JP7652382B2

JP7652382B2 - 半月板再生基材

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Publication number: JP7652382B2
Application number: JP2020208522A
Authority: JP
Inventors: 周平大槻; 邦明池田; 峻輔瀬崎
Original assignee: Gunze Ltd; Educational Foundation of Osaka Medical and Pharmaceutical University
Current assignee: Gunze Ltd; Educational Foundation of Osaka Medical and Pharmaceutical University
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2025-03-27
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN114632190A; JP2022095288A

Description

本発明は、損傷した半月板の患部を覆うように巻き付けて固定することで半月板の再生を促進することができ、取り扱い性と耐久性に優れた半月板再生基材に関する。

半月板は、膝関節内にある軟骨様組織である。以下に図１及び２を用いて膝関節の構造について説明する。図１は、右膝関節の矢状面での断面模式図であり、図２は右膝関節の横断面での断面模式図である。図１に示すように、膝関節は大腿骨４と脛骨５との間に半月板１を有し、大腿骨４と脛骨５とが対向する側にはそれぞれ軟骨３が形成されている。膝の前面には膝蓋骨６があり、その下部には膝蓋下脂肪体（ＩＰＦＰ：ＩｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒＦａｔＰａｄ）２がある。膝関節は関節包７で包まれており、関節内部は関節液８で満たされている。図２に示すように、半月板１は膝関節の内側と外側で対抗するように一対形成されており、膝関節の前面側と後面側が厚くなっている。

半月板の変性や損傷は、変形性膝関節症（ＯＡ：ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）における軟骨変性とともによく見られる病態の一つである。また、半月板を切除することで、軟骨組織が減少し、変形性膝関節症が進行するという報告もある。半月板は、無血管領域を多く含む組織であるため、自己再生能力が乏しく自己修復は困難である。そのため、手術では半月板の治癒を促進する目的で、半月縫合術に加えて、成長因子、滑膜移植、骨髄刺激等の追加処置がなされてきたが、半月板の再生は不充分であった。

一方、近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、例えば、基材を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を基材中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法が行われている。

再生医療用の基材として、例えば、特許文献１に開示されるような生体吸収性材料からなる不織布を用いることが提案されている。生体吸収性材料からなる不織布は、再生医療用の基材や縫合補強材として用いた場合には、その空隙部分に細胞が侵入して増殖し、早期に組織が再生される。半月板の再生治療においても、このような組織再生基材を用いることが試みられるようになってきており、例えば、生体吸収性材料からなる不織布を生体吸収性材料からなるフィルムで挟んだ構造の組織再生基材や、不織布状のコラーゲンを多層積層させた組織再生基材を半月板の再生に用いることが検討されている。

特開平０５－０７６５８６号公報

しかしながら、生体吸収性材料からなる不織布を生体吸収性材料からなるフィルムで挟んだ組織再生基材は、半月板の再生能力が低いことに加え、曲げにくいことから半月板の患部に巻き付ける、包む等の移植での操作が行いにくいという問題があった。また、コラーゲンを多層積層させた組織再生基材は、生体吸収性材料からなる不織布を生体吸収性材料からなるフィルムで挟んだ組織再生基材よりは半月板の再生能力が高いものの、それでも充分ではなく、更に、半月板のような高い荷重と摩擦に曝される過酷な環境に用いるには強度に劣るという問題があった。

本発明は、損傷した半月板の患部を覆うように巻き付けて固定することで半月板の再生を促進することができ、取り扱い性と耐久性に優れた半月板再生基材を提供することを目的とする。

本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の損傷部分を覆うように巻き付け固定することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材であって、生体吸収性材料からなる不織布の片方の面上に生体吸収性材料からなるフィルムが複合一体化されている半月板再生基材である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討した結果、生体吸収性材料からなる不織布の片面に生体吸収性材料からなるフィルムを積層、複合一体化することによって従来の組織再生基材よりも高い半月板再生性能を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の半月板再生基材は、生体吸収性材料からなる不織布（以下、単に不織布ともいう）を有する。
上記不織布は、半月板以外の外部から侵入してきた細胞や半月板内の細胞が増殖するための足場となる役割を有する。また、上記不織布は、生体吸収性材料からなるため、半月板が再生するとともに徐々に体内へ吸収されるため、取り出しのための再手術が必要なく安全性が高い。

上記生体吸収性材料は、特に限定されず、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ－ε－カプロラクトン、ラクチド－グリコリド共重合体、グリコリド－ε－カプロラクトン共重合体、ラクチド－ε－カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ－α－シアノアクリレート、ポリ－β－ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ－γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート、ポリ－γ－メチル－Ｌ－グルタメート、ポリ－Ｌ－アラニン等の合成高分子や、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。これらの生体吸収性材料は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも半月板の辺縁から細胞をより集めやすくすることができることからポリグリコリドが好ましい。

上記ポリグリコリドの重量平均分子量の好ましい下限は３００００、好ましい上限は４０００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００以上であると、強度をより高めることができ、４０００００以下であると、異物反応をより抑えることができる。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は５００００、より好ましい上限は３０００００である。

上記ポリグリコリドの分子量の代替指標としてメルトフローレートを用いてもよい。該ポリグリコリドのメルトフローレートの好ましい下限は０．１ｇ／１０分、好ましい上限は１００ｇ／１０分である。この範囲内であると、ポリグリコリドからなる不織布を作製することが容易となる。ポリグリコリドのメルトフローレートのより好ましい下限は１ｇ／１０分、より好ましい上限は５０ｇ／１０分である。
なお、メルトフローレートの測定条件は、ポリグリコリドを２４０℃、１０分間、シリンダー内で保持して溶融した後、荷重４ｋｇｆの条件で測定した値を意味する。

上記不織布は、平均繊維径が０．９μｍ以上７．０μｍ以下であることが好ましい。
不織布の平均繊維径が上記範囲であることで、細胞をより侵入させやすくすることができるとともに強度も高めることができる。上記不織布の平均繊維径は、１．５μｍ以上であることがより好ましく、３．０μｍ以下であることがより好ましく、２．０μｍ以下であることが更に好ましい。
なお、本明細書において不織布の平均繊維径は、生地の中央の一部を切り取り、電子顕微鏡を用いて観察して繊維径をランダムに１０カ所測定し、平均したものを意味する。

上記不織布は目付が３ｇ／ｍ^２以上２０ｇ／ｍ^２以下であることが好ましい。
不織布の平均繊維径に加えて目付を上記範囲とすることで、細胞をより侵入させやすくすることができるとともに強度も高めることができる。上記不織布の目付は、５ｇ／ｍ^２以上であることが好ましく、１５ｇ／ｍ^２以下であることが好ましい。

上記不織布の厚みは特に限定されないが、好ましい下限は５０μｍ、好ましい上限は２００μｍである。不織布の厚みが上記範囲であることで、得られる半月板再生基材の強度をより高めることができるとともに、半月板の再生能力を向上させることができる。上記不織布の厚さのより好ましい下限は７０μｍ、より好ましい上限は１３０μｍである。

上記不織布の製造方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。

本発明の半月板再生基材は、上記生体吸収性材料からなる不織布の片方の面上に生体吸収性材料からなるフィルム（以下、単にフィルムともいう）を有する。
上記フィルムは、大腿骨や脛骨等の半月板と接する骨の動きを円滑にする、つまり、損傷した半月板の患部が再生するまでの間、患部の軟骨としての働きを代替する役割を有する。
上記フィルムは表面が滑らかであるため、半月板と接する骨の動きを阻害しがたい。また、上記フィルムは生体吸収性材料からなるため、半月板が再生するとともに徐々に体内へ吸収され、最終的には消滅することから安全性が高い。

上記フィルムを構成する生体吸収性材料は特に限定されず、上記不織布と同様の生体吸収性材料を用いることができるが、上記フィルムを構成する生体吸収性材料は、上記不織布を構成する生体吸収性材料よりも分解速度が遅いことが好ましい。
上記フィルムを上記不織布よりも分解速度の遅い生体吸収性材料によって構成することで、半月板が再生するまでの間充分に軟骨との摩擦に耐える耐久性を付与することができる。このような生体吸収性材料は、上記不織布を構成する生体吸収性材料に応じて適宜決定されるが、上記不織布を構成する生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、ラクチド－ε－カプロラクトン共重合体であることが好ましい。

上記ラクチド－ε－カプロラクトン共重合体は、ラクチドに由来する構成単位とε－カプロラクトンに由来する構成単位とのモル比が４５：５５以上５５：４５以下であることが好ましい。上記ラクチドに由来する構成単位とε－カプロラクトンに由来する構成単位とのモル比が上記範囲であることで、高い耐久性と適度な分解速度を有するフィルムとすることができる。上記ラクチドに由来する構成単位とε－カプロラクトンに由来する構成単位とのモル比は、４８：５２以上５２：４８以下であることがより好ましい。

上記ラクチド－ε－カプロラクトン共重合体の重量平均分子量の好ましい下限は１５００００、好ましい上限は６０００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３０００００以上であると、強度をより高めることができる。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は２０００００、より好ましい上限は４０００００である。

上記フィルムの製造方法は特に限定されず、例えば、溶融押出成型法等従来公知の方法を用いることができる。

本発明の半月板再生基材は、上記不織布の片方の面上に上記フィルムが複合一体化されている。
上記フィルムを上記不織布の片方の面だけに積層させることにより、上記フィルムを積層していない面は多数の空隙を有する不織布が露出するため、半月板内部及び半月板周縁から細胞が侵入、増殖しやすくなり、従来の組織再生基材よりも半月板再生能力を高めることができる。
また、本発明の半月板再生基材は、上記フィルムを上記不織布の片面にしか積層させていないため、巻き付ける、包むといった操作が行いやすく、取り扱い性が高い。更に、上記フィルムを有していることから、軟骨との摩擦に対する耐久性も高い。なお、ここで複合一体化とは、上記不織布と上記フィルムとが容易に分離しない程度に強固に貼り合わせることを意味する。また、上記不織布及び上記フィルムは厚みの調節等の目的で複数の不織布又はフィルムを積層した構造であってもよい。

本発明の半月板再生基材の製造方法は特に限定されず、例えば、上記方法で製造した不織布に上記方法で製造したフィルムを重ね、重りを載せた状態で真空加熱する方法等によって製造することができる。

本発明の半月板再生基材は、半月板の再生治療に用いられる。
具体的には、損傷した半月板の患部に半月板再生基材を巻き付け、縫い合わせる等の方法で固定することで、半月板の再生を促進することができる。特に本発明は、従来の半月板再生基材と比べて半月板の再生能力に優れるため、再生後の半月板が再断裂してしまうリスクを低減することができる。

本発明によれば、損傷した半月板の患部を覆うように巻き付けて固定することで半月板の再生を促進することができ、取り扱い性と耐久性に優れた半月板再生基材を提供することができる。

右膝関節の矢状面での断面模式図である。右膝関節の横断面での断面模式図である。引張強度の測定の結果を表したグラフである。糸掛け強力の測定の結果を表したグラフである。細胞の生存定量評価の結果を示す写真である。細胞の生存定量評価の結果を表したグラフである。半月板の再生性の評価における８週目の半月板欠損部位の様子を示した顕微鏡写真である。半月板の再生性の評価における１２週目の半月板欠損部位の様子を示した顕微鏡写真である。半月板の再生性の評価におけるＩｓｈｉｄａｓｃｏｒｅの結果を表したグラフである。大腿骨軟骨の損傷の評価における８週目の大腿骨の軟骨の様子を示した顕微鏡写真である。大腿骨軟骨の損傷の評価における１２週目の大腿骨の軟骨の様子を示した顕微鏡写真である。大腿骨軟骨の損傷の評価におけるＯＡＲＳＩｓｃｏｒｅの結果を表したグラフである。

以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１）
生体吸収性不織布（ネオベールナノ（ＮＶ－１０１０－Ｄ１５Ｇ）、グンゼ社製、平均繊維径：３μｍ、目付：１０ｇ／ｍ^２、厚み：８０μｍ）の片面上にラクチド－ε－カプロラクトン共重合体からなるフィルム（厚み：１００μｍ、ラクチドに由来する構成単位とε－カプロラクトンに由来する構成単位とのモル比：５０：５０）３枚を重ねて積層体とした。積層体を真空乾燥機（ＤＰ４１、ヤマト科学株式会社製）に入れ、シリコンシートで挟み板状の重りを載せ３ｋＰａの荷重を加えた。真空下で１６０℃、１０分加熱圧着することで半月板再生基材を得た。

（比較例１）
グンゼ社製ＳＥＡＭＤＵＲＡＳＤ－０９０９Ｃ（厚み８０μｍのポリグリコリドからなる不織布を厚み１００μｍのラクチド－ε－カプロラクトン共重合体からなるフィルム２枚で挟んだ３層構造）を半月板再生基材として用いた。

（比較例２）
ガイストリッヒ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ）社製Ｂｉｏ－Ｇｉｄｅ（不織布状のコラーゲン２層構造、厚み：６００μｍ）を半月板再生基材として用いた。

＜評価＞
実施例及び比較例で得られた半月板再生基材について以下の評価を行った。

（引張強度の測定）
得られた半月板再生基材を５０×１０ｍｍにカットして測定サンプルを作製した。測定サンプルをチャックに装着し、オートグラフ（島津製作所製）を用いてチャック間距離２０ｍｍ、試験速度５０ｍｍ／ｍｉｎの条件で引張強度を測定した。次いで、生理食塩水に２週間、４週間、８週間浸した測定サンプルをそれぞれ用意し、各サンプルについて上記と同様の方法で引張強度を測定した。結果を図３に示した。なお、比較例２については、４週間と８週間は半月板再生基材が完全に分解してしまったため測定できなかった。

（糸掛け強力の測定）
得られた半月板再生基材を２２ｍｍ×２２ｍｍにカットし、１組の対向する辺の端部から３ｍｍの位置に穴をあけて糸（２－０ナイロン糸、直径０．３ｍｍ）をそれぞれ通した。通した糸は両端を結んで輪にしてこれを測定サンプルとした。得られた測定サンプルについて各糸をチャックで挟みオートグラフ（島津製作所製）を用いてチャック間距離４０ｍｍ、試験速度１００ｍｍ／ｍｉｎの条件で糸での引張強度（糸掛け強力）を測定した。次いで、生理食塩水に２週間、４週間、８週間浸した測定サンプルをそれぞれ用意し、各サンプルについて上記と同様の方法で糸掛け強力を測定した。結果を図４に示した。なお、比較例２については、４週間と８週間は半月板再生基材が完全に分解してしまったため測定できなかった。

（細胞生存定量の評価）
得られた半月板再生基材を１×１ｃｍにカットし、培養液に浸透した後にＡＴＤＣ－５を各基材の上に散布し、３７度でインキュベートした。１週、２週、４週後にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤａｓｓａｙ試薬を用いてレーザ顕微鏡にて生存細胞の評価を行った。
染色写真を図５に、生細胞数の結果を定量化したグラフを図６に示した。
図５、６より実施例１が比較例１、２よりも細胞を増殖させる性能に優れていることが分かる。

（半月板の再生性の評価）
実験動物としてウサギ（日本白色家兎、月齢６ヶ月、オス）を用意し、内側半月板前節部にΦ２ｍｍの円柱欠損を作製した。半月板欠損部の周囲に半月板再生基材をそれぞれ巻き付けるように移植して縫合した。コントロールとして半月板再生基材を移植しないものと、実施例１の半月板再生基材を移植したウサギを２羽、比較例１と比較例２の半月板再生基材を移植したウサギを２羽の計４羽のウサギに対して移植を行った。
術後８、１２週目に犠牲死させ、半月板を取り出した。その後、半月板の切除部位についてサフラニンＯ染色を施した顕微鏡サンプルを作製し、顕微鏡写真を撮影した。８週目の写真を図７に、１２週目の写真を図８に示した。また、組織標本をスコアリングすることでＩｓｈｉｄａｓｃｏｒｅを算出した。算出したＩｓｈｉｄａｓｃｏｒｅを図９に示した。なお、Ｉｓｈｉｄａｓｃｏｒｅとは半月板組織修復についての評価法である。
図７、８より、実施例１では欠損部位が埋まってきていることが分かり、また、欠損部位の表面が染色されていることから、表面から細胞が侵入していることが分かる。一方、比較例１、２では、欠損がほとんど埋まっておらず、また表面もほとんど染色されていないことから細胞の侵入が少ないことが分かる。このことは、図９のＩｓｈｉｄａｓｃｏｒｅ結果からも確認できる。

（大腿骨軟骨の損傷の評価）
半月板再生性の評価で犠死させたウサギの大腿骨を取り出した。取り出した大腿骨の半月板と接する軟骨についてサフラニンＯ染色を施した顕微鏡サンプルを作製し、顕微鏡写真を撮影した。８週目の写真を図１０に、１２週目の写真を図１１に示した。また、組織標本をスコアリングすることでＯＡＲＳＩｓｃｏｒｅを算出した。算出したＯＡＲＳＩｓｃｏｒｅを図１２に示した。なお、ＯＡＲＳＩｓｃｏｒｅとは、軟骨変性の評価に用いるスコアリングである。
図１０、１１より、実施例１は染色された面積が大きいことから軟骨細胞がダメージを受けていないことが分かる。一方、比較例１、２は半月板再生基材を移植していないものと比べると摩耗は少ないものの、染色された面積が小さいことから、細胞はダメージを受けていることがわかる。このことは、図１２のＯＡＲＳＩｓｃｏｒｅ結果からも確認できる。

１半月板
２膝蓋下脂肪体
３軟骨
４大腿骨
５脛骨
６膝蓋骨
７関節包
８関節液

Claims

半月板の再生治療において、膝関節の半月板の損傷部分を覆うように巻き付け固定することで、半月板の再生を促進するための半月板再生基材であって、
生体吸収性材料からなる不織布の片方の面上に生体吸収性材料からなるフィルムが複合一体化され、他方の面上に前記不織布が露出している
半月板再生基材。
前記フィルムを構成する生体吸収性材料は、前記不織布を構成する生体吸収性材料よりも分解速度が遅い
請求項１に記載の半月板再生基材。
半月板の再生治療において、膝関節の半月板の損傷部分を覆うように巻き付け固定することで、半月板の再生を促進するための半月板再生基材であって、
ポリグリコリドからなる不織布の片方の面上にラクチド－ε－カプロラクトン共重合体からなるフィルムが複合一体化され、他方の面上に前記不織布が露出している
半月板再生基材。