JP7684143B2 - 画像処理方法、プログラムおよび記録媒体 - Google Patents

Description

この発明は、細胞塊を撮像した画像を解析する画像処理方法に関するものであり、特にがん細胞スフェロイドの画像から細胞塊の領域と突起部の領域とを分離する技術に関するものである。

がん研究や創薬スクリーニングの分野においては、がん細胞を人工的に培養してがん細胞スフェロイドを作製し、これを観察、評価することが行われている。特に悪性度の高いがん細胞では浸潤突起と呼ばれる突起が形成されることが知られており、生体内環境を模倣した人工的な培養環境下でも、スフェロイドから放射状に延びる浸潤突起が形成されることが観察されている。浸潤突起の数や長さの変化は、がん細胞に対する化学物質の薬効評価の指標として利用可能である。

これまでは、光学顕微鏡を用いて取得されたがん細胞スフェロイドの像を用いて浸潤突起の計測が行われてきたが、三次元構造を有するスフェロイドを二次元像で観察するものであるため、計測精度は十分でなかった。この問題に対応するため、例えば特許文献１では、突起部に対応する蛍光標識が付与された試料を共焦点顕微鏡で撮像することで断層画像を取得し、多数断面の断層画像から三次元像を構成して突起部の計測を行うことで、細胞の突起形成能を評価する方法が提案されている。

特開２０１９－０８８２００号公報

上記従来技術では、試料を蛍光染色するという作業が必要となる。また、がん細胞スフェロイドは通常ゲル状の培地内に包埋された状態で培養されるため、蛍光試薬を加えることでゲルの自家発光が生じることとなり、このことが観察を阻害する要因となり得る。また、染色度合いのばらつきが定量的な評価結果に影響を及ぼすおそれがある。

ここで、例えば光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）技術を用いることで、試料の染色を行うことなく三次元像を取得することが可能である。これにより、染色作業が不要になり、また染色ばらつきによる評価のばらつきも抑えることができる。その一方で、ＯＣＴ画像ではがん細胞スフェロイドを構成する細胞塊と突起部とが区別されない。そのため、定量的な計測を行うためには、画像からこれらの構造を相互に分離することが必要となる。

例えば汎用の画像処理アプリケーションソフトウェアにも、被撮像物体からこのような樹状構造を分離し定量的に計測する機能を有するものがある。しかしながら、本願発明者の知見では、がん細胞スフェロイドの突起部を抽出するという目的に関しては、この種のアプリケーションは精度の点では十分なものとは言えない。すなわち、一般的に樹状構造の分離には画像オブジェクトの収縮と膨張とを伴うモルフォロジー処理が適用される。ここで、がん細胞スフェロイドにおける突起部は特に根元部分が太くなっており、細胞塊との境界が不明瞭である。そのため、一般的なモルフォロジー処理ではこの部分が細胞塊の一部と認識されて、突起部の数や長さに関して本来よりも低く見積もられてしまうケースがある。

このように、がん細胞スフェロイドの三次元像から浸潤突起に相当する突起部を分離しその定量的計測を行うという目的に関して、これを可能とする画像処理技術は現時点では実用化されるに至っていない。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、がん細胞スフェロイドの三次元像から細胞塊に対応する領域と突起部に対応する領域とを精度よく分離することのできる画像処理技術を提供することを目的とする。

この発明の一の態様は、突起部が形成されたがん細胞スフェロイドの三次元像を含む原画像から細胞塊に対応する領域と前記突起部に対応する領域とを特定するための画像処理方法であって、上記目的を達成するため、前記原画像から、前記がん細胞スフェロイドに対応するオブジェクトが占めるオブジェクト領域を抽出し、前記オブジェクト領域がそれ以外の領域よりも高輝度となるよう二値化した二値化画像を作成する工程と、前記二値化画像を距離変換して、前記オブジェクト領域内の各画素に、前記オブジェクト領域の最も近い外縁までの距離が大きい画素ほど高輝度となるように輝度値を割り当てた距離画像を作成する工程と、前記距離画像に対し最大値フィルタ処理を実行してフィルタ後画像を作成する工程と、前記フィルタ後画像内の前記オブジェクト領域のうち所定の閾値よりも高輝度の領域を前記細胞塊に対応する領域として、前記オブジェクト領域から領域分割する工程とを備えている。

このように構成された発明では、細胞塊と突起部とを精度よく分離することが可能となり、特に、従来の画像処理アプリケーションにおいて問題となる、突起部の根元の太い部分が細胞塊の一部と誤認識されることが抑制される。その理由について詳しくは後述するが、概略は以下の通りである。

一般的なモルフォロジー処理において用いられるエロージョン（収縮）処理は、画像中のオブジェクトの外縁を収縮させるものであり、がん細胞スフェロイドにおける浸潤突起のような太いオブジェクトの内部にはほとんど影響を与えない。したがって、外縁を相当に大きく収縮させない限り、突起部の根元部分は細胞塊の領域と一体のものとして扱われる。これに代わる処理として本発明では、距離変換処理を行う。したがって、たとえ突起部の根元の太い部分の内部領域であっても、突起部よりも十分に大きな構造体である細胞塊の中心部に近い領域に比べれば、付与される輝度値は相対的に小さくなる。

さらに本発明では、従来のモルフォロジー処理におけるディレーション（膨張）処理に対応する処理として最大値フィルタ処理を実行する。これにより、細胞塊の外縁部分の画素については輝度値が増大する一方で、細胞塊の中心部から遠い突起部内の画素の輝度値はそれほど大きく増大しない。その結果、各画素の輝度値は、細胞塊の内側と突起部の内側とで二極化することになる。

したがって、各画素の輝度値に対し適宜の閾値を導入することで、オブジェクト領域を細胞塊に対応する領域と突起部に対応する領域とに区分することができる。太い突起部の内部であっても、細胞塊の中心部から遠ければ輝度値が低く突起部の一部として認識されるため、従来技術のような誤認識は回避される。

このように、本発明に係る画像処理は、突起部を有するがん細胞スフェロイド特有の形態的特徴を十分に活用した構成となっており、かかる構成により、細胞塊の領域と突起部の領域とを精度よく分離することが可能である。

また、この発明の他の一の態様は、上記した画像処理方法の各工程を、コンピューターに実行させるためのプログラムである。また、この発明の他の一の態様は、上記プログラムを非一時的に記憶したコンピューター読み取り可能な記録媒体である。このように構成された発明では、本発明の実行主体として、例えば既存のコンピューター装置を用いることが可能となる。

上記のように、本発明によれば、がん細胞スフェロイドの三次元像、例えばＯＣＴ画像から、細胞塊の領域と突起部の領域とを精度よく分離することが可能となっている。

本発明に係る画像処理方法を実行可能なコンピューター装置の構成例を示す図である。 本実施形態の解析対象であるがん細胞スフェロイドを例示する図である。 本発明に係る画像処理方法の一実施形態を示すフローチャートである。 ここまでの処理に伴う画像の変化を示す図である。 本実施形態における領域分割の原理を説明するための図である。 領域分割の結果の例を示す図である。 閾値を調整するのに適したＧＵＩ画面の一例を示す図である。 本実施形態による領域分割の効果を示す図である。

図１は本発明に係る画像処理方法を実行可能なコンピューター装置の構成例を示す図である。本発明に係る画像処理は、例えば図１に示すようなハードウェア構成を有するコンピューター装置１に後述する画像処理の各処理ステップを実行するための制御プログラムを実装し、コンピューター装置１が当該制御プログラムを実行することにより実現可能なものである。

コンピューター装置１は、例えばパーソナルコンピューターとして一般的なハードウェア構成を有するものであり、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１０、メモリ１４、ストレージ１５、入力デバイス１６、表示部１７、インターフェース１８およびディスクドライブ１９などを備えている。

ＣＰＵ１０は、予め用意された制御プログラムを実行することで、後述する画像処理を実行するための機能ブロックとしての画像処理部１１をソフトウェア的に実現する。なお、画像処理部１１を実現するための専用ハードウェアが設けられてもよい。メモリ１４はＣＰＵ１０の演算過程で生成される各種データを一時的に記憶する。ストレージ１５は、ＣＰＵ１０が実行すべき制御プログラムのほか、処理の対象となる原画像の画像データや処理後の画像データ等を長期的に記憶する。

入力デバイス１６は、オペレータからの指示入力を受け付けるためのものであり、例えばマウス、キーボードなどを含む。また、表示部１７は画像を表示する機能を有する例えば液晶ディスプレイであり、原画像や処理後の画像、オペレータへのメッセージ等種々の情報を表示する。なお、入力デバイスと表示部とが一体化されたタッチパネルが設けられてもよい。

インターフェース１８は、電気通信回線を介して外部装置との間で各種データ交換を行う。ディスクドライブ１９は、画像データや制御プログラム等各種のデータを記録した外部の記録ディスク２を受け入れる。記録ディスク２に記憶された画像データや制御プログラム等は、ディスクドライブ１９により読み出され、ストレージ１６に記憶される。ディスクドライブ１９はコンピューター装置１内で生成されたデータを記録ディスク２に書き込む機能を備えていてもよい。

本実施形態の画像処理をコンピューター装置１に実行させるための制御プログラムについては、これを記録した記録ディスク２にディスクドライブ１９がアクセスして読み出される態様であってもよく、インターフェース１８を介して外部装置から与えられる態様であってもよい。原画像データについても同様である。

以下、コンピューター装置１により実行される画像処理方法の具体的内容について説明する。なお、このコンピューター装置１は撮像機能を有しておらず、処理対象となる画像については、別の装置で撮像されたものを例えば電気通信回線を通じて外部から取得する態様である。しかしながら、例えば撮像機能を有する装置の制御ユニットに制御プログラムを実装し、この撮像装置によって撮像と画像処理とがともに実行されるようにしてもよい。

この実施形態における画像処理は、がん細胞スフェロイドを撮像して得られた三次元像を解析して、細胞塊の領域と、その周囲に延びる浸潤突起と呼ばれる突起部の領域とを分離するための処理である。その最終的な目的は、浸潤突起の本数、長さ、太さ、枝分かれの程度などの定量的情報を取得することである。

図２は本実施形態の解析対象であるがん細胞スフェロイドを例示する図である。図２（ａ）は、人工的に培養されたがん細胞スフェロイドの画像例である。より詳しくは、図２（ａ）は、生体内環境を模した培養環境下で浸潤突起が形成されるまで培養したがん細胞スフェロイドを、光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）方式の撮像装置で断層撮像し、複数の断層画像からがん細胞スフェロイドの三次元像を作成した画像の例である。また、図２（ｂ）は、がん細胞スフェロイドの構造を簡略的に示した模式図である。

これらの図に示されるように、がん細胞スフェロイドＳでは、中央部に多数の細胞が略球状に集まった細胞塊Ｃと、その表面から放射状に延びる突起部Ｐとが形成される。さらに突起部は、多岐に枝分かれしていることがある。このように人工的に作製されたがん細胞スフェロイドは、例えばがん治療薬の開発のための創薬スクリーニングにおけるモデル細胞として用いられることがある。すなわち、がん細胞スフェロイドに薬剤候補となる化学物質を投与しその変化を調べることで、当該化学物質の薬効を評価することができる。

がん細胞スフェロイドの変化については、例えば細胞塊や浸潤突起の大きさや形状の変化を計測することにより評価することができる。このような評価を可能とするために、がん細胞スフェロイドの三次元像から、細胞塊Ｃが占める領域と、突起部Ｐが占める領域とをそれぞれ個別に特定するというニーズがある。本実施形態の画像処理は、これを志向したものである。

図３は本発明に係る画像処理方法の一実施形態を示すフローチャートである。この処理は、コンピューター装置１のＣＰＵ１０が、予め記録ディスク２から読み出されてストレージ１６に記録されている制御プログラムを実行することにより実現される。最初に、処理対象となる原画像として、浸潤突起が形成されたがん細胞スフェロイドの三次元像を含む画像が取得される（ステップＳ１０１）。画像は新たに撮像されてもよく、また予め撮像され保存されている画像データが呼び出される態様であってもよい。

原画像は、例えば図２（ａ）に示すように、ＯＣＴ撮像により得られた断層画像から作成される三次元画像である。ただし、同様にがん細胞スフェロイドの三次元像を得ることができるものであればよく、撮像方法については特に限定されない。

こうして取得された原画像から、がん細胞スフェロイドに対応する画像オブジェクトが抽出され（ステップＳ１０２）、その結果に基づき原画像が、画像オブジェクトが占める領域とそれ以外の領域とで異なる輝度値を与えることで二値化される（ステップＳ１０３）。簡単には、例えば画像オブジェクトの領域に最大輝度、それ以外の領域に最小輝度（例えばゼロ）を与えることができる。

画像オブジェクトの抽出には、例えばセマンティックセグメンテーション法を好適に適用可能である。しかしながら、これに限定されず、画像を画素ごとの輝度値に基づいて領域分割するための各種の手法を適用することが可能である。また、各画素の輝度値に対して所定の閾値を設定し、該閾値よりも高輝度または低輝度の領域を抽出する処理を行った場合には、抽出の結果自体が二値化画像となっている。

こうして二値化された画像では、細胞塊の領域と突起部の領域とが未分離である。また、試料に含まれるがん細胞スフェロイド以外の物体も含まれている可能性がある。そこで、引き続きこれらを分離するための画像処理が順次実行される。

具体的には、二値化画像に対しまず距離変換処理が実行される（ステップＳ１０４）。距離変換処理は、汎用の画像処理ソフトウェアでも実行可能な一般的な画像処理であり、画像オブジェクト内の画像内の各画素を、当該画素から最も近い黒色（すなわち輝度値ゼロの）画素までの距離によって表すというものである。例えばＯｐｅｎＣＶ（Open Source Computer Vision）ライブラリに装備されているDistance Transform関数を利用して、画像の距離変換を行うことができる。

距離変換処理の性質上、変換後の画像では、大きな画像オブジェクトの中心部に近い画素ほど高い値が与えられる一方、小さな画像オブジェクト内の画素や、画像オブジェクトのエッジ部分に近い画素では値が小さくなる。画像オブジェクトの外部では値がゼロである。

距離変換後の画像について、輝度値に対する最大値フィルタ処理が実行される（ステップＳ１０５）。後述するように、フィルタ処理におけるウィンドウサイズは原画像中における突起部のサイズに応じて定められたものであることが好ましいが、この時点でのウィンドウサイズとしては、例えば予め設定された初期値を適用することができる。最大値フィルタ処理を実行することで、各画素の輝度値は、その周囲にある画素のうち最も高輝度の画素の輝度値に置き換えられる。

そして、最大値フィルタ処理後の画像を所定の閾値に基づき領域分割することで（ステップＳ１０６）、画像オブジェクトは細胞塊に対応する領域と突起部に対応する領域とに区分される。ここまでの処理により、画像中のオブジェクトを細胞塊に対応する領域と突起部に対応する領域とに分割することが一応可能となっている。続くステップＳ１０７以降の処理は、処理のパラメータを最適化してより良好な分割結果を得る、調整のための処理である。この処理については後で説明する。

図４はここまでの処理に伴う画像の変化を示す図である。なお、実際の画像処理は三次元画像データ、いわゆるボクセルデータに基づき三次元画像空間で行われるものであるが、紙面での説明をわかりやすくするために、ここでは便宜的に、三次元画像データの元となった断層画像の１つを用いて説明することとする。後出の図５、図６についても同様である。なお、以下では画像オブジェクトを単に「オブジェクト」と称することとする。

図４（ａ）に示す画像Ｉａは、原画像、具体的にはがん細胞スフェロイドをＯＣＴ撮像することで得られた１つの断層画像の例である。図４（ａ）では、画像の中央にがん細胞スフェロイドに対応する大きなオブジェクトがある。このうち中央部の大きな領域が細胞塊に、周辺の細長く延びた領域が突起部にそれぞれ対応すると推定される。

大きなオブジェクトの周囲に孤立した小さなオブジェクトがいくつも見られる。このような孤立したオブジェクトには、試料内で実際に孤立しているケースと、実際には中央のオブジェクトと連続した構造であるが、一の断面の画像では孤立しているように見えているケースとが含まれ得る。つまり、三次元像では細胞塊と連続した構造となっている突起部が、断面画像では孤立しているように見えているケースがあることに留意する必要がある。このことは以下の画像においても同じである。

図４（ｂ）に示す画像Ｉｂは、画像Ｉａを二値化処理（ステップＳ１０３）した後の画像の例である。二値化画像Ｉｂでは、画像オブジェクトとして抽出された領域は白く（つまり高輝度で）、それ以外の領域は黒く（つまり低輝度で）表されている。

また、図４（ｃ）に示す画像Ｉｃは、画像Ｉｂを距離変換（ステップＳ１０４）した後の画像（すなわち距離画像）の例であり、処理により与えられた値が大きいほど高輝度となる。大きなオブジェクトの中心部で特に明るく、周縁部に近いほど暗くなっている。小さなオブジェクトでは、周縁部までの距離が大きくないため、中央部分でもさほど明るくならない。

二値化画像Ｉｂと比較すると、オブジェクトが収縮し特に細かい構造を有する部分が細くなっているように見え、その意味では従来のモルフォロジー処理におけるエロージョン処理に類似している。しかしながら、オブジェクト自体を収縮させるエロージョン処理と異なり、オブジェクトのサイズは変わっておらず、単にその周縁部の輝度が低下しているだけである。

図４（ｄ）に示す画像Ｉｄは、距離変換後の画像Ｉｃに対し最大値フィルタ処理（ステップＳ１０５）を行った後の画像の例である。最大値フィルタ処理によって、高輝度の領域が画像Ｉｃよりも拡大されている。周縁部の低輝度の領域も、最大値フィルタ処理によってウィンドウサイズに相当する量だけ拡大されることになる。この意味において、従来のモルフォロジー処理におけるディレーション処理に代わる処理であるとも言える。

図５は本実施形態における領域分割の原理を説明するための図である。がん細胞スフェロイドを単純化したモデルとして、図５（ａ）に示すように、略円形の細胞塊Ｃから比較的細い突起部Ｐ１とこれより太い突起部Ｐ２とが互いに反対方向に延びた構造体を用い、本実施形態における領域分割の原理について説明する。

図５（ｂ）は距離変換処理後の画像における輝度分布を示しており、具体的には、図５（ａ）に点線で示す、細胞塊Ｃの中心を通り突起部Ｐ１，Ｐ２が延びる方向に沿って引いた線上における輝度分布を示している。これからわかるように、細胞塊Ｃの中心部で輝度が最も高く、周縁部に近いほど輝度が低くなる。突起部がなければ、図５（ｂ）に点線で示すように、細胞塊Ｃの周縁部で輝度がゼロとなるまで低下するが、突起部Ｐ１，Ｐ２が存在することで、細胞塊Ｃの周縁部における輝度の低下は抑えられる。突起部Ｐ１，Ｐ２においても、その幅が広い部分では輝度値が高く、先端の細い部分に近づくにつれて輝度値は低下する。

図５（ｃ）は最大値フィルタ処理後の画像における、上記と同じ線上での輝度分布を示している。最大値フィルタ処理を実行することで、図５（ｂ）に示される距離変換後のプロファイル（図５（ｃ）においては点線で示す）が、実線で示すようにウィンドウサイズＷに対応する幅だけ広がることになる。この図からわかるように、細胞塊Ｃに対応する領域では、その内部における輝度が高いため、フィルタ処理後には輝度が比較的大きく増加する。特にその周縁部において、増加が顕著である。これに比べて、細胞塊Ｃよりも細い構造体であるため輝度値が低い突起部Ｐ１，Ｐ２に対応する領域では、輝度の増加は僅かである。この違いが、細胞塊と突起部とを精度よく分離するための重要な要素となっている。

ここで、図５（ｄ）に示すように、適宜の閾値Ｔｈを導入し、輝度値が閾値Ｔｈより高い領域を細胞塊Ｃ、輝度値が閾値Ｔｈより低い領域を突起部Ｐ１，Ｐ２に対応する領域とみなして領域分割を行うこととする。そうすると、図５（ａ）と図５（ｄ）との比較から明らかなように、実際の細胞塊Ｃと突起部Ｐ１，Ｐ２との境界に近い位置で、これらの領域が相互に分離されることになる。当然に、分割される領域間の境界は閾値によって大きく変わるから、閾値が適切に設定されることが必要条件となる。

図５（ｃ）からわかるように、最大値フィルタ処理を行わないプロファイル（点線）に対し閾値に基づく分割を実行すると、細胞塊Ｃに対応する領域が実際よりも小さく見積もられてしまう。図５（ｃ）に実線で示すように、最大値フィルタ処理を行って、輝度値を細胞塊Ｃの内部、特にその周縁部において選択的に増加させておくことで、このような問題を回避することが可能である。

本実施形態の画像処理では、突起部に対応する細かい構造を細胞塊に対応する領域から分離するために、距離変換処理を実行する。この方法によれば、オブジェクトの中央部に比べて周縁部の重みが相対的に小さくなるが、従来の手法におけるエロージョン処理とは異なり、オブジェクトの一部が消去されることはない。すなわち、この時点でオブジェクトの輪郭を特定するための情報は維持されている。

そして、従来の手法におけるディレーション処理に相当する処理として最大値フィルタ処理を行う。これによる輝度値増加の効果は、比較的大きな構造であり距離変換処理によって高い輝度値を有するに至った細胞塊において大きい一方、より小さな構造である突起部において小さい。したがって、細胞塊の周縁部では顕著に輝度値が増加するが、突起部の周縁部では輝度値の増加は限定的である。

そのため、続く領域分割処理においては、適宜に設定された閾値より高輝度の領域を細胞塊に対応する領域とみなして抽出することができる。すなわち、細胞塊はその周縁部の画素まで比較的高い輝度値が与えられているため、最大値フィルタ処理による輝度値の増加の効果が小さい突起部との区別を、閾値との単純な比較によって実現することが可能である。なお、最大値フィルタ処理によって、突起部の周縁部はいくらか膨張することとなる。このため、閾値より低輝度の領域をそのまま突起部の領域とみなすと、実際よりも大きな領域が抽出されることになる。これを防止するためには、最大値フィルタ処理前の画像、例えば原画像または二値化画像から、細胞塊に対応する領域とみなされた領域を削除した領域を、突起部の領域として扱うことが望ましい。

このように、本実施形態における距離変換処理と最大値フィルタ処理との組み合わせは、細胞塊と突起部との間の輝度のコントラストを明確にし、後続の閾値に基づく領域分割による細胞塊と突起部との分離を適切に機能させることを可能にするものである。

図５（ｅ）は、比較例として、従来のエロージョン処理とディレーション処理との組み合わせによる領域分割におけるエロージョン処理の結果を模式的に示したものである。オブジェクトの周縁部を適当な量だけ一律に収縮させることで、比較的細い突起部Ｐ１に対応する部分をオブジェクトから消去することは比較的容易である。一方、幅の広い突起部Ｐ２についてはオブジェクトの一部として残留し、このことが前記した従来技術の問題点、すなわち、太い突起部の根元部分が細胞塊の一部とみなされてしまう問題の原因となっている。

原理的には、収縮量を大きくすればこのような突起部についても消去することは可能である。しかしながら、収縮量が大きすぎると元の形状に関する情報が大きく失われて、ディレーション処理後のオブジェクト形状の再現性が大幅に低下してしまうことになる。

これに対して、本実施形態の画像処理では、原画像に対し二値化処理、距離変換処理、最大値フィルタ処理を順番に実行し、最終的に閾値に基づく領域分割を行うことで、上記のような問題を抑えることが可能である。

図６は領域分割の結果の例を示す図である。図６（ａ）は、二値化画像Ｉｂのうち細胞塊Ｃに対応する領域と判断された領域を白抜きで示す画像の例である。また図６（ｂ）は、二値化画像Ｉｂのうち突起部Ｐに対応する領域と判断された領域を白抜きで示す画像の例である。例えばこれらをマスク画像として原画像Ｉａに作用させることで、原画像Ｉａから細胞塊Ｃに対応する領域および突起部Ｐに対応する領域を抽出することが可能となる。

図３に戻って、本実施形態の画像処理についての説明を続ける。ステップＳ１０６までの処理により、オブジェクトは細胞塊Ｃに対応する領域と、突起部Ｐに対応する領域とに分割されている。ただし、処理パラメータ、具体的には最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズＷおよび領域分割処理における閾値Ｔｈの設定が適切でなければ、分割の結果も良好なものとはならない。そこで、本実施形態の画像処理は、必要に応じてこれらの処理パラメータの調整を行うことができるように構成されている。

具体的には、ステップＳ１０６までの処理により得られた結果画像を表示部１７に表示してユーザーに提示し（ステップＳ１０７）、パラメータの変更に関するユーザーからの操作入力を受け付ける。ユーザーが領域分割のための閾値の設定変更を希望する場合には（ステップＳ１０８においてＹＥＳ）、新たな閾値の設定入力を受け付け（ステップＳ２１１）、新たな閾値に基づき領域分割処理を実行し（ステップＳ１０６）、その結果を表示する（ステップＳ１０７）。また、ユーザーが最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズの設定変更を希望する場合には（ステップＳ１０９においてＹＥＳ）、その新たな設定入力を受け付け（ステップＳ２１２）、新たなウィンドウサイズに基づき最大値フィルタ処理を再実行する（ステップＳ１０５）。さらに、領域分割処理を再実行し（ステップＳ１０６）、その結果を表示する（ステップＳ１０７）。

ユーザーがパラメータの変更を希望しない場合には（ステップＳ１０８、Ｓ１０９においてともにＮＯ）、その時点の結果画像をストレージ１５に記憶保存し（ステップＳ１１０）、処理は終了する。このようにしてパラメータが最適化され、ユーザーが所望する分割結果を得ることが可能となる。

これらのパラメータのうちウィンドウサイズＷについては、細胞塊から突起部を分離するという目的からは、突起部のサイズからその最適値をある程度見積もることが可能である。具体的には、突起部の太さの（１／２）倍ないし１倍程度が好適であることがわかっている。なお、実際の最大値フィルタ処理は三次元画像空間における球形フィルタ処理である。したがって、ここでいうウィンドウサイズＷとは、球形フィルタ処理における球形ウィンドウの直径に相当する概念である。球形ウィンドウの半径がウィンドウサイズとされてもよい。

がん細胞スフェロイドにおいて浸潤突起は種々の太さを取り得る。この場合、ウィンドウサイズの決定に関わる「突起部の太さ」としては、例えば種々の突起部のうち最も太い部分の太さ（幅）を用いることができる。このように、最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズについては、がん細胞スフェロイドの外形が把握できる時点である程度絞り込むことが可能である。つまり、パラメータの最適化に際して、ウィンドウサイズを頻繁に変化させる必要性は生じないものと考えられる。

一方、閾値Ｔｈについては、細胞塊と突起部との境界を画定するのに重要なパラメータであり、微調整が必要となる。このことから、図３に示す処理では、閾値の調整に係る処理ループを、ウィンドウサイズの調整に係る処理ループの内側に設けている。また、次に示すように、ユーザーによる閾値調整作業を支援するためのユーザーインターフェース画面（Graphical User Interface；ＧＵＩ）が提供される。

図７は閾値を調整するのに適したＧＵＩ画面の一例を示す図である。図７（ａ）～図７（ｄ）はいずれも、ステップＳ１０６における領域分割の結果画像の事例であり、画像内でオブジェクトが占める領域のうち、細胞塊に対応するとみなされた領域を、突起部とみなされた領域よりも高輝度（紙面においてはより白く）となるように色付け加工したものである。

また、これらの各画像においては、上記した色付け加工が施された画像Ｉｐに、当該画像における輝度値のヒストグラムＨと、輝度値に対する閾値Ｔｈの設定値を表すゲージＧとが添えられている。これらの画像の比較から、閾値Ｔｈの設定の違いにより細胞塊と突起部との境界が大きく変化することがわかる。

ユーザーは、入力デバイス１６を介してゲージＧを操作することで、閾値Ｔｈの設定を変更することができる。閾値の変更に伴い領域分割が再実行され、その都度結果画像が表示される。ユーザーは結果画像を確認しながら閾値Ｔｈの調整を行うことができ、短時間で最適な閾値Ｔｈを見出すことが可能となる。

図８は本実施形態による領域分割の効果を示す図である。図８（ａ）は、本実施形態の画像処理の結果画像を元の三次元像に適用して、三次元像中において細胞塊が占める領域と突起部が占める領域とを区別した画像である。ここでは三次元画像を二次元に投影した画像を示している。具体的には、中央部分の色の濃い部分が細胞領域とみなされた領域であり、これより白っぽい領域が突起部とみなされた領域である。中央部の細胞塊の領域と、その表面から外向きに放射状に延びる突起部の領域とで的確に領域分割がなされていると言える。

図８（ｂ）は比較例として示したものであり、従来手法であるエロージョン処理とディレーション処理との組み合わせにより細胞塊の領域と突起部の領域とを分割した結果を示している。エロージョンにおける収縮量およびディレーションにおける膨張量を十分に調整しても、図に矢印を付して示すように、特に太い突起部の一部に、細胞塊と誤認識された領域が残ってしまっている。

以上のように、この実施形態の画像処理では、がん細胞スフェロイドの三次元像に対し、オブジェクト抽出結果に基づく二値化処理、距離変換処理、最大値フィルタ処理、および閾値に基づく領域分割の各処理を順番に行う。これにより、従来の方法よりも精度よく、細胞塊の領域と突起部（浸潤突起）の領域とを分離することが可能である。

こうして細胞塊と浸潤突起とが精度よく分離されれば、その結果を各種の定量的評価、例えば、浸潤突起の本数、太さおよび長さや、その枝分かれの程度などの評価に役立てることが可能である。例えば、三次元像から細胞塊の像を消去し、突起部の像のみを残した画像を作成すれば、このような評価のための計測を当該画像に基づき容易に行うことが可能となる。特に、本実施形態によれば、太い浸潤突起が細胞塊とみなされるタイプの誤認識が低減されるため、浸潤突起の長さが本来より短く見積もられてしまうという問題を回避することが可能である。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態のコンピューター装置１は、本発明に係る画像処理を実行するための制御プログラムが予め実装されたものである。すなわち、本発明は、上記した処理の各処理ステップをコンピューター装置に実行させるためのソフトウェアプログラムとして実施されてもよい。

このようなプログラムの配布は、例えばインターネット等の電気通信回線を介してダウンロードする形式によって行うことが可能であり、また当該プログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体を配布することによっても可能である。また、例えば既存の顕微鏡撮像装置にインターフェースを介してこのプログラムを読み込ませることで、当該装置により本発明を実施することも可能となる。

また例えば、上記実施形態では、処理パラメータとして、最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズと領域分割処理における閾値とを変更設定可能である。このうちウィンドウサイズに関しては、前記したように解析対象となるがん細胞スフェロイドにおける浸潤突起のサイズ（太さ）から適切な値をある程度推定することが可能である。したがって、対象物のサイズに応じて予め定められた固定値を用いたり、初期値のみをユーザー設定させたりする態様であってもよい。

また、上記実施形態の画像処理に加えて、他の画像処理、例えば解析対象物以外の微小なオブジェクトの像や画像ノイズを消去するために、ノイズ除去処理や平滑化処理等を適宜組み合わせて実行してもよい。

また上記実施形態の画像処理では、三次元像のうち画像オブジェクトの内部が高輝度、背景が低輝度となる二値化画像を用い、距離変換処理ではオブジェクトの中心部ほど高輝度となるように距離変換し、最大値フィルタ処理を行い、領域分割処理では閾値より高輝度の領域を細胞塊の領域とみなしている。しかしながら、これらの処理において輝度の関係を反転させても技術的には等価である。

また、上記実施形態の画像処理は、ＯＣＴ撮像されたがん細胞スフェロイドの三次元像を解析対象とするものである。しかしながら、撮像方式はこれに限定されず、解析対象物の表面の立体形状を三次元的に表現することのできる各種の撮像方式で撮像された画像について、同様に処理することが可能である。また、がん細胞スフェロイドに限らず、これと同様にまとまった細胞塊の表面から外向きに突起部が延びているような各種の細胞塊の解析にも、本実施形態の画像処理を適用可能である。

以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明に係る画像処理方法において、例えば距離変換では、オブジェクト領域内の各画素に、オブジェクト領域以外の画素に与えられた輝度値よりも高い輝度値を割り当てるようにしてもよい。このような処理は汎用の画像処理ソフトウェアの標準機能を用いて実現可能であり、また本発明の距離変換処理として十分に実用になるものである。

また、原画像からオブジェクト領域を抽出する方法としては、例えばセマンティックセグメンテーション法を適用することができる。このような構成によれば、抽出対象ががん細胞スフェロイドのように形状が不定であるものであっても、精度よくオブジェクト領域を抽出することが可能である。

また例えば、領域分割後の画像を表示装置に表示させる工程がさらに設けられてもよい。こうして処理の結果がユーザーに画像として提示されることで、ユーザーは処理の結果を確認することができる。例えば以下のようなパラメータの調整に利用可能である。

例えば、閾値がユーザー操作により変更設定可能とすることができる。閾値の設定により、細胞塊と突起部との間に画定される境界の位置が変化し、このことが両者の分離の良否に大きく影響する。閾値を変更可能なパラメータとすることで、解析対象のがん細胞スフェロイドの状態に応じてこれを調整することで、細胞塊と突起部との分離をより的確に行うことが可能となる。

同様に、最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズがユーザー操作により変更設定可能とされてもよい。最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズは、細胞塊と突起部との間で両者を分離するための輝度値のコントラストに関わるパラメータであり、特にそれらの分離後の形状の再現性に影響を及ぼす。これについても必要に応じて調整可能としておくことで、細胞塊と突起部との分離をより的確に行うことが可能となる。

また例えば、最大値フィルタ処理と領域分割とがこの順番で繰り返し実行可能に構成されてもよい。上記したように、最大値フィルタ処理に係る処理パラメータであるウィンドウサイズと、領域分割に係る処理パラメータである閾値とは、いずれも細胞塊と突起部との分離の精度に関わるものである。これらが変更された際には最大値フィルタ処理または領域分割が再実行されることが好ましく、これら２つの処理が繰り返し実行されるようにしておけば、２つのパラメータを逐次最適な値に近づけてゆくことが可能になる。

また、本発明に係る画像処理方法は、例えば原画像または二値化画像から細胞塊に対応する領域を消去して突起部に対応する領域を示す画像を作成するように構成されてもよい。このような構成によれば、突起部に対応する領域だけが示された三次元像が作成される。この画像に基づいて、突起部の定量的評価を容易に行うことが可能となる。

また例えば、原画像は、光干渉断層撮像方式の撮像により取得された画像であってもよい。光干渉断層撮像（ＯＣＴ）方式の撮像では細胞やスフェロイドに対し非破壊、非侵襲で撮像を行うことが可能である。そのため、例えば培養されるがん細胞スフェロイドを定期的に撮像することで、がん細胞スフェロイドの経時的変化を観察することができる。そして、ＯＣＴ撮像された画像は、本発明に係る画像処理に好適に適用可能なものである。

この発明は、人工的に培養されたがん細胞スフェロイドの定量的な評価に適用可能であり、例えば医療や創薬分野に好適なものである。

１ コンピューター装置
２ 記録ディスク（記録媒体）
１０ ＣＰＵ
１５ ストレージ
１６ 入力デバイス
１７ 表示部
Ｃ 細胞塊
Ｐ，Ｐ１，Ｐ２ 浸潤突起（突起部）

Claims (11)

1. 突起部が形成されたがん細胞スフェロイドの三次元像を含む原画像から細胞塊に対応する領域と前記突起部に対応する領域とを特定するための画像処理方法であって、
   前記原画像から、前記がん細胞スフェロイドに対応するオブジェクトが占めるオブジェクト領域を抽出し、前記オブジェクト領域がそれ以外の領域よりも高輝度となるよう二値化した二値化画像を作成する工程と、
   前記二値化画像を距離変換して、前記オブジェクト領域内の各画素に、前記オブジェクト領域の最も近い外縁までの距離が大きい画素ほど高輝度となるように輝度値を割り当てた距離画像を作成する工程と、
   前記距離画像に対し最大値フィルタ処理を実行してフィルタ後画像を作成する工程と、
   前記フィルタ後画像内の前記オブジェクト領域のうち所定の閾値よりも高輝度の領域を前記細胞塊に対応する領域として、前記オブジェクト領域から領域分割する工程と
   を備える、画像処理方法。
2. 前記距離変換では、前記オブジェクト領域内の各画素に、前記オブジェクト領域以外の画素に与えられた輝度値よりも高い輝度値を割り当てる、請求項１に記載の画像処理方法。
3. セマンティックセグメンテーションにより、前記原画像から前記オブジェクト領域が抽出される、請求項１または２に記載の画像処理方法。
4. 前記領域分割後の画像を表示装置に表示させる工程をさらに備える、請求項１ないし３のいずれかに記載の画像処理方法。
5. 前記閾値がユーザー操作により変更設定可能である、請求項１ないし４のいずれかに記載の画像処理方法。
6. 前記最大値フィルタ処理におけるウィンドウサイズがユーザー操作により変更設定可能である、請求項１ないし５のいずれかに記載の画像処理方法。
7. 前記最大値フィルタ処理と前記領域分割とがこの順番で繰り返し実行可能である、請求項５または６に記載の画像処理方法。
8. 前記原画像または前記二値化画像から前記細胞塊に対応する領域を消去して前記突起部に対応する領域を示す画像を作成する、請求項１ないし７のいずれかに記載の画像処理方法。
9. 前記原画像は、光干渉断層撮像方式の撮像により取得された画像である、請求項１ないし８のいずれかに記載の画像処理方法。
10. 請求項１ないし９のいずれかに記載の画像処理方法の各工程をコンピューターに実行させるための、プログラム。
11. 請求項１０に記載のプログラムを非一時的に記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。

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