとＲＮＡ剤とが別々の脂質粒子に内包された核酸導入キャリアセット、核酸導入キャリア又は核酸導入キャリアセットを含む核酸導入組成物、核酸導入キャリア又は核酸導入キャリアセットを用いる核酸導入方法も提供される。以下、核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法について詳細に説明する。
（第１の実施形態）
・核酸導入キャリア
図１は、第１の実施形態の核酸導入キャリアの一例を示す断面図である。核酸導入キャリア１は、ドナーＤＮＡ２と、ＲＮＡ剤３と、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３を内包する脂質粒子４を備える。ドナーＤＮＡ２は、細胞のゲノムに導入される第１の配列５を含む。ＲＮＡ剤３は、ＲＮＡ３ａとガイドＲＮＡ３ｂとを含む。ＲＮＡ３ａは、ゲノムへの第１の配列５の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡである。ガイドＲＮＡ３ｂは、第１の配列５が導入されるゲノム上の配列（以下、「第２の配列」と称する）に対応する配列を含むＲＮＡである。ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とは、例えば、核酸凝縮ペプチド６で凝縮された状態で内包されている。脂質粒子４は複数の脂質分子４ａが非共有結合で隙間なく配列してできた脂質膜からなり、略球状の中空体であり、その中心の内腔４ｂにドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とが内包されている。
以下、各構成について詳細に説明する。
ドナーＤＮＡ２は、例えば、二本鎖の直鎖状ＤＮＡである。ドナーＤＮＡ２は、一本鎖ＤＮＡであってもよいし、環状ＤＮＡであってもよい。ドナーＤＮＡ２の長さは、例えば、３～約２００００塩基である。
ドナーＤＮＡ２に含まれる第１の配列５は、細胞のゲノムに導入されるための配列であり、例えば、プロモーター配列と特定の遺伝子と転写終結配列とを含む遺伝子発現カセット、特定の遺伝子又は遺伝子の一部をコードする塩基配列、又は遺伝子ではない天然の塩基配列又は非天然の塩基配列等である。或いは１個～数個のアミノ酸をコードする塩基配列又は３個～数十個のヌクレオチドからなる配列等であってもよい。第１の配列の長さは、例えば、３～約２００００塩基である。
ドナーＤＮＡ２は、例えば、第１の配列５以外に他の配列を含んでいてもよい。そのような配列は、ＲＮＡ３ａにコードされるタンパク質の認識配列、或いは、ガイドＲＮＡ３ｂの認識配列などである。
ドナーＤＮＡ２の構成、即ち、第１の配列５の種類、他の配列の種類及び塩基長等は、詳しくは後述するが、核酸導入キャリア１の用途によって選択される。ドナーＤＮＡ２は、核酸導入キャリア１内に１～１００分子含まれることが好ましい。
ＲＮＡ３ａは、ゲノムへの第１の配列５の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡである。当該タンパク質は、例えば、ＤＮＡの切断、結合、挿入及び／又は修復などを行う活性を有し、その活性によりゲノム上へのＤＮＡ配列の導入に関与する酵素である。以下、このようなタンパク質を単に「酵素」とも称する。酵素は、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、トランスポゼース、逆転写酵素及びインテクラーゼ（レトロウイルス型レトロトランスポゾン用酵素）、逆転写酵素及びエンドヌクレアーゼ（非レトロウイルス型レトロトランスポゾン用酵素）等であることが好ましい。
エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の例は、ＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ９：Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化用エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼなどを含む。エンドヌクレアーゼは、詳しくは後述するがゲノム上の第１の配列５が導入される位置のホスホジエステル結合を切断することにより、第１の配列５のゲノムへの導入に関与する。
トランスポゼースは、例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１等を含む。トランスポゼースは、ドナーＤＮＡ２から第１の配列５を含む配列を切り出し、ゲノム上に導入する活性を有し、それにより第１の配列５のゲノムへの導入に関与する。
ＲＮＡ３ａは、例えば、上記酵素の遺伝子のｍＲＮＡであってもよい。ＲＮＡ３ａは、酵素の遺伝子をコードする配列の他に更なる配列を有してもよい。更なる配列は、例えば、５’末端リーダー配列、ＩＲＥＳ（ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ）、転写終結配列、又はＰｏｌｙ（Ａ）配列などである。ＲＮＡ３ａは、ＣＡＰ構造を有してもよい。
ＲＮＡ３ａの長さは、例えば、約２０～約５０００塩基である。ＲＮＡ３ａは、核酸導入キャリア１内に１～約１０００分子含まれることが好ましい。ＲＮＡ３ａは、複数種類の酵素をそれぞれコードする複数のＲＮＡを含んでもよい。
ガイドＲＮＡ３ｂは、第２の配列又はその相補配列に対応する塩基配列を有するＲＮＡである。第２の配列は、細胞のゲノム上の第１の配列５が導入される位置周辺の、例えば、１５～２５塩基の配列である。第２の配列はＤＮＡであり、ガイドＲＮＡ３ｂはＲＮＡであるので、「対応する塩基配列」とは、第２の配列のＴ（チミン）がガイドＲＮＡ３ｂではＵ（ウリジン）であることを除き、相同な塩基配列又はその相補配列をいう。
ガイドＲＮＡ３ｂは、ＲＮＡ３ａがＣａｓ９をコードするＲＮＡである場合に用いることが好ましい。その場合、ガイドＲＮＡ３ｂは、当業者が通常の知識に従って第２の配列を基に設計することができる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡであればよい。この場合、ガイドＲＮＡ３ｂは、第２の配列の３’末端に、ＰＡＭ配列を含む３’末端側ｃｒＲＮＡを連結したＲＮＡであってもよいし、第２の配列の３’末端に、ＰＡＭ配列を含む３’末端側ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの一部からなる配列とを連結したＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。このようなガイドＲＮＡ３ｂの長さは、例えば、約４０～約１５０塩基である。
ガイドＲＮＡ３ｂは、ＲＮＡ３ａから発現したエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼを第２の配列まで導く役割を有する。したがって、ガイドＲＮＡ３ｂを用いることによって部位特異的に第１の配列５を導入することが可能である。第１の配列５を部位特異的に導入する必要がない場合、或いは酵素としてＣａｓ９を用いない場合、ガイドＲＮＡ３ｂを用いなくともよい。
ガイドＲＮＡ３ｂは、核酸導入キャリア１内に１～約１０００分子含まれることが好ましい。
ＲＮＡ剤３は、更なるＲＮＡを含んでいてもよい。更なるＲＮＡは、例えば、ＤＮＡのメチル化、脱メチル化、修復及び／又は結合など、ＤＮＡを修飾する機能を有するＲＮＡである。例えば、これらのＲＮＡは、上記修飾の活性を有するタンパク質をコードするＲＮＡであってもよい。これらのＲＮＡを含むことによって、ゲノムに導入された第１の配列５やその周辺の配列に上記修飾を加えることが可能である。それにより、例えば、細胞に更なる機能改変を加えることができる。
ＲＮＡ剤３に含まれるＲＮＡは、分解に耐性を有するように修飾されていることが好ましい。例えば、当該修飾は、細胞内外に存在するＲＮａｓｅによりＲＮＡが分解されないようにする公知の修飾であればよい。そのような修飾は、例えば、ＲＮＡへの天然修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの使用／導入、非天然配列の使用／付加、又は天然／非天然ＣＡＰ構造の付加等である。
天然修飾ヌクレオチドは、例えば、シュードウリジン、５－メチルシチジン、１－メチルアデノシン等である。非天然ヌクレオチドは、例えば、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）等である。
非天然配列は、例えば、人工的に作成された天然には存在しない塩基配列であり、例えば、ランダムな塩基配列、又は天然／非天然アミノ酸と核酸のハイブリッド配列などである。非天然配列は、例えばＲＮＡの末端に付加することが好ましい。
天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＣＡＰ０（ｍ７ＧｐｐｐＮ）、ＣＡＰ１（ｍ７ＧｐｐｐＮｍ）等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－ＲｅｖｅｒｓｅＣａｐＡｎａｌｏｇ）又はＬＮＡ－グアノシン等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えばＲＮＡの５’末端に付加することが好ましい。
上記のように修飾されたＲＮＡを用いれば、細胞内外に存在するＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解が防止される。その結果、第１の配列５の導入効率をより高めることが可能である。
核酸凝縮ペプチド６は、より多くの核酸をより小さく凝縮し、脂質粒子４内に多くの核酸を効率よく内包するためのペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、カチオン性を有するペプチドを用いることが好ましい。カチオン性のペプチドは、例えば、アニオン性の核酸の螺旋形状の隙間に入り込んで隙間を縮めることにより核酸を凝縮することができる。
好ましい核酸凝縮ペプチド６は、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチド６は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。
上記核酸凝縮ペプチド６は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号２）。
このような核酸凝縮ペプチドによれば、Ｒによるカチオン性により核酸を効率よく凝縮し、且つ核酸の有するアニオン性を弱めることが可能であるため、効率よく核酸を脂質粒子４内に封入することが可能である。更に、当該核酸凝縮ペプチドは細胞中で核酸を効率よく解離するため、細胞内に導入された核酸を細胞内で効率よく発現させることが可能である。
或いは、核酸凝縮ペプチド６は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第３のアミノ酸配列）を有し、他方の端にＲＲＲＲＲＲ（第４のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第３のアミノ酸配列、第４のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。
このような核酸凝縮ペプチド６は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）。
このような核酸凝縮ペプチド６は、両端のカチオン性が強く、核酸との結合性が高い。したがって、更に効率よく核酸を凝縮し、より多くの核酸を脂質粒子４内に内包することができる。その結果、脂質粒子４外に残存する核酸の量が低減され、それによって核酸導入キャリア同士の凝集が防止されるため、核酸導入キャリアが細胞内に取り込まれやすくなる。
更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチド６を上記の何れかの核酸凝縮ペプチドと組み合わせて用いることもできる。
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号４）。
このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチド６で凝縮した核酸凝集体を更に凝縮することができる。したがって、更に粒径の小さい核酸導入キャリアを得ることが可能である。そのような核酸導入キャリアは細胞内に取り込まれやすいため、より効率よく核酸を細胞のゲノムに導入することが可能である。
例えば、脂質粒子４に内包する前に、ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とを核酸凝縮ペプチド６と撹拌混合することによってドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とを凝縮することができる。ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とを一緒に凝縮してもよいし、別々に凝縮してもよい。
以上に説明した効果を奏することから核酸凝縮ペプチド６を用いることが好ましいが、用いるドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３の種類、又は導入する細胞の種類によっては核酸凝縮ペプチド６を用いなくともよい。
脂質粒子４は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質粒子４は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。
脂質粒子４の材料として、例えば、生体膜の主成分である脂質を用いることができる。そのような脂質の例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドなどである。これらのうち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いる場合、脂質粒子４の構造と粒子径の制御が容易であるため、また、膜融合能を付与することができるため好ましい。脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さはＣ１０～Ｃ２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
例えば、脂質として、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール
などを用いることが好ましい。これらは、脂質粒子４を形成する機能を有することに加え、核酸導入キャリアを細胞に導入する際、細胞膜と融合する効果が高い。
脂質粒子４は、単一の脂質で構成されてもよいが、複数種類の脂質から構成される脂質混合物であることが好ましい。脂質粒子４に用いる脂質の種類は、目的とする脂質粒子４のサイズ、内包物の種類、導入する細胞中での安定性などを考慮して適切に選択される。
脂質粒子４は上記脂質の他に、第１の生分解性脂質化合物を更に含むことが好ましい。第１の生分解性脂質化合物は、Ｑ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
脂質粒子４が第１の生分解性脂質化合物を含む場合、脂質粒子４の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、核酸の導入率が高まる。その結果、第１の配列５をより効率よく細胞のゲノムに導入することができる。
第１の生分解性脂質化合物として、例えば、下記式で表される構造を有する脂質を用いれば、核酸内包量及び核酸導入効率がより優れているため好ましい。
Figure 0007630904000001
Figure 0007630904000002
Figure 0007630904000003
また例えば、脂質粒子４は、第２の生分解性脂質化合物を更に含むことが好ましい。第２の生分解性脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合またはＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
第２の生分解性脂質化合物を含む場合、Ｐに含まれるエーテル結合を構成する酸素が、内包される核酸と水素結合を形成するため、核酸等の内包量が多くなる。
例えば、以下の構造を有する第２の生分解性脂質化合物を用いれば、核酸内包量及び核酸導入効率がより優れているため好ましい。
Figure 0007630904000004
Figure 0007630904000005
Figure 0007630904000006
以上に説明した第１及び第２の生分解性脂質化合物を含む脂質粒子４を用いた場合、核酸の導入率が高く、かつ導入した細胞の細胞死も低減することができる。第１の生分解性脂質化合物と第２の生分解性脂質化合物との両方を含む場合、遺伝子治療や核酸医療、ゲノム診断などへの応用しやすくなる。特に、式（１－０１）又は式（１－０２）の化合物と、式（２－０１）の化合物とを用いれば核酸内包量及び核酸導入効率が特に優れているため好ましい。
脂質粒子４は、さらにその他の脂質を含むこともできる。このようなその他の脂質は、脂質粒子４において一般的に用いられている物から任意に選択して用いることができる。その他の物質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドなどの脂質粒子４同士の凝集を低減する脂質；毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子４に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロールなどの内包物の漏出を抑制するための脂質などである。
例えば、脂質粒子４は、式（１－０１）又は式（１－０２）の化合物と、式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含む場合、核酸内包量及び核酸導入効率が特に優れているため好ましい。例えば、これらの成分を以下の表１に示す１～６の何れかの組成で含むことが好ましい。
Figure 0007630904000007
脂質粒子４は、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３の他に、更なる化合物を内包していてもよい。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）又はアスコルビン酸などの細胞内での核酸の発現を調節する化合物；ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、腫瘍薬、ホルモン及びステロイドなどの治療剤などである。
核酸導入キャリア１は、例えば、小分子を脂質粒子等に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などを用いて作製することができる。例えば、脂質粒子４の材料をアルコールなどの有機溶媒に含ませて得られた混合物に、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３を含む水性緩衝液を添加し、撹拌して懸濁することにより核酸導入キャリア１を作製することができる。脂質粒子４に内包するドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３の量比は、水性緩衝液中の両者の量比を変えることにより容易に調節することができる。
ＤＮＡ及びＲＮＡの内包量の確認は、例えば、市販のＤＮＡ及びＲＮＡ定量キット等を用いて行うことができる。
核酸導入キャリア１の平均粒子径は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍであり、好ましくは約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。核酸導入キャリア１を医薬用途に用いようとする場合には、核酸導入キャリア１はナノオーダーサイズの粒子とされるのが好ましい。例えば、超音波処理によって粒子径を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、核酸導入キャリア１のサイズを調整することも可能である。なお、核酸導入キャリア１の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
・核酸導入方法
以下に上記核酸導入キャリアを用いた核酸導入方法について説明する。核酸導入方法は、第１の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、核酸導入キャリアを細胞に接触させることを含む。
図２は、核酸導入方法の一例を示す概略フローチャートである。核酸導入方法は、例えば、以下の工程を含む。
（Ｓ１）核酸導入キャリアを細胞に接触させること、
（Ｓ２）前記接触によって、細胞内で、ＲＮＡ剤に含まれるＲＮＡからタンパク質を発現させること、及び
（Ｓ３）タンパク質の活性により第１の配列を細胞のゲノムに導入すること。
核酸導入方法においては、当該方法の実施者が工程（Ｓ１）を行うことによって、核酸導入キャリアに含まれる分子の活性及び細胞内にもともと存在する機構により工程（Ｓ２）及び工程（Ｓ３）が自ずと起こり得る。
細胞は、例えば、ヒト、動物又は植物由来のもの、或いは細菌若又は菌類等の微生物由来のもの等であり得る。細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。細胞は、例えば、血液及び免疫系細胞、間葉系細胞、上皮系細胞、内皮系細胞、或いは組織幹細胞又は多能性幹細胞であることが好ましい。
細胞は、生体外に取り出された細胞であってもよく、例えば、血液などの体液、組織又はバイオプシーなどから分離された細胞であってもよい。細胞は、例えば、単離されたものであってもよいし、株化されたものであってもよい。或いは、細胞は、生体内の細胞であってもよい。
細胞が生体外に取り出された細胞又は微生物である場合、核酸導入キャリア１の細胞７への接触は、例えば、培養されている細胞又は微生物上に上記の核酸導入キャリア１を含む組成物を添加すること等により行うことができる。例えば、添加した後、細胞を３０～４８時間、細胞の生存に適した条件で培養することが好ましい。
細胞が動物の生体内の細胞である場合、接触は、例えば、生体に核酸導入キャリア１を含む組成物を投与することによって行われる。投与は、例えば、非経口経路、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、眼内、肝内、病変内及び頭蓋内への注射又は点滴などによって行うことができる。
細胞が植物の細胞である場合、接触は、核酸導入キャリア１を含む組成物に植物を浸すこと、又はシリンジなどにより植物に組成物を注入することなどにより行うことができる。
実施形態の核酸導入方法に用いられる酵素は、Ｃａｓ９及びトランスポゼースに限られるものではなく、他の核酸導入に関与する酵素を用いても同様に第１の配列５を導入することが可能である。
実施形態の核酸導入方法によれば、酵素がＲＮＡの形態で導入されることにより、ＤＮＡの形態で導入される場合と比較して転写工程を省略することができるので、より迅速かつ高効率で酵素が発現される。したがって、より効率よく第１の配列５を導入することができる。
また、酵素をタンパク質の形態で導入する場合は、内包するタンパク質のサイズや性質に従って脂質粒子４のサイズや組成を調節する必要がある。一方、実施形態の核酸導入方法のようにＲＮＡの形態であれば脂質粒子４の組成に比較的制限がないため、タンパク質の形態で導入する場合と比較して核酸導入キャリアを製造する際の手間やコストを低減することが可能である。
また、酵素をＤＮＡの形態で導入する場合は、酵素の遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれ、細胞又はその細胞を含む生体内で悪影響を及ぼす可能性がある。対して、実施形態の核酸導入方法によれば、当該酵素はＲＮＡの形態で導入されるため、細胞のゲノム上に組み込まれることはなく、それによる悪影響を防止することができる。
加えて、核酸をリポフェクトアミンなどの脂質と結合させて細胞に導入しようとする場合、核酸が分解されたり、不要な分子と凝集したりする可能性がある。また、導入する核酸の存在比を調節しづらい。対して、実施形態の方法によれば、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３を脂質粒子４の内腔４ｂに内包するため、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３を分解や凝集から保護することが可能である。また、導入するドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３の量比を容易に調節することが可能である。したがって、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３を効率よく細胞内に導入し、ＲＮＡを発現させ、第１の配列５を導入することができる。
また、上記のように核酸凝縮ペプチド６を用いること、ＲＮＡに耐分解性を付与すること、また脂質粒子４に生分解性脂質化合物を含めることにより、より導入効率を高めることが可能である。
核酸導入方法は、例えば、ゲノム編集又は遺伝子組換えなどにおけるＤＮＡの導入に利用可能である。例えば、第１の配列５が遺伝子発現カセット、遺伝子又は遺伝子の一部を含む場合、上記核酸導入方法により細胞のゲノムに該遺伝子が導入され、細胞は該遺伝子による新たな機能を得ることができる。例えば、該遺伝子が欠失している細胞、少ない細胞、該遺伝子に異常を有する細胞、部分的に異常を有する細胞に、該遺伝子の正常な機能を付与することが可能である。
或いは、第１の配列５の導入により、細胞のゲノムにおける遺伝子をノックアウトすることができる。例えば、細胞に悪影響をもたらす産物を発現する遺伝子、過剰発現する遺伝子をノックアウトすることにより、細胞に正常な機能を与えることが可能である。また、遺伝子ノックアウトモデル生物を作製することが可能である。
限定されるものではないが、核酸導入方法は、遺伝子治療、モデル動物の産生、遺伝子機能解析、創薬、遺伝子ドライブ又は遺伝子組換作物の産生などの種々の分野において利用可能である。実施形態の方法によれば、より効率よく当該遺伝子を導入することができるため、遺伝子治療効果、モデル動物の産生効率、遺伝子機能解析効果、創薬効率、遺伝子ドライブ効果若しくは効率、又は遺伝子組変生物産生効果若しくは効率などがより高まり得る。
・組成物
実施形態によれば、核酸導入キャリア１と、担体とを含む組成物も提供される。
担体は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液などである。
実施形態の組成物は、核酸導入キャリア及び担体の他に、更なる成分を含んでもよい。更なる成分は、限定されるものではないが、例えば、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリンなどの糖タンパクなどの安定性を改善する薬剤；医薬用途の場合、例えばｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤など、例えば、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリドなどの製薬学的に許容可能であり、医薬組成物を生理的状態に近づける関与剤；フリーラジカルによるダメージを抑制する、α－トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャーや、脂質の過酸化損傷を抑制するフェリオキサミンのような水溶性キレーターなどの貯蔵安定性を改良するための脂質保護剤等の化合物等である。担体及び他の成分は好ましくは、核酸導入キャリアの形成の後に加える。
組成物は、例えば、薬学的に投与可能な組成からなる医薬組成物であってもよい。また、実施形態の組成物は、従来の周知の方法によって滅菌することができる。
組成物は、液体として提供されてもよいし、乾燥した粉末として提供されてもよい。粉末の組成物は、例えば、適切な液体に溶解することにより使用可能となる。
実施形態の組成物中に含まれる核酸導入キャリアの濃度は、限定されるものではないが、０．０１～３０質量％、好ましくは０．０５～１０質量％であることが好ましい。濃度は、目的に応じて適切に選択される。
・キット
実施形態によれば、核酸導入キャリアを含むキットが提供される。キットは、例えば、核酸導入キャリアを含む上記組成物と、細胞に核酸導入キャリアを導入するための試薬を含む。或いは、脂質粒子４の材料を担体に分散させた分散物とドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子４と、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３と、担体とを個別容器に収容したキットなどが提供される。さらに、乾燥させた脂質粒子４又は脂質粒子４の材料の分散物と、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
キットは、上記組成物に含ませることが可能な更なる薬剤を別の容器に収容して含んでもよい。
（第２の実施形態）
第２の実施形態において、ドナーＤＮＡ２及びＲＮＡ剤３がコアシェル構造を有する核酸導入キャリアが提供される。第２の実施形態の核酸導入キャリアの断面図を図３に示す。
図３の（ａ）に示される核酸導入キャリア１００は、ドナーＤＮＡ２を含むドナーＤＮＡコア１５、及びドナーＤＮＡコア１５をコーティングするＲＮＡ剤３を含むＲＮＡ剤シェル１６を含むコアシェル構造を備える。コアシェル構造は、脂質粒子４に内包されている。
核酸導入キャリア１００は、例えば、次のように製造することができる。まず、ドナーＤＮＡ２を核酸凝縮ペプチドで凝縮し、ドナーＤＮＡコア１５を作製する。次にＲＮＡ剤３をドナーＤＮＡコア１５に接触させることによって、ＲＮＡ剤３に含まれるＲＮＡが静電気的にドナーＤＮＡコア１５の周囲に張り付き、ＲＮＡ剤シェル１６が形成される。ＲＮＡ剤３は、核酸凝縮ペプチドで凝縮されたものであってもよい。その結果、コアシェル構造が形成される。次いで、脂質粒子４の材料を含む溶媒にコアシェル構造を添加し、撹拌することによってコアシェル構造が脂質粒子４に内包され、核酸導入キャリア１００が製造される。
このような構造を有することによって、ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３との時間差導入が可能である。例えば、核酸導入キャリア１００が細胞に導入されると、シェルであるＲＮＡ剤３がコアであるドナーＤＮＡ２よりも先に放出され、ＲＮＡ剤３に含まれるＲＮＡから生成した酵素は、ドナーＤＮＡ２よりも先に核内に到達する。そのため、ドナーＤＮＡ２が核内に到達してすぐ第１の配列５の導入が開始され、導入効率が高まり得る。
図３の（ｂ）に示される核酸導入キャリア１０１は、ＲＮＡ剤３を含むＲＮＡ剤コア１７、及びＲＮＡ剤コア１７をコーティングするドナーＤＮＡ２を含むドナーＤＮＡシェル１８を含むコアシェル構造を備える。コアシェル構造は、脂質粒子４に内包されている。
核酸導入キャリア１０１は、例えば、ＲＮＡ剤３を核酸凝縮ペプチドで凝縮してＲＮＡ剤コア１７を作製し、そこにドナーＤＮＡ２を接触させることによってドナーＤＮＡシェル１８が形成される。ドナーＤＮＡ２は、核酸凝縮ペプチドで凝縮されたものであってもよい。次いで、得られたコアシェル構造を脂質粒子４の材料を含む溶媒に添加し、撹拌することによって核酸導入キャリア１０１を製造することができる。
このような構成を有することによって、例えば、核酸導入キャリア１０１が細胞に導入されると、シェルであるドナーＤＮＡ２がコアであるＲＮＡ剤３よりも先に放出され、ＲＮＡ剤３は徐放される。そのため、ＲＮＡ剤から生成した酵素が細胞内で分解されても、再びＲＮＡ剤コア１７からＲＮＡが放出されて酵素が供給されるため、第１の配列５の導入効果を長い間持続させることが可能である。
用いる細胞の種類によって、核酸導入キャリアの構成が選択される。例えば、タンパク質分解が遅い細胞など、ＲＮＡ剤から生成した酵素が先に核内に移行しても問題がない細胞では、図３の（ａ）に示す核酸導入キャリア１００を用いれば導入効率を高めることが可能である。或いは、例えば、分裂周期が速い細胞又はタンパク質分解が速い細胞など、酵素が分解又は消費されやすい細胞では、図３の（ｂ）に示す核酸導入キャリア１０１を用いれば導入効率を高めることが可能である。
コアに含まれる核酸の放出速度及び放出持続時間は、核酸凝縮ペプチドの組成又は量、或いは核酸の量などによって調節可能である。
核酸導入キャリア１００及び１０１は、第１の実施形態の核酸導入キャリアと同様の方法で核酸導入方法に用いることができる。また、第１の実施形態と同様の組成物、キットとして提供されてもよい。
（第３の実施形態）
第３の実施形態によれば、ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とが別々に脂質粒子４内に内包された核酸導入キャリアセットが提供される。核酸導入キャリアセットの一例を図４に示す。核酸導入キャリアセット２００は、第１のキャリア２０１と第２のキャリア２０２を備える。第１のキャリア２０１は、ドナーＤＮＡ２と、ドナーＤＮＡ２を内包する第１の脂質粒子４１とを備える。第２のキャリア２０２は、ＲＮＡ剤３と、ＲＮＡ剤３を内包する第２の脂質粒子４２とを備える。ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とはそれぞれ、核酸凝縮ペプチドで凝縮された状態で内包されていてもよい。
第１のキャリア２０１と第２のキャリア２０２とは、別々に製造され得る。例えば、第１のキャリア２０１と第２のキャリア２０２とはそれぞれ、ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とをそれぞれ核酸凝縮ペプチドで凝縮し、脂質粒子の材料を含む別々の溶液に混合し、撹拌することによって得られる。
核酸導入キャリアセット２００、第１の実施形態と同様の組成物、キットとして提供されてもよい。例えば、第１のキャリア２０１と第２のキャリア２０２とは、例えば、別々の容器に収容された組成物又は同じ１つの容器に収容された組成物として提供される。
核酸導入キャリアセット２００は、第１の実施形態の核酸導入キャリアと同様の方法で核酸導入方法に用いることができる。このような核酸導入キャリアセット２００によれば、核酸導入方法において第１のキャリア２０１と第２のキャリア２０２とのどちらかを先に細胞に接触させることができる。
例えば、上記のようなＲＮＡ剤３を先に核内に移行させることが好ましい細胞を用いる場合、第２のキャリア２０２を第１のキャリア２０１よりも先に細胞に接触させることが好ましい。例えば、第２のキャリア２０２を接触した後、３０分～４８時間後に第１のキャリア２０１を接触させることが好ましい。
或いは、上記のようにドナーＤＮＡ２を先に核内に移行させ、ＲＮＡ剤３を徐放することが好ましい細胞を用いる場合、第１のキャリア２０１を第２のキャリア２０２よりも先に細胞に接触させることが好ましい。例えば、第１のキャリア２０１を接触した後、３０分～４８時間後に第２のキャリア２０２を接触させることが好ましい。
或いは、両者を同時に細胞に接触させてもよい。
核酸導入キャリアセット３００を用いることにより、ドナーＤＮＡ２とＲＮＡ剤３とを時間差導入する場合、導入時間の差を調節しやすい。
［例］
以下に実施形態の核酸導入キャリアを製造及び使用した例について記載する。
例１．ＤＮＡを内包するキャリアによるＮａｎｏＬｕｃ遺伝子の導入効率及び発現効率の評価
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ‐ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂溶液（ＦＦＴ１０（前記式（１－０１）の生分解性脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
・Ｊｕｒｋａｔの調製及びＤＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
ヒトＴ細胞性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ製）をＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養し、遠心で細胞を回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳとを各１５０μＬ加えた。
その後、ＤＮＡ内包キャリアをＤＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・リポフェクタミン３０００によるＤＮＡの細胞への導入
比較対象として、リポフェクタミン３０００試薬（インビトロジェン製）を用いて、上記プラスミドＤＮＡをＪｕｒｋａｔに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。プラスミドＤＮＡは、０．５μｇ／ウェルとなるようにＪｕｒｋａｔに添加され、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
ＤＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００と混合したプラスミドＤＮＡの添加の４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
・ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイの結果
図５にＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を示す。ＤＮＡ内包キャリアによる導入では、リポフェクタミン３０００によって導入した場合よりも発光強度が高かった。この結果から、ＤＮＡ内包キャリアでＤＮＡを導入した細胞では、ＤＮＡがよく導入され、且つＮａｎｏＬｕｃ遺伝子がよく発現していることが明らかである。このことは、ＤＮＡをキャリアに内包して導入する方法は、リポフェクタミンとＤＮＡとの複合体を用いる方法よりもＤＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
・顕微鏡による発光細胞の検出
次に、キャリア又はリポフェクタミン３０００でＤＮＡを添加した上記細胞を用いて、発光顕微鏡システム（ＬＶ２００、オリンパス製）で発光細胞の検出を行った。添加から２４時間後に、細胞培養液１００μＬを４ウェル培養ディッシュに移し、ＮａｎｏＬｕｃ基質（ＬｉｖｅＣｅｌｌＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ、プロメガ製）を添加した。発光顕微鏡システム（ＬＶ２００、オリンパス製）の所定の位置に培養ディッシュをセットした後、細胞の明視野像と発光像を撮影した。
・顕微鏡観察の結果
図６に、発光細胞の撮影画像（Ｍａｔａｍｏｒｐｈソフトウェアによる明視野像と発光像の重ね合わせ画像）を示す。図中矢印で示す白色の点は、発光細胞である。図６の（ａ）は、ＤＮＡ内包キャリアを用いた細胞の顕微鏡画像を示し、図６の（ｂ）は、リポフェクタミン３０００を用いた細胞の顕微鏡画像を示す。両者を比較すると、ＤＮＡ内包キャリアを用いた場合では、リポフェクタミン３０００を用いた場合よりも発光した細胞の数がはるかに多いことが明らかである。この結果は、ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイと同様に、ＤＮＡ内包キャリアを用いた場合、リポフェクタミンとＤＮＡとの複合体を用いるよりもＤＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
例２．ｍＲＮＡを内包するキャリアによる緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子の導入効率及び発現効率の評価
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ（オズバイオサイエンス製）を使用した。このｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質液（ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで縣濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
・Ｊｕｒｋａｔの調製及びＲＮＡ内包キャリアによる核酸の導入
ＪｕｒｋａｔをＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、遠心で細胞を回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳとを各１５０μＬ加えた。
その後、ＲＮＡ内包キャリアをｍＲＮＡが０．５μｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・リポフェクタミン３０００によるｍＲＮＡの細胞への導入
比較対象として、リポフェクタミン３０００試薬を用いて上記ｍＲＮＡをＪｕｒｋａｔに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。ｍＲＮＡは、０．５μｇ／ウェルとなるようにＪｕｒｋａｔに添加され、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＧＦＰの発現検出
ＲＮＡ内包キャリア又はリポフェクタミン３０００と混合したｍＲＮＡの添加の２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）を含むリン酸緩衝液ＰＢＳに懸濁し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）、ＢＤバイオサイエンス製）により、ＧＦＰの緑色蛍光を検出した。
・結果
図７に、検出結果を示す。図７の（ａ）はＲＮＡ内包キャリアにおける結果を示し、図７の（ｂ）は、リポフェクタミン３０００における結果を示す。グラフは、縦軸を細胞数（％）とし、横軸をＧＦＰ発現強度としたヒストグラムを示す。実線のヒストグラムはＲＮＡを導入した細胞における分布、破線のヒストグラムはＲＮＡを導入していない細胞（コントロール）の分布を示す。
図７の（ａ）に示すように、ＲＮＡ内包キャリアで導入した場合、細胞の蛍光強度の分布はコントロールと比較して右側に大きくシフトしており、細胞でＧＦＰがよく発現していることを示している。このことから、ＧＦＰのｍＲＮＡが良く導入され、かつＧＦＰがよく発現していることが明らかである。
対して図７の（ｂ）に示すように、リポフェクタミン試薬を用いてＲＮＡを導入した場合は、蛍光強度の分布はコントロールとほとんど同じものであり、ＧＦＰのｍＲＮＡの導入又は発現が弱いことを示唆している。
従って、ｍＲＮＡをキャリアに内包して導入する方法は、リポフェクタミンとｍＲＮＡとの複合体を用いる方法よりもｍＲＮＡ導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
例３．ｍＲＮＡ形態での導入（ＲＮＡ内包キャリア）及びＤＮＡ形態での導入（ＤＮＡ内包キャリア）におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率及び発現効率の評価
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
ｍＲＮＡとして、例２に記載のＧＦＰのｍＲＮＡを使用した。ＧＦＰのｍＲＮＡを含むＲＮＡ溶液を、エタノール溶解脂質液（ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に加え、ピペッティングで縣濁した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＲＮＡ内包キャリアを得た。キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍで測定し、ｍＲＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを使用した。このＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加えてＤＮＡを凝縮させた後、それをエタノール溶解脂溶液（ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＤＮＡ内包キャリアを得た。キャリアのＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔで測定し、ＤＮＡが十分な量で内包れていることを確認した。
・Ｊｕｒｋａｔの調製及びキャリアによる核酸の導入
ＪｕｒｋａｔをＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、遠心で細胞を回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳとを各１５０μＬ加えた。
ＲＮＡ内包キャリア及びＤＮＡ内包キャリアを１．０μｇ／ウェルとなるようにそれぞれ別のウェル培養プレートの各ウェルに添加し、それぞれ３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＧＦＰの発現検出
キャリアを添加してから２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁し、ＦＡＣＳにより細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）を検出した。
・結果
図８に、検出結果を示す。図８の（ａ）はＲＮＡ内包キャリアにおける結果を示し、図８の（ｂ）は、ＤＮＡ内包キャリアにおける結果を示す。グラフは、縦軸を細胞数（％）とし、横軸をＧＦＰ発現強度としたヒストグラムを示す。実線のヒストグラムはそれぞれキャリアでＲＮＡ又はＤＮＡを導入した細胞における分布を示し、破線のヒストグラムはＲＮＡ又はＤＮＡを導入していない細胞（コントロール）の分布を示す。
図８の（ａ）に示す通り、ｍＲＮＡの形態でＧＦＰ遺伝子を導入した場合、蛍光強度の分布は、コントロールと比較して右側に大きくシフトしており、細胞でＧＦＰがよく発現していることを示している。このことから、ＧＦＰのｍＲＮＡが良く導入され、かつＧＦＰがよく発現していることが明らかである。
対して図８の（ｂ）に示すように、ＤＮＡの形態でＧＦＰ遺伝子を導入した場合は、蛍光強度の分布はコントロールとほとんど同じものであり、ＤＮＡの導入又はＧＦＰの発現が弱いことを示唆している。
従って、ｍＲＮＡの形態でのＧＦＰの導入は、ＤＮＡ形態での導入する場合よりも核酸導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
例４ ＤＮＡ／ＲＮＡ共内包キャリアによるＧＦＰ遺伝子の導入効率及び発現効率の評価
・ＲＮＡ／ＤＮＡ共内包キャリアの調製及びＪｕｒｋａｔへの導入
例１に記載のＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡと、例２に記載のＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡを含む混合溶液を、エタノール溶解脂溶液（ＦＦＴ１０／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＲＮＡ／ＤＮＡ内包キャリアを得た。キャリアのＲＮＡ内包量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡＳｙｓｔｅｍで、ＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔで測定し、ｍＲＮＡ及びＤＮＡが十分な量で含まれることを確認した。
ＪｕｒｋａｔをＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、遠心で細胞を回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに細胞を縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳとを各１５０μＬ加えた。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ内包キャリアをｍＲＮＡとＤＮＡとがそれぞれ０．５μｇ／ウェルとなるようにウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・リポフェクタミン３０００によるｍＲＮＡ及びＤＮＡの細胞への導入
比較対象として、リポフェクタミン３０００試薬を用いて、ｍＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡをＪｕｒｋａｔに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。ｍＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡは、０．５μｇ／ウェルとなるようにＪｕｒｋａｔに添加され、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃ及びＧＦＰの発現検出
ＮａｎｏＬｕｃＤＮＡからのＮａｎｏＬｕｃの発現は、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍで、ＧＦＰｍＲＮＡからのＧＦＰの発現は、ＦＡＣＳで検出した。検出は、それぞれ例１及び例２に記載の方法で行った。
・結果
図９にＮａｎｏＬｕｃの発現を検出した結果を示す。図９に示すグラフから、キャリアでＤＮＡ及びＲＮＡを導入した方が、リポフェクタミン３０００を用いるよりも相対発光強度がはるかに高いことが明らかとなった。この結果は、キャリアを用いた方が、ＤＮＡの導入効率がよく、ＤＮＡからの遺伝子の発現効率がよいことを示している。
図１０にＧＦＰの発現を検出した結果を示す。図１０の（ａ）はキャリアにおける結果を示し、図１０の（ｂ）は、リポフェクタミン３０００における結果を示す。これらのヒストグラムから、キャリアを用いた方が、リポフェクタミン３０００を用いるよりもＧＦＰ蛍光強度が高いことが明らかとなった。この結果は、キャリアを用いた方が、ｍＲＮＡの導入効率がよく、ｍＲＮＡからの遺伝子の発現効率がよいことを示している。
以上の結果から、ＤＮＡ／ＲＮＡ共内包キャリアによれば、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方における導入効率及び発現効率の高い同時導入が可能であることが明らかとなった。
例５．ＤＮＡ内包キャリア及びＲＮＡ内包キャリアによるＤＮＡ及びＲＮＡの時間差導入の評価
・ＤＮＡ内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターとＮａｎｏＬｕｃ遺伝子とを連結したＮａｎｏＬｕｃ遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドＤＮＡを使用した。ＤＮＡ内包キャリアは、例１に記載の方法で調整した。
・ＲＮＡ内包キャリアの調製
ＲＮＡとして、トランスポゼースＲＮＡを使用した。ＲＮＡ内包キャリアは、例２に記載の方法で調整した。
・細胞の調製及びキャリアによる核酸の導入
凍結した市販のヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ、Ｌｏｎｚａ）を３７℃の恒温槽で融解した後、遠心で細胞を回収した。細胞を２種類のサイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ミルテニー））を含むＴｅｘＭＡＣＳに縣濁した後、６ｃｍ培養ディッシュに播種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で培養した。１晩培養した後、インキュベータから培養ディッシュを取り出して、遠心で細胞を回収し、ＴｅｘＭＡＣＳ（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む）に懸濁した後、ＣＤ３抗体（ミルテニー）及びＣＤ２８抗体（ミルテニー）でコーティングした４８ウェル培養プレートで、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で一晩培養した。
細胞培養液にトランスポゼースＲＮＡ内包キャリア（４μｇ）を添加して５％ＣＯ２雰囲気で培養した。２時間後に更にＮａｎｏＬｕｃＤＮＡ内包キャリア（４μｇ）を添加し、培養を継続した。
比較対象として、同様の細胞培養液にトランスポゼースＲＮＡ内包キャリア（４μｇ）及びＮａｎｏＬｕｃＤＮＡ内包キャリア（４μｇ）を同時に添加し、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃの発光検出
最初のキャリア添加から４８時間後、培養プレートをそれぞれインキュベータから取り出して、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ＮａｎｏＬｕｃの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯ、テカン製）でそれぞれ測定した。発光測定は、キットと装置に添付のマニュアルに従った。
・結果
図１１に、ＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を示す。ＤＮＡ内包キャリアとＲＮＡ内包キャリアとを同時に添加した場合よりも、ＲＮＡ内包キャリアの添加の２時間後にＤＮＡ内包キャリアを添加した場合の方が、高いＮａｎｏＬｕｃの発光強度が測定された。この結果から、ＤＮＡの導入を補助するトランスポゼースのｍＲＮＡと導入される配列を含むＤＮＡとの時間差導入が、ＤＮＡからのタンパク質発現量を増加させるのに有効であることが明らかになった。また、実施形態の方法によれば、一般的に核酸導入効率が低いとされているＰＢＭＣにおいてもＤＮＡを効率よく導入及び発現させることが可能であることが明らかとなった。
例６．ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル構造を有するキャリアによる核酸の導入効率の評価
・ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリアの調製
ＤＮＡとして、サイトメガロウイルスプロモーターとＣＡＲ遺伝子とを連結したＣＡＲ遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドＤＮＡを使用し、ＲＮＡとして、例２に記載のＧＦＰ ｍＲＮＡを使用した。当該ＤＮＡを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加えてＤＮＡコアを形成した後、当該ＲＮＡを添加してＤＮＡコアにＲＮＡをシェルとして外套させたＤＮＡ／ＲＮＡコアシェルを含む溶液を調整した。これをエタノール溶解脂溶液（ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル構造を有するキャリアを得た。
・ＤＮＡ／ＲＮＡ混合内包キャリアの調製
比較対象として、上記ＤＮＡ及びＲＮＡを含む混合溶液にカチオン性ペプチドを加えてＤＮＡ／ＲＮＡ混合コアを含む溶液を調整し、これにエタノール溶解脂溶液（ＦＦＴ１０／ＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝７３／４４／５９／４ｍｏｌ）に添加し、更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮することによりＤＮＡ／ＲＮＡ混合内包キャリアを得た。
・キャリア内へのＤＮＡ／ＲＮＡの内包の確認
次に、得られた両キャリアにＤＮＡ及びＲＮＡが内包されたか否かを確認するために、キャリア開裂（界面活性剤：ドデシル硫酸ナトリウムの添加）及びコア構造破壊（ポリグルタミン酸の添加）を行い、放出されたＤＮＡ／ＲＮＡをアガロース電気泳動で検出した。
図１２にその結果を示す。ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリア及びＤＮＡ／ＲＮＡ混合コア内包キャリアの両方において、キャリア開裂とコア構造破壊との両方一度におこなった条件でのみＤＮＡとＲＮＡとのシグナル（図中矢印）が検出された。この結果から、ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリア及びＤＮＡ／ＲＮＡ混合コア内包キャリアの両方に、ＤＮＡ及びＲＮＡの凝集物が含まれることが確認された。
・細胞の蛍光顕微鏡観察
ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリア及びＤＮＡ／ＲＮＡ混合コア内包キャリアを、Ｊｕｒｋａｔに導入して２０時間後、緑色蛍光を有する細胞（ＧＦＰ発現細胞）を蛍光顕微鏡で検出した。図１３にその結果を示す顕微鏡写真を示す。ＤＮＡ／ＲＮＡ混合コア内包キャリアでは、キャリア導入の２０時間後の時点ではＧＦＰ発現細胞は検出されなかったが（図１３の（ｂ））、４日後にＧＦＰ発現細胞が検出された（図１３の（ｄ）の矢印）。対して、ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリアでは、キャリア添加から２０時間後にＧＦＰ発現細胞が検出された（図１３の（ａ）の矢印）。この結果は、ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェルにおけるＲＮＡの発現が、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合コアに比べて早いことを示唆している。したがって、ＤＮＡ／ＲＮＡコアシェル内包キャリアでは、細胞内でＤＮＡ／ＲＮＡコアが時間差分解され、ＲＮＡシェルからコアＤＮＡの順にタンパク質を発現させることが可能であることが明らかとなった。
以下、本出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
第１の配列を含むドナーＤＮＡと、
ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、
前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡ剤を内包する脂質粒子と
を備える、
前記第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリア。
［２］
前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡ剤は、前記ドナーＤＮＡがコアであり、前記ＲＮＡ剤がシェルであるコアシェル構造を有する［１］に記載の核酸導入キャリア。
［３］
前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡ剤は、前記ＲＮＡ剤がコアであり、前記ドナーＤＮＡがシェルであるコアシェル構造を有する［１］に記載の核酸導入キャリア。
［４］
前記タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である［１］～［３］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［５］
前記タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、［４］に記載の核酸導入キャリア。
［６］
前記ＲＮＡ剤は、前記第１の配列を導入するための前記ゲノム上の配列に対応する配列を含むガイドＲＮＡを更に含む［５］に記載の核酸導入キャリア。
［７］
前記タンパク質は、トランスポゼースである［１］～［３］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［８］
前記タンパク質は、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である［７］に記載の核酸導入キャリア。
［９］
前記ＲＮＡ剤は、ＤＮＡをメチル化するタンパク質をコードするＲＮＡ、ＤＮＡを脱メチル化するタンパク質をコードするＲＮＡ、ＤＮＡを修復するタンパク質をコードするＲＮＡ及び／又はＤＮＡを結合するタンパク質をコードするＲＮＡを更に含む［１］～［８］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［１０］
前記ＲＮＡ剤に含まれるＲＮＡは、分解に耐性を有するように修飾されている［１］～［９］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［１１］
前記ドナーＤＮＡ及び／又は前記ＲＮＡ剤は、核酸凝縮ペプチドで凝縮されている［１］～［１０］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［１２］
前記脂質粒子は、式Ｑ－ＣＨＲ ２
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ １２ ～Ｃ ２４ の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される第１の生分解性脂質を更に含む［１］～［１１］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［１３］
前記脂質粒子は、式Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］ ２
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ １ ～Ｃ ６ アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合またはＣ １ ～Ｃ ６ アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ １２ ～Ｃ ２２ 脂肪族炭化水素基である）
で表される第２の生分解性脂質を更に含む［１］～［１２］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
［１４］
第１の配列を含むドナーＤＮＡと、前記ドナーＤＮＡを内包する第１の脂質粒子とを備える第１のキャリア、及び
ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、前記ＲＮＡ剤を内包する第２の脂質粒子とを備える第２のキャリア
を含む、
前記第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリアセット。
［１５］
［１］～［１３］の何れか１項に記載の核酸導入キャリア又は［１４］に記載の核酸導入キャリアセットと、
担体と
を含む核酸導入組成物。
［１６］
第１の配列を含むドナーＤＮＡと、ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡを内包する脂質粒子とを備える核酸導入キャリアを用いて、前記第１の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、前記核酸導入キャリアを前記細胞に接触させることを含む核酸導入方法。
［１７］
前記核酸導入キャリアの前記細胞への接触によって、前記細胞内で前記ＲＮＡから前記タンパク質を発現させること、及び
前記タンパク質の活性により前記第１の配列を前記細胞の前記ゲノムに導入すること
を更に含む［１６］に記載の方法。
［１８］
前記核酸導入キャリアの前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡ剤は、前記ドナーＤＮＡがコアであり、前記ＲＮＡ剤がシェルであるコアシェル構造を有する［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］
前記ＲＮＡから発現された前記タンパク質が、前記ドナーＤＮＡよりも早く前記細胞の核内に到達する［１８］に記載の方法。
［２０］
前記核酸導入キャリアの前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡ剤は、前記ＲＮＡ剤がコアであり、前記ドナーＤＮＡがシェルであるコアシェル構造を有する［１６］又は［１７］に記載の方法。
［２１］
前記ＲＮＡが前記細胞内で徐放される［２０］に記載の方法。
［２２］
第１の配列を含むドナーＤＮＡと、前記ドナーＤＮＡを内包する脂質粒子とを備える第１のキャリア、及び
ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを少なくとも含むＲＮＡ剤と、前記ＲＮＡ剤を内包する脂質粒子とを備える第２のキャリア
を用いて、前記第１の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、
前記第１のキャリアと第２のキャリアとを前記細胞に接触させることを含む核酸導入方法。
［２３］
前記第１のキャリアを前記細胞に接触させた後、前記第２のキャリアを前記細胞に接触させる、［２２］に記載の方法。
［２４］
前記第２のキャリアを前記細胞に接触させた後、前記第２のキャリアを前記細胞に接触させる、［２２］に記載の方法。
［２５］
前記第１のキャリアと前記第２のキャリアとを同時に前記細胞に接触させる、［２３］に記載の方法。
［２６］
前記タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である［１６］～［２５］の何れか１項に記載の方法。
［２７］
前記タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、［２６］に記載の方法。
［２８］
前記ＲＮＡ剤は、前記第１の配列を導入するための前記ゲノム上の配列に対応する配列を含むガイドＲＮＡを更に含む［２７］に記載の方法。
［２９］
前記タンパク質は、トランスポゼースである［１６］～［２５］の何れか１項に記載の方法。
［３０］
前記タンパク質は、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である［２９］に記載の方法。
１、１００、１０１…核酸導入キャリア
２…ドナーＤＮＡ
３…ＲＮＡ剤
３ａ…ＲＮＡ
３ｂ…ガイドＲＮＡ
４…脂質粒子
５…第１の配列
６…核酸凝縮ペプチド
２００…核酸導入キャリアセット
２０１…第１のキャリア
２０２…第２のキャリア

Claims (15)

  1. 第１の配列を含むドナーＤＮＡと、
    ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ配列を少なくとも含むＲＮＡと、
    前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡを内包する脂質粒子と
    を備え、
    前記脂質粒子に内包される前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡは、前記ドナーＤＮＡを備えるドナーＤＮＡコア層、及び、前記ドナーＤＮＡコア層をコーティングし、前記ドナーＤＮＡコア層の前記ドナーＤＮＡに接する前記ＲＮＡを備えるＲＮＡシェル層で構成される２層のコアシェル構造を形成している、
    前記第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリア。
  2. 第１の配列を含むドナーＤＮＡと、
    ゲノムへの前記第１の配列の導入に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ配列を少なくとも含むＲＮＡと、
    前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡを内包する脂質粒子と
    を備え、
    前記脂質粒子に内包される前記ドナーＤＮＡ及び前記ＲＮＡは、前記ＲＮＡを備えるＲＮＡコア層、及び、前記ＲＮＡコア層をコーティングし、前記ＲＮＡコア層の前記ＲＮＡに接する前記ドナーＤＮＡを備えるドナーＤＮＡシェル層で構成される２層のコアシェル構造を形成している、
    前記第１の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリア。
  3. 前記タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である請求項１又は２に記載の核酸導入キャリア。
  4. 前記タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項３に記載の核酸導入キャリア。
  5. 前記ＲＮＡは、前記第１の配列を導入するための前記ゲノム上の配列に対応する配列を含むガイドＲＮＡを含む、請求項４に記載の核酸導入キャリア。
  6. 前記タンパク質は、トランスポゼースである請求項１又は２に記載の核酸導入キャリア。
  7. 前記タンパク質は、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３－ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である請求項６に記載の核酸導入キャリア。
  8. 前記ＲＮＡは、ＤＮＡをメチル化するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、ＤＮＡを脱メチル化するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、ＤＮＡを修復するタンパク質をコードするＲＮＡ配列及び／又はＤＮＡを結合するタンパク質をコードするＲＮＡ配列を含む、請求項１～７の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
  9. 前記ＲＮＡは、分解に耐性を有するように修飾されている請求項１～８の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
  10. 前記ドナーＤＮＡ及び／又は前記ＲＮＡは、核酸凝縮ペプチドで凝縮されている請求項１～９の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
  11. 前記脂質粒子は、式Ｑ－ＣＨＲ２
    （式中、
    Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
    Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
    少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）で表される第１の生分解性脂質を更に含む請求項１～１０の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
  12. 前記脂質粒子は、式Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２
    （式中、
    Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
    Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
    Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
    Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
    Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合またはＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
    Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
    で表される第２の生分解性脂質を更に含む請求項１～１０の何れか１項に記載の核酸導入キャリア。
  13. 請求項１～１２の何れか１項に記載の核酸導入キャリアと、
    担体と
    を含む核酸導入組成物。
  14. 請求項１～１３の何れか１項に記載の核酸導入キャリアを用いて、前記第１の配列を生体外に存在する細胞のゲノムに導入する方法であって、前記核酸導入キャリアを前記細胞に接触させることを含む核酸導入方法。
  15. 前記核酸導入キャリアの前記細胞への接触によって、前記細胞内で前記ＲＮＡから前記タンパク質を発現させること、及び
    前記タンパク質の活性により前記第１の配列を前記細胞の前記ゲノムに導入することを更に含む請求項１４に記載の方法。
JP2019135474A 2019-07-23 2019-07-23 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 Active JP7630904B2 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019135474A JP7630904B2 (ja) 2019-07-23 2019-07-23 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法
CN202080004819.9A CN112639113A (zh) 2019-07-23 2020-02-28 核酸递送载体、核酸递送载体组、核酸递送组合物和核酸递送方法
CN202411097059.7A CN118979066A (zh) 2019-07-23 2020-02-28 核酸递送载体、核酸递送载体组、核酸递送组合物和核酸递送方法
PCT/IB2020/051711 WO2021014224A1 (en) 2019-07-23 2020-02-28 Nucleic acid delivery carrier, nucleic acid delivery carrier set, nucleic acid delivery composition, and nucleic acid delivery method
EP20716922.8A EP4004220A1 (en) 2019-07-23 2020-02-28 Nucleic acid delivery carrier, nucleic acid delivery carrier set, nucleic acid delivery composition, and nucleic acid delivery method
US17/189,376 US20210230636A1 (en) 2019-07-23 2021-03-02 Nucleic acid delivery carrier, nucleic acid delivery carrier set, nucleic acid delivery composition, and nucleic acid delivery method
JP2023079952A JP7646729B2 (ja) 2019-07-23 2023-05-15 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019135474A JP7630904B2 (ja) 2019-07-23 2019-07-23 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023079952A Division JP7646729B2 (ja) 2019-07-23 2023-05-15 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021016370A JP2021016370A (ja) 2021-02-15
JP7630904B2 true JP7630904B2 (ja) 2025-02-18

Family

ID=70166079

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019135474A Active JP7630904B2 (ja) 2019-07-23 2019-07-23 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法
JP2023079952A Active JP7646729B2 (ja) 2019-07-23 2023-05-15 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023079952A Active JP7646729B2 (ja) 2019-07-23 2023-05-15 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210230636A1 (ja)
EP (1) EP4004220A1 (ja)
JP (2) JP7630904B2 (ja)
CN (2) CN112639113A (ja)
WO (1) WO2021014224A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7769325B2 (ja) 2019-07-23 2025-11-13 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
CN117279888A (zh) * 2021-04-28 2023-12-22 富士胶片株式会社 化合物或其盐、脂质颗粒及药物组合物
JP2022187826A (ja) * 2021-06-08 2022-12-20 株式会社東芝 核酸送達キャリア、その製造方法、核酸送達方法、細胞製造方法、細胞検出方法及びキット
AU2022291742A1 (en) * 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
WO2025010554A1 (en) * 2023-07-07 2025-01-16 Yoltech Therapeutics Co., Ltd. Lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545375A (ja) 2005-05-14 2008-12-18 フダン ユニバーシテイ 脊椎動物の遺伝子操作および解析のための手段としてのｐｉｇｇｙＢａｃ
JP2010505877A (ja) 2006-10-05 2010-02-25 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー スマートな高分子ナノ粒子を用いた低水溶性薬物用の水分散性経口、非経口および局所的製剤
WO2016124765A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Cellectis Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles
WO2018064371A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 The Regents Of The University Of California Rna-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
WO2018107026A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
WO2018112282A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
JP2019507579A (ja) 2015-10-28 2019-03-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための材料および方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
GB9930533D0 (en) * 1999-12-23 2000-02-16 Mitsubishi Tokyo Pharm Inc Nucleic acid delivery
CA2740000C (en) * 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP2970985A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives
CA2969619A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CA3009715A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-06 Avectas Limited Vector-free delivery of gene editing proteins and compositions to cells and tissues
WO2018096457A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-31 Kabushiki Kaisha Toshiba Nucleic acid condensing peptide, nucleic acid condensing peptide set, nucleic acid delivery carrier, nucleic acid delivery method, cell production method, cell detection method and kit
EP3792246B1 (en) * 2018-03-16 2024-11-27 Kabushiki Kaisha Toshiba Biodegradable compound, lipid particle, lipid particle-containing composition, and kit

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545375A (ja) 2005-05-14 2008-12-18 フダン ユニバーシテイ 脊椎動物の遺伝子操作および解析のための手段としてのｐｉｇｇｙＢａｃ
JP2010505877A (ja) 2006-10-05 2010-02-25 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー スマートな高分子ナノ粒子を用いた低水溶性薬物用の水分散性経口、非経口および局所的製剤
WO2016124765A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Cellectis Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles
JP2019507579A (ja) 2015-10-28 2019-03-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための材料および方法
WO2018064371A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 The Regents Of The University Of California Rna-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
WO2018107026A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
WO2018112282A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery

Also Published As

Publication number Publication date
EP4004220A1 (en) 2022-06-01
JP2023091069A (ja) 2023-06-29
JP2021016370A (ja) 2021-02-15
JP7646729B2 (ja) 2025-03-17
CN118979066A (zh) 2024-11-19
CN112639113A (zh) 2021-04-09
US20210230636A1 (en) 2021-07-29
WO2021014224A1 (en) 2021-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7646729B2 (ja) 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法
JP7600208B2 (ja) 拘束された脂質を含むナノ材料およびその使用
EP0759694B1 (en) Method for in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
JP7447389B2 (ja) Ｔ細胞遺伝子発現の非ウイルス性改変
JP6887020B2 (ja) 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
JP2023153231A (ja) Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
US20240384277A1 (en) Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
JP2024086785A (ja) 生物学的製剤の粒子媒介送達
JP7419168B2 (ja) 改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法
JP6826014B2 (ja) 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
CN104758254A (zh) 颗粒组合物和含有其的医药组合物
CN117500819A (zh) 脂质和组合物
CN113968968B (zh) 氨基脂质化合物、其制备方法和应用
EP4431085A1 (en) Lipid composition and substance delivery method
WO2025260432A1 (zh) 细胞膜包封脂质纳米颗粒及其制备方法与应用
CN118252815A (zh) 一种细胞膜包被核酸脂质复合物纳米粒及其制备方法和应用
KR20060132927A (ko) 복합 입자 및 피복 복합 입자
JPWO2005054486A1 (ja) 遺伝子導入試薬調製法
CN120837451B (zh) 一种基于积雪草酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用
WO2025063214A1 (ja) 核酸を内封したリガンド修飾脂質ナノ粒子の製造方法
CN101259289B (zh) 用于rna干扰的治疗用途的方法及组合物
JP2003164289A (ja) 骨組織導入用遺伝子
CN119770672A (zh) 一种心脏靶向的纳米脂质体递送载体、治疗心血管疾病的环状rna药物及其制备方法和应用
JP2026044130A (ja) 遺伝子改変用薬剤、薬剤送達方法、及び薬剤送達キャリア
CN121714717A (zh) 一种新型LNP基因药物siRNA递送载体及其构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210903

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221031

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230214

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230515

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230519

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20230616

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250205

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7630904

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150