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JP7646362B2 - 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクターデリバリー - Google Patents
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JP7646362B2 - 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクターデリバリー - Google Patents

筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクターデリバリー Download PDF

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Description

本出願は、２０１８年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８６，６６８号、２０１８年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，４０２号、２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２，８４１号、２０１９年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８２３，６４９号、および２０１８年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６０，２２０号の優先権を主張し、各々が、その全体が参照により本明細書に援用される。
電子的に提出された資料の参照による援用
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表を含有し、これはその全体が参照により組み込まれ、以下の通り、ファイル名：５３１６９＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：６０，０５６バイト、作成日：２０１９年６月１７日、特定される。
本発明は、小型化されたヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子療法ベクター、筋ジストロフィーに罹患している対象において、横隔膜および心筋を含む骨格筋においてマイクロジストロフィンを発現させ、損傷から筋線維を保護し、筋力を増加させ、ならびに線維症を低減し、および／または予防するためのこれらのベクターの使用方法を提供する。
自発運動および呼吸などの日常活動、ならびに身体代謝のため、筋肉の量および強さの重要性は、明白である。筋機能の不足は、筋肉低下および萎縮性により特徴付けられる筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じ、クオリティ・オブ・ライフに深刻な影響を及ぼす。最も十分に特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の変異から生じる。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘と細胞骨格の係留の喪失と関連する膜脆弱性から生じる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人の生まれたばかりの男児の１人に影響する最も深刻な筋肉疾患の一つである。
ＤＭＤは、ｍＲＮＡの低減およびジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）と関連する４２７ｋＤの筋鞘タンパク質であるジストロフィンの不存在を生じるＤＭＤ遺伝子の変異により引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９～２８、１９８７）。ＤＡＰＣは、アクチン結合タンパク質であるジストロフィンおよびラミニン結合タンパク質であるα－ジストログリカンを介した細胞外基質（ＥＣＭ）と細胞骨格との間の構造結合を形成する、筋肉の筋鞘において複数のタンパク質から構成される。これらの構造結合は、収縮中に筋細胞膜を安定化させ、収縮により誘導される損傷から保護する働きをする。ジストロフィン喪失により、膜脆弱性は、筋鞘裂傷およびカルシウムの流入を生じ、これにより、カルシウム活性化プロテアーゼおよび分節性の線維壊死の引き金を引く（Ｓｔｒａｕｂら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１０（２）：１６８～７５、１９９７）。筋肉の変性および再生のこの制御不能なサイクルは、最終的には筋肉幹細胞集団を枯渇させ（Ｓａｃｃｏら、Ｃｅｌｌ、２０１０、１４３（７）：ｐ．１０５９～７１；Ｗａｌｌａｃｅら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００９年、７１：ｐ．３７～５７）、これにより、進行性の筋力低下、筋膜炎、および線維性瘢痕を生じる。
ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンによる膜安定化がなければ、ＤＭＤは、組織損傷と修復の制御不能なサイクルを明らかにし、最終的に失われた筋線維を、結合組織の増殖を通じて線維性瘢痕組織と置換える。線維症は、コラーゲンおよびエラスチンを含む、ＥＣＭ基質タンパク質の過剰な沈着により特徴付けられる。ＥＣＭタンパク質は、ストレスおよび炎症に応答する活性化線維芽細胞により放出されるＴＧＦβなどのサイトカインから主に産生される。ＤＭＤの主な病理学的特性は、筋線維の変性および壊死であるが、病理学的結果としての線維化は、同等の余波を有する。線維性組織の過剰産生は、ＤＭＤ患者において、筋肉の再生を制限し、進行性の筋力低下に関与する。ある研究において、初期のＤＭＤ筋肉生検における線維症の存在は、１０年間の追跡調査において不良な運動予後と高度に相関した（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００９、６８（７）：ｐ．７６２～７）。これらの結果は、ＤＭＤの筋肉機能障害の主な要因として線維症を指摘し、明らかな線維症より前に早期の介入の必要性を強調する。
ＤＭＤに罹患している患者において、筋力を増加させ、筋肉の損傷から保護する治療の必要性がある。
Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９～２８、１９８７ Ｓｔｒａｕｂら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１０（２）：１６８～７５、１９９７ Ｓａｃｃｏら、Ｃｅｌｌ、２０１０、１４３（７）：ｐ．１０５９～７１ Ｗａｌｌａｃｅら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００９年、７１：ｐ．３７～５７ Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、２００９、６８（７）：ｐ．７６２～７
本発明は、筋線維を損傷から保護し、筋強度を増加させ、線維症を低減し、および／または予防するための、筋膜および心筋を含む骨格筋にマイクロジストロフィン遺伝子を発現させる遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶに関する。
本発明は、ＤＭＤにおいて観察される遺伝子欠損に立ち向かうためにマイクロジストロフィンをデリバリーするための遺伝子療法ベクターを使用する、筋力を増加させる、および／または筋肉量を増加させるための療法ならびにアプローチを提供する。実施例２は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための全身遺伝子デリバリー臨床試験を記載しており、本研究では、対象は、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与された。実施例３に記載される臨床試験は、無作為化二重盲検プラセボ対照設計を含む、新規の中心的な臨床プロトコールを提供する。研究開始時に、対象は、無作為化され、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンまたは乳酸リンゲルのいずれかを投与される。
本発明は、配列番号３、８または９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本発明はまた、配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、および配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。
本発明の別の態様は、配列番号３、８または９のヌクレオチド配列を含む核酸分子、配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、および配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。本明細書において開示される方法のいずれかは、これらの組成物を用いて実施されてもよい。
本発明は、組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与する工程を含む、それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、ｒＡＡＶは、全身投与経路により用量約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇで投与される、方法を提供する。筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーであってもよい。
例えば、投与されるｒＡＡＶの用量は、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
一つの実施形態では、本発明の方法は、ｒＡＡＶを全身投与することを含み、全身投与経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、本発明の方法は、ｒＡＡＶを全身投与することを含み、全身投与経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１４ ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１５ｖｇ／ｋｇである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンまたはＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇで投与され得る。特定の実施形態では、用量またはｒＡＡＶは、約１０ｍＬ／ｋｇで投与される。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンまたはＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、注射、注入または移植により投与され得る。例えば、ｒＡＡＶの用量は、約１時間かけて注入により投与される。さらに、ｒＡＡＶの用量は、末梢腕静脈または末梢下肢静脈などの末梢肢静脈を通じた静脈内経路により投与される。あるいは、注入は、約３０分、または約１．５時間、または約２時間、または約２．５時間、または約３時間かけて投与されてもよい。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の方法のいずれかにより投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含み得る。さらに、本発明の方法のいずれかにより投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含み得る。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。
一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の方法のいずれかにおいて、投与されるｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ７．４である。
一部の実施形態では、本発明の方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー筋ジストロフィーを治療する。典型的な実施形態は、組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィンの用量を投与する工程を含む、それを必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを治療する方法であり、投与経路は、静脈内注入であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１時間かけて約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶベクターは、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一つの実施形態では、本発明は、筋肉特異的制御エレメントヌクレオチド配列、およびマイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードし、ヌクレオチドは、配列番号１に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、タンパク質は、マイクロジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋収縮中に筋肉膜に安定性をもたらし、例えば、マイクロジストロフィンは、筋収縮中にショックアブソーバとして機能する。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明はまた、ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードする、ｒＡＡＶを提供する。
一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、非反復性の、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。このベクターゲノムは、全てＭＨＣＫ７プロモーター／エンハンサーの制御下に、ＡＡＶ２逆位末端リピート（ＩＴＲ）、マイクロジストロフィン、ＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）、合成ポリアデニル化（Ｐｏｌｙ Ａ）シグナルを含む、遺伝子発現に必要な最小限のエレメントを含む。ベクターゲノムおよび発現カセットの概略図を図１に示す。ＡＡＶｒｈ７４血清型を使用して、ＩＶ投与後の骨格筋および心筋における効率的な遺伝子導入を達成することができる。
「ストリンジェント」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般的に理解される条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度により決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（６５℃～６８℃）または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド（４２℃）である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）が使用されてもよいが、ハイブリダイゼーションの速度は、影響されるだろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合において、追加の典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基のオリゴのため）、４８℃（１７塩基のオリゴのため）、５５℃（２０塩基のオリゴのため）、および６０℃（２３塩基のオリゴのため）にて洗浄することを含む。
他の薬剤が、非特異性および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを低減する目的のため、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に含まれてもよい。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハート液、超音波処理したサーモン精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な剤も使用することができる。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（オックスフォード、イングランド）。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を調節し、異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者により調整され得る。
「筋肉特異的制御エレメント」という用語は、筋肉組織における発現に特異的であるコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列を指す。これらの制御エレメントは、エンハンサーおよびプロモーターを含む。本発明は、筋肉特異的制御エレメントＭＣＫＨ７プロモーター、ＭＣＫプロモーターおよびＭＣＫエンハンサーを含むコンストラクトを提供する。
「作動可能に結合される」という用語は、調節エレメントヌクレオチド配列、例えば、プロモーターヌクレオチド配列が、当該調節エレメントにより当該ヌクレオチド配列の発現を付与するように位置付けられることを指す。
一つの態様では、本発明は、筋肉特異的制御エレメントが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメントまたはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である、ｒＡＡＶを提供する。
例えば、筋肉特異的制御エレメントは、配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列であるか、または筋肉特異的制御エレメントは、配列番号４のＭＣＫヌクレオチド配列である。さらに、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかにおいて、筋特異的制御エレメントヌクレオチド配列、例えば、ＭＨＣＫ７またはＭＣＫヌクレオチド配列は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合される。例えば、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列（配列番号２または配列番号７）は、図１または図２（配列番号３）または図１３（配列番号９）において提供されるコンストラクトに記載されるヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に結合される。例えば、ＭＣＫプロモーター（配列番号４）は、図５または図６（配列番号５）において提供されるコンストラクトに記載されるヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に結合される。別の態様では、本発明は、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および配列番号７のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、配列番号１および配列番号４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号８のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるｒＡＡＶコンストラクトを提供する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号３のＩＴＲの範囲内のヌクレオチド配列を含み、図２に示される。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。一つの実施形態では、ベクターは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む。配列番号３に記載されるプラスミドは、アンピシリン耐性およびｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格をさらに含む。
別の態様では、本発明は、配列番号９のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、図１３に示される。ｒＡＡＶベクターコンストラクトは、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、およびポリＡを含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶベクターコンストラクトは、プロモーターに対してＩＴＲ５’、およびポリＡに対してＩＴＲ３’をさらに含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４である。
別の態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号８のＩＴＲの範囲内のヌクレオチド配列を含み、図１５に示される。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。一つの実施形態では、ベクターは、配列番号９のヌクレオチド１～４９７７を含む。配列番号３に記載されるプラスミドは、カナマイシン耐性およびｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格をさらに含む。
別の態様では、本発明は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターコンストラクトを含むプラスミドを提供する。一つの実施形態では、プラスミドは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。一つの実施形態では、プラスミドは、カナマイシン耐性を含み、任意で、ｐＢＲ３２２複製開始点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。特定の実施形態では、プラスミドは、配列番号８に記載され、図１４および１５に示される。
本発明は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
本発明はまた、配列番号３におけるＩＴＲの範囲内のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列、配列番号８におけるＩＴＲ範囲内のヌクレオチド配列または配列番号９に記載されるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
本発明のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３などのいずれかのＡＡＶ血清型であってもよい。
本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（または、本明細書において単に「組成物」と称されることもある）を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の任意のｒＡＡＶベクターで遺伝子導入された細胞を培養すること、および遺伝子導入された細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することを含む、ｒＡＡＶベクター粒子を生成する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。
筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与後に増加する。細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶの投与前および後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットによりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。特に、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。
さらに、細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。
筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約６５％～約９０％、または約６５％～約９５％、または約７５％～約９０％、または約８０％～約９０％、または約８５％～約９５％、または約８７％～約９５％、または約８７％～約９０％減少する。特に、本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約８７％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７２％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７３％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７８％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約９５％減少する。筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象の筋組織におけるマイクロジストロフィン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、ｒＡＡＶの投与は、α－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンなどのＤＡＰＣタンパク質の発現をアップレギュレートする。例えば、対象におけるα－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のα－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。さらに、対象におけるβ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のβ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。α－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりα－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における疾患の進行は、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される通り、ｒＡＡＶの投与後に遅くなる。
例えば、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６カ所の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
別の実施形態では、本発明は、患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現させる方法であって、患者に、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。例えば、患者細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。さらに、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、一つの核当たりのベクターゲノムの数をさらに検出することにより、患者において測定され、一つの核当たりの一つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、一つの核当たり一つより多いコピーは、マイクロジストロフィン発現レベルと一致する。例えば、細胞は、一つの核当たり１．２のベクターコピー、または一つの核当たり１．３のベクターコピー、または一つの核当たり１．４のベクターコピー、または一つの核当たり１．５のベクターコピー、または一つの核当たり１．６のベクターコピー、または一つの核当たり１．７のベクターコピー、または一つの核当たり１．８のベクターコピー、または一つの核当たり１．９のベクターコピーを有する。
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における血清ＣＫレベルを減少する方法であって、患者に、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。例えば、患者における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、少なくとも約６５％～約９０％、または約６５％～約９５％、または約７５％～約９０％、または約８０％～約９０％、または約８５％～約９５％、または約８７％～約９５％、または約８７％～約９０％減少する。特に、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約８７％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７２％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７３％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約７８％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療する方法のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに、約９５％減少する。
本発明はまた、患者筋肉組織においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させる方法であって、患者に、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。さらに、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、一つの核当たりのベクターゲノムの数をさらに検出することにより、患者において測定され、一つの核当たりの一つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、一つの核当たり一つより多いコピーは、マイクロジストロフィン発現レベルと一致する。例えば、細胞は、一つの核当たり１．２のベクターコピー、または一つの核当たり１．３のベクターコピー、または一つの核当たり１．４のベクターコピー、または一つの核当たり１．５のベクターコピー、または一つの核当たり１．６のベクターコピー、または一つの核当たり１．７のベクターコピー、または一つの核当たり１．８のベクターコピー、または一つの核当たり１．９のベクターコピーを有する。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者においてα－サルコグリカンの発現を増加させる方法であって、患者に、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。例えば、α－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりα－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
さらに、本発明は、それを必要とする患者においてβ－サルコグリカンの発現を増加させる方法であって、患者に、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。例えば、β－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりβ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
本発明はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを有する患者を治療する方法であって、患者における疾患の進行が、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される通り、遅らせるように、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法を提供する。
例えば、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６カ所の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、ｒＡＡＶの投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
「線維症」は、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む、損傷時の組織における細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰または制御されていない沈着および異常な修復過程を指す。沈着しているＥＣＭ成分は、フィブロネクチンおよびコラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３を含む。
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減するか、または予防する方法であって、治療上有効量の、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを投与することを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０６６のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
別の実施形態では、本発明はまた、それを必要とする対象における線維症を予防する方法であって、治療上有効量の、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを投与することを含む、方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかを、筋ジストロフィーに罹患している対象に投与して、線維症を予防することができ、例えば、ヒトマイクロジストロフィンタンパク質を発現する本発明のｒＡＡＶが、対象において観察される前に投与される。さらに、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤに罹患しているか、または診断されたもののような、線維症を発症するリスクがある対象に投与することができる。本発明のｒＡＡＶは、これらの対象における新たな線維症を予防するために、筋ジストロフィーに罹患している対象に投与することができる。
本発明は、線維症が、対象において観察される前に、ｒＡＡＶを投与することを考慮する。さらに、ｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤに罹患しているか、または診断されたもののような、線維症を発症するリスクがある対象に投与することができる。ｒＡＡＶは、これらの対象における新たな線維症を予防するために、既に線維症を発症した筋ジストロフィーに罹患している対象に投与することができる。
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力および／または筋肉量を増加させる方法であって、治療上有効量の、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、線維症が対象において観察される前、または筋力が低減される前、または筋肉量が低減される前に、ＤＭＤと診断された対象にｒＡＡＶベクターを投与することを考慮する。
本発明はまた、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを、既に線維症を発症した筋ジストロフィーに罹患している対象に投与して、これらの対象における新たな線維症を予防するため、またはこれらの対象における線維症を低減することを考慮する。本発明はまた、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを、さらなる損傷から筋肉を保護するために、既に筋力が低減したか、または筋肉量が低減した筋ジストロフィーに罹患している対象に投与することを提供する。
本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患していてもよい。
本明細書に記載の本発明の方法のいずれかの他の実施形態では、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、
ａ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
ｃ）投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
ｅ）投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する。
別の実施形態では、本発明は、必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、１用量の組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、この場合において、組成物は、全身投与経路用に製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０１４ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
例えば、本発明の組成物は、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一つの実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化され、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇであるｒＡＡＶの用量を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化され、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１５であるｒＡＡＶの用量を含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の組成物のいずれかでは、ｒＡＡＶの用量は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇでデリバリーされる。特定の実施形態では、組成物は、約１０ｍＬ／ｋｇでデリバリーされるｒＡＡＶの用量を含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の組成物は、注射、注入または移植による投与用に製剤化される。例えば、組成物は、約１時間にわたって注入により投与するように製剤化される。さらに、本発明の組成物は、末梢腕静脈または末梢下肢静脈などの末梢肢静脈を通じた静脈内投与用に製剤化される。あるいは、注入は、約３０分、または約１．５時間、または約２時間、または約２．５時間、または約３時間かけて投与されてもよい。
本発明の組成物のいずれかは、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むｒＡＡＶ、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む。
特に、本発明の組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを治療するためである。例えば、本発明は、それを必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを治療するための組成物であり、１用量の組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィンを含み、約１時間かけた静脈内注入による投与用に製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明はまた、それを必要とする対象における線維症を低減するためのｒＡＡＶを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を予防するためのｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力および／または筋肉量を増加させるためのｒＡＡＶを含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーの治療のための本発明のｒＡＡＶのいずれかを含む組成物を提供する。
本発明の組成物のいずれかの他の実施形態では、筋ジストロフィーの治療の必要なヒト対象における当該組成物の投与後、対象における血清ＣＫレベルは、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、
ａ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、７０、または８５％；
ｃ）投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与の９０日後までに少なくとも８７、９９、９３または９５％；
ｅ）投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のための組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの用量の使用であって、医薬が、全身投与経路用に製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０１４ｖｇ／ｋｇである、使用を提供する。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
例えば、医薬は、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一つの実施形態では、本発明の医薬は、ｒＡＡＶの用量の全身投与用に製剤化され、全身投与経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、本発明の医薬は、ｒＡＡＶの用量の全身投与用に製剤化され、全身投与経路は、静脈内経路であり、ｒＡＡＶの用量は、５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１５ｖｇ／ｋｇである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の使用のいずれかでは、医薬は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。特定の実施形態では、用量またはｒＡＡＶは、約１０ｍＬ／ｋｇである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ．マイクロジストロフィンである。一つの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明の使用のいずれかでは、医薬は、注射、注入または移植による投与用に製剤化される。例えば、医薬は、約１時間に渡る注入による投与用に製剤化される。さらに、医薬は、末梢腕静脈または末梢下肢静脈などの末梢肢静脈を通じた静脈内投与用に製剤化される。あるいは、注入は、約３０分、または約１．５時間、または約２時間、または約２．５時間、または約３時間かけて投与されてもよい。
本発明の使用のいずれかでは、医薬は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むｒＡＡＶ、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む。
本発明の特定の使用は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のためである。例えば、本発明は、それを必要とするデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーヒト対象を治療するための医薬の調製のための組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィンの用量の使用であって、医薬が、約１時間かけた静脈内注入による投与用に製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、使用を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における線維症を低減するための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。例えば、必要とする対象は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している。
別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を予防するための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
さらに、本発明は、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力および／または筋肉量を増加させるための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
本発明はまた、筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
本発明はまた、筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２もしくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクター、または筋ジストロフィーの治療のための配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
本発明の使用のいずれかの他の実施形態では、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象へのｒＡＡＶの投与後に、
ａ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、７０、または９５％；
ｃ）投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
ｅ）投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与の９０、１８０、または２７０日後までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する。
筋ジストロフィーを治療するための組成物または筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルは、組成物または医薬の投与後に増加する。細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、組成物または医薬の投与前および後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットによりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。特に、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物の投与後に、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。
さらに、細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。
筋ジストロフィーを治療する組成物のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約６５％～約９０％、または約６５％～約９５％、または約７５％～約９０％、または約８０％～約９０％、または約８５％～約９５％、または約８７％～約９５％、または約８７％～約９０％減少する。特に、本発明の筋ジストロフィーを治療するための組成物のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約８７％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療するための組成物もしくは本発明の筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７２％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療するための組成物のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７３％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療するための組成物もしくは本発明の筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７８％減少するか、または本発明の筋ジストロフィーを治療するための組成物もしくは本発明の筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約９５％減少する。筋ジストロフィーを治療するための組成物または筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象の筋組織におけるマイクロジストロフィン陽性線維の数は、組成物または医薬の投与前のマイクロジストロフィン陽性線維の数と比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
筋ジストロフィーを治療するための組成物または筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、組成物または医薬の投与は、α－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンのようなＤＡＰＣタンパク質の発現をアップレギュレートする。例えば、対象におけるα－サルコグリカンのレベルは、組成物または医薬の投与前のα－サルコグリカンのレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。さらに、対象におけるβ－サルコグリカンのレベルは、組成物または医薬の投与前のβ－サルコグリカンのレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。α－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンのレベルは、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりα－サルコグリカンまたはβ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
筋ジストロフィーを治療するための組成物または筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用のいずれかでは、対象における疾患の進行は、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される通り、組成物または医薬の投与後に遅くなる。
例えば、筋ジストロフィーを治療するための組成物の投与または筋ジストロフィーを治療するための医薬の使用後、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後、ＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６カ所の改善を有する。さらに、方法のいずれかでは、対象は、組成物または医薬の投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。さらに、本発明の方法または使用のいずれかでは、対象は、組成物または医薬の投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する。さらに、本発明の方法または使用のいずれかでは、対象は、組成物または医薬の投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
別の実施形態では、本発明は、患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現させるための組成物であって、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現させるための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の用量の使用を提供する。例えば、患者細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。さらに、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、一つの核当たりのベクターゲノムの数をさらに検出することにより、患者において測定され、一つの核当たりの一つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、一つの核当たり一つより多いコピーは、マイクロジストロフィン発現レベルと一致する。例えば、細胞は、一つの核当たり１．２のベクターコピー、または一つの核当たり１．３のベクターコピー、または一つの核当たり１．４のベクターコピー、または一つの核当たり１．５のベクターコピー、または一つの核当たり１．６のベクターコピー、または一つの核当たり１．７のベクターコピー、または一つの核当たり１．８のベクターコピー、または一つの核当たり１．９のベクターコピーを有する。
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における血清ＣＫレベルを減少するための組成物であって、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする患者細胞において血清ＣＫレベルを減少させるための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の用量の使用を提供する。例えば、患者における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、少なくとも約６５％～約９０％、または約６５％～約９５％、または約７５％～約９０％、または約８０％～約９０％、または約８５％～約９５％、または約８７％～約９５％、または約８７％～約９０％減少する。特に、対象における血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約８７％減少するか、または組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７２％減少するか、または組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７３％減少するか、または組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約７８％減少するか、または組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与の６０日後までに、約９５％減少する。
本発明はまた、患者筋肉組織においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させるための組成物であって、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。さらに、本発明は、患者筋肉組織におけるマイクロジストロフィン陽性線維を増加させるための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の用量の使用を提供する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。さらに、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、一つの核当たりのベクターゲノムの数をさらに検出することにより、患者において測定され、一つの核当たりの一つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、一つの核当たり一つより多いコピーは、マイクロジストロフィン発現レベルと一致する。例えば、細胞は、一つの核当たり１．２のベクターコピー、または一つの核当たり１．３のベクターコピー、または一つの核当たり１．４のベクターコピー、または一つの核当たり１．５のベクターコピー、または一つの核当たり１．６のベクターコピー、または一つの核当たり１．７のベクターコピー、または一つの核当たり１．８のベクターコピー、または一つの核当たり１．９のベクターコピーを有する。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者においてα－サルコグリカンの発現を増加させるための組成物であって、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする患者においてα－サルコグリカンの発現を増加させるための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の用量の使用を提供する。例えば、α－サルコグリカンのレベルは、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりα－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
さらに、本発明は、それを必要とする患者においてβ－サルコグリカンの発現を増加させるための組成物であって、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする患者においてβ－サルコグリカンの発現を増加させるための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の使用を提供する。例えば、β－サルコグリカンのレベルは、組成物または医薬の投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりβ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
本発明はまた、医薬の投与が、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される、遅くなっている、患者における疾患の進行を生じるように、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを有する患者を治療するための医薬の調製のための、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列の用量の使用を提供する。
例えば、対象は、組成物または医薬の投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６カ所の改善を有する。さらに、対象は、組成物または医薬の投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。さらに、対象は、組成物または医薬の投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する。さらに、対象は、組成物または医薬の投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与する工程を含み、
前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、約５．０×１０ １２ ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０ １５ の用量で投与される、方法。
(項目２)
前記全身投与経路が、静脈内経路であり、前記投与されるｒＡＡＶの前記用量が、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇである、項目１に記載の方法。
(項目３)
ｒＡＡＶの前記用量が、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される、項目１または２に記載の方法。
(項目４)
前記ｒＡＡＶが、注射、注入または移植により投与される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記ｒＡＡＶが、約１時間に渡る注入により投与される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記ｒＡＡＶが、末梢肢静脈を通じた静脈内経路により投与される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記ｒＡＡＶが、配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記ヒト対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しており、前記ｒＡＡＶが、静脈内注入により約１時間かけて約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記対象の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記細胞における前記マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、前記ｒＡＡＶの投与前および後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットによりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
マイクロジストロフィンタンパク質の前記レベルが、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも７２％増加する、項目１４に記載の方法。
(項目１６)
前記細胞における前記マイクロジストロフィン遺伝子の発現が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記マイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目１３に記載の方法。
(項目１７)
マイクロジストロフィンタンパク質の前記レベルが、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィンの前記レベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも７２％増加する、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記対象における血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の６０日後までに８７％減少する、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
前記対象の筋組織におけるマイクロジストロフィン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
マイクロジストロフィン陽性線維の前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記マイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
マイクロジストロフィン陽性線維の前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記マイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２０に記載の方法。
(項目２３)
前記対象におけるα－サルコグリカンのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前のα－サルコグリカンのレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４)
α－サルコグリカンの前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記α－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
α－サルコグリカンの数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査によりα－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
前記対象におけるβ－サルコグリカンのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前のβ－サルコグリカンのレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
β－サルコグリカンの前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットによりβ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２６に記載の方法。
(項目２８)
β－サルコグリカンの数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記β－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目２６に記載の方法。
(項目２９)
前記対象における疾患の進行が、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される通り、前記ｒＡＡＶの投与後に遅くなる、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、前記ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後のＮＳＡＡスコアで少なくとも６カ所の改善を有する、項目２５に記載の方法。
(項目３１)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも０．８秒の改善を有する、項目２５に記載の方法。
(項目３２)
前記対象が、前記ｒＡＡＶの投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する、項目２５に記載の方法。
(項目３３)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に前記１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも７秒の改善を有する、項目２５に記載の方法。
(項目３４)
患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現させる方法であって、前記患者に、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目３５)
前記患者細胞における前記マイクロジストロフィン遺伝子の発現が、前記ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記マイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目３０に記載の方法。
(項目３６)
前記患者細胞における前記マイクロジストロフィン遺伝子の発現が、前記ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記マイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目３０に記載の方法。
(項目３７)
前記マイクロジストロフィン遺伝子の発現が、一つの核当たり一つより多いｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することにより、前記患者において測定される、項目３０に記載の方法。
(項目３８)
それを必要とする患者における血清ＣＫレベルを減少する方法であって、前記患者に、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目３９)
前記患者における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の６０日後までに少なくとも８７％減少する、項目３４に記載の方法。
(項目４０)
患者筋肉組織においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させる方法であって、前記患者に、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目４１)
マイクロジストロフィン陽性線維の前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記ジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目３６に記載の方法。
(項目４２)
マイクロジストロフィン陽性線維の前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記ジストロフィンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目３６に記載の方法。
(項目４３)
マイクロジストロフィン陽性線維の前記数が、一つの核当たり一つより多いｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することにより、測定される、項目３６に記載の方法。
(項目４４)
それを必要とする患者におけるα－サルコグリカンの発現を増加させる方法であって、前記患者に、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目４５)
α－サルコグリカンの前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記α－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目４０に記載の方法。
(項目４６)
α－サルコグリカンの前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記α－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目４０に記載の方法。
(項目４７)
それを必要とする患者におけるβ－サルコグリカンの発現を増加させる方法であって、前記患者に、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目４８)
β－サルコグリカンの前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検におけるウエスタンブロットにより前記β－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目４３に記載の方法。
(項目４９)
β－サルコグリカンの前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋肉生検における免疫組織化学検査により前記β－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することにより、検出される、項目４３に記載の方法。
(項目５０)
デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーを有する患者を治療する方法であって、前記患者における疾患の進行が、六分間の歩行テスト、立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、４つの階段を上り、下るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト、１００メートルの時間内テスト、手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）、タイムドアップ・アンド・ゴー、および／または粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかにより測定される通り、遅らせるように、前記患者に配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
(項目５１)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、前記ｒＡＡＶ投与の少なくとも９０日後のＮＳＡＡスコアで少なくとも６カ所の改善を有する、項目４６に記載の方法。
(項目５２)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前の立ち上がるまでの時間と比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも９０日後に立ち上がるまでの時間において少なくとも０．８秒の改善を有する、項目４６に記載の方法。
(項目５３)
前記対象が、前記ｒＡＡＶの投与前の４つの階段を上るまでの時間テストと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも９０日後に４つの階段を上るまでの時間テストにおいて少なくとも約１．２秒の改善を有する、項目４６に記載の方法。
(項目５４)
前記対象が、前記ｒＡＡＶ投与前の１００メートルの時間内テストと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも９０日後に前記１００メートルの時間内テストにおいて少なくとも７秒の改善を有する、項目４６に記載の方法。
(項目５５)
それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、全身投与経路用に製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約５×１０ １２ ｖｇ／ｋｇ～約１．０× １０ １５ ｖｇ／ｋｇである、組成物。
(項目５６)
前記全身投与経路が、静脈内経路であり、前記ｒＡＡＶの前記用量が、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇである、項目５１に記載の組成物。
(項目５７)
ｒＡＡＶの前記用量が、約１０ｍＬ／ｋｇである、項目５１または５２に記載の組成物。
(項目５８)
前記組成物が、注射、注入または移植による投与用に製剤化される、項目５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目５９)
前記組成物が、約１時間かけた注入による投与用に製剤化される、項目５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６０)
組成物の前記用量が、末梢肢静脈を通じた静脈内投与用に製剤化される、項目５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６１)
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列を含む、項目５１～５６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６２)
前記ｒＡＡＶが、配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、項目５１～５７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６３)
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目５１～５８のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６４)
前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、項目５１～５９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６５)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、項目５１～６０のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６６)
それを必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、
静脈内注入により約１時間かけて約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇの用量での投与用に製剤化され、
前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、組成物。
(項目６７)
それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のための組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの使用であって、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化され、約１×１０ １４ ｖｇ／ｋｇ～約４×１０ １４ ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む、使用。
(項目６８)
前記医薬が、静脈内投与用に製剤化され、前記ｒＡＡＶの前記用量が、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇである、項目５５に記載の使用。
(項目６９)
ｒＡＡＶの前記用量が、約１０ｍＬ／ｋｇである、項目６３または６４に記載の使用。
(項目７０)
前記医薬が、注射、注入または移植による投与用に製剤化される、項目６３～６５のいずれか一項に記載の使用。
(項目７１)
前記医薬が、約１時間かけた注入による投与用に製剤化される、項目６３～６５のいずれか一項に記載の使用。
(項目７２)
前記医薬が、末梢肢静脈を通じた静脈内投与用に製剤化される、項目６３～６５のいずれか一項に記載の使用。
(項目７３)
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列を含む、項目６３～６８のいずれか一項に記載の使用。
(項目７４)
前記ｒＡＡＶが、配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、項目６３～６９のいずれか一項に記載の使用。
(項目７５)
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目６３～７０のいずれか一項に記載の使用。
(項目７６)
前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、項目６３～７０のいずれか一項に記載の使用。
(項目７７)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、項目６３～７１のいずれか一項に記載の使用。
(項目７８)
それを必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための組み換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィンの使用であって、前記医薬が、約１時間かけた静脈内注入による投与用に製剤化され、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの用量を含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号９のまたは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む、使用。
(項目７９)
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に、
ａ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）前記投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
ｃ）前記投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）前記投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
ｅ）前記投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）前記投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する、項目１～５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目８０)
筋ジストロフィーの治療の必要なヒト対象への前記組成物の投与後、前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、
ａ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）前記投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
ｃ）前記投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）前記投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
ｅ）前記投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）前記投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する、項目５１～６２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目８１)
前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの前記対象への投与後に、
ａ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
ｂ）前記投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
ｃ）前記投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）前記投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
ｅ）前記投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
ｆ）前記投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
ｇ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する、項目６３～７４のいずれか一項に記載の使用。
(項目８２)
ａ）配列番号３のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、
ｅ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ、
ｆ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ、
ｇ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子、
ｈ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子、または
ｉ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子、を含む、組成物。
図１は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトを示す。このコンストラクトにおいて、ｃＤＮＡ発現カセットは、ＡＡＶ２逆末端リピート配列（ＩＴＲ）に隣接している。コンストラクトは、インフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）により特徴付けられる一方、ヒンジ１、２および４（Ｈ１、Ｈ２およびＨ４）ならびにシステインリッチなドメインは、依然として１３８ｋＤａのタンパク質を産生する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）により誘導される。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前に共通のコザックおよびｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８、２５３～２６１（２００２））により既に記載された通り、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）を含有していた。
図２は、核酸配列（配列番号３）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを提供する。 同上。 同上。 同上。
図３は、ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４ＡＡＶヘルパープラスミドマップを提供する。
図４は、ＡｄヘルパープラスミドｐＨＥＬＰを提供する。
図５は、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンコンストラクトを示す。
図６は、核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提供する。 同上。 同上。 同上。
図７は、免疫細胞化学検査により測定される、腓腹筋肉生検の筋線維におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現を示す。
図８Ａ～８Ｃは、正しい分子量のマイクロジストロフィンタンパク質発現を示すウエスタンブロットを提供する。図８Ｃにおいて、対象４の試料（＊）は、開始時の解析における過剰なＵＬＤＱ（＞８０％）として１：４（線形範囲に）希釈され、平均値に、正常との比較において最終的な値のための希釈補正係数を掛けた。正常に対する平均マイクロジストロフィン発現は、方法１では１８２．７％、方法２では２２２．０％であった。 同上。 同上。
図９Ａ～９Ｃは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与は、ＤＡＰＣタンパク質、α－サルコグリカンおよびβ－サルコグリカンの発現を上方制御する。 同上。 同上。
図１０は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与によるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の持続的な劇的な低減を示す。
図１１は、ベースラインから２７０日目までの平均ＣＫ変化を提供する。このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の経時的なＣＫの有意な減少を示した。
図１２は、ベースラインから２７０日目までの平均ＮＳＡＡ変化および平均ＣＫ変化を提供する。このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の経時的なＮＳＡＡの有意な増加を示した。
図１３は、核酸配列（配列番号９）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを提供する。 同上。 同上。
図１４は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドコンストラクトを示す。
図１５は、カナマイシン耐性遺伝子を含む、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドコンストラクトの核酸配列（配列番号８）を提供する。 同上。 同上。 同上。
本発明は、ヒトマイクロジストロフィンを過剰発現する、遺伝子療法ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ならびに筋ジストロフィー患者において線維症を低減および予防する方法を提供する。ＤＭＤの診断の最も早い年齢で採取された筋肉生検により、顕著な結合組織の増殖が明らかになる。筋線維症は、複数の点で有害である。それは、結合組織バリアを通じた髄膜内栄養の正常な通過を低減し、血流を低減し、血管からもたらされる栄養成分を筋肉から奪い、四肢拘縮を通じた歩行能力の早期喪失に機能的に関与する。時間の経過とともに、治療の課題は、筋肉での著しい線維化の結果として増大する。これは、継続的な時間ポイントでの結合組織の増殖を比較する筋肉生検において観察することができる。このプロセスは、悪化し続け、歩行運動の喪失を導き、特に、車椅子使用患者において、制御不能を加速する。
線維症を低減するための並走したアプローチを含む早期治療がなければ、エクソンスキッピング、終始コドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利点は、今まで完全に達成され得る可能性は低い。小分子またはタンパク質置換ストラテジーでさえ、筋肉の線維化を低減するアプローチなしでは、ほぼ失敗する。ＡＡＶ．マイクロジストロフィンで処置された、線維症を有する高齢のｍｄｘマウスにおける従前の研究は、完全な機能回復を達成できなかったことを示した（Ｌｉｕ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１、２４５～２５６（２００５年））。ＤＭＤ心筋症の進行は、脳室壁の瘢痕化および線維症が伴うことも知られている。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が共感染しているヘルパーウイルスによってもたらされている、細胞においてのみ成長する１本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられたＡＡＶの血清型は１３種類存在する。ＡＡＶの一般的な情報およびレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９８９年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第１巻、１６９～２２８頁、およびＢｅｒｎｓ、１９９０年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７４３～１７６４頁、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見ることができる。しかしながら、様々な血清型が、構造的にも機能的にも、遺伝子レベルでさえ、非常に密接に関連していることは周知であるので、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型にも適用可能であることが完全に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ、１９８８年、１６５～１７４、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編；およびＲｏｓｅ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１（１９７４年）を参照）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により仲介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、全てが、ＡＡＶ２において発現されるもののような三つの関連するキャプシドタンパク質を生じる。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーションを明らかにする、ヘテロ二本鎖解析、および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によりさらに示唆される。同様の感染性パターンは、各血清型における複製機能が、同様の調節制御下にあることを示唆する。
「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する対象の一つ以上のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし、発現するベクターでトランスフェクションされた宿主細胞に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質および封入ポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞にデリバリーされるべき導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含むなら、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ＡＡＶベクターの産生を必然的に含み、したがって、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。
ＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その１本鎖ＤＮＡゲノムは、長さが約４．７ｋｂであり、１４５ヌクレオチドの逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、７５：３３８５～３３９２（１９９４年）により訂正された、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、４５：５５５～５６４（１９８３年）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムは ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００ １８６２に提供され、少なくとも一部のＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され（また、ＡＡＶ－８に関する、米国特許第７，２８２，１９９号および第７，７９０，４４９号を参照）；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され；並びにＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５、４５（２００７年）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するシス作用配列は、ＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（相対マップ位置についてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名された）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンの異なるスプライシング（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）と結合し、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、三つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。代替的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８：９７～１２９（１９９２年）において概説される。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、細胞に外来ＤＮＡをデリバリーするためのベクターとして魅力的であるユニークな特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳類細胞に感染するため、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的にすることができる。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞と分裂しない細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として、これらの細胞の寿命の間、本質的に持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化ＤＮＡとして挿入され、組換えゲノムの構築を実行可能にする。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、およそ４．３ｋｂの内部ゲノムの一部またはすべて（コード複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐ）は、プロモーター、対象のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットのような外来ＤＮＡで置換されてもよい。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスに提供してもよい。ＡＡＶの別の重要な特性は、ＡＡＶが極めて安定しており、元気なウイルスであることである。それは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えられるため、ＡＡＶの低温保存の重要度は低くなる。ＡＡＶは、凍結乾燥されることもある。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に対して抵抗性ではない。
複数の研究により、筋肉における長期（＞１．５年）の組み換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現が示された。Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、８：６５９～６６９（１９９７年）；Ｋｅｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ、９３：１４０８２～１４０８７（１９９６年）；およびＸｉａｏら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８～８１０８（１９９６年）を参照。また、Ｃｈａｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２：６１９～６２３（２０００年）およびＣｈａｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、４：２１７～２２２（２００１年）も参照。さらに、筋肉は、高度に血管新生されているため、組み換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４：５８０４～５８０９（１９９７年）およびＭｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４：１３９２１～１３９２６（１９９７年）に記載されるような、筋肉内注射後の全身循環における導入遺伝子産物の出現をもたらした。さらに、Ｌｅｗｉｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７６：８７６９～８７７５（２００２年）は、骨格筋線維が、正しい抗体のグリコシル化、フォールディング、および分泌に必要な細胞因子を有することを示し、これは、筋肉が分泌されたタンパク質治療薬を安定的に発現できることを示している。
本発明の組み換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する一つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－１３を含むがこれに限定されないから生じる可能性があるＡＡＶ血清型であってもよい。擬型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。カプシド変異を有する、他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、ｒＡＡＶも、考慮される。例えば、Ｍａｒｓｉｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２２（１１）：１９００～１９０９（２０１４年）を参照されたい。上述の背景技術の項で述べたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ．７４が使用され得る。
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移され、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に集合させる。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野で標準である。ｒＡＡＶの産生は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、そこに存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能という、以下の構成要素が、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスがｒＡＡＶゲノムＩＴＲよりも異なるＡＡＶ血清型からもたらされ得、由来し得る、非限定的にＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－１３を含む、任意のＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定的に発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７～２０８１）、制限酵素エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、２３：６５～７３）、または直接的なブラントエンドライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１～４６６６）のような手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに感染する。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適していることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３～５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７～１２９で概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２０７２（１９８４年）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６（１９８４年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５年）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８年）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９（１９８８年）において記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２～３８２８（１９８９年）；米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開第９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８．７７６号；国際公開第９５／１３３９２号；国際公開第９６／１７９４７号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；国際公開第９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；国際公開第９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；国際公開第９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；国際公開第９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；国際公開第９９／１１７６４号；Ｐｅｒｒｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４～１２５０（１９９５年）；Ｐａｕｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９～６１５（１９９３年）；Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４～１１３２（１９９６年）；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、参照によりその全体が本明細書に援用され、特にｒＡＡＶの生産に関する文書のこれらの項に重点が置かれる。
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族体２９３株）のような安定的に形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ベロ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル肺細胞）のような形質転換された癌細胞ではない細胞である。
本発明の組み換えＡＡＶ（すなわち、感染性キャプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。典型的な実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶｒｅｐとｃａｐＤＮＡの両方を欠き、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶｒｅｐまたはｃａｐＤＮＡは存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（国際公開第２０１３／０１６３５２号）に記載されている。
典型的な実施形態では、本発明の組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４およびｐＨｅｌｐを使用して、トリプルトランスフェクション法_ENREF_1（Ｘｉａｏら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２、２２２４～２２３２（１９９８年））により産生され、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接したマイクロジストロフィン遺伝子発現カセットを含有する。これは、ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにカプセル形成されている配列である。プラスミドは、マイクロジストロフィン配列、ならびに筋肉特異的プロモーターのＭＨＣＫ７エンハンサーおよびコアプロモーターエレメントを含有し、遺伝子発現をもたらす。発現カセットは、高レベルの遺伝子発現を促進するためのＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）を含有し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルは、効率的な転写終結に使用される。
ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４プラスミドの概略図を図３に示す。
ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは、１１，６３５ｂｐであり、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓから取得した。プラスミドは、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡを含有する（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞により提供される）。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％のみを表し、アデノウイルス末端リピートのような複製に重要なシスエレメントを含有しない。したがって、そのような産生系から生成されると予想される感染性アデノウイルスは存在しない。ｐＨＥＬＰプラスミドの概略マップを図４に示す。
ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配のような当該技術分野における標準的な方法により精製されてもよい。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（６）：１０３１～１０３９（１９９９年）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、６９ ４２７～４４３（２００２年）；米国特許第６，５６６，１１８号および国際公開第９８／０９６５７号に開示される方法を含む。
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を考慮する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび医薬的に許容される担体を含む。組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容可能な担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントにとって無毒であり、好ましくは、使用される投薬量および濃度で不活性であり、緩衝剤およびプルロニクスのような界面活性剤を含む。
本発明の方法で投与されるべきｒＡＡＶのタイターは、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与形式、治療目標、個体、および標的とされる細胞タイプ（複数可）に応じて変化し得、当該技術分野の標準的な方法により決定され得る。ｒＡＡＶのタイターは、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲にあり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表されてもよい。キャプシド形成ベクターゲノムタイターを決定する一つの例示的な方法は、（Ｐｏｚｓｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５～８６９、２０１７年）に記載される方法のような定量的ＰＣＲを使用する。
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法は、本発明により考慮される。ｉｎ ｖｉｖｏの方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量、または有効反復投与量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与する工程を含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与されるなら、投与は、予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与されるなら、投与は、治療である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患に関連する少なくとも一つの症状を緩和（除去または低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延または予防し、障害／病状の進行を遅延または予防し、疾患の程度を減少し、疾患の寛解（部分的または全体）をもたらし、および／または生存期間を延長する用量である。本発明の方法による予防または治療のために意図される疾患の例は、ＤＭＤである。
併用療法も、本発明により考慮される。本明細書に使用される組み合わせは、同時治療と連続治療の両方を含む。本発明の方法の標準的な医療処置（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせは、新規療法との組み合わせと同様に、特に考慮される。
組成物の有効用量の投与は、限定されないが、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含む、当技術分野の標準的な経路によることができる。ｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、治療される感染および／または疾患状態、ならびにマイクロジストロフィンを発現することになる標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者により選択および／または適合され得る。
本発明は、ｒＡＡＶおよび本発明の組成物の有効用量の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身に影響を及ぼす循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を介した吸収、および注射、注入、または移植を介した非経口投与などの経腸投与が含まれる。
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組み換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用して達成され得る。本発明による投与には、筋肉への注射および血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩液に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビークルを提供するのに充分なことが示されており、（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いた通常の方法では回避されるべきであるが）担体またはｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に対する既知の制限はない。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉のような対象の特定の標的組織を標的とするように改変されてもよい。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に援用される。医薬組成物は、経皮輸送により筋肉にデリバリーされるべき、注射可能な製剤としてまたは局所製剤として調製され得る。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするための任意の医薬的に許容される担体とともに使用することができる。
本発明の一つの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、２０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロキサマー１８８を含有する緩衝液中で製剤化される。
本明細書で開示される方法で投与されるべきｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、治療目標、個体、および標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し得、当該技術分野において標準的な方法により決定され得る。投与される各々のｒＡＡＶのタイターは、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、約２×１０１４、または～約１×１０１５またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲にあり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、２×１０１４ｖｇ、１×１０１５ｖｇ）。投薬量は、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶのタイターを決定する方法は、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９（１９９９年）に記載されている。
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組み換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用して達成され得る。本発明による投与は、筋肉への注射および血流への注射を含むがこれに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩液に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビークルを提供するのに充分なことが示されており、（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いた通常の方法では回避されるべきであるが）担体またはｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に対する既知の制限はない。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉のような対象の特定の標的組織を標的とするように改変されてもよい。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に援用される。医薬組成物は、経皮輸送により筋肉にデリバリーされるべき、注射可能な製剤としてまたは局所製剤として調製され得る。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするための任意の医薬的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射の目的で、ゴマ油もしくはピーナッツ油のようなアジュバント中の溶液、またはプロピレングリコール水溶液、ならびに無菌の水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、所望であれば緩衝することができ、液体希釈剤は、まず生理食塩水またはグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または医薬的に許容される塩としてのｒＡＡＶ溶液は、ヒドロックスプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油中に調製され得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含有する。この関連において、利用される無菌の水性媒体は、全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
注射可能な使用に適した医薬担体、希釈剤または賦形剤は、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末を含む。いずれの場合でも、形態は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度まで流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、上で列挙された様々な他の成分と共に適当な溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを取り込み、必要に応じて、その後フィルター滅菌することにより調製される。概して、分散液は、滅菌された有効成分を、基本分散媒体および上で列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する無菌の媒体に取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その既にフィルター滅菌された溶液から有効成分の粉末と任意の追加の所望の任意の成分とを生じる真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
ｒＡＡＶを用いた形質導入も、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。一つの実施形態では、所望の標的筋細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種の筋細胞が、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じさせない場合に使用することができる。
形質導入された細胞の対象への形質導入および再導入の適当な方法は、当技術分野で公知である。一つの実施形態では、細胞は、例えば、適当な培地中で、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、ならびにサザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来の技術を用いて、または選択マーカーを用いて、対象のＤＮＡを有するそれらの細胞をスクリーニングすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入され得る。次いで、形質導入された細胞は、医薬組成物に製剤化され、組成物は、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射、または例えば、カテーテルを使用して、平滑筋および心筋への注射のような様々な技術により対象に導入することができる。
本発明のｒＡＡＶを用いた細胞の形質導入は、マイクロジストロフィンタンパク質の持続的な発現をもたらす。したがって、本発明は、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくは、ヒトに投与／デリバリーする方法を提供する。これらの方法は、本発明の一つ以上のｒＡＡＶを用いて組織（筋肉のような組織、肝臓および脳のような器官、ならびに唾液腺のような腺を含むが、これらに限定されない）を形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的調節エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われてもよい。例えば、本発明の一つの実施形態は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーのようなアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６１～７６６（１９９１年）を参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（ＣｓｅｒｊｅｓｉおよびＯｌｓｏｎ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４～４８６２（１９９１年））、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する調節エレメント（Ｍｕｓｃａｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７：４０８９～４０９９（１９８７年））、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：３３９３～３３９９（１９８９年））およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格の速収縮性トロポニンＣ遺伝子、遅収縮性心筋トロポニンＣ遺伝子および遅収縮性トロポニンＩ遺伝子に由来する調節エレメント：低酸素誘発性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：５６８０～５６８４（１９９１年））、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性エレメントおよびプロモーター（ＭａｄｅｒおよびＷｈｉｔｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７（１９９３年）を参照）、ならびに他の調節エレメントを含むが、これらに限定されない、筋特異的調節エレメントにより筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。
筋組織は、重要な器官ではなく、アクセスしやすいため、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡデリバリーの魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのマイクロジストロフィンの持続的な発現を考慮する。
「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、骨格筋および平滑筋、例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織）に由来する細胞または細胞の群を意味する。かかる筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞および心筋芽細胞のような、分化または未分化であり得る。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるマイクロジストロフィンの発現をもたらす、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介して、レシピエント細胞へのマイクロジストロフィンのコード領域の投与／デリバリーを指すために使用される。
したがって、本発明は、マイクロジストロフィンをコードする有効量（または本質的に同時に投与される用量、もしくは一定間隔で投与される用量）のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。記載される数値範囲は、各範囲内の各整数値を含み、最小および最大の規定の整数を含む。
実施例１
Ａ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの生成
ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接したヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含有する（図１を参照）。マイクロジストロフィンコンストラクトは、インフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）により特徴付けられる一方、ヒンジ１、２および４ならびにシステインリッチなドメインは、依然として１３８ｋＤａのタンパク質を産生する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９２ｂｐ）により誘導された。プラスミドを、ＭＣＫプロモーターを取り除き、ＭＨＣＫ７プロモーターを挿入することにより、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドから構築した。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が、効率的な転写開始のために存在し、続いてＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（１５０ｂｐ）および小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前に共通のコザックおよびｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８、２５３～２６１（２００２））により既に記載された通り、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）を含有していた。相補的ＤＮＡは、ヒト使用に最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により合成されたコドンであった（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８、１０９～１１７（２０１０年））。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列であり、これは、ウイルスＤＮＡ複製とパッケージングの両方に必要である。マイクロジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結用の小さな５３ ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。
過去の研究では、ＭＨＣＫ７プロモーターを使用した心発現（Ｓａｌｖａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５、３２０～３２９（２００７年）、ならびに骨格筋、横隔膜筋、および心筋発現を達成するＡＡＶｒｈ７４（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２、２５６～２７０（２０１５年））を示し、図１のコンストラクトの配列をＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプセル形成させた。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンを、アカゲザルのリンパ節からクローニングし、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５、４５（２００７年）において考察されている。
表１は、プラスミドＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン（配列番号３）の分子特性を示す。
Ｂ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトのカナマイシン（Ｋａｎ）耐性をコードするプラスミドからの生成およびカナマイシン（Ｋａｎ）耐性をコードするプラスミド
ＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＫＡＮのクローニングを、ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントをＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＡＭＰプラスミドおよびカナマイシン骨格から単離し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してそれらをアニーリングすることにより達成した。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントを、ＳｎａＢＩを用いた制限酵素消化を介して単離した。消化を、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）中のトータル反応液５０μＬおよびＳｎａＢＩ １μＬ中、３７℃で１時間行った。得られたフラグメントを、１％アガロースゲルを使用し、１０５ボルトで１．５時間泳動する電気泳動により単離した。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓインサートに対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。得られたフラグメントは、ＤＮＡ濃度１０ｎｇ／μＬを有していた。Ｋａｎ骨格フラグメントを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）およびＸｂａＩ １μＬを含む反応液５０μＬにおいて、３７℃で１時間、ＸｂａＩ制限酵素消化を介して単離した。得られたフラグメントを、１％アガロースゲルを使用し、１０５ボルトで１．５時間泳動する電気泳動により単離した。Ｋａｎ骨格に対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を介して精製した。得られたフラグメントは、ＤＮＡ濃度８．１ｎｇ／μＬを有していた。二つのフラグメントを、重複配列で二つのフラグメントを結合させる能力を有する、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してアニーリングした。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニング反応を、製造元のプロトコルに従い、５０℃で１５分間、総反応量容積２０μＬについて１×ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ中カナマイシン骨格に対するＭＨＣＫ７．μＤｙｓ比１：１を使用して行った。得られたクローンを、クローニング産物２．５Ｌを細胞に加え、続いて氷上で３０分間、次いで４２℃で３０秒間、および氷上でさらに５分間置くことにより、ＮＥＢ（登録商標）安定コンピテント大腸菌（Ｃ３０４０）に形質転換した。形質転換後、増殖培地９５０μＬを細胞に加え、３０℃で１．５時間、２２５ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。増殖後、これらの細胞４５０μＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンＬＢ寒天プレートに播種し、乾燥インキュベーター内で３０℃で一晩インキュベートした。このプレートからコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ中で一晩成長させた。ＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、この培養液３ｍＬから単離した。このＤＮＡを使用して、クローニング産物を確認した。クローニング産物を、ＰｍｅＩ、ＭｓｃＩ、およびＳｍａＩを用いた制限酵素消化、続いてゲル電気泳動を介して確認した。クローニング産物を、配列決定を介してさらに確認した。得られたプラスミドを、配列番号８に記載し、図１４および１５に示す。配列番号９のものに対応する図１３のコンストラクトの配列、および配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を、上述のようにＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプセル形成させた。
実施例２
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための全身遺伝子デリバリー臨床試験
これは、ＤＭＤ対象のための、配列番号３、ヌクレオチド５５～５０２１のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用した単回投与対照試験である。コホートＡは、３ヵ月～３歳の対象６名、コホートＢは、４歳～７歳の対象６名を含む。全対象にマイクロジストロフィンベクターを静脈内投与する（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロキサマー１８８を含有する緩衝液中で製剤化する。
試験では、体内のすべての筋肉に到達するように、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを末梢腕静脈を介して注入した。コホートＡでは３カ月～３歳のＤＭＤ対象６名、コホートＢでは４歳～７歳のＤＭＤ対象６名を登録した。全対象にマイクロジストロフィンベクターを静脈内投与した（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）。投与した用量についてのカプセル化ベクターゲノムを、スーパーコイルＤＮＡプラスミド標準と比較して、ＭＨＣＫ７プロモーターに対するプライマーを用いたＰｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量的ＰＣＲを使用して決定した（Ｐｏｚｓｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５～８６９、２０１７年）。
対象は、ネーションワイド・チルドレンズ病院の小児集中治療室（ＰＩＣＵ）で１時間かけて点滴を受けた。遺伝子療法前に、スクリーニング来院時に筋肉生検を行った。対象は、デリバリーの９０日後に欠損しているジストロフィンタンパク質の置換が可能であったかを決定するための２回目の筋肉生検を受けた。遺伝子導入後、患者を、治療の副作用がないか慎重にモニタリングした。このモニタリングは、遺伝子注射由来の副作用が存在しないことを確実にするための、スクリーニング来院中ならびに０、１、７、１４、３０、６０、９０、１８０日目、および９、１２、１８、２４、３０および３６ヵ月目の血液検査および尿検査、ならびに身体検査を含んでいた。
コホートＡの対象（ｎ＝６）は、３ヵ月～３歳であり、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターの静脈内投与を受けた（１０ｍＬ／ｋｇ中の２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）。コホートＡにおいて遺伝子導入する１日前に、対象に、１ｍｇ／ｋｇプレドニゾンまたはデフラザコートを開始し、免疫反応をモニタリングしながら３０日間管理した。３０日目に陰性なら、ステロイドを１週間かけて離脱させた。ＡＡＶまたはマイクロダイスに対するＴ細胞応答が、＞１２５ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣであるなら、レベルがこの閾値未満に下がるまで、ステロイドを維持した。
コホートＢの対象（ｎ＝６）は、４歳～７歳であり、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターの静脈内投与を受けた（１０ｍＬ／ｋｇ中の２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）。これらの対象を、治験を通じて安定用量のコルチコステロイドで管理したが、ＡＡＶまたはマイクロジストロフィンに対するＴ細胞応答が、＞１２５ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣであったなら、短期間増量してもよかった。
適格性基準
治験の選択基準は以下の通りであった。
・登録年齢：コホートＡ：３ヵ月～７歳、コホートＢ：４～７歳（その年齢を含む）。
・フレームシフト（欠失または重複）、またはエクソン１８～５８の未熟停止コドン変異を伴うＤＭＤ遺伝子の分子特徴。
・ＣＫ上昇＞１０００Ｕ／Ｌ
・コホートＡの対象：調整スコア≦９として定義した、肉眼的運動についてのＢａｙｌｅｙ－ＩＩＩ運動評価で平均未満。
・コホートＢ：予測値＜８０％として定義した、１００メートルの時間テストで平均未満。
・任意の民族の男性。
・運動評価試験に協力する能力。
・コホートＡの対象：コルチコステロイドでの治療歴なし。
・コホートＢの対象：スクリーニング前の少なくとも１２週間、安定用量と同等の経口コルチコステロイド、用量は、試験期間を通じて一定に保たれることが予想される（体重の変化に対応するための修正を除く）。
本治験の除外基準は、以下の通りであった。
・臨床所見に基づく活性なウイルス感染。
・駆出率４０％未満の心エコー検査を含む、心筋症の徴候。
・ＨＩＶ感染、またはＢ型もしくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠。
・自己免疫疾患の診断（または進行中の治療）。
・臨床的に重要とみなされる、異常な検査値。
・共存する病気またはＰＩの見解において、遺伝子導入に対する不必要なリスクを生じる、慢性的な薬物治療の必要性。
・ＥＬＩＳＡ免疫アッセイにより決定した、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ８抗体タイター＞１：４００を有する対象。
・調査者の見解において、プロトコール遵守検査もしくは手法に応じる対象の能力を危うくする、または被検者の健康、安全性、もしくは臨床的な説明能力を危うくし得る、医学的状態または酌量できる状況。
・遺伝子導入来院前４週間以内に重度の感染症（例えば、肺炎、腎静脈腎炎、または髄膜炎）（登録を延期してもよい）。
・本治験のスクリーニングの前６ヵ月間に、実験的またはその逆の、治験薬（コルチコステロイド以外）またはエクソンスキッピング薬（ＥｘｏｎＤｙｓ ５１（登録商標）を含む）の投与を受けた。
・任意の種類の遺伝子療法、細胞ベース療法（例えば、幹細胞移植）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９療法を受けた。
・家族が、患者の治験参加をかかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない。
評価項目
主要な評価項目は、有害事象を有する参加者数に基づく安全性であった（時間枠：３年）。副作用をモニタリングし、重症度および研究論文との関連性についてスコア化した。
副次的な評価項目は、以下の通りであった。
粗大運動サブテスト測定（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：粗大運動尺度スコアは、運動発達を測定した。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ粗大運動サブテストを、３０日目に始まり～３年目までの全追跡調査来院時にコホートＡについてスコア化した。スクリーニング時の年齢が４３～４７ヵ月（年齢を含む）であった任意の対象は、４２ヵ月齢の小児の標準的なデータと比較して計算した尺度化スコアを有していた。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩは、生後１～４２ヵ月の小児の標準的なデータを提供している。
理学療法評価。１００メートルの時間内テスト（１００ｍ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：１００ｍは、コホートＢの主要な運動結果であった。１００メートルの時間内テストは、小児が３歳になった時点でコホートＡについて開始した調査結果であった。
理学療法評価。ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）は、小児が４歳になった時点でコホートＡについて、およびコホートＢについて開始した調査結果であった。ＮＳＡＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する若年男児の歩行の質を測定する。
小児についての理学療法評価タイムドアップ・アンド・ゴー（ＴＵＧ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：コホートＢについての調査結果は、小児について修正したタイムドアップ・アンド・ゴー（ＴＵＧ）を含んでいた。
理学療法評価の４段階の上昇および下降（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：コホートＢについての調査結果は、４段階の上昇および下降を含む。
理学療法評価の手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年）：コホートＢについての調査結果は、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についての手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）を含んでいた。
免疫蛍光染色によるマイクロジストロフィン遺伝子発現の定量（時間枠：スクリーニング、９０日目）：マイクロジストロフィン遺伝子発現レベルを、免疫蛍光染色により定量し、筋肉生検の前後で比較した。
免疫蛍光染色によるマイクロジストロフィン遺伝子発現の定量（時間枠：スクリーニング、９０日目）：マイクロジストロフィン遺伝子発現レベルを、ウエスタンブロットにより定量し、筋肉生検の前後で比較した。
遺伝子療法後のＣＫ低下（時間枠：３年）：循環血中ＣＫレベルの低下。
心臓磁気共鳴画像法（１年時点）。
マイクロジストロフィン遺伝子発現
免疫蛍光染色（ＩＦ）線維強度を介したマイクロジストロフィン発現のベースラインからの変化を分析し、定量した。図７に示すように、対象１（５歳）は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の腓腹筋肉生検の筋線維において７８％のマイクロジストロフィンタンパク質の発現を示し、対象２（４歳）は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の腓腹筋肉生検の筋線維において７３．５％のマイクロジストロフィンタンパク質の発現を示し、対象３（６歳）は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の腓腹筋肉生検の筋線維において７７．０％のマイクロジストロフィンタンパク質の発現を示した。対象４（４歳）は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後の腓腹筋肉生検の筋線維において９６．２％のマイクロジストロフィン発現を示した。すべての患者が、形質導入したマイクロジストロフィンの強力な発現を示し、これは、免疫組織化学検査により測定した通り、筋鞘に適切に局在する。マイクロジストロフィン陽性線維の割合により測定した、平均遺伝子発現は、７６．２％であり、線維の平均強度は、正常対照と比較して７４．５％であった。
ベースラインから６０日目までのマイクロジストロフィン遺伝子発現の変化も、生検した筋肉組織のウエスタンブロットにより測定したマイクロジストロフィンタンパク質の発現を定量することにより評価した。図８Ａおよび図８Ｂに示すように、ウエスタンブロット分析により、対象１（５歳）、対象２（４歳）および対象３（６歳）においてマイクロジストロフィンタンパク質発現を検出した。図８Ｃは、対象４（４歳）におけるマイクロジストロフィンタンパク質発現を検出するウエスタンブロット解析を提供する。すべての処置後生検が、ウエスタンブロット法により測定した、健全なレベルのマイクロジストロフィンを示し、これは、方法１を利用して正常と比較して対象１～４についての平均７４．３％、および脂肪および線維性組織について調節する方法２に従い正常と比較して対象１～４についての平均９５．８％を伴った。
各対象について、筋線維の核当たりのベクターゲノムコピーを測定した。表２に示すように、ヌクレアーゼ当たりのベクターゲノムコピーは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与後に、対象各々について１より大きかった。１コピーのベクターは、マイクロジストロフィン遺伝子のおよそ５０％の発現を示す。細胞核あたり平均１．６個のベクターコピーを、対象１～３において測定し、これは、観察した高マイクロジストロフィン発現レベルと一致した。対象４についての値を含めたとき、平均ベクターコピー／ＤＮＡ１μｇは、＞１０５であり、細胞核当たり平均３．３個のベクターコピーであった。
筋肉生検組織におけるα－サルコグリカンおよびβ－サルコグリカンのタンパク質レベルを、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与前後に、免疫組織化学により測定した。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７の投与はまた、対象においてＤＡＰＣタンパク質の上方制御ももたらした。図９に示すように、筋肉生検組織におけるα－サルコグリカンおよびβ－サルコグリカンの発現は、対象１（図９Ａ）、対象２（図９Ｂ）および対象３（図９Ｃ）におけるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７投与前の筋肉生検におけるこれらのタンパク質のレベルと比較して増加した。
循環血清ＣＫレベル
血液検体を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中の２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の静脈内注入後３０日毎に採取した。ＣＫレベルを、各来院時に測定し、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン投与前（来院０日目）に得たベースラインレベルと比較した。ベースラインの血清ＣＫレベル（単位／リットル）を、以下の表３で提供する。図１０に示すように、循環血清ＣＫのレベルは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与の２ヵ月後に約８７％減少した。すべての対象は、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルの有意な低下を示し、これは、処置の２ヵ月後に８７％を超えるＣＫの平均低下を伴った（ｎ＝３）。ＣＫは、筋肉損傷と関連する酵素であり、ＤＭＤを有する患者は、高レベルのＣＫを一貫して示す。実際に、有意に上昇したＣＫを、ＤＭＤについての予備診断ツールとしてよく使用し、次に、確定的な遺伝子検査が続く。
表４および図１０は、各対象についてのＣＫレベルを提供する。図１１は、経時的な平均ＣＫレベルを提供し、平均ＣＫレベルが、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与後に経時的な有意に低下することを示す。平均ベースラインＣＫレベル２７，０６４Ｕ／Ｌ（表３の平均値）は、平均９，９８２Ｕ／Ｌまで約６３％低下する（平均、２７０日目、表４）。
有効性評価
マイクロジストロフィンおよびＣＫレベルに加えて、有効性を、以下の機能検査：床から立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、立ち上がるまでの時間テスト、４つの階段を上るまでの時間、１０メートルの時間内テスト（１０ｍ）、１００メートルの時間内テスト（１００ｍ）により測定した。データを、以下の表５および６で提供し、このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与から９ヵ月後に一貫した持続的改善を示す。経時的なＮＳＡＡの改善も、図１２で提供する。
安全性評価
試験中に重篤な有害事象（ＳＡＥ）を観察しなかった。３人の対象は、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）を上昇し、これは、１週間以内に増加したステロイドで解決し、ベースラインレベルまで戻った。他に臨床的に有意な検査所見は存在しなかった。患者は、一般に、増加したステロイド投与と同時の最初の週の療法中に、一過性の吐き気を有した。これは、肝酵素上昇またはいずれの他の異常と相関しなかった。
実施例３
無作為化二重盲検プラセボ対照全身遺伝子デリバリー第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験
これは、ＤＭＤ対象についてｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用した無作為化二重盲検単回投与試験である。本試験は、４～７歳の対象２４名を含む。対象を、登録時に処置またはプラセボに無作為化する。対象１２名に、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターの静脈内投与し（約１０ｍＬ／ｋｇで２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）、対象１２名に、１０ｍＬ／ｋｇプラセボ（乳酸リンゲル液）を投与する。プラセボ対象は、既に処置した対象１２名と同じ方法で、最後に処置した対象に投与した１年後に、治療に進む。対象に、マイクロジストロフィンを有するｒＡＡＶまたは乳酸リンゲル液をおよそ１時間かけて注入する。処置前および処置後（９０日目）のニードル筋肉生検を、腓腹筋で行う。
この研究の主要目的は、末梢肢静脈を介した、ＤＭＤ対象に対するｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの静脈内投与の安全性の評価である。安全性のエンドポイントを、血液学的検査、血液生化学検査、尿検査の変化、ｒＡＡＶｒｈ．７４およびマイクロジストロフィンに対する免疫応答、ならびに報告を受けた病歴および症状の観察により評価する。ジストロフィン遺伝子発現は、安全性とともに主要な結果測定として機能する。定量を、検証した免疫蛍光アッセイおよびイムノブロットアッセイを使用して行う。遺伝子療法後のＣＫの低下は、二次的な結果として機能する。有効性を、以下の機能検査：立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト（１０ｍ）、１００メートルの時間内テスト（１００ｍ）により測定する。調査測定は、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についての手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）を含む。
本研究の選択基準は、以下の通りである。
・登録年齢：４～７歳（年齢を含む）。
・フレームシフト（欠失または重複）、またはエクソン１８～５８の未熟停止コドン変異を伴うＤＭＤ遺伝子の分子特徴。
・症候性筋ジストロフィーの兆候：ＣＫ上昇＞１０００Ｕ／Ｌおよび１００メートルの歩行テストで平均パーセント予測時間未満。
・いずれの民族集団の男性も適格である。
・運動評価試験に協力する能力。
・スクリーニング前の少なくとも１２週間、安定用量と同等の経口コルチコステロイド、用量は、試験期間を通じて一定に保たれることが予想される（体重の変化に対応するための可能性のある修正を除く）。
本治験の除外基準は、以下の通りである。
・臨床所見に基づく活性なウイルス感染。
・駆出率４０％未満の心エコー検査を含む、心筋症の徴候。
・ＨＩＶ感染、またはＢ型もしくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠。
・自己免疫疾患の診断（または進行中の治療）。
・臨床的に有意とみなされる異常な臨床検査値（ＧＧＴ＞３ＸＵＬＮ、ビリルビン≧３．０ｍｇ／ｄＬ、クレアチニン≧１．８ｍｇ／ｄＬ、Ｈｇｂ＜８または＞１８ｇ／Ｄｌ、ＷＢＣ＞１ｃｍｍ当たり１８，５００）、血小板≦５０，０００。
・共存する病気またはＰＩの見解において、遺伝子導入に対する不必要なリスクを生じる、慢性的な薬物治療の必要性。
・ＥＬＩＳＡ免疫アッセイにより決定した、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ８抗体タイター＞１：４００を有する対象。エンドポイントタイターが、スクリーニング時に陽性であるなら、検査を、除外前に繰り返してもよい。
・調査者の見解において、プロトコール遵守検査もしくは手法に応じる対象の能力を危うくする、または被検者の健康、安全性、もしくは臨床的な説明能力を危うくし得る、医学的状態または酌量できる状況を有する。
・遺伝子導入来院前４週間以内に重度の感染症（例えば、肺炎、腎静脈腎炎、または髄膜炎）（登録を延期してもよい）。
・本治験のスクリーニングの前６ヵ月間に、実験的またはその逆の、治験薬（コルチコステロイド以外）またはエクソンスキッピング薬（ＥｘｏｎＤｙｓ ５１（登録商標）を含む）の投与を受けた。
・任意の種類の遺伝子療法、細胞ベース療法（例えば、幹細胞移植）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９療法を受けた。
・家族が、患者の治験参加をかかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない。
有効性評価
ジストロフィン遺伝子発現は、安全性とともに主要な結果測定として機能する。定量を、検証した免疫蛍光アッセイおよびイムノブロットアッセイを使用して行う。遺伝子療法後のＣＫの低下は、二次的な結果として機能する。加えて、有効性を、以下の機能検査：床から立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時間内テスト（１０ｍ）、１００メートルの時間内テスト（１００ｍ）により測定する。調査測定は、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についての手持ち式筋力測定（ＨＨＤ）を含む。
超音波ガイダンスを用いた筋肉生検を使用して、ベースラインと９０日目を比較して導入遺伝子発現を定量する。生検を、元の生検と同じ筋肉だが、反対の脚で行う。すべての対象に投与した１年後、プラセボクロスオーバー対象は、１回目の来院で治験スケジュールを再開する。プラセボ対象は、２回目のベースラインスクリーニング時に以下は実施しない：心臓ＭＲＩおよび筋肉生検。プラセボ対象は、９０日目に筋肉生検（計３回の筋肉生検）を受ける。凍結切片を、間接免疫蛍光染色（ＩＦ）を用いてジストロフィンについて染色する。完全なスライドスキャンを行い、マイクロジストロフィン強度および陽性線維の割合を、検証した画像スキャンおよびＭｕｓｃｌｅＭａｐ（商標）解析アルゴリズムを使用して定量する。線維サイズヒストグラムを含む筋形態計測を、盲検下で行う。盲検凍結筋肉生検シェービングを使用して、検証したウエスタンブロット法を使用してマイクロジストロフィンについての定量的タンパク質解析を行う。
腓腹筋の筋針生検（ＰＩが特定の対象において禁忌でない限り、その場合、ＰＩは、生検査するための別の筋肉を選択する）を使用して、マイクロジストロフィン発現を定量する。
有効性解析
主要な有効性エンドポイントは、生検した筋組織のウエスタンブロットにより測定した、マイクロジストロフィンタンパク質発現の量におけるベースラインから９０日目までの変化である。主要な有効性エンドポイントについての処置群の相違を、固定因子として処置を用いた共分散の解析（ＡＮＣＯＶＡ）モデルおよび共変数としてベースライン値で評価する。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を、補足解析として行う。免疫蛍光染色（ＩＦ）線維強度を介してマイクロジストロフィン発現のベースラインからの変化を、同様に解析する。
補足有効性エンドポイントは、床から立ち上がるまでの時間、４つの階段を上るまでの時間、ＮＳＡＡ、１０メートルの時間内テスト（１０ｍ）、１００メートルの時間内テスト（１００ｍ）、およびＣＫの変化の、ベースラインから各スケジュールした評価までの変化を含む。調査測定は、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についてのＨＨＤを含む。処置群の相違を、固定因子として処置を用いたＡＮＣＯＶＡモデルおよび共変数としてベースライン値で評価する。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を、補足解析として行う。
実施例４
上記の実施例２および３に記載の試験および研究を、配列番号９に記載、配列番号８、ヌクレオチド１～４９７７に記載、または配列番号６、ヌクレオチド５６～５０２２に記載のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトを使用して代わりに行う。
実施例５
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンコンストラクトの生成
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドを、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列をもたらすＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１に挿入することにより、構築する（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６～３１０１）。筋肉特異的制御エレメントをコンストラクトに含め、筋特異的遺伝子発現をもたらした。この制御エレメントは、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位部）に融合させたマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）を含んでいた。コアプロモーターの後、コンストラクトは、効率的な転写開始のため５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）、続いて、ＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）および小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）を含む。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前に共通Ｋｏｚａｋを有し、ｍＲＮＡ終結の小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３～６１、２００２年により既に記載された（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含有する。
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接したヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含有した（図５を参照）。この配列を、ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド形成させた。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンを、アカゲザルのリンパ節からクローニングし、それは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎ．Ｍｅｄ．４５（２００７年）に記載される。
参考文献

Claims (16)

  1. 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、配列番号９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む血清型ｒｈ．７４の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、静脈内投与用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、組成物。
  2. 前記ｒＡＡＶの前記用量が、スーパーコイルＤＮＡ標準を利用して決定される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｒＡＡＶの前記用量が、約１０ｍＬ／ｋｇである、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記組成物が、注射または注入による投与用に製剤化される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物であって、血清型ｒｈ．７４の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、静脈内注入により約１時間かけて約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での投与用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、配列番号９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、組成物。
  7. 前記ｒＡＡＶの前記用量が、スーパーコイルＤＮＡ標準を利用して決定される、請求項６に記載の組成物。
  8. 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象における筋ジストロフィーの治療のための医薬の調製のための、配列番号９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む血清型ｒｈ．７４の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記医薬が、静脈内投与用に製剤化され、約２×１０ １４ ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの用量を含む、使用。
  9. 前記ｒＡＡＶの前記用量が、スーパーコイルＤＮＡ標準を利用して決定される、請求項８に記載の使用。
  10. ｒＡＡＶの前記用量が、約１０ｍＬ／ｋｇでの投与のために製剤化される、請求項８または９に記載の使用。
  11. 前記医薬が、約１時間かけた注入による静脈内投与用に製剤化される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の使用。
  12. 前記筋ジストロフィーが、ベッカー型筋ジストロフィーである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の使用。
  13. デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための血清型ｒｈ．７４の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記医薬が、約１時間かけた静脈内注入による投与用に製剤化され、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの用量を含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、使用。
  14. 前記ｒＡＡＶの前記用量が、スーパーコイルＤＮＡ標準を利用して決定される、請求項１３に記載の使用。
  15. 筋ジストロフィーの治療の必要なヒト対象への前記組成物の投与後、前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、
    ａ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
    ｂ）前記投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
    ｃ）前記投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
    ｄ）前記投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
    ｅ）前記投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
    ｆ）前記投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
    ｇ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
    ｈ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの前記対象への投与後に、
    ａ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも７８％；
    ｂ）前記投与の２７０日後までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または８５％；
    ｃ）前記投与の１８０日後までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
    ｄ）前記投与の９０日後までに少なくとも８７、８８、９３または９５％；
    ｅ）前記投与の２７０日後までに少なくとも７０％；
    ｆ）前記投与の９０、１８０または２７０日後までに７０～９５％；
    ｇ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
    ｈ）前記投与の９０、１８０、または２７０日後までに少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４または９５％、からなる群から選択されるパーセンテージレベルで減少する、請求項８～１４のいずれか一項に記載の使用。
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