JP7752382B2 - 核酸増幅方法 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年３月１５日に出願された、日本国特許出願第２０１９－０４９００９号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、核酸増幅方法に関する。

核酸の検出は、医薬品の研究開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなすものである。癌を含む種々の疾患、微生物の感染、分子系統解析に基づいた遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患及び発症リスク診断、マーカーの探索、食品や環境中の安全性評価、犯罪の立証、及び他の多くの技術にとって普遍的技術となっている。

遺伝子である少量の核酸を高感度に検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部又は全部を指数関数的に複製し増幅した産物を分析する手法である。

ＰＣＲ法は、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する強力な技術である。ＰＣＲを用いると、テンプレートＤＮＡの中の標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレートＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を生成することができる。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応が順次繰り返される。このサイクルは、分析に必要な十分なコピー数が得られるまで繰り返し行われる。原理上、ＰＣＲの1回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能である。実際には、サーマルサイクルが続くと、必要な反応試薬の濃度が減少するので、増幅されたＤＮＡ産物の集積が、最終的に止まる。ＰＣＲの一般的詳細については、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ」、Ｄｅｎｎｉｓ Ｌｏ（編集）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）（１９９８年）、及び「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）を参照のこと。

ＰＣＲ法は目的のＤＮＡを選択的に増幅できる強力な手法であるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。そこで、ＰＣＲ法の改良として、目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させるリアルタイムＰＣＲ法が開発され、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。従来のＰＣＲ法では、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することは出来ない。しかし、リアルタイムＰＣＲ法においては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲ法は、定量的ＰＣＲ法とも呼ばれる。

リアルタイムＰＣＲ法による標的ＤＮＡ量の定量性は,臨床において特に有用であり、例えばエイズウイルス（ＨＩＶ）などウイルス感染の治療効果を確認する上で、ウイルス量の推移をモニタリングすること等に利用されている。また、ヘルペスウイルス（ＨＨＶ）のような、多くが幼児期より不顕性感染しているが、体力減衰等により増殖し発症する日和見感染症の診断においても、リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ定量が有効である。

ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法であるが、ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。

本願発明者らは、ＰＣＲ操作の高速化を図る目的からマイクロブロア等を送液用機構として使用するレシプロカルフロー型の核酸増幅装置を開発した(特許文献１)。

一方、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲが注目されている。マルチプレックスＰＣＲを発展させたリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、それぞれのターゲットを、他のターゲットの影響（クロストーク）を受けにくく、感度を落とすことなく、複数の異なるターゲット遺伝子を区別して検出し、定量的な結果を得ることを目的としている。しかし、ラベル可能な蛍光物質の種類や、蛍光波長のオーバーラップの問題のために、２類以上の定量的マルチプレックス反応は、困難な場合が多いという報告がある。

特許文献１では、マルチプレックスＰＣＲの例として３種類の蛍光の同時計測が可能な多色蛍光検出器を使用して微小流路の直線流路上の１点を検出点として計測した結果が報告されている。

ＷＯ２０１６／００６６１２

しかしながら、マルチプレックスＰＣＲを行う際に、特許文献１のように多色蛍光検出器を使用し、直線流路上の１点を検出点として複数のプローブの蛍光強度を同時に計測すると、そのうちの1つのプローブから発光した蛍光波長のスペクトルが、同時に測定される別のプローブ由来の蛍光波長のスペクトルや、別のプローブに標識した蛍光色素を励起するための光源の波長のスペクトルと一部において重なり区別することができないため、正確な蛍光強度を計測するためには、このような蛍光同士や励起光との干渉が無いことが望ましい。

また、このような干渉を防ぐために直線流路上に３つの測定ポイントを並べ、励起光源を時間差で点灯させ蛍光強度を測定することも可能である。しかし、干渉の発生を避ける目的から、送液スピードを遅くしなければならないという不都合が生じる。

本発明の目的は、マルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、迅速でありかつノイズの低下させたリアルタイムＰＣＲ法を提供することである。

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを行う際に、空間的に離れた２つの温度帯の微小流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことで上記課題を解決できることを見いだした。本発明は、かかる発見にさらなる検討を重ねて完成したものである。

本発明は、以下の態様を包含する。

項１、空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行う、方法。

項２、以下の工程を含む、核酸増幅方法：
工程１：変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置の基板上に、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップを載置する工程、
工程２：微小流路の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
工程４：前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。

項３、前記送液用機構がマイクロブロア又は送風機である、項１又は２に記載の核酸増幅方法。

項４、前記曲線流路をつなぐ中間流路が直線状である、項１～３のいずれかに記載の核酸増幅方法。

項５、さらに前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の曲線流路をつなぐ前記中間流路を通過する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、前記中間流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、項４に記載の核酸増幅方法。

項６、前記中間流路上の蛍光測定点（Ｐ２）と前記変性温度帯上の蛍光測定点（Ｐ１）の距離が、８ｍｍ以上である、項５記載の核酸増幅方法。

本発明によれば、マルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、迅速でありかつノイズを低下させたリアルタイムＰＣＲ法を提供可能である。

核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター２個）。 核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター３個）。 ＰＣＲチップの変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯の曲線流路及びこれらをつなぐ直線状の中間流路の例を示す図である。 マルチプレックスｑＰＣＲ（Ｃｙ５検出）のグラフである。 マルチプレックスｑＰＣＲ（ＦＡＭ検出）のグラフである。 マルチプレックスｑＰＣＲ（ＡＢＹ検出）のグラフである。

以下、本発明の核酸増幅方法について詳説する。

本発明の核酸増幅方法は、試料液を微小流路中２つの温度帯間を往復移動させることによりサーマルサイクリングを行う方法である。このような核酸増幅方法を、レシプロカルフロー型の核酸増幅方法と呼ぶ場合もある。

本発明の核酸増幅方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のうち、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることができるリアルタイムＰＣＲである。なお、ＰＣＲにおいては、複数回のサイクルの変性、プライマー対の相対鎖へのアニーリング、ターゲット核酸配列のコピー数の指数関数的な増加をもたらすプライマーの伸長を利用し、核酸の増幅を行う。

リアルタイムＰＣＲを実現するために、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行う。すなわち、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化を経時的に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。ＰＣＲにおいて、遺伝子増幅のされ方、即ち遺伝子産物が対数増殖的に増加するときのサイクル数は、基となる鋳型の量に依存するため、あらかじめ濃度が分かっている外部標準ＤＮＡを鋳型としたときの遺伝子増幅の状況と比較することで、試料中の標的遺伝子の存在量を算出することができる。

本発明の核酸増幅方法は、ＤＮＡを鋳型とするものであっても、ＲＮＡを鋳型とするものであってもよい。ＤＮＡを鋳型とする場合は図１に示すような核酸増幅装置の構成によりＰＣＲが実施され、ＲＮＡを鋳型とする場合（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）は図２に示すような核酸増幅装置の構成により、まず逆転写酵素によりｍＲＮＡから相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成（逆転写）した後にＰＣＲが実施される
ＰＣＲの各種キット及びプロトコールとして、各種公知のものを使用することができる。本発明の核酸増幅方法がリアルタイムＲＴ－ＰＣＲである場合、逆転写反応及びＰＣＲでのサイクリングを、ワンステップで迅速かつ簡便に行うことができるＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを用いることができる。

本発明の核酸増幅方法はその好ましい態様の１つにおいて、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲである。２又は３種の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲであることが特に好ましい。

本発明の核酸増幅方法は、試料液が微小流路中を移動することにより実施される。本発明の核酸増幅方法を実施するための微小流路は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備える。微小流路は、試料液を導入するための開口部を備えることもできる。試料液を導入するための開口部は、任意選択でシールや弁等により密閉可能とすることができる。

微小流路は、（i）熱伝導性が比較的高い、（ii）ＰＣＲに必要な温度範囲において安定である、（iii）電解質溶液や有機溶媒に侵食されにくい、（iv）核酸やタンパク質の吸着性が低いなどの要件の一部又は全部を満たす材料から構成されることが好ましい。具体的には、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの熱硬化性や光硬化性の各種樹脂が例示される。また、蛍光検出を実施するとの観点から、光（特に、蛍光検出を行うための励起光及び放射光）の透過性が高い（すなわち、吸収、拡散、反射等が少ない）、透明な材料であることが好ましい。

微小流路は、例えば、ＮＣ加工による切削などの機械加工、射出成形、ナノインプリンティング、ソフトリソグラフィーなどの方法により溝が素材に形成され、シール（好ましくは、例えばポリオレフィン製などの透明シール）により密閉された構造とすることができる。あるいは、三次元プリンティングにより微小流路を形成することもできる。微小流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、くさび形、台形、多角形などとすることができる。また、微小流路の断面は、例えば、幅１０～１０００μｍ程度、深さ１０～１０００μｍ程度とすることができる。また、微小流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、又は、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路の形状は、ループ形状を有する蛇行流路、渦巻き状などの曲線流路の形状とすることができる。変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ中間流路は、直線状又は曲線状のいずれの形状とすることができる。

変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であることが好ましい。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれは、対応する温度に維持されており、当該温度帯に移動してきた試料液の温度を当該温度帯の温度に変化させる。

変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変性温度帯の温度は９０～１００℃程度が好ましく、９５℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。

変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯のそれぞれは、一定の温度に維持されていることが好ましい。温度の維持は、熱源により実現することができる。熱源は、例えば、微小流路に内蔵されている又は微小流路が接触している。熱源の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が例示される。

本発明の核酸増幅方法において、試料液はプラグ状の形態で微小流路中を移動する。微小流路中を移動する試料液の容量は、特に限定されず、好ましくは５～５０μＬ程度、より好ましくは１５～２０μＬ程度とすることができる。

試料液には、ＰＣＲの反応に必要な成分、リアルタイムＰＣＲを実現するための蛍光検出に必要な成分等が含まれている。例えば、試料液は水を主体とした水性媒体に、鋳型核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよい）ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、標識されていてもよい各種デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標的遺伝子領域に対応するプライマーセットなどのＰＣＲの反応に必要な成分；ＴａｑＭａｎプローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅプローブ、Ｅプローブ（登録商標）などの蛍光プローブ、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮなどの色素などの蛍光検出に必要な成分などが含まれている。また、ｐＨ及び塩濃度を調整するための緩衝液成分が含まれていてもよい。

本発明のＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである場合、試料液には２種類以上含むプライマーセットを含む。一般に、「プライマーセット」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものをいい、通常は一つの標的遺伝子領域に対応して1種のフォワードプライマー及び1種のリバースプライマーを用いる。本発明に係るプライマーセットは、リバースプライマーを１種のみ含む場合であっても、そのリバースプライマーが２種以上のフォワードプライマーとの組み合わせで（プライマー対として）それぞれ別個の遺伝子領域に対応する増幅産物を生成するときは、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用することができる。

蛍光検出に用いる色素（蛍光色素）の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５－ＦＡＭ、６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５－ＨＥＸ、６－ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５－ＲＯＸ、６－ＲＯＸ、５－ＴＡＭＲＡ、６－ＴＡＭＲＡ、５－ＴＥＴ、６－ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。

本発明のマルチプレックスＰＣＲに使用する色素として、ＡＢＹ及びＨＥＸからなる群から選択される少なくとも１種が含まれることが好ましく、例えば、ＡＢＹ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせやＨＥＸ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせを挙げることができる。

本発明の核酸増幅方法における試料液の移動は、送液停止時には大気圧開放される送液用機構により実現される。すなわち、シリンジポンプ等の圧力が逃げないように流路内部を閉鎖系とする必要がある機構を用いるのではなく、送液時であっても開放系を形成するように構成される送液用機構を使用する。このような送液用機構を採用することで、送風を停止させると、流路内部の圧力が瞬時に流路外部の圧力と等しくなり、プラグ状試料液へ作用する圧力が失われるため送液はすぐに停止する。そのため、試料液の位置制御を行うための圧力開放用の複数の弁がなくても、正確な位置制御が可能となる。

送液停止時には大気圧開放される送液用機構の例としては、マイクロブロア、ファンを挙げることができる。

マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４)。

ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。

本発明の核酸増幅方法において、下記［1］～［4］を１サイクルとして、レシプロカルフロー型の核酸増幅を行う。
［1］送液用機構を動作させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［2］送液用機構を停止させ、試料液を変性温度帯内に一定時間保持させる工程、
［3］送液用機構を動作させ、試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、及び
［4］送液用機構を動作させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に一定時間保持させる工程。

上記サイクルを少なくとも１回以上、好ましくは３０～５０回程度、より好ましくは３５～５０回程度繰り返して行い、サーマルサイクリングを行う。サイクル数は、鋳型核酸の濃度、標的遺伝子の種類などに応じて適宜設定することができる。

本発明の核酸増幅方法において、試料液の移動の速度、特に試料液が前記中間流路を移動する際の速度は、例えば、２５ｍｍ／秒～２．２ｍ／秒程度、より好ましくは４０ｍｍ／秒～１ｍ／秒程度、６０ｍｍ／秒～３００ｍｍ／秒程度とすることができる。

試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２～１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２～６０秒程度とすることができる。

送液用機構は、例えば接続部を介して、微小流路と接続している。

本発明の一つの態様においては、２つの送液用機構が、微小流路の２つの端のそれぞれに１つずつ接続されている。すなわち、伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第１の送液用機構を上記工程［1］において動作させ、変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第２の送液用機構を上記工程［3］において動作させる。

本発明の別の態様においては、１つの送液用機構が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の２つの端に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせる。なお、切替弁については３方弁の場合であれば、送液停止時には大気圧開放されるマイクロブロアやファンに接続され、分岐点で２方向に分かれる空気流路の両端に配置された２つの３方弁を介し、微小流路の２つ端まで通じる２本の接続流路に対し、交互に送風を行うことで、微小流路内において試料液を往復送液することが可能となる。この場合、３方弁は、一方の弁を閉じて、他方の弁を開いた状態にて送風を行うことにより試料液を送液することが可能となる。また、３方弁は１つである方が望ましいが、接続流路の組み合わせにより２方弁の組み合わせや３方、４方、５方など多方弁で合っても良い。

本発明の別の態様においては、２つの送液用機構（エアーの吐出手段とエアーの吸引手段）が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の１つの端（伸長・アニーリング温度帯側）に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吐出手段）を作動させ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吸入手段）を作動させる。

典型的な実施形態における本発明の核酸増幅方法においては、変性温度帯に対応する流路；伸長・アニーリング温度帯に対応する流路、及び直線状もしくは曲線状の中間流路の３つの流路のうち少なくとも２つにおける所定の位置で、サーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う。例えば、本発明の一実施形態において、変性温度帯に対応する流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する流路、任意選択で、直線状もしくは曲線状の中間流路の所定の位置で、サーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う。変性温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ１を挙げることができる。また、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ３を挙げることができる。直線状の中間流路の所定の位置は、特に制限はなく、図３におけるＰ２を挙げることができる。
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測により、前述のとおりリアルタイムＰＣＲが実現される。

なお、２つの位置で蛍光強度の計測を行う場合、蛍光強度の計測を行う位置を、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路と直線状もしくは曲線状の中間流路とすることもできる。

また、３つの位置で蛍光強度の計測を行う場合、蛍光強度の計測を行う位置は、変性温度帯に対応する流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する流路と直線状もしくは曲線状の中間流路との３つの位置である。

１つの位置での蛍光強度の検出は、１種の蛍光種（１種の波長）を検出するものであることが好ましい。

蛍光強度の計測の少なくとも１つは、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることに加えて、試料液の移動を検出するものであることが好ましい。例えば、試料溶液の移動の検出を変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯で行い、試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号により送液用機構の駆動を制御することが可能である。

試料液の送液制御の例を以下に示す。
［1］変性温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を伸長・アニーリング温度帯から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［2］変性温度帯における試料液を検出したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信し送液用機構を停止させる工程、
［3］伸長・アニーリング温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、及び
［4］伸長・アニーリング温度帯における試料液を検出したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信し送液用機構を停止させる工程。

蛍光強度の計測は、光源から微小流路中の試料液に向かって照射された励起光により生じた放射光（蛍光）を、蛍光検出器で検出することにより行うことができる。
なお、中間流路において蛍光強度を計測する場合、試料液が中間流路の蛍光強度の検出位置（Ｐ２）を通過し始めた時から変性又は伸長・アニーリング温度帯の蛍光強度の検出位置（Ｐ１又はＰ３）を通過する時までとすることが好ましい。上記のように蛍光強度の計測時間（期間）を規定することにより、Ｐ１又はＰ３を試料液が通過後まで蛍光強度を取得した場合と比較してノイズの少ない安定した測定結果を得ることができる。

本発明の核酸増幅方法は、例えば、以下の核酸増幅装置と核酸増幅用チップの組み合わせを用いて実施することができる：
［核酸増幅装置］
変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料溶液試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記２つの温度帯間の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置。
［核酸増幅用チップ］
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップ。

具体的には、以下の工程１～４により行うことができる：
工程１：上記核酸増幅装置の基板に上記核酸増幅用チップを載置する工程、
工程２：微小流路の一方又は両端部の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程
工程４：前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。

以下、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップの例を、図を参照しながら説明する。

核酸増幅装置は、図１に示す通り、核酸増幅用チップを載置するための基板（図示せず）、核酸増幅用チップ温調部、送液用機構（例えば、一例としてマイクロブロアを示す）、蛍光検出器、制御機構としての制御用コンピュータ電源用小型バッテリーを備えることができる。

図１において、核酸増幅用チップ用温調部は、カートリッジヒーター２本を、上記核酸増幅用チップの２つの曲線流路部のそれぞれのシール面側と隙間なく接触する様に、１０ｍｍの間隔をおいて平行に配置させた構成としており、２本のヒーターの温度制御のため、各ヒーターにはＫ型熱電対を接合させている。

カートリッジヒーター１は、ＤＮＡ変性反応に必要な温度に制御用コンピュータにより制御されている。カートリッジヒーター２はＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に制御用コンピュータに制御されている。なお、ＤＮＡの変性反応のための温度帯、アニーリング反応及び伸長反応のための温度帯は、例えばＰＩＤ（比例－積分－微分）制御により定温保持することができる。

蛍光検出器は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯の微小流路の直線上の各1点（図３のＰ１，Ｐ３）並びに中間流路上の１点（図３のＰ２）を検出点として蛍光強度を計測するように配置されており、加圧により一方の曲線流路部から送液された試料液が、検出点Ｐ１あるいはＰ３に到達した時点又はその直後に、送液用機構を停止させ、当該試料液を、他方の曲線流路部内に一定時間保持されることができる。

制御用コンピュータは、送液用機構のプログラム制御が可能であり、各微小流路中心の上記検出点の蛍光強度を連続モニタリングしながら、当該試料液が各ヒーター上の曲線流路部へ設定した時間ずつ交互に移動する様、当該送液用機構について交互にスイッチングしサーマルサイクリングを行う。当該制御用コンピュータは、さらに、リアルタイムＰＣＲ法において、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化も同時に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。

図３に微小流路を備えた核酸増幅用チップを示す。図３に示す核酸増幅用チップ用では、変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯に対応する２つの曲線流路（蛇行流路）を直線状の中間流路で連結され、検出点Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３において試料液蛍光を検出する。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例］肺炎起炎菌群の定量
高速リアルタイムＰＣＲ用のＰＣＲチップ及び本発明の装置を用いて、肺炎起炎菌群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標的遺伝子の定量を行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するテンプレートＤＮＡは、市販のコントロールＤＮＡであるＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＵＳ ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ、ＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳ ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ、ＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬを使用し、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）には滅菌水を代わりに混合して高速リアルタイムＰＣＲを実施した。

プライマー及びプローブの配列は、３種類の標的に対して以下の配列を使用した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォーワードプライマー配列は ５’－ＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＡＡＴＣＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡ－３’ （配列番号１）、リバースプライマー配列は５’－ＣＧＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡ－３’（配列番号２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡ－３’（配列番号３）とした。また、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対するフォワードプライマー配列は５’－ＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＡＡＣ Ａ－３’ （配列番号１１）、リバースプライマー配列は５’－ＧＣＴＴＴＧ ＧＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＴＴ－３’（配列番号１２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１３）とした。また、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードプライマー配列は５’－ＣＴＴＧＧＴＣＴＣ ＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＣ－３’（配列番号２１）、リバースプライマー配列は５’－ＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＡＴＧＣＡＧ－３’（配列番号２２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣＴＡ－３’（配列番号２３）とした。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する蛍光プローブには、それぞれＣｙ５、ＦＡＭ、ＡＢＹ標識のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用し、ＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２００ｎＭとした。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する２種類のフォワードプライマー並びにリバースプライマーのＰＣＲ溶液中の最終濃度は各１．５μＭとし、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードプライマー並びにリバースプライマーのＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２．０μＭとした。その他の試薬については、タカラバイオ社のＳｐｅｅｄＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを最終濃度０．１５Ｕ／μＬにて使用し、付属のＦＡＳＴ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ及びｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅをマニュアル通りの濃度で混合し、ＰＣＲ用プレミクスチャーとした。

当該ＰＣＲ用プレミクスチャー１１μｌに、５．０ｘ１０^３コピー／μＬに調製した３種類のコントロールＤＮＡについて各２μｌを、もしくはＮＴＣとして滅菌水を６μｌ添加し、全量２０μｌをリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用した。

サーマルサイクル条件は、ホットスタートに９８℃で１０秒加熱後、さらに９８℃で２秒と６２℃で６秒を５０サイクル繰り返す設定とした。この条件における５０サイクルのサーマルサイクル時間は、８分５４秒であった。

変性温度帯の流路（図３のＰ１）を照射する光源（ＬＥＤ）は励起波長５２５ｎｍであり、中間流路（図３のＰ２）を照射する光源（ＬＥＤ）は励起波長４７０ｎｍであり、伸長・アニーリング温度帯の流路（図３のＰ３）を照射する光源（ＬＥＤ）は６３０ｎｍのものを使用した。

高速リアルタイムＰＣＲを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するマルチプレックスＰＣＲの結果を図４～６に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する増幅曲線としてＣｙ５標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図４に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する増幅曲線としてＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図５に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する増幅曲線としてＡＢＹ標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図６の各実線に示し、ＮＴＣの結果を破線で重ねている。
実線にて示す通り、３種類の何れのコントロールＤＮＡを含有させた場合には、破線で示すＮＴＣの蛍光シグナルに比べ明確な増幅が得られ、同一試料からの多項目同時計測を実現した。

Claims (4)

1. 空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
   前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
   前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
   微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
   前記変性温度帯に対応する流路の所定の位置及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置及び前記中間流路の所定の位置で、それぞれ蛍光波長が異なる１種の蛍光種のサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行い、
   前記変性温度帯に対応する流路の所定の位置は中間流路から１～数回の折り返しあるいは曲線部を通過した位置であり、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置は中間流路から１～数回の折り返しあるいは曲線部を通過した位置であり、
   試料液の送液速度は２５ｍｍ／秒～２．２ｍ／秒である、方法。
2. 以下の工程を含む、核酸増幅方法：
   工程１：変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
   前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
   前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路をつなぐ中間流路を通過する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
   前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
   核酸増幅用チップを載置可能な基板、
   試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
   サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置の基板上に、
   前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップを載置する工程、
   工程２：微小流路の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
   工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程であって、試料液の送液速度は２５ｍｍ／秒～２．２ｍ／秒である工程、及び
   工程４：前記変性温度帯に対応する流路の所定の位置及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置及び前記中間流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりそれぞれ蛍光波長が異なる１種の蛍光種のサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程、であって、前記変性温度帯に対応する流路の所定の位置は中間流路から１～数回の折り返しあるいは曲線部を通過した位置であり、前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置は中間流路から１～数回の折り返しあるいは曲線部を通過した位置である、工程。
3. 前記送液用機構がマイクロブロア又は送風機である、請求項１に記載の核酸増幅方法。
4. 前記中間流路上の蛍光測定点（Ｐ２）と前記変性温度帯上の蛍光測定点（Ｐ１）の距離が、８ｍｍ以上である、請求項１記載の核酸増幅方法。