JP7633787B2 - 細胞外小胞の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞外小胞の製造方法に関する。
従来、薬理効果の増強および副作用の軽減などの観点から、体内での薬物の分布を、空間的、時間的および量的に制御する技術についての検討が行われている。前記技術はドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれており、近年では、例えば、がん細胞などの目的の細胞に対して目的の薬剤を効率よく作用させるべく、細胞レベルでのＤＤＳ技術の向上が望まれている。
このような細胞レベルでのＤＤＳに関する技術として、たとえば、特許文献１に記載の技術が知られている。特許文献１には、抗腫瘍活性を有する化合物等の外来物質を対象細胞（例えばがん細胞）内に導入するためのエクソソームであって、前記外来物質等を内包するエクソソームが提案されている。
上記特許文献１には、外来物質等をエクソソームに内包させる方法として、エレクトロポーション法（電気穿孔法）が記載されている。前記エレクトロポーション法では、外来物質等を含む懸濁液に所定の電気パルスを負荷してエクソソームに微小な穴をあけることにより、外来物質等が導入されるため、エクソソームが破壊されることがある。また、前記方法では、エクソソーム内への外来物質等の導入率が低い（外来物質等の内包量が少ない）という問題もあり、改善が求められている。
本発明の課題は、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供することである。
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、核酸医薬を内包する細胞外小胞の製造方法であって、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含み、工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬である細胞外小胞の製造方法である。
本発明によれば、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供できる。
本発明の細胞外小胞の製造方法は、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含む。工程１は核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程である。以下の説明において、「配列（１）」とは、本明細書中または配列表における「配列番号（１）」を意味し、配列（１）以外の配列についても同様である。
核酸医薬は遺伝子発現を介さずに直接生体に作用する。また、核酸医薬は標的物質に対し、高い特異性を有する医薬である。核酸医薬としては、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ヘテロ核酸などがあげられる。工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する。
工程１で用いる核酸医薬としては、３’末端が核酸アプタマーまたはポリエチレングリコール鎖により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬、および５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物または核酸アプタマーにより修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬が好ましく、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、かつ、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬がより好ましい。３’末端が核酸アプタマーにより修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬は、細胞外小胞内へ導入されやすいので、細胞外小胞における核酸医薬内包量を多くすることができる。５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬は、分解酵素による分解を抑制するため安定性に優れ、対象となる細胞での滞留時間を長くすることができる。
センス鎖の３’末端を修飾しうる核酸アプタマーとしては、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸、ならびに、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。核酸アプタマーは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子のことをいい、天然由来のものであってもよいし、公知の方法（後述のＳＥＬＥＸ法など）により製造したものであってもよい。
核酸アプタマーは３’末端と５’末端のいずれか一方またはそれらの両方が修飾されていてもよい。末端が修飾されているものによれば、核酸の安定性を改善することができる。核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は、核酸アプタマー立体構造によりもたらされるので、その立体構造が維持される限り、核酸アプタマーの末端に他の塩基配列や修飾物質が付加されていても、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性を維持することができる。末端修飾の例としてはビオチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、蛍光物質、発光物質、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ぺプチド、アミノ酸、脂質などが挙げられる。上記修飾は、スペーサー配列を介して核酸アプタマーに対して結合されていてもよい。スペーサー配列は任意の長さとしうるが、好ましくは０～２０塩基としうる。
核酸アプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得してもよい（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ． ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５０５－５１０，１９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列を含む核酸ライブラリーから、標的分子と結合する核酸を選択し増幅するサイクルを複数回、例えば５～２０回繰り返すことによって、標的分子と高い親和性で結合する核酸のみを選別する方法である。ＳＥＬＥＸ法により取得した核酸アプタマーは、その塩基配列を決定した後、従来公知の種々の合成法によって調製することができる。例えば、核酸アプタマーは化学合成法によって調製することができる。
センス鎖の５’末端を修飾しうるポリエチレングリコール鎖を有する化合物としては、ポリエチレングリコール、直鎖型または分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルなどが挙げられる。ポリエチレングリコール鎖を有する化合物としては、油化産業株式会社製のポリエチレングリコール修飾剤［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）シリーズ］を用いてもよい。５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖は、例えば、５’末端にアミノ基を有する核酸（センス鎖となる核酸）と、ポリエチレングリコール鎖を有する化合物とを反応させることにより得ることができる。
核酸医薬が有するアンチセンス鎖は、５’末端および／または３’末端が修飾されているものであってもよい。核酸医薬のアンチセンス鎖の５’末端および３’末端は、それぞれ、センス鎖の３’末端および５’末端と対向する位置に配されており、アンチセンス鎖の塩基配列はセンス鎖の塩基配列と相補的である。
本発明で用いうる核酸医薬の具体例について説明する。核酸医薬としては、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（３）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（４）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（５）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（６）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（７）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（８）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（９）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１０）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１３）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１４）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１５）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１６）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、ならびに、５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、配列（２１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（２２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、があげられる。
細胞外小胞の供給源細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来間葉系幹細胞、ヒト以外の動物（具体的には哺乳動物）由来の初代培養細胞、継代細胞、および細胞株（セルライン）などの各種培養細胞、ならびに生体内に存在する種々の細胞（例えば上皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、免疫系細胞、造血系細胞など）などがあげられる。
工程１において、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する際には、核酸医薬とともに、トランスフェクション試薬を用いることが好ましい。トランスフェクション試薬を用いると、核酸医薬が前記供給源細胞内に導入されやすくなる。トランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選ばれるものを用いることができる。トランスフェクション試薬としては、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）シリーズを用いてもよい。
細胞外小胞の供給源細胞の培養条件（温度、環境及び時間など）は、特に限定されず、前記供給源細胞の種類、核酸医薬の種類などを考慮して選択することができる。例えば前記供給源細胞がヒト由来間葉系幹細胞で、核酸医薬がルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである場合、培養温度は３５℃～３９℃が好ましく、ＣＯ２条件下で行うことが好ましい。培養時間は細胞の性質を考慮し、適宜設定することができる。
本発明の細胞外小胞の製造方法は、工程１を行った後に得られる培養液から細胞外小胞を精製および／または分離する工程（工程２）を含んでいてもよい。培養液から細胞外小胞を精製または分離する方法としては、例えば遠心分離法などの方法があげられる。
本発明の製造方法で得られる細胞外小胞は、好ましくは直径が１０ｎｍ以上、より好ましくは２０ｎｍ以上であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下である。細胞外小胞の直径が下限値以上であることにより、核酸医薬の内包量を増やすことができ、細胞外小胞の直系が上限値以下であることにより、核酸医薬を内包する細胞外小胞が前記供給源細胞から外部に分泌されやすくなる。また、細胞外小胞を標的細胞に対して投与した際に、エンドサイトーシスによる標的細胞への細胞外小胞の取り込みがされやすくなる。細胞外小胞の直径の測定は、例えばナノ粒子マルチアナライザー（ｑＮａｎｏ）を使用することにより行うことができる。細胞外小胞の直径とは、平均粒径をいう。
細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。本発明において細胞外小胞としては、エクソソームが好ましい。
本発明によれば、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養することにより、細胞外小胞の内部に含まれる核酸医薬量（核酸医薬の内包量）を向上させることが可能である。このような効果が得られるメカニズムは、以下のように推測されるが、本発明の効果が得られるメカニズムは、下記に限定されない。
３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養すると、前記供給源細胞の細胞膜から前記供給源細胞の内部へと核酸医薬が導入される。前記供給現細胞内に導入された核酸医薬はエンドソーム内へと輸送される。核酸医薬が輸送された初期エンドソームでは内部のｐＨが低下し、核酸医薬はプロトン化されて当該エンドソーム内の浸透圧を上げ、これにより、核酸医薬のエンドソーマルエスケープが起こる。エンドソーマルエスケープした核酸医薬は前記供給源細胞の細胞膜内層と、初期エンドソームから移行した後期エンドソームの外層に結合する。後期エンドソームでは、当該エンドソームが内側にくびれることにより複数の腔内膜小胞が形成される。この腔内小胞内には核酸医薬が導入され、これにより核酸医薬を内包した細胞外小胞が形成される。このようにして形成された核酸医薬を内包した細胞外小胞は、前記供給源細胞の細胞膜と融合し、当該供給源細胞の外へと放出される。
本発明では、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬を用いることで、核酸医薬が前記供給源細胞の細胞膜内層及び後期エンドソームの外層に結合しやすくなり、その結果、細胞内小胞の内部に含まれる核酸医薬量を向上させることが可能となると考えられる。また、本発明では、核酸医薬を導入する際に、細胞外小胞の細胞膜にエレクトロポレーション法等によって微小な穴をあける必要はないので、細胞外小胞の破壊は生じにくい。その結果、核酸医薬を内包した細胞外小胞の粒子数を増やすことができ、さらに、細胞外小胞内への核酸医薬の導入量を増やすことができると考えられる。
本発明では、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬を用いることで、核酸医薬が前記供給源細胞の細胞膜内層及び後期エンドソームの外層に結合しやすくなり、その結果、細胞内小胞の内部に含まれる核酸医薬量を向上させることが可能となると考えられる。また、本発明では、核酸医薬を導入する際に、細胞外小胞の細胞膜にエレクトロポレーション法等によって微小な穴をあける必要はないので、細胞外小胞の破壊は生じにくい。その結果、核酸医薬を内包した細胞外小胞の粒子数を増やすことができ、さらに、細胞外小胞内への核酸医薬の導入量を増やすことができると考えられる。
本発明の製造方法によれば、核酸医薬の内包量を向上させることができ、その結果、本発明の製造方法により得られる細胞外小胞を用いることにより核酸医薬を効率よく作用させることができる。よって、例えば、核酸医薬として標的遺伝子の発現抑制効果を有する核酸医薬を用いた場合には、標的遺伝子の発現抑制効果の高い核酸医薬内包細胞外小胞を容易に製造することができる。
本発明の製造方法により得られる細胞外小胞は、目的の細胞に対して目的の薬剤（核酸医薬）を作用させる薬剤送達システムに好適に用いることができるので、核酸医薬の実用化において、極めて有用である。
本発明の製造方法により得られる細胞外小胞は、目的の細胞に対して目的の薬剤（核酸医薬）を作用させる薬剤送達システムに好適に用いることができるので、核酸医薬の実用化において、極めて有用である。
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。核酸の塩基配列（配列）は５’末端から３’末端方向に左から右へ記載した。
＜製造例１：核酸医薬（Ａ－１）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１）の塩基配列を有する核酸１および配列（２）の塩基配列を有する核酸２を委託合成した。
核酸１をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸２と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１）を得た。核酸医薬（Ａ－１）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１）の塩基配列を有する核酸１および配列（２）の塩基配列を有する核酸２を委託合成した。
核酸１をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸２と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１）を得た。核酸医薬（Ａ－１）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
＜製造例２：核酸医薬（Ａ－２）の合成＞
製造例１において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－２）を得た。核酸医薬（Ａ－２）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
製造例１において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－２）を得た。核酸医薬（Ａ－２）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
＜製造例３：核酸医薬（Ａ－３）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（３）の塩基配列を有する核酸３および配列（４）の塩基配列を有する核酸４を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－３）を得た。核酸医薬（Ａ－３）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（４）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（３）の塩基配列を有する核酸３および配列（４）の塩基配列を有する核酸４を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－３）を得た。核酸医薬（Ａ－３）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（４）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
＜製造例４：核酸医薬（Ａ－４）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（５）の塩基配列を有する核酸５および配列（６）の塩基配列を有する核酸６を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－４）を得た。核酸医薬（Ａ－４）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａｇａｃ－３’
［配列番号（６）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａｇａｃ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（５）の塩基配列を有する核酸５および配列（６）の塩基配列を有する核酸６を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－４）を得た。核酸医薬（Ａ－４）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａｇａｃ－３’
［配列番号（６）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａｇａｃ－３’
＜製造例５：核酸医薬（Ａ－５）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（７）の塩基配列を有する核酸７および配列（８）の塩基配列を有する核酸８を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－５）を得た。核酸医薬（Ａ－５）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（７）の塩基配列を有する核酸７および配列（８）の塩基配列を有する核酸８を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－５）を得た。核酸医薬（Ａ－５）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
＜製造例６：核酸医薬（Ａ－６）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（９）の塩基配列を有する核酸９（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１０）の塩基配列を有する核酸１０（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
核酸９をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸１０と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－６）を得た。核酸医薬（Ａ－６）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａａｇａ－３’
［配列番号（１０）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａａｇａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（９）の塩基配列を有する核酸９（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１０）の塩基配列を有する核酸１０（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
核酸９をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸１０と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－６）を得た。核酸医薬（Ａ－６）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａａｇａ－３’
［配列番号（１０）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａａｇａ－３’
＜製造例７：核酸医薬（Ａ－７）の合成＞
製造例６において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例６と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－７）を得た。核酸医薬（Ａ－７）はルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
製造例６において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例６と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－７）を得た。核酸医薬（Ａ－７）はルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
＜製造例８：核酸医薬（Ａ－８）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１１）の塩基配列を有する核酸１１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１２）の塩基配列を有する核酸１２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－８）を得た。核酸医薬（Ａ－８）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（１２）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１１）の塩基配列を有する核酸１１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１２）の塩基配列を有する核酸１２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－８）を得た。核酸医薬（Ａ－８）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（１２）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
＜製造例９：核酸医薬（Ａ－９）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１３）の塩基配列を有する核酸１３（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１４）の塩基配列を有する核酸１４（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－９）を得た。核酸医薬（Ａ－９）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａｇａｃ－３’
［配列番号（１４）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａｇａｃ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１３）の塩基配列を有する核酸１３（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１４）の塩基配列を有する核酸１４（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－９）を得た。核酸医薬（Ａ－９）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａｇａｃ－３’
［配列番号（１４）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａｇａｃ－３’
＜製造例１０：核酸医薬（Ａ－１０）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１５）の塩基配列を有する核酸１５（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１６）の塩基配列を有する核酸１６（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１０）を得た。核酸医薬（Ａ－１０）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（１６）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１５）の塩基配列を有する核酸１５（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１６）の塩基配列を有する核酸１６（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１０）を得た。核酸医薬（Ａ－１０）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（１６）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
＜製造例１１：比較の核酸医薬（Ａ－１１）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（５’末端および３’末端のいずれも修飾なし）及び配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１７と、核酸１８とを混合することで、５’末端および３’末端が修飾されていないセンス鎖とアンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１１）を得た。核酸医薬（Ａ－１１）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔ－３’
［配列番号（１８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（５’末端および３’末端のいずれも修飾なし）及び配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１７と、核酸１８とを混合することで、５’末端および３’末端が修飾されていないセンス鎖とアンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１１）を得た。核酸医薬（Ａ－１１）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔ－３’
［配列番号（１８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔ－３’
＜製造例１２：比較の核酸医薬（Ａ－１２）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含む配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（３’末端の修飾なし）および配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１２）を得た。核酸医薬（Ａ－１２）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含む配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（３’末端の修飾なし）および配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１２）を得た。核酸医薬（Ａ－１２）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
＜製造例１３：比較の核酸医薬（Ａ－１３）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１９）の塩基配列を有する核酸１９（５’末端の修飾なし）および配列（２０）の塩基配列を有する核酸２０（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１９と、核酸２０とを混合することで、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１３）を得た。核酸医薬（Ａ－１３）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２０）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１９）の塩基配列を有する核酸１９（５’末端の修飾なし）および配列（２０）の塩基配列を有する核酸２０（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１９と、核酸２０とを混合することで、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１３）を得た。核酸医薬（Ａ－１３）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２０）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
＜製造例１４：核酸医薬（Ａ－１４）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端に核酸アプタマーを含み、３’末端にアミノ基を含む配列（２１）の塩基配列を有する核酸２１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（２２）の塩基配列を有する核酸２２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸２１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸２２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１４）を得た。核酸医薬（Ａ－１４）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（２１）：センス鎖］
５’－ａａａｇａｃｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａ－３’
［配列番号（２２）：アンチセンス鎖］
５’－ａａａｇａｃｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇ－３’
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端に核酸アプタマーを含み、３’末端にアミノ基を含む配列（２１）の塩基配列を有する核酸２１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（２２）の塩基配列を有する核酸２２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸２１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸２２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１４）を得た。核酸医薬（Ａ－１４）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（２１）：センス鎖］
５’－ａａａｇａｃｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａ－３’
［配列番号（２２）：アンチセンス鎖］
５’－ａａａｇａｃｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇ－３’
＜実施例１～１１及び比較例１～３：細胞外小胞の製造及び評価＞
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍの培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、製造例１～１４で合成した核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下（ａ）～（ｄ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収することにより核酸医薬を内包した細胞外小胞（ＥＶ）を得た。
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍの培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、製造例１～１４で合成した核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下（ａ）～（ｄ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収することにより核酸医薬を内包した細胞外小胞（ＥＶ）を得た。
（２）細胞外小胞の粒子数の評価
（１）（ｄ）で得られた沈殿（核酸医薬を内包したＥＶ）に０．５ｍＬのＰＢＳを加えて懸濁させ、ＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。比較例４のＥＶサンプル液の１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を１．００としたときの、各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数の比を算出した。結果を表１に示す。
（１）（ｄ）で得られた沈殿（核酸医薬を内包したＥＶ）に０．５ｍＬのＰＢＳを加えて懸濁させ、ＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。比較例４のＥＶサンプル液の１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を１．００としたときの、各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数の比を算出した。結果を表１に示す。
（３）細胞外小胞に内包された核酸医薬量の評価
リシスバッファーを用いて、（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。比較例４のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量に対する各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量の比を算出した。結果を表１に示す。
リシスバッファーを用いて、（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。比較例４のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量に対する各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量の比を算出した。結果を表１に示す。
＜比較例４：エレクトロポーション法による細胞外小胞の製造及び評価＞
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の（ａ）～（ｅ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、細胞外小胞（ＥＶ）として、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。このＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標） ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いて、エレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、核酸医薬を内包した細胞外小胞を製造した。
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の（ａ）～（ｅ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、細胞外小胞（ＥＶ）として、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。このＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標） ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いて、エレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、核酸医薬を内包した細胞外小胞を製造した。
（２）細胞外小胞の粒子数の測定
（１）（ｅ）で得られた溶液にＰＢＳを添加して０．５ｍＬの懸濁液とすることでＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。
（１）（ｅ）で得られた溶液にＰＢＳを添加して０．５ｍＬの懸濁液とすることでＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。
（３）細胞外小胞に内包された核酸医薬量の測定
リシスバッファーを用いて（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。
リシスバッファーを用いて（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。
表１および２のＰＥＧ修飾の欄には、核酸医薬のセンス鎖の５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物で修飾されているものについては「＋」、前記センス鎖の５’末端が修飾されていないものは「－」と記載した。表１および２の核酸アプタマー修飾の欄には、核酸医薬のセンス鎖の３’末端が核酸アプタマーで修飾されているものについては「＋」、前記センス鎖の３’末端が修飾されていないものは「－」と記載した。核酸医薬（Ａ－１４）については、センス鎖の５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているが、核酸アプタマー修飾の欄及びＰＥＧ修飾の欄に、それぞれ「＋」と記載した。
＜実施例１２～２２及び比較例６～８：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果の評価＞
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。核酸医薬としては製造例１～１４で製造した核酸医薬（Ａ－１）～（Ａ－１４）であって表２に示す種類のものを用いた。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、０．２ｍＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶサンプルとした。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に、（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの各例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。核酸医薬としては製造例１～１４で製造した核酸医薬（Ａ－１）～（Ａ－１４）であって表２に示す種類のものを用いた。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、０．２ｍＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶサンプルとした。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に、（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの各例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
＜比較例５：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果を評価するためのコントロール例＞
核酸医薬を用いなかったこと以外は実施例１１と同様の操作を行い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
核酸医薬を用いなかったこと以外は実施例１１と同様の操作を行い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
＜比較例９：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果の評価（エレクトロポレーション法）＞
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳで懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、ＥＶとして、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。得られたＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標）ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いてエレクトロポレーション法により遺伝子の導入を行った。得られた溶液にＰＢＳを添加して懸濁し０．２ｍＬのＥＶサンプルを得た。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの本例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳで懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、ＥＶとして、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。得られたＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標）ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いてエレクトロポレーション法により遺伝子の導入を行った。得られた溶液にＰＢＳを添加して懸濁し０．２ｍＬのＥＶサンプルを得た。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの本例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
表１に示すように、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬の存在下に細胞外小胞を製造した実施例１～１１では、比較例１～３と比較して、ＥＶ内への核酸医薬の導入量（内包量）が顕著に高いことが分かる。また、実施例１～１１では、比較例４の方法と比較して、回収できるＥＶの粒子数が顕著に多いことが分かる。
さらに、表２に示すように、実施例１２～２２の方法で標的遺伝子の活性抑制を行うと、比較例５～８の方法と比較して、標的遺伝子の活性抑制効果が顕著に高いことが分かる。また、実施例１２～２２の方法では、比較例９の方法（エレクトロポレーション法により作製したＥＶを用いる方法）よりも、標的遺伝子の発現抑制効果が顕著に高いことが分かる。
これらの結果から、本発明によれば、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供でき、かつ、標的遺伝子の発現抑制効果の高い核酸医薬内包細胞外小胞を容易に製造できることがわかる。
さらに、表２に示すように、実施例１２～２２の方法で標的遺伝子の活性抑制を行うと、比較例５～８の方法と比較して、標的遺伝子の活性抑制効果が顕著に高いことが分かる。また、実施例１２～２２の方法では、比較例９の方法（エレクトロポレーション法により作製したＥＶを用いる方法）よりも、標的遺伝子の発現抑制効果が顕著に高いことが分かる。
これらの結果から、本発明によれば、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供でき、かつ、標的遺伝子の発現抑制効果の高い核酸医薬内包細胞外小胞を容易に製造できることがわかる。
Claims (3)
- 核酸医薬を内包する細胞外小胞の製造方法であって、
核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含み、
工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬であり、
前記核酸医薬は、３’末端が核酸アプタマーで修飾され、かつ５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖を有するか、５’末端が核酸アプタマーで修飾され、かつ３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖を有し、
前記核酸医薬は細胞外小胞の供給源細胞の細胞膜内層及び後期エンドソームの外層と結合するものであり、
前記アンチセンス鎖は、５’末端または３’末端が、核酸アプタマーにより修飾されているものであり、
前記核酸医薬が、３’末端が核酸アプタマーで修飾され、かつ５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖を有するものである場合、当該核酸医薬が有するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、３’末端に、同一の塩基配列を有し、その塩基配列は、塩基配列（ＡＡＡＡＧＡ）、塩基配列（ＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＧＣＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＣＴＡ）、塩基配列（ＡＡＡＧＡＣ）または塩基配列（ＧＧＧＧＡＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡ）であり、
前記核酸医薬が、５’末端が核酸アプタマーで修飾され、かつ３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖を有するものである場合、当該核酸医薬が有するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、５’末端に、塩基配列（ＡＡＡＧＡＣ）を有する、細胞外小胞の製造方法。 - 細胞外小胞の直径が１０ｎｍ～２００ｎｍである請求項１に記載の細胞外小胞の製造方法。
- 細胞外小胞がエクソソームである請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
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